ELEMENTE DE DIAGNOSTIC DE LABORATOR IN EVALUAREA ANEMIILOR

REFERAT Dr. Catalin Lata, medic rezident anul III de studiu, Hematologie

Introducere
Cele mai raspandite pe glob anemii sunt : 1. anemia prin carenta de Fe1 2. anemia cronica simpla 3. talasemiile Semnalul clinic principal in aprecierea anemiilor este paloarea tegumentelor si a mucoaselor, care insa nu e un semn fidel deoarece e prezenta si in starile insotite de hipervolemie (sarcina, splenomegalie, hiperhidratare, macroglobulinemie) cand sunt numite anemii relative sau pseudoanemii. Laboratorul, in schimb, furnizeaza informatiile care permit elucidarea diagnosticului si urmarirea terapeuticii anemiilor. Parametrii eritrocitari ofera informatii despre: 1. cantitatea (numarul si volumul eritrocitelor, cantitatea de hemoglobina dintr-un decilitru de sange) 2. marimea eritrocitelor 3. incarcarea cu hemoglobina 4. producerea de reticulocite de catre maduva spinarii (MO) 5. variatia dimensiunilor hematiilor (RDW)

1. Hemoglobina
Hemoglobina este un parametru doar orientativ. Organismul se adapteaza prin: ajustarea curbei disocierii Hgb. In anemii creste cantitatea de 2, 3 difosfoglicerat eritrocitar si aceasta mediaza o eliberare mai lesnicioasa a O2 de catre oxihemoglobina ce poate spori oxigenarea tisulara cu pana la 30%. cresterea travaliului cardiac, fenomen favorizat de reducerea vascozitatii sangelui si limitat de capacitatea de performanta a
1

Abervieri folosite in text: Fe fier, Hg hemoglobina, Vem volum eritrocitar mediu, HEM hemoglobina eritrocitara medie, CHEM concentratia hemoglobinei eritrocitare medie, MMM metaplazia mieloida cu mielofibroza, CID coagularea intravasculara diseminata, IDEr indicele distributiei eritrocitare (RDW red distribution width), MO maduva osoasa, Bi bilirubina, LDH lactat dehidrogenaza, Ig imunoglobuline, AHAI anemia hemolitica autoimuna

cordului. Semnele ce exprima limita performantelor cardiace: palpitatii, dispnee de efort si suferinta cerebrala secundara anoxiei (ameteli, cefalee, acufene)

2. Indici eritrocitari
Principalii indici eritrocitari sunt: 1. volumul eritrocitar mediu VEM (80-94 fl) 2. hemoglobina eritrocitara medie HEM (25-33 pg/celula) 3. concentratia hemoglobinei eritrocitare medie CHEM (32-36 gr/dl) Tabelul de mai jos sugereaza o cauza a anemiilor functie de indicii eritrocitari: VEM Normocitara (80-93 fl) CHEM Normocroma (32-36 g/dl) Sugestii etiopatogenice Insuficienta medulara Sangerare acuta Hemoliza Leucemii Neoplasme solide Insuficienta renala cronica (IRA) Anemii megaloblastice carentiale si noncarentiale Anemii macrocitare nonmegaloblastice Boala cronica de ficat Mielodisplazie Mixedem Carenta de fier Anemia cronica simpla Inflamatii cornice Infectii cronice Neoplasme Talasemii Anemii sideroblastice Unele hemoglobinopatii

Macrocitara (peste 94 fl)

Normocroma (32-36 g/dl)

Microcitara (sub 80 fl)

Hipocroma (sub 30 g/dl)

