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Relatrio
de
um
trabalho
prtico
da
disciplina
de
Biologia
Celular
2011/12
Faculdade
de
Cincias
da
Universidade
do
Porto
Introduo
custa
da
fermentao
alcolica.
A
fermentao
compreende
um
conjunto
de
vias
metablicas
anaerbias
que
por
oxidao
de
hexoses
e
pentoses
leva
fosforilao
de
ADP
em
ATP.
Este
processo
corresponde
a
uma
adaptao
a
condies
de
baixa
concentrao
de
O2
ou
ento
apenas
como
forma
de
evitar
o
stress
oxidativo
resultante
da
utilizao
do
oxignio
nas
vias
metablicas
(Lus
G.
Pereira
-
2012).
As
vias
metablicas
fermentativas
so
diversas
Figura
1
-
Fermentao
Alcolica
(Alberts
B.,
et
al.
2002)
fermentativa
na
fermentao
alcolica
e
lctica
(Guia
das
Aulas
Prticas
de
Biologia
Celular
2011/2012).
Este
processo
requer
a
interveno
de
duas
enzimas,
a
piruvato
descarboxilase
que
promove
a
ruptura
de
uma
ligao
CC
na
molcula
de
piruvato
dando
origem
ao
acetaldedo;
e
a
lcool
desidrogenase
que
catalisa
a
oxidao
do
acetaldedo
a
etanol.
As
molculas
de
piruvato
que
sofrem
a
descarboxilao
e
posterior
oxidao
a
CO2
so
obtidas
a
partir
da
glicose
pela
via
glicoltica
de
Embden-Meyerhof
que
ilustra
os
mecanismos
envolvidos
para
a
produo
do
piruvato.
Esta
via
metablica
parte
de
uma
molcula
de
glicose
que
fosforilada
custa
das
desfosforilao
de
molculas
de
Relatrio
de
um
trabalho
prtico
da
disciplina
de
Biologia
Celular
2011/12
1
ATP,
sendo
portanto
uma
fase
que
requer
consumode
energia.
Posteriormente
ocorre
a
clivagem
da
hexose
(molcula
de
glicose
fosforilada)
em
duas
molculas
com
3
tomos
de
carbono
cada.
Ocorrem
posteriormente
vrias
etapas
que
levam
desfosforilao
e
oxidao
das
molculas
de
3-fosfato
gliceraldedo
formando-se
assim
o
piruvato
(Alberts
B.
Et
al.
2008).
O
etanol
e
o
dixido
de
carbono
so
os
produtos
finais
desta
via
metablica
que
pode
ser
facilmente
traduzida
pela
seguinte
equao
geral,
!! !!" !! 2!! !! !" + 2!"!
Pela
equao
geral
que
traduz
todo
o
processo
metablico
possvel
inferir
que
a
concentrao
de
glucose
(substrato)
um
fator
condicionante
na
fermentao
alcolica
das
leveduras,
portanto
a
concentrao
de
glucose
ir
condicionar
a
produo
de
etanol
e
dixido
de
carbono
por
parte
das
leveduras.
Para
comprovar
que
a
glucose
realmente
um
fator
condicionante
na
atividade
fermentativa
das
leveduras
podem
fazer-se
estudos
experimentais
em
que
se
varia
a
concentrao
de
substrato
e
se
observam
as
diferenas
quantitativas
na
produo
dos
produtos
da
reao
da
gliclise.
Para
isso
pode
usar-se
a
glucose
como
substrato
com
diferentes
concentrao
e
leveduras
do
fermento
de
padeiro
(Saccharomyces
cerevisae).
Assim
pode
incubar-se
as
leveduras
durante
um
certo
perodo
de
tempo
e
conferir,
no
final,
a
quantidade
de
produtos
formados.
Consegue-se
assim
inferir
indiretamente
acerca
da
atividade
fermentativa
das
leveduras.
A
Saccharomyces
cerevisae
uma
das
leveduras
mais
usada
industrialmente
pois
tanto
pode
ser
uma
soluo
fermentativa
para
a
indstria
panificadora
como
tambm
na
indstria
cervejeira
e
de
outras
bebidas
alcolicas
convertendo
a
glucose
em
etanol
conferindo
assim
o
teor
alcolico
destas
bebidas
e
por
vezes
o
prprio
sabor
caracterstico
(Pelczar
Jr.
