Avis de lAnses Saisine n 2012-SA-0092

LE DIRECTEUR GENERAL

Maisons-Alfort, le 31 mai 2012

AVIS
de lAgence nationale de scurit sanitaire de lalimentation, de lenvironnement et du travail
relatif une demande dappui scientifique et technique dans la perspective de la publication de l'article "A common pesticide decreases foraging success and survival in honey bees"
LAnses met en uvre une expertise scientifique indpendante et pluraliste. LAnses contribue principalement assurer la scurit sanitaire dans les domaines de lenvironnement, du travail et de lalimentation et valuer les risques sanitaires quils peuvent comporter. Elle contribue galement assurer dune part la protection de la sant et du bien-tre des animaux et de la sant des vgtaux et dautre part lvaluation des proprits nutritionnelles des aliments. Elle fournit aux autorits comptentes toutes les informations sur ces risques ainsi que lexpertise et lappui scientifique technique ncessaires llaboration des dispositions lgislatives et rglementaires et la mise en uvre des mesures de gestion du risque (article L.1313-1 du code de la sant publique). Ses avis sont rendus publics.

L'Anses a t saisie le 23 mars 2012 par la Direction gnrale de l'alimentation (DGAl) d'une demande d'appui scientifique et technique dans la perspective de la publication de l'article "A common pesticide decreases foraging success and survival in honey bees" dont les auteurs sont Mickal Henry, Maxime Beguin, Fabrice Requier, Orianne Rollin, JeanFranois Odoux, Pierrick Aupinel, Jean Aptel, Sylvie Tchamitchian, Axel Decourtye. Cet article, initialement publi le 29 mars 2012 dans Sciencexpress, est paru dans la revue Science 336 p.348-350 (20 avril 2012). Il est noter que lEFSA a de son ct t saisie le 3 avril 2012 par la Commission europenne dune demande dappui scientifique et technique relative deux articles publis dans la revue Science, dont larticle de Henry et al. mentionn ci-dessus. Une concertation avec changes de donnes a t dans ce cadre mise en place entre lAnses et lEFSA.
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1.

CONTEXTE ET OBJET DE LA SAISINE

L'article cit en rfrence tend dmontrer que l'exposition des abeilles des doses sub-ltales la substance active thiamthoxam, d'une part, cause un certain nombre de troubles du comportement des abeilles, et d'autre part, du fait d'un dfaut de retour la ruche, peut intervenir dans les mcanismes de fragilisation des colonies d'abeilles un niveau susceptible de placer la ruche dans une situation critique. Il est demand l'Anses d'indiquer si la dose administre dans l'exprimentation rapporte dans l'article correspond des situations reprsentatives en milieu naturel de l'exposition des abeilles et si ces travaux sont susceptibles de remettre en cause les conclusions des prcdentes valuations
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EFSA : Autorit europenne de scurit des aliments

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des risques conduites sur la substance active thiamthoxam ainsi que les diffrents produits en contenant.

2. ORGANISATION DE LEXPERTISE
Lexpertise a t ralise dans le respect de la norme NF X 50-110 "Qualit en expertise Prescriptions gnrales de comptence pour une expertise (Mai 2003)". Dans le cadre de cette saisine, la DGAL a demand au CETIOM de procder des prlvements de nectar dans des colzas en fleurs afin de doser d'une part, le taux de sucre dans ces nectars 3 4 issus de diffrentes varits de colza traites avec du CRUISER OSR , et les teneurs en thiamthoxam et clothianidine correspondantes. Le rsum de protocole et des rsultats obtenus sont prsents dans le prsent avis. L'Agence et deux experts du comit d'experts spcialis "produits phytosanitaires : substances et prparations chimiques" ont auditionn le 16 mai 2012 les auteurs de l'article cit en rfrence, le CETIOM qui a mis en uvre le protocole de prlvement de nectar dans les colzas, ainsi qu' la demande d'une association d'apiculteurs, deux experts en matire dapidologie et de technique apicole. A l'issue de ces auditions, et aprs consultation du comit d'experts spcialis "produits phytosanitaires : substances et prparations chimiques" runi le 30 mai 2012, lAgence nationale de scurit sanitaire de lalimentation, de lenvironnement et du travail met lavis suivant.
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3. CONCLUSIONS ET RECOMMANDATIONS DE LAGENCE

RESUME DU PROTOCOLE ET RESUME DES RESULTATS SELON LES AUTEURS Cette partie dcrit la mthodologie, les expriences et les rsultats tels que rapports par les auteurs dans les documents disponibles. Certains points ont t clarifis lors de laudition des auteurs le 16 mai 2012. Ltude a pour but de tester lhypothse selon laquelle lexposition une dose sub-ltale dune substance nonicotinode augmente indirectement le taux de mortalit des colonies en agissant sur le retour la ruche des abeilles butineuses. Les effets dune administration unique dune dose sub-ltale de thiamthoxam (1,34 ng/abeille) sur le retour la ruche ont t mesurs au moyen 5 dun transpondeur RFID (RadioFrequency Identification) coll sur le thorax de butineuses et de dtecteurs enregistreurs installs lentre des ruches. Limpact des effets observs sur la dynamique de la colonie a ensuite t valu sur la base dun modle de dynamique des 6 populations dabeilles dcrit dans la littrature . Chacun des groupes dabeilles traites, raison de 1,34 ng de thiamthoxam/abeille, est compar un groupe tmoin.
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Centre technique interprofessionnel des olagineux et du chanvre La prparation CRUISER OSR est un insecticide compos de 280 g/L de thiamthoxam (puret minimale 98 %) et un fongicide compos de 8 g/L de fludioxonil (puret minimale 95 %) et 32,3 g/L de mtalaxyl-M (puret minimale 91 %), se prsentant sous la forme dune suspension concentre pour traitement de semences (FS) Avis du 15 octobre 2010 de lAnses relatif une demande d'autorisation de mise sur le march de la prparation CRUISER OSR base de thiamthoxam, fludioxonil et mtalaxyl-M de la socit SYNGENTA AGRO SAS. Autorisation de mise sur le march n 2100180. mic3-TAG 64-bit RO, iID2000, 13.56 MHz system, 1.01.60.5mm; Micro-sensys GmbH, Erfurt, Germany S. Khoury, M. R. Myerscough, A. B. Barron, A quantitative model of honey bee colony population dynamics. PLoS ONE 6, e18491 (2011). doi:10.1371/journal.pone.0018491 Medline