3. Morfologia eritrocitara
Prin modificari ale morfologiei eritrocitara apar pe frotiu eritrocite cu infatisari particulare care reveleaza un mecanism sau o boala: 1. eritrocite in semn de tras la tinta cu precadere in talasemii si in carenta martiala (lipsa Fe in organism) dar si in hemoglobinozele C si S
2

 icter obstructiv deficienta enzimatica (lecitincolesterol acid transferaza) 2. eliptocite (ovalocite) anemii carentiale (acid folic si vit B12) unele anemii hemolitice ereditare (eliptocitoza, talasemii) 3. sferocite, intr-o varietate larga de situatii cu alterari ale membranei sau agresiuni asupra membranei eritrocitare sferocitoza ereditara anemii hemolitice imune anemii hemolitice cu corpi Heinz unele hemolize provocate de medicamente dupa arsuri intinse hipersplenism hipofosfatemie severa 4. stomatocite in etilism cronic boala cronica de ficat dupa antihistaminice, fenotiazide, propranolol 5. echinocite (hematii crenelate) uremie carcinom gastric deficienta de piruvat kinaza 6. acantocite (anemii spiculate) ciroza alcoolica abetalipoproteinemia ereditara 7. dacriocite (eritrocite in picatura) in MMM (metaplazia mieloida cu mielofibroza) talasemii anemii mieloftizice 8. schizocite (fragmentate), semnaleaza o mutilare mecanica a eritrocitelor : anemii hemolitice microangiopatice (in CID, purpura trombotica trombocitopenica, forme de vasculita si glomerulonefrita) la protezatii vasculari hemoglobinuria de mars dupa arsuri intinse 9. drepanocite (in secera sau drepanocite) caracteristice in siclemie 10.eritrocite cu corpi Jolly diseritropoieze asplenie (in cursul autosplenectomiei din cursul evolutiei siclemiei sau dupa splenectomie) 11.eritricite cu punctatii bazofile diseritropoieze
3

 saturnism talasemie

4. Hipocromia

In cadrul modificarilor de coloratie eritrocitara hipocromia e semn al scaderii productiei de hemoglobina prin : 1. incorporarea scazuta a Fe in inelul protoporfirinei (defect in formarea hemului) a. prin lipsa Fe in organism (carenta martiala) b. proasta aprovizionare cu Fe a eritroblastilor c. stocarea Fe in macrofagele medulara (anemia cronica simpla) d. blocarea Fe in peretele mitocondriilor (anemii sideroblastice) scaderea sintezei unor specii de globina a. e tulburarea centrala in talasemii

5. Reticulocite
Reticulocitele (VN = 0.5-2%) sunt eritrocite tinere care mai pastreaza in citoplasma ribozomi si ARNm, pe baza carora sintetizeaza in continuare hemoglobina. Asocierea reticulocitozei la anemie arata ca mecanismul anemiei e periferic (sangerare sau hemoliza). Reticulopenia arata cauza centrala a anemiei (defect medular). Reticulopenia este semnal pentru: 1. defect de productie se estimeaza prin raportul precursorilor granulocitari/eritroizi (raport G/E) normal 3/1 sau 4/1 frecvent e expresia unei insuficiente medulare: anemie aplastica si dislocarea tesutului hematopoetic: 1. celule neoplazice 2. fibroza 3. necroza unele dintre situatiile pomenite (infectiile, invaziile neoplazice) pot coexista cu un raspuns leucoeritroblastic al sangelui 2. ineficienta productiei de eritrocite 2.1. se poate asocia cu transformare megaloblastica (in carenta de vitamina B12 sau ac folic) 2.2. cu aspecte de diseritropoieza, cu multiple anomalii morfologice: multinuclearitate kariorhexis (fragmentare nucleara) polilobulare nucleara (eventual cu lobi uniti prin punti filamentoase)
4

 mitoze atipice, citoplasma cu vacuole sau cu punctatii bazofile sideroblasti inelari In caz de hiperreticulocitoza, se pune problema diagnosticului diferential intre hemoliza si alte procese de regenerare active (starea posthemoragie acuta sau refacerea anemiilor carentiale dupa administrarea tratamentului adecvat).

