DETERMINACIN DE MOHOS Y LEVADURAS

OBJETIVOS Realizar adecuadamente mediante el mtodo de cuenta en placa, el nmero de mohos y levaduras viables presentes en productos alimenticios destinados al consumo humano. Evaluar la calidad microbiolgica de un alimento, que sea factible de estar contaminado con estos microorganismos, tomando como referencia la NOM-111SSA1-1994. Comprender el fundamento de todas las etapas del mtodo de deteccin y cuantificacin de mohos y levaduras en alimentos.

MATERIAL Vaso de licuadora

Y estril o bolsa para

EQUIPO Stomacher

Motor

para

licuadora

Stomacher

Pipetas graduadas estriles de 1 y 10 mL con tapn de algodn

Pipetas

Pasteur

estriles

Propipeta

Cajas

de

Petri

estriles

(una

se

utiliza

para

pesar

la

muestra)

Utensilios estriles para la manipulacin de muestras: cuchillos, cucharas, tenedores, etc.

Incubadora

con

termostato

que

pueda

ser

mantenido

251C

 Bao de agua con control de temperatura y circulacin mecnica mantenida a 451C

Portaobjetos,

cubreobjetos,

diurex

Microscopio

ptico

Asa

bacteriolgica

asa

micolgica

 Contador de colonias de campo oscuro, con luz adecuada, placa de cristal cuadriculada y lente amplificador

PROCEDIMIENTO 1. Pesar 10.0 g de muestra en una caja Petri estril y pasarla a un matraz Erlenmeyer que contenga 90.0 mL de una solucin amortiguadora de fosfatos de pH 7.2 agua peptonada al 0.1%. 2. Homogeneizar la muestra con la solucin anterior en un vaso de licuadora estril o pasarla a una bolsa de Stomacher y homogeneizar durante 10.0 seg en el caso de la licuadora a velocidad mnima, 30.0 seg en el Stomacher a una velocidad normal. Esta es la dilucin primaria. 3. De la suspensin o solucin anterior, tomar 1.0 mL y transferirlo a un tubo de ensayo que contenga 9.0 mL de solucin amortiguadora de fosfatos de pH 7.2, agitar y repetir esta operacin tantas veces como diluciones sean necesarias. Se debe utilizar una pipeta estril para cada dilucin.

4. Colocar por duplicado en cajas Petri estriles, 1.0 mL de cada una de las diluciones de la muestra, utilizando una pipeta estril. 5. Fundir el medio contenido en los tubos de 22 x 175 mm con 20.0 mL de agar papa dextrosa y/o de agar extracto de malta estriles. Enfriarlos y

mantenerlos

45C.

6. Para lograr acidificar los medios a un pH de 3.5, adicionar por cada 100.0 mL de agar, 1.4 mL de cido tartrico al 10% esterilizado por filtracin en membrana, o bien esterilizar la solucin a 121C1C durante 15 minutos. Esto significa que a cada tubo conteniendo 20.0 mL del medio fundido y mantenido a 45C se le deber adicionar 0.3 mL del cido, o colocarlas en la caja de Petri teniendo precaucin de que no toque la muestra antes de agregar el medio de cultivo. 7. Despus de la acidificacin, utilizar un tubo de medio acidificado como testigo y medir el pH para corroborar que se encuentre a 3.5 utilizando un potencimetro. 8. En cada caja de Petri con inculo, verter de 15.0 a 20.0 mL de agar papa dextrosa acidificado y/o agar extracto de malta acidificado, fundidos y mantenidos a 45C. El tiempo transcurrido entre la preparacin de las diluciones y el momento en que es vertido el medio de cultivo no debe de exceder de 20.0 min. 9. Mezclar cuidadosamente el medio con seis movimientos de derecha a izquierda, seis en el sentido de las manecillas del reloj, seis en sentido contrario y seis de atrs hacia adelante, sobre una superficie lisa, cuidado de no humedecer con el medio la tapa de la caja de Petri. Permitir que la mezcla en las cajas Petri solidifique, dejndolas reposar sobre una superficie horizontal fra.

10. Verificar la esterilidad de los medios acidificados para lo cual se verter en una caja de Petri sin inculo, de 15.0 a 20.0 mL del agar papa dextrosa acidificada y/o agar extracto de malta acidificado. Despus de la incubacin estas cajas no debern presentar desarrollo de colonias. 11. Invertir las cajas y colocarlas en la incubadora a 251C.

12. Contar las colonias de cada placa despus de 3, 4 y 5 das de incubacin. Despus de 5 das, seleccionar aquellas placas que contengan entre 10 y 150 colonias. Si alguna de las cajas muestra crecimiento extendido de mohos o si es difcil contar colonias bien aisladas, considerar la cuantificacin de 4 das de incubacin o incluso las de 3 das. En este caso, se informa el perodo de incubacin en los resultados de los anlisis. 13. Realizar una tincin hmeda para mohos con colorante de lactofenol azul de algodn, para un examen microscpico y una posible identificacin de los mohos que se hayan desarrollado.

14. Realizar una tincin de Gram para la observacin microscpica de las levaduras obtenidas. 15. Contar las colonias de cada placa representativa, despus de 3, 4 y 5 das de incubacin (a 26 1C o a temperatura ambiente).

16. Considerar las cuentas de placas con 10 a 150 colonias como las adecuadas para el informe. Multiplicar por el inverso de la dilucin. 17. Informar las unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro (UFC/g o mL) de mohos y levaduras (cada uno en forma independiente), incubadas a 251C durante 5 das. 18. Describir las caractersticas macroscpicas y microscpicas observadas, de los mohos y/o levaduras desarrollados a partir de la muestra analizada. 19. Si alguna parte de la caja muestra crecimiento extendido de hongos, o si es difcil contar las colonias, considerar el desarrollo de estos microorganismos a los 4 das de incubacin y an a los 3 das. En este caso se debe informar el periodo de incubacin de 3 4 das, en los resultados del anlisis.

2. ANLISIS CUANTITATIVO Para hacer un reporte de la parte cuantitativa de este anlisis, se deben seleccionar las placas que contengan entre 10 y 150 colonias (representatividad estadstica). Posteriormente, contar las colonias presentes y calcular el nmero de hongos y levaduras por separado. De esta manera se

puede calcular las unidades formadoras de colonias por gramo o por mililitro dependiendo del estado fsico de la muestra analizada. Esto se logra multiplicando el nmero de UFC encontradas en una caja representativa, por el inverso de la dilucin correspondiente a esa caja.

3. BIBLIOGRAFIA http://depa.pquim.unam.mx/amyd/archivero/TecnicBasicas-Cuentamohos-levaduras_6530.pdf Para mayor informacin consulta la Norma Oficial Mexicana. NOM-111SSA1-1994. Bienes y Servicios. Mtodo para la cuenta de mohos y levaduras en alimentos dando link en el siguiente enlace http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/111ssa14.html