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Exprimentations menes Quatre expriences, comprenant chacune un groupe trait et un groupe tmoin, ont t ralises, dans des conditions diffrentes en ce qui concerne le trajet de retour la ruche. Les expriences 1 et 3 ont impliqu des abeilles considres comme connaissant le trajet de retour la ruche et relches une distance de 1 km (exprience 1) ou 70 m (exprience 3) de leur colonie. Les expriences 2 et 4 ont port sur des butineuses considres comme ntant pas familires avec le trajet de retour la ruche, relches une distance de 1 km de leur colonie, partir dun environnement de grandes cultures (exprience 2) ou dun environnement priurbain (exprience 4). Les abeilles butineuses ont t captures le matin leur retour la ruche sur la planche denvol, puis transportes au laboratoire. Leur tat nutritionnel a t synchronis par la mise disposition ad libitum dun sirop candy pendant 60 minutes suivi dune priode de jene de 90 minutes. Chaque abeille a t ensuite alimente individuellement avec 20 L de sirop de sucrose (50% poids/poids) contenant ou non du thiamthoxam. Seules les abeilles consommant la totalit des 20 L ont t conserves pour lexprience. Chaque abeille a t quipe avec un transpondeur RFID et maintenue au laboratoire pendant 40 minutes supplmentaires, pour permettre une assimilation complte de la dose administre, avant dtre relche sur le site choisi. Le dispositif de lecture RFID positionn entre le corps de la ruche et sa planche denvol a permis de relever pour chaque abeille le temps du premier retour la ruche aprs le lcher. Les enregistrements ont t maintenus 5 7 jours aprs le lcher pour couvrir la totalit des retours. Dans toutes les expriences, les abeilles tmoins et intoxiques ont t relches simultanment chaque point et, pour une exprience donne, les lchers ont t effectus pendant deux ou trois jours conscutifs. Les donnes collectes ont t transfres un ordinateur et enregistres sous forme de fichiers (.txt). Dose de thiamthoxam administre La dose de thiamthoxam de 1 ng/abeille a t retenue car : 7 8 - elle est infrieure la DL50 par voie orale chez labeille pour cette substance active ; - il a t vrifi par les auteurs de larticle quelle ninduisait pas de mortalit ; - une exprience prliminaire avait permis de dterminer quelle avait un effet sur le taux et le temps de retour la ruche des abeilles traites, relches une distance de 1 km. Lanalyse effectue dans le sirop de glucose a montr que la dose relle administre est de 1,34 ng/abeille. Trajets de retour la ruche et choix des sites Les abeilles considres comme connaissant le trajet de retour la ruche (abeilles exprimentes , expriences 1 et 3) ont t slectionnes pour avoir t captures portant du pollen de phaclie, identifiable par sa couleur bleue caractristique, partir dune unique parcelle de cette culture situe dans la zone exprimentale. Elles ont t dans lexprience relches sur cette parcelle. Les abeilles nayant pas rapport de pollen de phaclie ont t relches sur lun des six sites slectionns pour lexprience et situs 1 km de la ruche, hors la parcelle de phaclie. Leur connaissance pralable du site do elles sont relches, et du trajet de retour la ruche, est alatoire (expriences 2 et 4). Ces abeilles sont donc considres comme inexprimentes en ce qui concerne le retour la ruche (mais pas en ce qui concerne le butinage quelles ont dj pratiqu la veille de lexprience). Les expriences ont t ralises dans deux zones : la zone agricole Zone Atelier Plaine et Val de Svre (dpartement des Deux-Svres) 2 dune superficie de 450 km qui fait lobjet dun suivi go-rfrenc du paysage, des pratiques agricoles, des populations dabeilles domestiques et de pollinisateurs, pour les expriences 1 3 ;
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DL50 (dose ltale) est une valeur statistique de la dose unique d'une substance/prparation dont ladministration orale provoque la mort de 50 % des animaux traits. Pour une exposition aigu orale chez labeille adulte, DL50 gale 0,005 g de thiamthoxam /abeille.

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la zone pri-urbaine de la station INRA Avignon (dpartement du Vaucluse), pour lexprience 4.

Traitement des donnes de retour la ruche Pour chaque exprience, le groupe dabeilles traites a t compar un groupe tmoin. La probabilit cumule de retour la ruche en fonction du temps (calcule sur les temps de premier retour la ruche aprs le lcher des abeilles) est prsente dans larticle sous forme de courbe, laxe des abscisses reprsentant le temps aprs le lcher, de 0 3000 minutes, et laxe des ordonnes la probabilit cumule de retour, de 0 1. Lanalyse statistique ralise a port sur une comparaison entre le groupe trait et le groupe tmoin, par un test binomial exact, des probabilits cumules obtenues dune part 4 heures aprs le lcher, et dautre part la fin de lexprience. Lorsque la diffrence tait statistiquement significative (P<0,05), la mortalit conscutive un chec de retour la ruche, mhf (hf : homing failure), a t calcule selon la formule : mhf = [probabilit de retour des abeilles tmoins probabilit de retour des abeilles traites] probabilit de retour des abeilles tmoins mhf est donc une estimation de la proportion de butineuses qui ne reviennent pas la ruche en raison du traitement, lexclusion dautres sources explicatives du non-retour la ruche telles que la mortalit naturelle, la prdation, le stress li la manipulation. Les valeurs de mhf obtenues dans lexprience 1 (abeilles exprimentes ) et dans lexprience 2 (abeilles inexprimentes ) sont considres comme reprsentant des limites minimale et maximale, respectivement, de la proportion de butineuses traites ne revenant pas la ruche. Modle de dynamique des populations Des simulations de dynamique des populations ont t ralises en introduisant dans un modle 9 dcrit dans la littrature les valeurs mesures de mhf (limites minimale et maximale), afin de dcrire les situations de meilleur et pire cas pour la dynamique de la population. La situation des trois premiers mois dune colonie aprs la sortie dhivernage a t prise en compte, de faon englober la priode de floraison du colza, avec les paramtres suivants : taux de ponte journalier de la reine (2000, 1800 ou 1600 ufs/jour), proportion dabeilles butineuses exposes chaque jour (50 ou 90%), taille de la colonie au dbut de lexposition (15000 ou 18000 abeilles), proportion de butineuses : 25% de la population totale, mortalit naturelle des butineuses : 0,154 individus/jour bas sur une esprance de vie moyenne de 6,5 jours, soit un taux de mortalit de 15,4%, les autres paramtres tant ceux dfinis dans le modle dorigine. Les simulations ont t effectues avec les hypothses suivantes : pour les butineuses non exposes, un taux de mortalit constant, pour les butineuses exposes, une dure dexposition de 30 jours, avec une augmentation du taux de mortalit par la proportion de non-retour la ruche mhf (taux de mortalit naturelle + mhf) chaque jour. Rsultats Sur les courbes de probabilit cumule de retour la ruche en fonction du temps, le groupe trait apparat dans chacune des 4 expriences prsenter un taux de retour la ruche infrieur celui de son groupe tmoin. La comparaison des probabilits cumules obtenues dune part 4 heures aprs le lcher, et dautre part la fin de lexprience donne les rsultats suivants :
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S. Khoury, M. R. Myerscough, A. B. Barron, A quantitative model of honey bee colony population dynamics. PLoS ONE 6, e18491 (2011). doi:10.1371/journal.pone.0018491 Medline