6. Indicele distributiei eritrocitare IDEr (RDW)

Indicele distributiei eritrocitare IDEr (RDW) e determinat de masinile electronice de efectuat hemograme. Se caracterizeaza prin 2 parametrii statistici: 1. Media aritmetica a volumelor globulare (pe 75.000 de celule) 2. Deviatia standard fata de aceasta medie permite cunoasterea numerica a etalarii distributiei eritrocitelor de o parte si de alta a axei curbei Un indice anormal traduce heterogenitatea volumelor eritrocitare (anizocitoza). Variatia IDEr se face numai in sensul cresterii. 1. crestere izolata fie in anemia carentiala la debut (feripriva, prin catalizatori), fie in sdr mielodisplazic la debut. 2. curba bimodala dublata de crestere IDEr in faza de reparatie a anemiilor carentiale (semnaleaza reticulocitoza) 3. Compararea IDEr si VEM deosebeste anemia feripriva de talasemie: 3.1. anemia feripriva (IDEr , VEM ) 3.2. talasemia heterozigota necomplicata (IDEr normal, VEM) 4. In carenta dubla (Fe + catalizatori) apare o despartire importanta intre VEM si IDEr .

7. Examenul maduvei osoase

Examenul MO este obligatoriu in: 1. reactia leucoeritroblastica (sugestie pentru invazie neo) 2. dispunerea eritrocitelor in rulouri (sugestie pentru gamapatie monoclonala) 3. reticulopenie cu pancitopenie (sugestie pentru aplazie, ineficienta de productie sau leucemie acuta aleucemica) 4. hipocromia impune analiza ferului medular (repartitia dintre sector de livrare si utilizare) si depistarea sideroblastilor inelari 5. prezenta unui numar mic de mieloblasti (pentru diagnosticul diferential dintre leucemia ac aleucemica si afeciune mielodisplazica)

8. Markeri de hemoliza
5

2.1. 2.2.

Hemoliza se identifica prin doua grupe de markeri: 1. Biochimici, semnaleaza hiperdistructia eritrocitelor 1.1. Hiperbilirubinemie (markerul degradarii protoporfirinei). Nu se coreleaza perfect cu intensitatea hemolizei, ficatul indemn avand o mare capacitate de conjugare a bilirubinei (titrul Bi la ficat sanatos nu depaseste 3 mg/dl) 1.2. Descarcarea crescuta de urobilinogen in urina 1.3. alti markeri: LDH (izoenzima 2) si consumarea haptoglobinei libere din plasma 2. Morfologici, semnaleaza hiperregenerarea compensator Hiperplazie eritroida medulara Hiperreticulocitoza Didactic sunt 2 tipuri de hemoliza: 1. extravasculara (intratisulara), mediata de ingerarea si digestia eritrocitelor de catre macrofagele tisulare (splenice sau hepatice cel Kupffer) 2. intravasculara, in care avem indicatori specifici: hemoglobinemia, semnalata de culoarea roz a plasmei din tubul de hematocrit, confirmata prin ex spectroscopic hemosiderinuria, excelent test de apreciere, mai ales in formele cronice. hemoglobinuria, colorarea rubinie a urinii, semnal de hemoliza intensa si recenta Din punct de vedere al mecanismului fundamental: 1. Anemii hemolitice corpusculare (defecte structurale ale eritrocitelor) 2. Anemii hemolitice extracorpusculare (agresivitatea mediului de viata al eritrocitelor): 2.1. in plasma (anticorpi, medicamente, agenti patogeni) 2.2. sistemul vascular (vasculite, proteze) 2.3. splenomegalii importante In anemiile hemolitice autoimune (AHAI) avem: 1. teste primare: Test Coombs Test de aglutinare la rece Test de autohemoliza Rezistenta osmotica Electroforeza Hgb 2. teste specifice: Determinarea enzimelor eritrocitare Determinarea structurii lanturilor de globina Testul hemolizinelor bifazice Test Ham (hemoglobinuria paroxistica nocturna)