Et
al.
1996).
Este
trabalho
prope-se
a
estudar
o
efeito
da
concentrao
de
substrato
(glucose)
na
fermentao
alcolica
de
leveduras
controlando
a
produo
de
dixido
de
carbono.
Assim
prev-se
que
a
produo
de
CO2
seja
crescente
com
o
aumento
da
concentrao
de
substrato,
mas
que
a
partir
de
um
determinado
momento
no
varie
e
passe
mesmo
a
diminuir
pois
para
concentraes
elevadas
de
substrato
ocorre
inibio
da
atividade
fermentativa
das
leveduras.
Relatrio
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um
trabalho
prtico
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disciplina
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Biologia
Celular
2011/12
2
Material
e
Mtodos
Material
utilizado:
Fermento
de
padeiro
(Maizena);
Sacarose;
Tubos
graduados
(de
duas
dimenses
distintas);
Parafilme;
Garrafa
de
esguicho
com
gua
destilada;
Estufa;
Balana
de
preciso;
Esptula;
Folha
de
alumnio.
Metodologia:
I)
Determinao
da
massa
de
leveduras
a
utilizar
Atravs
de
uma
balana
de
preciso
determinar
12g
de
leveduras.
Para
tal,
deve-se
recorrer
a
papel
de
alumnio,
o
que
permite
que
o
transporte
das
leveduras
seja
executado
evitando
perda
de
massa.
Assim
sendo,
deve-se
comear
por
colocar
o
papel
de
alumnio
na
balana.
Seguidamente
devemos
tarar
a
balana
e
colocar
leveduras
at
obter
a
massa
pretendida.
Por
ltimo
transfere-se
a
massa
para
um
tubo.
Este
procedimento
deve
ser
repetido
cinco
vezes,
tendo
em
conta
que
se
pretende
realizar
cinco
ensaios.
II)
Ressuspenso
das
leveduras
De
modo
a
que
as
leveduras
no
fiquem
depositadas
no
fundo
do
tubo,
adiciona-se
um
pouco
de
gua
e
parafilme
para
homogeneizar
a
soluo.
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trabalho
prtico
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Biologia
Celular
2011/12
3
III)
Prefazer
o
volume
pretendido
Concluda
a
ressuspenso
das
leveduras
adicionar
gua
at
perfazer
o
volume
pretendido
(neste
caso
em
especifico,
17
ml).
Por
fim,
coloca-se
parafilme
e
inverte-se
o
tubo.
IV)
Determinao
do
volume
da
bolha
gasosa
Colocar
um
tubo
de
maior
dimenso
sobre
o
anterior,
de
modo
que
este
ltimo
esteja
em
contacto
com
o
fundo
do
tubo
maior.
Para
que
se
possa
proceder
leitura
do
volume
da
bolha
gasosa
deve-se
inverter
o
tubo.
Contudo,
importante
realar
que
estando
a
realizar
cinco
ensaios,
os
cinco
tubos
devem
ser
invertidos
em
simultneo,
para
que
se
diminua
o
erro
associado
experincia
em
questo.
V)
Incubao
a
37C
Colocar
os
tubos
numa
estufa
temperatura
de
37C
e
aguardar
cerca
de
45
minutos.
VI)
Leitura
do
volume
da
bolha
gasosa
Ao
fim
de
45
minutos
retirar
os
tubos
da
estufa
e
proceder
leitura
do
volume
do
espao
vazio.
VII)
Determinao
do
volume
de
dixido
de
carbono
libertado
Atravs
da
diferena
entre
o
volume
final
e
o
volume
inicial
da
bolha
gasosa,
determinar
a
quantidade
de
dixido
de
carbono
libertado.
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Biologia
Celular
2011/12
4
Clculos
prvios:
Concentrao
a
1
%(p/V)
X=
X=
X=
X=
171 20
X = 0.85 mL
Concentrao
a
2
%(p/V)
172 20
X = 1.7 mL
Concentrao
a
4
%(p/V)
174 20
X = 3.4 mL
Concentrao
a
8
%(p/V)
178 20
X = 6.8 mL
Tabela A Composio dos tubos para testar a concentrao de sacarose na fermentao alcolica de leveduras.