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Tableau 1
Exprience 1 :
Butineuses exprimentes relches 1km de la ruche zone de grande culture-

Exprience 2 :
Butineuses inexprimentes relches 1km de la ruche zone de grande culture-

Exprience 3 :
Butineuses exprimentes relches 70m de la ruche zone de grande culture-

Exprience 4 :
Butineuses inexprimentes relches 1km de la ruche zone priurbaine-

(traites-tmoins)
Nombre de butineuses relches Probabilit de retour la ruche 4 heures aprs lcher (Test binomial exact pour le pourcentage de retour) Probabilit de retour la ruche la fin de lexprience (Test binomial exact pour le pourcentage de retour) Mortalit due au non retour la ruche en raison du traitement (mhf)

(traites-tmoins) 118-118 33,9%-57,6% (P<0,001) 56,8%-83,1% (P<0,001)

(traites-tmoins) 67-68 67,2%-82,4% (P=0,002) 92,5%-98,5% (P=0,003)

(traites-tmoins) 82-54 68,3%-81,5% (P=0,003) 76,8%-85,2% (P=0,029)

72-74 68,1%-81,1% (P=0,005) 76,4%-85,1% (P=0,036)

0,102

0,316

0,061

0,098

La diffrence entre les pourcentages dabeilles retournes la ruche est significativement diffrente entre le groupe trait et le groupe tmoin, dans toutes les expriences, 4 heures aprs le lcher des butineuses et la fin de lexprience. Six scnarios dmographiques ont t simuls avec le modle de dynamique des populations en intgrant la mortalit due au non retour la ruche li lexposition des abeilles au thiamthoxam, avec les valeurs mesures de mhf de 0,102 et 0,316, issues des expriences 1 et 2. Des graphiques reprsentant en abscisse le temps (de 0 90 jours) et en ordonne la taille totale de la population montrent les volutions associes, pour les groupes tmoins et traits, de la population dabeilles selon les diffrents paramtres dentre indiqus ci-dessus. Les simulations A et D sont ralises avec un taux de ponte journalier de 2000 ufs (dveloppement normal), les simulations B et E avec un taux de ponte journalier de 1800 ufs (dveloppement lquilibre) et les simulations C et F avec un taux de ponte journalier de 1600 ufs (dveloppement dficitaire). La phase dexposition au thiamthoxam est de 30 jours. Les scnarios A, B et C sont dclins lorsque 90% des butineuses sont exposes et les scnarios D, E et F lorsque 50% des butineuses sont exposes, tous les jours de la phase dexposition. Dans tous les cas, la taille des colonies exposes dcroit pendant la phase dexposition, puis augmente aprs lexposition sans toutefois atteindre la taille des colonies non exposes au bout de 3 mois. Dans les simulations pire-cas (A, B et C, 90% de butineuses exposes, mhf maximal), les colonies initialement de 15000 abeilles pourraient dcliner jusqu et en dessous de 5000 abeilles aprs un mois dexposition. En cas dexposition plus prolonge (pendant 90 jours et non 30), les tracs montrent une dcroissance continue jusquau dclin de la colonie. Les auteurs concluent que cette tude dmontre clairement quune exposition des butineuses des doses de thiamthoxam non ltales mais communment rencontres peut impacter la survie des butineuses, avec contribution potentielle au risque deffondrement de la colonie. Les consquences de lexposition sur la survie des butineuses semblent dpendre de lenvironnement paysager et de la connaissance pralable de cet environnement par les abeilles. Les risques les plus levs sont observs lorsque le retour la ruche prsente davantage de difficults. En consquence, les tudes dimpact qui sont conduites sur des colonies dabeilles places

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proximit immdiate des cultures traites sous-estiment probablement les effets sub-ltaux des pesticides en ne permettant pas de mettre en vidence dventuels effets sur le vol de retour.