9. Teste imunologice
6

In anemiile induse prin mecanisme imune, testele imunologice evidentiaza anticorpii (Atc) fixati pe eritrocite. Ca regula generala, Atc aglutinanti sunt Ig M, iar Atc neaglutinanti sunt Ig G! Atc aglutinanti sunt Atc care aglutineaza eritrocitele (Er) in ser fiziologic. Atc neaglutinanti pot fi detectati prin tehnici de aglutinare artificiala: o testul Coombs o tratare enzimatica a Er o adaugare de solutii macromoleculare. Testul Coombs are la baza antigenitatea moleculelor de Ig care fixate pe eritrocite prin fragmentul Fab, expun situsurile antigenice ale fragmentului lor Fc. Adaugarea de reactiv antiglobulina umana la eritrocitele acoperite cu Atc neaglutinanti permite declansarea aglutinarii eritrocitelor. Testul Coombs are doua versiuni: 1. testul Coombs direct (TCD). Ca principiu, TCD evidentiaza prezenta Ig si/sau fractiuni ale complementului (Er sensibilizate) fixate in vivo la suprafata Er (debarasate prin spalare de proteinele plasmatice) cu ajutorul reactivului antiglobulina umana care serveste de legatura intre Atc fixati specific, provocand aglutinarea Er. In fata unui TCD pozitiv cu reactive specific, se folosesc seruri monospecifice: anti-IgG, anti-IgA, anti-IgM, anti-C3, anti-C4. Trei tipuri de pozitivitate sunt observate : a. Ig G. Masurarea cantitativa a Ig G fixat la suprafata Er a aratat ca nu exista totdeauna o corelatie intre numarul moleculelor Ig G si severitatea hemolizei. b. Ig G + C3 c. C3. Auto Atc Ig M sunt detectati mai greu la suprafat Er prin TCD pentru ca sunt detasati mai usor prin spalare de pe Er. Dar Ig M fixeaza intotdeauna C3 la suprafata Er de aceea depistarea prin TCD este mai usor realizabila prin intermediul potentialului anti-C3 al antiglobulinei. Semnificatia diagnostica a TCD : Anemie hemolitica autoimuna cu anticorpi la cald (si medicamentoasa) unde TCD este tip Ig G si/sau C3d, C4 Anemia hemolitica autoimuna cu anticorpi la rece, unde TCD este tip C3d si/sau C4 Transfuzia de sange incompatibil unde TCD este tip Ig G si/sau C3d, C4 Sensibilizarea Er prin medicamente : penicilina (Ig G), rifampicina (C3) Boala hemolitica a nou-nascutului unde TCD este tip Ig G (rar, C3d, C4) Diferite alte boli 2. testul Coombs indirect In anemiile hemolitice, triajul incepe cu testul Coombs direct deoarece anemiile hemolitice autoimune (AHAI) sunt cele mai frecvente.
7

AHAI cu autoanticorpi active la cald care sunt Ig G, neactivatoare de complement, care raman pe antigenele Rh si la 37oC. pot fi evidentiate prin test Coombs direct cu ser monospecific antiIg G. 2. AHAI cu autoanticorpi active la rece sunt Ig M sau specii Ig G care la temperatura de 4oC se leaga de antigene eritrocitare specifice cu aviditate, impreuna cu complementul. La un anumit prag termic, anticorpii se desprind, ramane doar complementul care e depistat prin test Coombs direct cu ser anticomplement. Diagnosticul bolii cu aglutinine la rece : a. Demonstrarea aglutinarii (uneori aglutinarea eritrocitelor pe frotiul de sange) b. Test Coomb direct pozitiv cu ser anticomplement c. Test Coombs indirect pozitiv cu ser anti Ig M 3. AHAI cu anticorpi bifazici 4. Numai dupa eliminarea AHAI cu anticorpi la cald si la rece si a AHAI secundare poate fi formulat dgn de AHAI idiopatice. Un test Coombs direct anticomplement pozitiv, in absenta demonstrarii aglutinarii sau a hemolizei nu are semnificatie dgn pentru AHAI (traduce, cel mai probabil, o atasare pasiva de complexe imune circulante pe eritrocite)! In AH induse medicamentos, testul Coombs e pozitiv numai in prezenta medicamentului cauzal.
1.