Tubo
1
(controlo)
2
3
4
5
NOTA
Volume final Concentrao (mL) final %(p/V) 17.0 17.0 17.0 17.0 17.0 0 1 2 4 8
Resultados
Tabela
B
Influncia
da
concentrao
de
sacarose
na
fermentao
alcolica
de
leveduras
(1)
Tubo 1 (controlo) 2 3 4 5
Diferena entre a variao do volume de CO2 libertado e a mdia (!) dos valores dos tubos controlo dos outros grupos (!= 0.2 mL).
Discusso
Os
resultados
obtidos
vo
de
encontro
hiptese
formulada,
pelo
que
se
verificou
um
aumento
do
volume
de
dixido
de
carbono
(CO2)
libertado
com
o
aumento
da
concentrao
de
sacarose.
Como
seria
de
esperar,
a
partir
de
uma
concentrao
de
sacarose
de
4%
(p/V)
a
produo
de
CO2
diminui
fruto
da
dificuldade
manifestada
pelas
leveduras
em
suportar
concentraes
mais
elevadas
de
sacarose.
Contudo,
no
seria
de
esperar
uma
diminuio
to
precoce,
isto
,
no
era
espectvel
o
decrscimo
na
produo
de
CO2
para
esta
gama
de
concentraes
de
substrato.
Estudos
publicados
na
literatura
comprovam
que
as
leveduras
suportam
concentraes
de
substrato
superiores
sem
que
isto
condicione
a
sua
atividade
fermentativa.
Todavia,
o
comportamento
obtido
experimentalmente
vai
de
encontro
com
o
utilizados
que
deveria
ser
muito
superiores
para
se
observar
tal
diminuio
na
produo
de
CO2.
Provavelmente
esta
discrepncia
ocorreu
como
consequncia
das
condies
em
que
a
levedura
se
encontrava
antes
de
se
iniciar
o
trabalho,
uma
vez
que
todos
os
microorganismos
apresentam
uma
fase
de
adaptao
ao
meio
(lag)
o
que
condiciona
o
crescimento
e
o
normal
metabolismo
das
leveduras
durante
esta
fase.
Assim
como
as
leveduras
estavam
liofilizadas
esta
fase
de
adaptao
superior,
podemos
inferir
que
para
concentraes
de
substrato
no
to
elevadas
j
so
suficientes
para
limitar
a
atividade
fermentativa
(Prescott
L,
et
alia).
O
facto
da
diminuio
acontecer
para
concentraes
muito
baixas
tambm
pode
estar
relacionada
com
o
uso
do
dissacardeo
de
glucose
(sacarose)
em
vez
do
respectivo
monossacrido,
visto
que
as
leveduras
crescem
menos
no
substrato
do
dissacardeo
pelo
que
manifestam
uma
atividade
fermentativa
inferior
(Maiorella
B,
et
alia).
Os
resultados
obtidos
diferem
dos
demais
e
portanto
a
experincia
deveria
ser
repetida
de
modo
a
ser
possvel
tirar
concluses
relativamente
ao
comportamento
das
leveduras.
Bibliografia
Guia
das
aulas
prticas
de
Biologia
Celular
2011/2012,
FCUP,
2011/12
Pelczar
Jr,
MJ,
Chan,
ECS
e
Krieg,
NR.
Microbiologia,
vol.
II,
2a
edio
-
So
Paulo:
Makron
Books,
1996
Alberts
B,
Johnson
A,
Lewis
J,
Raff
M,
Roberts
K
and
Walter
P,
2008,
Molecular
Biology
of
the
Cell,
5th
edition,
Marjorie
Anderson
and
Sherry
Granum,
United
States
of
America
Pereira
LG,
Vias
metablicas
de
converso
de
energia
Biologia
Celular
FCUP,
2011/12 Prescott
L,
Harley
J
and
Kleins,
2002,
Microbiology,
5th
edition,
McGraw-Hill
Maiorella
B,
Blanch
H
and
Charles
R,
1983,
By-Product
Inhibition
Effects
on
Ethanolic
Fermentation
by
Saccharomyces
cerevisiae,
Department
of
Chemical
Engineering,
University
of
California,
Berkeley,
California