COMMENTAIRES GENERAUX SUR LARTICLE Ltude exprimentale dcrite prsente une approche originale de ltude comportementale des abeilles butineuses exposes une substance phytopharmaceutique. La technique de RFID permet de suivre individuellement le retour la ruche des abeilles. La dose de thiamthoxam administre est connue avec prcision. Le protocole mis en uvre utilise une mthode lgante pour prendre en compte plusieurs niveaux de difficults dans le vol de retour la ruche des butineuses. Les rsultats mettent en vidence de faon claire un effet du thiamthoxam, la dose administre, sur le retour la ruche. Sur le plan mthodologique, quelques lments seraient toutefois claircir. Composition des groupes de butineuses inexprimentes Les abeilles considres comme connaissant le trajet de retour la ruche (abeilles exprimentes ) ont t slectionnes pour avoir rapport avant lexprience du pollen de phaclie, partir dune unique parcelle de cette culture do elles seront ensuite relches. Les abeilles nayant pas rapport de pollen de phaclie (abeilles inexprimentes ) sont relches sur lun des six sites slectionns pour lexprience et situs 1 km de la ruche, hors la parcelle de phaclie. Leur connaissance pralable du site do elles sont relches, et du trajet de retour la ruche, est alatoire. Dans ces expriences 2 et 4, la proportion de butineuses connaissant dj le trajet de retour nest donc pas connue. Il est possible de considrer que cette proportion est la mme dans les groupes tmoins et traits. Nanmoins, aucune donne disponible ne peut confirmer cette hypothse. Il est noter quune proportion sensiblement diffrente dabeilles connaissant le trajet de retour entre les groupes tmoins et traits constituerait un biais, conduisant surestimer ou sousestimer les effets, limitant ainsi linterprtation des rsultats de ces expriences. Analyse statistique Lanalyse statistique ralise a port sur une comparaison entre le groupe trait et le groupe tmoin, par un test binomial exact, des probabilits cumules obtenues 4 heures aprs le lcher, ou la fin de lexprience. Le test binomial exact est un test qui permet de comparer un pourcentage observ un pourcentage thorique. Les comparaisons effectues dans larticle sont dune autre nature, puisque les deux pourcentages compars sont issus dobservations de terrain, dans le groupe trait dune part et dans le groupe tmoin de lautre. Un test adquat pour comparer 2 pourcentages observs est le test exact de Fisher. Compte tenu des effectifs relativement levs des diffrents groupes dabeilles mis en jeu, un test du Chi2 serait galement adapt. Il convient de signaler que la mise en uvre du test exact de Fischer pour comparer les probabilits cumules obtenues 4 heures aprs le lcher ou la fin de lexprience dans les groupes traits et tmoins conduit, partir des donnes prsentes dans larticle, des valeurs de P diffrentes de celles du tableau 1 :

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Tableau 2
Exprience 1 :
Butineuses exprimentes relches 1km de la ruche zone de grande culture-

Exprience 2 :
Butineuses inexprimentes relches 1km de la ruche zone de grande culture-

Exprience 3 :
Butineuses exprimentes relches 70m de la ruche zone de grande culture-

Exprience 4 :
Butineuses inexprimentes relches 1km de la ruche zone priurbaine-

(traites-tmoins)
Nombre de butineuses relches Probabilit de retour la ruche 4 heures aprs lcher

(traites-tmoins) 118-118

(traites-tmoins) 67-68

(traites-tmoins) 82-54

72-74

68,1%-81,1%

33,9%-57,6%

67,2%-82,4%

68,3%-81,5%

(Test exact de Fisher (P=0.0874) (P<0,001) pour le pourcentage de retour) Probabilit de retour la ruche la 76,4%-85,1% 56,8%-83,1% fin de lexprience (Test exact de Fisher (P<0,001) (P=0,210) pour le pourcentage de retour) Mortalit due au non retour la ruche en 0,102 0,316 raison du traitement (mhf) Les valeurs de P sont celles obtenues pour un test bilatral.

(P=0.0489)

(P=0.1126)

92,5%-98,5%

76,8%-85,2%

(P=0,115)

(P=0,276)

0,061

0,098

Selon les rsultats de ces tests, seules les 3 comparaisons qui conduisent une valeur de P en caractres gras dans le tableau ci-dessus sont considres comme montrant une diffrence significative entre le groupe tmoin et le groupe trait. Modle de dynamique des populations Des simulations de dynamique des populations ont t ralises en introduisant dans un modle mathmatique les valeurs mesures de mhf afin dvaluer limpact sur la colonie de la mortalit due au non retour la ruche des abeilles exposes. Le modle utilis a t dcrit dans une publication de Khoury et al. (2011). Il sagit dun modle thorique trs simple, selon ses auteurs, dvelopp uniquement pour prdire limpact dune perte de butineuses sur le recrutement dautres ouvrires de la ruche pour le butinage. En effet, en cas de perte de butineuses, le dveloppement de jeunes abeilles est acclr afin quelles commencent prmaturment le butinage pour compenser cette perte. Or, il a t montr que ces jeunes abeilles recrutes prcocement pour le butinage sont moins efficaces et ont une esprance de vie rduite (jusqu' 2,8 jours contre 6,5 jours en moyenne pour une butineuse normale). Le modle de Khoury et al. est conu pour mettre en vidence les effets lis ce phnomne et ignore volontairement tous les autres mcanismes qui rendent la dynamique de la population de la ruche beaucoup plus complexe. Cette simplification se retrouve galement au niveau du phnomne modlis. Ainsi, le modle considre un taux de ponte de la reine constant dans le temps alors qu'il varie selon les saisons, la disponibilit des ressources, etc Le couvain n'a pas

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d'existence relle. Le cannibalisme des larves n'est pas pris en compte alors qu'il reprsente un phnomne de rgulation important de la population d'abeilles. Ce modle thorique trs simple ne peut donc pas tre utilis pour simuler in situ la dynamique d'une population d'abeilles.

REPRESENTATIVITE DE LA DOSE ADMINISTREE EN REGARD DE LEXPOSITION EN CONDITIONS DE TERRAIN Caractre sub-ltal de la dose de thiamthoxam administre La dose administre individuellement par voie orale chaque abeille butineuse tait de 1,34 ng/abeille en une prise unique dans 20 L de sirop de sucrose (50% poids/poids). Le caractre non ltal de la dose administre ponctuellement dans lexprience de Henry et al. (2012) a t vrifi au laboratoire. Ceci est conforme aux donnes du dossier de la substance active, tuant 50% des abeilles en 48 h aprs ingestion orale (DL50 aigu) 1,34 ng/abeille est galement infrieure la dose sans effet sur administration aigu mais suprieure la dose journalire sans pendant 10 jours de 0,2 ng/abeille/jour. qui montrent que la dose ltale est de 5 ng/abeille. La dose de la mortalit de 2 ng/abeille en effet aprs exposition rpte