10. Metabolismul fierului

Parametri ce apreciaza metabolismul fierului sunt: 1. concentratia fierului circulant sau sideremie (concentratia plasmatica a transferina este de 250 g/dl din care doar 100 g/dl fixeaza 100 g fier/dl = sideremie). Fierul seric este 1. crescut in: anemiile hemolitice hemocromatoza si 2. scazut in: anemiile feriprive, in eritropoeza regenerative, dupa hemoragii acute in faza de regenerare dupa vit B12, in anemia Biermer si in inflamatii acute si cronice. 2. capacitatea totala a transferinei de fixare a fierului este de 300 g/dl. Singura afectiune in care creste capacitatea totala de fixare a fierului este anemia feripriva, iar in conditii fiziologice in sarcina. In celelalte anemii hipocrome capacitatea totala e normala, moderat sau semnificativ redusa. 3. Saturatia transferinei este in mod normal doar de 30% (coeficient de saturatie). In anemia hipocroma saturatia transferinei este <16%.
8

Restul pana la 100% se numeste coeficient latent de saturatie (are valoarea de 200 g/dl) 5. Feritina serica (forma fiziologica de depozitare a fierului) este cam 69 g/l la barbat si 35 g/l la femeie si se coroleaza fidel cu situatia depozitelor de fier, fiind un indicator deosebit in diagnosticul anemiilor hipocrome, cand feritina serica e mult scazuta (<10g/l caracteristic pentru deficitul de Fe). Ea creste si in: in boli inflamatorii boala Gaucher (lipidoza) boala cronica de rinichi tumori maligne. Asocierea anemiei cu una din aceste boli face greu interpretabila concentratia feritinei serice. In asemenea cazuri scaderea feritinei serice < 60g/l e caracteristica pentru un deficit de fier concomitent. si in hepatita acuta. 6. Hemosiderina este insolubila in apa si se coloreaza usor cu albastru de Prusia (feritina se coloreaza mai greu fiind solubila). Se afla in macrofagele din splina, ficat si maduva. 6.1. In anemia hipocroma feripriva in MO e scazuta sau absenta hemosiderina criteriu de sensibil de apreciere a depozitelor de fier. Reducerea hemosiderinei apare si in LGC si in metaplazia mieloida cu mielofibroza fara ca in aceste boli sa existe boli sa existe o carenta de Fe. Aspectul general al MO e normo sau hiperplazic cu hiperplazie evidenta eritroblastica ce depaseste 30% din celulele medulare si cu predominanta formele imature. Eritroblastii sunt mici, bazofili, cu citoplasma franjurata (zdrentuita) aspect considerat caracteristic si denumit eritroblast feripriv. Numarul sideroblastilor mult diminuat. 6.2. In anemia sideroblastica (anemie hipocroma prin deficit in sinteza protoporfirinei, a. Sideroacrestice, a. Hipocrome hipersideremice). Sunt un grup de afectiuni caracterizat prin prezenta de sideroblasti inelari (depunere de Fe micelial in mitocondrii care fiind dispuse perinuclear, la coloratia cu albastru de Prusia apar ca un inel in jurul nucleului) pe MO, hipersideremie, saturatie crescuta a transferinei, microcitoza si hipocromie. Excesul de Fier e consecinta blocarii sintezei hemului la diferite nivele.
4.

11. Anamneza si examenul fizic

Anamneza si examenul fizic pot sugera etiopatogenia anumitor forme de anemii: 1. Glosita, esofagita, maldigestia sugereaza anemie carentiala Asociata cu friabilitate capilara si ungheala si koilonikie sugereaza carenta de Fier Asociata cu parestezii carenta de B12
9

2. 3. 4. 5.