Dans une tude soumise dans le dossier de la substance active, dans laquelle les abeilles butineuses ont t relches 500 m de leur colonie, les abeilles nourries avec un nourrisseur contenant 10 g thiamthoxam/L (correspondant une exposition moyenne de 1,1 ng/abeille) sont toutes rentres la ruche dans les 24 heures suivantes, alors que des absences sont releves chez les abeilles nourries avec 25 g thiamthoxam/L (correspondant une exposition moyenne de 3,0 ng/abeille). Il convient de noter que lexposition la substance active a eu lieu dans le cadre dune consommation journalire et non en une prise unique comme dans lexprience rapporte par Henry et al. (2012), qui met par ailleurs en uvre une mthodologie de mesure plus prcise. Principe du calcul de lexposition des abeilles butineuses Les abeilles butineuses consomment du nectar et sont donc exposes aux rsidus de substances actives quil contient. La quantit de nectar consomm pour satisfaire les besoins nergtiques, eux-mmes lis la dure du vol de labeille, dpend du taux en sucre de celui-ci. Elle est dautant plus leve que le taux de sucre est faible. Larticle de Rortais et al. (2005) indique une consommation de sucre par une abeille butineuse de 32 128,4 mg de sucre par jour, pour des dures de vol allant de 4 10,7 heures. Dans lvaluation des risques ralise par lAnses dans le cadre de la demande dAMM du CRUISER OSR, prparation phytopharmaceutique contenant du thiamthoxam et destine au traitement des cultures de colza, lexposition maximale des abeilles a t prise en compte, pour reprsenter une situation de pire cas , et une consommation de 128,4 mg de sucre/jour a t intgre au calcul. Si X est le taux de sucre (%) et Y la concentration en rsidus du nectar (g/kg), lexposition thorique correspondant la situation de consommation pire cas est ainsi obtenue par la formule : Dose dexposition (ng/abeille/jour) = 128,4 x Y x 0,1/ X Calcul effectu par les auteurs Les auteurs justifient la dose de 1,34 ng/abeille comme reprsentative des scnarii dexposition des butineuses de nectar dun colza dhiver trait par la prparation CRUISER OSR. Le niveau de rsidus de substance active dans le nectar qui a t retenu est la moyenne des concentrations mesures dans les nectars collects dans le jabot de butineuses exposes sous

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tunnel en priode de floraison du colza dhiver trait (1,85 g/kg), telle que rapporte dans lavis de lAnses. Les taux de sucre des nectars de colza utiliss par les auteurs proviennent des travaux de lINRA 10 de Rennes publis en 1999 et qui rapportent des taux variables entre 10,6 et 30,2% pour la varit de colza Samourais et de 8,3 66,6% pour dautres varits. Les doses dexposition en situation de consommation de sucre pire cas sont alors de 1,19 ng/abeille/jour pour un nectar 20% de sucre et de 2,38 ng/abeille/jour pour un nectar 10% de sucre. Pour une abeille ne volant que 4 heures par jour, et consommant seulement 48 mg de sucre, la dose dexposition thorique est de 0,89 ng/abeille/jour. Elle est de 0,20 ng/abeille/jour pour une consommation de 32 mg de sucre. Calcul effectu par lAnses (avis du 15 octobre 2010 relatif la prparation CRUISER OSR) En considrant une consommation de 128,4 mg de sucre/jour, une concentration en rsidus de substance active de 1,85 g/kg et un taux de sucre dans le nectar de 40%, la dose dexposition en situation de consommation pire cas est de 0,59 ng/abeille/jour. Ce taux de sucre initialement extrapol partir du taux de sucre dun nectar de tournesol dcrit dans la publication de Rortais et al. (2005) est galement cit pour le nectar de colza dans un 11 ouvrage classique dapidologie (Vaissire et al., 2002) : Scrtion de nectar : 0,2 2 mg/fleur/jour avec 40 60% de sucres . Discussion sur le taux de sucre dans le nectar de colza Le taux de sucre dans les nectars de colza est ainsi un paramtre trs important du calcul de lexposition. En effet, plus le taux de sucre est bas, plus la quantit de nectar consomme par les butineuses pour satisfaire leurs besoins nergtiques est importante, et donc concentrations en rsidus gales, plus les butineuses sont thoriquement exposes. Les taux de sucre pris en compte par les auteurs dans leur calcul sont issus de la publication de Pierre et al. (1999). Celle-ci dcrit la variabilit quantitative et qualitative de la scrtion de nectar du colza dhiver parmi 71 gnotypes. Les travaux avaient pour objectif dexaminer la possibilit de slectionner des gnotypes, incluant des lignes mles striles, qui scrtent une quantit suffisante de nectar pour attirer les abeilles afin dassurer la pollinisation des lignes mles striles pour amliorer la production de semences hybrides. Les taux de sucre repris dans les calculs sont ceux mesurs pour une ligne mle fertile Samourais . La ligne mle fertile Samourais est la rfrence du groupe 1 regroupant les 64 lignes mles fertiles conventionnelles. Les taux de sucre sont trs diffrents pour les lignes mles striles et fertiles F1 Fu 27-Hokkaido/Bienvenu du groupe 3 pour lesquels ils peuvent atteindre 66,6% lune des dates de collecte. Une varit Darmor prsente des taux extrmement bas (8,2%). Lattractivit des nectars de colza pour les abeilles dans ces conditions est discutable. Ces donnes indiquent que les taux de sucre, ainsi que les quantits de nectar, sont lis aux varits de colza, au stade de la floraison et aux conditions climatiques. Analyses ralises en 2012 sur du colza trait avec du thiamthoxam Les varits de colza dhiver cultives voluent constamment et rapidement. Des prlvements de nectars floraux de colza dhiver ont t raliss les 2 et 11 mai 2012 par le CETIOM, laide de micropipettes, sur 5 parcelles de colza trait avec du CRUISER OSR afin de raliser des analyses des taux de sucre et des rsidus de substances actives (thiamthoxam et
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Pierre J., Mesquida J., Marilleau R., Pham Delgue M.H., Renard M. (1999). Nectar secretion in winter oilseed rape, Brassica napus quantitative and qualitative variability among 60 genotypes. Plant Breeding 118:360 365. Vaissire et al., 2006, Chapitre IV : Pollinisation, apiculture et environnement, dans Le trait Rustica de lapiculture, Rustica Editions.

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son mtabolite, la clothianidine). Les 5 varits de colza sur lesquelles du nectar a t collect (DK EXSTORM, ADRIANA T PAMELA, DK EXQUISITE et EXOCET) reprsentent 30% des surfaces cultives en 2011-2012 en colza dhiver. Les prlvements du 2 mai correspondent au stade pleine floraison et les prlvements du 11 mai correspondent au stade dbut de fin de floraison . Les mesures de taux de sucre ont t ralises au moyen dun rfractomtre portatif lectronique juste aprs prlvement sur le terrain. Les chantillons ont t envoys au laboratoire de lAnses (Sophia-Antipolis) pour les analyses de 12 13 rsidus, ralises par une mthode LC-MS/MS (LQ = 0,3 ng/mL, LD = 0,1 ng/mL). Les rsultats disponibles, ainsi quun calcul thorique de dose dexposition en situation de consommation de sucre pire cas , sont prsents dans le tableau ci-dessous.

Tableau 3
Varit Date Taux de sucre moyen (%) Concentration thiamthoxam (ng/mL) Concentration clothianidine (ng/mL) Volume de nectar pour 128,4 mg de sucre (mL) 0,39 0,45 0,39 0,37 0,50 0,22 0,25 0,19 0,25 0,21 Dose dexposition (ng/abeille)

DK EXSTORM ADRIANA T PAMELA DK EXQUISITE EXOCET DK EXSTORM ADRIANA T PAMELA DK EXQUISITE EXOCET

02/05/2012 02/05/2012 02/05/2012 02/05/2012 02/05/2012 11/05/2012 11/05/2012 11/05/2012 11/05/2012 11/05/2012

32,6 28,7 33,3 34,7 25,8 59,5 51,0 66,6 50,5 61,4

0,4 0,4 0,7 0,4 0,4 0,7 0,8 1,6 1,3 0,5

<LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD

0,16 0,18 0,27 0,15 0,20 0,15 0,20 0,31 0,33 0,10

Par ailleurs, des chantillons de nectar collects le 07/05/2012 sur du colza non trait titre de contrle ngatif ont prsent des taux de sucre compris entre 13,7 et 21,2%. Les valeurs dexposition moyenne et maximale sont respectivement de 0,21 et 0,33 ng/abeille et par jour. Si la concentration de clothianidine, infrieure la limite de dtection dans tous les chantillons, est considre comme gale 0,1 ng, les valeurs dexposition moyenne et maximale sont respectivement de 0,24 et 0,36 ng/abeille et par jour. Ces valeurs calcules partir des analyses ralises en 2012 reprsentent une exposition journalire, en situation de consommation de sucre pire cas , qui est infrieure lexposition thorique des butineuses nectar estime 0,59 ng/abeille/jour par lAnses et la dose de 1,34 ng/abeille administre en une prise unique dans lexprience de Henry et al. (2012). Conclusion sur la dose administre Les calculs thoriques effectus par les auteurs de larticle reposent sur une consommation leve de sucre, de faibles taux de sucre dans le nectar et une concentration de rsidus de thiamthoxam dans le nectar obtenue dans une situation dexposition maximale des abeilles sous tunnel.
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LQ : limite de quantification. LD : limite de dtection.

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Compte tenu de la variabilit observe dans les taux de sucre du nectar de colza, une telle situation sur le terrain ne peut tre exclue. Les analyses rcentes confirment toutefois que le nectar de colza peut contenir, notamment dans conditions climatiques dans lesquelles les abeilles ont une activit intense de butinage, des taux de sucre trs levs. La dose dexposition calcule, en situation de consommation de sucre pire cas , partir du taux de sucre et du niveau de rsidus est, dans tous les chantillons, infrieure la dose administre dans ltude. Linterprtation des auteurs selon laquelle la dose de thiamthoxam de 1,34 ng/abeille serait communment rencontre sur le terrain est donc considre comme non vrifie par les observations disponibles. Des exprimentations dans des conditions permettant lexposition des butineuses directement aux rsidus prsents dans la culture seraient toutefois ncessaires pour prciser les effets sur le retour la ruche en situation de terrain. LEFSA, saisie sur la mme question, conclut, sur la base des donnes collectes auprs de lensemble des Etats membres, que la concentration en thiamthoxam du sirop administr aux abeilles dans ltude de Henry et al. (2012) est environ 10 fois suprieure la concentration maximale observe dans un chantillon de nectar et que, bien que lexposition calcule des abeilles puisse thoriquement dpasser la dose administre dans cette tude, elle ne peut intervenir sur le terrain que progressivement au cours dune journe de butinage.

REPRESENTATIVITE DES CONDITIONS EXPERIMENTALES AU REGARD DE LA REALITE DU TERRAIN Le retour la ruche est mesur sur les abeilles butineuses quipes de la puce lectronique RFID et rentrant leur ruche aprs avoir t relches sur un site situ 1km de celle-ci, sans quelles aient effectu immdiatement auparavant le trajet de la ruche ce site. Le dispositif exprimental met en jeu des abeilles butineuses considres comme connaissant dj ou non le trajet de retour la ruche. Les abeilles considres comme connaissant le trajet de retour la ruche (expriences 1 et 3) sont slectionnes pour avoir prcdemment rapport du pollen de phaclie, identifiable par sa couleur bleue caractristique, partir dune unique parcelle de cette culture situe dans la zone exprimentale. Elles sont relches sur cette parcelle. Les abeilles nayant pas rapport de pollen de phaclie sont relches sur lun des six sites slectionns pour lexprience et situs 1 km de la ruche, hors la parcelle de phaclie. Leur connaissance pralable du site do elles sont relches, et du trajet de retour la ruche, est alatoire (expriences 2 et 4). Dans lexprience 2, les abeilles sont relches dans un environnement de grandes cultures, comportant peu de repres visuels. Dans lexprience 4, les abeilles sont relches dans un environnement pri-urbain dans lequel les points de repre sont a priori plus nombreux. La reprsentativit de ces conditions au regard de la ralit mrite dtre discute. En effet, dans une situation habituelle, les butineuses retournent la ruche aprs lavoir quitte, mme aprs une transhumance. La comparaison des courbes tmoins de retour la ruche des expriences 1 et 2 montre que les abeilles relches sur un site partir duquel leur connaissance du trajet de retour la ruche est alatoire subissent un stress important, une partie des abeilles ne regagnant sa colonie que le lendemain. Les essais au champ soumis avec la demande dAMM de la prparation phytopharmaceutique CRUISER OSR prsentent galement des limites, mais diffrentes. En effet, afin dobtenir une exposition maximale des abeilles aux rsidus de substance active, les essais en champ sont

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raliss en plaant les ruches le plus prs possible des cultures traites. Mme si cette situation peut se rencontrer sur le terrain, dans le cas de ruchers installs devant une aire butiner, les abeilles nayant pas une distance suffisamment longue parcourir pour rentrer la ruche aprs butinage, un effet de lexposition la substance active sur leurs capacits motrices ou sensorielles ou sur leur systme dorientation pourrait ne pas tre mis en vidence dans ces essais. En ce sens, des protocoles dessais au champ intgrant un certain loignement des ruches tout en assurant une exposition raliste des abeilles la substance teste permettraient dtudier une situation dans laquelle les systmes locomoteur, sensoriels et dorientation des butineuses sont davantage sollicits.