Boala renala, modificarea culorii urinii cu subicter hemoliza Depapilarea linguala anemie carentiala Percutia oaselor superficiale leucemii acute Splenomegalie in Anemii hemolitice Boli limfoproliferative daca se asociaza cu poliadenopatie si hepatomegalie

12. Determinari cu caracter specific

1.

2.

3.

4.

Concentratia serica a vit B12 (VN = 200-900 pg/ml ) si a acidului folic(VN = 6-21g/ml). Valorile sub 100 pg/ml coincid cu transformarea megaloblastica a maduvei. In anemia megaloblastica prin deficit de vit B12 scade vit B12 in ser. In anemia megaloblastica prin deficit de acid folic scade folatul seric. In sferocitoza, rezistenta osmotica e pronuntat scazuta: hemoliza incepe la valori apropiate de ale serului fiziologic (0,8%) si se termina la aprox 0,4%. La evaluare cu ochiul liber hemoliza incepe, la normali, la o concentratie de NaCl de 0,45% si e totala la 0,35% In hemoglobinopatii exista tehnici simple ce pot fi executate in laboratorul clinic cu dotare tehnica obisnuita si anume : Testul de siclizare (diagnosticheaza siclemia) Determinarea Hg alcalinorezistente Coloratia pentru corpi Heinz si testul de stabilitate termica, in bolile cu hemoglobine instabile anemii hemolitice cu corpi Heinz. Electroforeza de Hb este testul de baza in diagnosticul hemoglobinopatiilor cu toate limitele ei (Hb anormale cu migrare asemanatoare Hb A, cazuri de si talasemie cu electroforeza normala). Tehnica de fingerprint si analiza de aminoacizi, care permit precizarea anomaliei structurale, se executa in laboratoare specializate. Electroforeza Hb e tehnica de baza in precizarea dgn de -talasemie, cand avem valori foarte crescute pentru Hb F (VN < 2%, dupa varsta de 1 an) obisnuit intre 20-90% din Hb.

Concluzie
Frecventa anemiilor in patologia hematologica impune cunoasterea acestor elemente de diagnostic care intr-o mare masura sunt la indemana laboratoarelor cu dotare obisnuita. Referatul furnizeaza indicii cu privire la investigatia ce trebuie efectuata asupra pacientului anemic pentru cresterea acuratetii diagnosticului etiopatogenetic si stabilirea unui tratament corespunzator.

10

Cuprins

Introducere 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
8.

Hemoglobina Indicii eritrocitari Morfologia eritrocitara Hipocromia Reticulocitele Indicele distributiei eritrocitare IDEr (RDW) Examenul maduvei osoase Markeri de hemoliza Teste imunologice Parametri ce apreciaza metabolismul fierului Anamneza si examenul fizic Determinari cu caracter specific

9.
10. 11.

12. Concluzie

11

Bibliografie
Tratat de medicina interna Hematologie, sub redactia prof. Radu Paun, partea I, coordonator : prof. Dan Colita, Editura medicala, Bucuresti, 1997 Hematologie clinica, Dr. Delia Mut Popescu, Editura Medicala, Bucuresti, 1994 Mariana Patiu The morphology of Human Blood Cells, Sabah Sallah and Ann Bell, by Abbott Laboratories, Sixth Edition, 2003 Atlas of Clinical Hematology, Springer, Helmut Lffler, Johann Rastetter, Torsten Haferlach, Fifth Edition, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 2005 Clinical Hematology Atlas, Jacqueline Carr Williams Hematology, McCraw-Hill Medical, Seventh Edition, 2007 Hematology in clinical practice, Robert S. Hillman, Kenneth A. Ault, Henry M. Rinder, Fourth Edition, McCraw-Hill,2005 Evidence-based Hematology, edited by Mark A. Crowther, A John Wiley and Sons, Ltd., Publication, First edition, 2008 Wintrobe's Atlas of Clinical Hematology, Tkachuk, Douglas C., Hirschmann Jan V., Lippincott Williams and Wilkins, 1st Ed, 2007

12