CONSEQUENCES POUR LES EVALUATIONS DE RISQUES DEJA REALISEES Ltude exprimentale dcrite dans larticle de Henry et al. (2012) prsente une approche originale de ltude comportementale des abeilles butineuses exposes une substance phytopharmaceutique. Le protocole et la technique de RFID permettent de suivre individuellement le retour la ruche des abeilles et dapprhender ainsi les effets potentiels de molcules pouvant agir sur leurs systmes locomoteur, sensoriel ou dorientation. Toutefois, la conclusion de larticle relative aux effets potentiels long terme sur la colonie repose sur lutilisation dune modlisation. Aucune tude exprimentale permettant de coupler les effets observs au niveau individuel sur le retour la ruche des abeilles et les effets rels sur les colonies nest actuellement disponible. Or, les conclusions de lvaluation des risques pralable la mise sur le march des prparations phytopharmaceutiques sont fondes sur une srie dessais permettant de raliser une valuation en plusieurs tapes. Ltape ultime repose sur des essais raliss sous tunnel et au champ. Dans ces essais, des colonies dabeilles sont exposes des cultures traites. Les effets de lexposition des abeilles lie aux activits de butinage, et par consquent la consommation de pollen et/ou nectar potentiellement contamin avec la substance active et/ou son mtabolite, sont directement observs sur les colonies. Ces essais permettent de suivre le dveloppement et la survie des colonies. Les butineuses sont principalement exposes aux rsidus de pesticides par la consommation de nectar. En France, le thiamthoxam est autoris en traitement de semences pour les cultures de mas (CRUISER 350), de betterave (CRUISER 600 FS), de pois (CRUISER FS) et de crucifres olagineuses (CRUISER OSR). Seules les crucifres olagineuses (colza) sont des cultures nectarifres dont les fleurs sont accessibles aux abeilles pour le butinage. Pour les autres cultures (mas, betterave, pois), lexposition des abeilles des rsidus prsents dans un nectar nest attendue que dans les ventuelles plantes nectarifres des cultures suivantes, dans lesquelles le niveau de rsidus est faible. Une prparation (ACTARA) est autorise en pulvrisation arienne pour diverses cultures, mais uniquement en dehors des priodes de floraison, de production dexsudats et de la prsence des abeilles. Quelques usages en serre, sur plantes dintrieur ou en btonnets dengrais sont galement disponibles. Cest pourquoi les effets rapports sont mettre en relation avec les donnes values dans le cadre de lvaluation des risques mene pour la demande dAMM de la prparation CRUISER OSR, destine au traitement de semences dune culture nectarifre et particulirement attractive pour les abeilles, le colza. En appui la demande de mise sur le march de la prparation CRUISER OSR, le ptitionnaire a soumis plusieurs tudes sous tunnel et au champ sur des cultures de colza issues de semences traites. Ces essais, dont certains raliss avec un suivi pluriannuel de ruches exposes, nont indiqu aucun effet significatif dune exposition ces cultures sur la survie, lactivit de butinage, le dveloppement de la population, le dveloppement larvaire et le comportement des abeilles. Cependant, comme indiqu plus haut, ils peuvent tre considrs comme prsentant des limites en ce qui concerne leur sensibilit pour dtecter des effets tels quune dfaillance du systme dorientation.

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Lvaluation des risques pour les abeilles mene dans le cadre rglementaire pour les prparations phytopharmaceutique est fonde sur le devenir de la colonie. Les rsultats obtenus avec la mthodologie mise en uvre dans larticle de Henry et al. (2012), pour innovante quelle soit, ne peuvent actuellement de faon fiable tre interprts en termes deffets sur le devenir des colonies, dans des conditions relles dexposition correspondant aux pratiques apicoles et agricoles, du fait de linadaptation du modle utilis pour prvoir leffet sur la dynamique des populations. Ces travaux mriteraient donc dtre poursuivis afin de vrifier si des effets sur le retour la ruche tels que ceux observs ont un impact moyen ou long terme sur le dveloppement et la survie de la colonie. Dautre part, les effets du thiamthoxam rapports dans larticle pourraient tre considrs comme explicatifs de phnomnes associs une exposition et observs sur le terrain. Environ 790 000 ha de colza dhiver trait avec la prparation CRUISER OSR ont t cultivs en France en 2011-2012. Cette premire anne dutilisation du produit nest pas en ltat des connaissances disponibles associe des accidents affectant les abeilles et attribus une exposition aux rsidus de thiamthoxam prsents dans les fleurs de colza. Cependant, compte tenu des conditions climatiques particulires du printemps 2012, les abeilles ont, selon les professionnels de lapiculture, peu visit cette culture en fleurs. Aucune conclusion, sur laquelle les rsultats de Henry et al. (2012) aurait pu apporter un clairage, nest donc tirer de cette campagne de terrain. Dans ltat actuel des connaissances, les rsultats prsents dans larticle de Henry et al. 2012 ne sont pas considrs comme remettant en cause les conclusions de lvaluation des risques menes dans le cadre du dossier de demande dautorisation de mise sur le march de la prparation CRUISER OSR selon les critres rglementaires actuels, mais mettent en vidence certaines limites des mthodologies mises en uvre dans ce cadre en ce qui concerne leur sensibilit. Les proprits de toxicit pour les abeilles prises en compte pour l'approbation du 14 thiamthoxam au titre du rglement (CE) n 1107/2009 et rappeles en page 8 de cet avis ne sont pas modifies par les rsultats de cette tude. Les butineuses peuvent galement thoriquement absorber des rsidus prsents dans le liquide de guttation. La guttation correspond la formation de petites gouttelettes liquides limpides que 15 lon peut observer, notamment, l'extrmit apicale de la feuille de mas . Selon des rsultats 16 diffuss en 2009 , le fluide de guttation pourrait contenir des rsidus de substances actives phytopharmaceutiques et constituer une voie dexposition pour les abeilles. Lexposition des butineuses une dose sub-ltale pourrait ainsi affecter les abeilles installes proximit de parcelles de mas trait avec la prparation CRUISER 350. Cependant, des essais ont montr que le liquide de guttation des feuilles de mas nest pas une source dabreuvement attractive et utilise par les abeilles. Lexposition dabeilles butineuses aux rsidus contenus dans les gouttelettes de guttation de mas trait avec la prparation CRUISER 350 est donc considre comme peu probable. Par ailleurs, dans le cadre de lvaluation de la demande dAMM pour cette prparation, un essai de plein champ a examin par lAgence pour valuer le risque li la formation de gouttelettes de guttation sur de jeunes plants de mas trait pour des colonies places en bordure des parcelles. Au cours de cet essai, il na pas t observ de mortalit significative ni de diffrence sur la force des colonies et sur les surfaces occupes par les rserves et les stades larvaires.

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Rglement (CE) n 1107/2009 du Parlement europen et du Conseil du 21 octobre 2009 concernant la mise sur le march des produits phytopharmaceutiques et abrogeant les directives 79/117/CEE et 91/414/CEE du Conseil. Voir dtails dans lavis de lAgence n 2009-SA-0 065 du 30 avril 2009. Gioro C. et al. (2009), How can guttation drops kill bees ? The lethal effect of neonicotinoid insecticides, XXIII Congresso Nazionale della Societ Chimica Italiana, Sorrento, 5-10 Juglio 2009 (Abstract).

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CONCLUSION GENERALE LAgence nationale de scurit sanitaire de lalimentation, de lenvironnement et du travail estime que les rsultats rapports dans larticle de Henry et al. (2012) mettent en vidence un effet dune dose subltale de thiamthoxam sur le retour la ruche des abeilles butineuses. En revanche, les consquences de ces effets sur le devenir de la colonie, tudies au moyen dune modlisation mathmatique non valide pour cette utilisation, ne peuvent pas tre clairement tablies. Lunique dose administre dans les expriences dcrites (1,34 ng/abeille) est infrieure aux doses induisant une mortalit chez les abeilles dans un essai de toxicit aigu. Les donnes disponibles en ce qui concerne les concentrations en substance active et les taux de sucre dans le nectar de colza, quelles proviennent de dossiers soumis dans un cadre rglementaire ou danalyses ralises en 2012 dans les conditions de pratique agricole actuelles, indiquent que lexposition des abeilles au thiamthoxam au travers des rsidus de nectar de colza est infrieure cette dose, bien quune exposition des doses de ce niveau ne puisse tre totalement exclue dans des circonstances exceptionnelles. Cette conclusion rejoint celle de lEFSA, saisie par la Commission europenne sur la mme question. Par ailleurs, des essais raliss avec la prparation CRUISER OSR base de thiamthoxam, dont certains ont inclus un suivi pluriannuel de ruches exposes des cultures de colza trait, nont indiqu aucun effet significatif de lexposition ces cultures sur la survie, lactivit de butinage, le dveloppement de la population, le dveloppement larvaire et le comportement des abeilles. Malgr les limites que peuvent prsenter ces essais en ce qui concerne leur sensibilit pour dtecter des effets tels quune dfaillance du systme dorientation, leur pertinence pour valuer le risque lchelle de la colonie ne peut actuellement tre remise en cause par des tudes exprimentales, fondes sur des niveaux et des modalits dexposition moins reprsentatifs des ralits du terrain. Nanmoins, l'Agence considre que les essais raliss mettent en vidence certaines limites des mthodologies mises en uvre dans les tudes de terrain, en particulier la non prise en compte de certains paramtres comme les effets sur le vol de retour la ruche. Au-del des rsultats de cette tude, lAgence recommande : De poursuivre les exprimentations sur la base de la technologie RFID en faisant varier les niveaux dexposition pour se rapprocher davantage des doses auxquelles les abeilles sont communment exposes, et en approfondissant les consquences des effets observs individuellement sur la dynamique de la colonie dabeilles. Ce travail permettrait de valider un protocole dtude permettant de mieux dcrire les effets subltaux dune exposition aux nonicotinodes, et qui pourrait tre pris en compte dans lvolution de la rglementation europenne. Dengager une rvaluation au niveau europen des substances actives nonicotinodes (thiamthoxam, clothianidine,) sur la base des donnes scientifiques nouvelles issues des tudes rcentes, comme le propose galement lEFSA.

Marc MORTUREUX

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MOTS-CLES
Produits phytopharmaceutiques, thiamthoxam, abeille

BIBLIOGRAPHIE
Gioro C. et al. (2009), How can guttation drops kill bees ? The lethal effect of neonicotinoid insecticides, XXIII Congresso Nazionale della Societ Chimica Italiana, Sorrento, 5-10 Juglio 2009 (Abstract). S. Khoury, M. R. Myerscough, A. B. Barron, A quantitative model of honey bee colony population dynamics. PLoS ONE 6, e18491 (2011). doi:10.1371/journal.pone.0018491 Medline Pierre J., Mesquida J., Marilleau R., PhamDelgue M.H., Renard M. (1999). Nectar secretion in winter oilseed rape, Brassica napus quantitative and qualitative variability among 60 genotypes. Plant Breeding 118:360365. A. Rortais, G. Arnold, M. P. Halm, F. Touffet-Briens, Modes of honeybees exposure to systemic insecticides: estimated amounts of contaminated pollen and nectar consumed by different categories of bees. Apidologie (Celle) 36, 71 (2005). Vaissire et al., 2006, Chapitre IV : Pollinisation, apiculture et environnement, dans Le trait Rustica de lapiculture, Rustica Editions.

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