MILLER DA SILVA LEHNER

ESTRUTURA GENTICA DA POPULAO DE Sclerotinia sclerotiorum EM FEIJOAIS DE MINAS GERAIS

Dissertao apresentada Universidade Federal de Viosa, como parte das exigncias do Programa de Ps-Graduao em Gentica e Melhoramento, para a obteno do ttulo de Magister Scientiae.

Viosa MINASGERAISBRASIL 2011

MILLER DA SILVA LEHNER

ESTRUTURA GENTICA DA POPULAO DE Sclerotinia sclerotiorum EM FEIJOAIS DE MINAS GERAIS

Dissertao apresentada Universidade Federal de Viosa, como parte das exigncias do Programa de Ps-Graduao em Gentica e Melhoramento, para a obteno do ttulo de Magister Scientiae.

APROVADA: 25 de julho de 2011.

_________________________________ Prof. Eduardo Seiti Gomide Mizubuti (Co-orientador)

_________________________________ Pesq. Trazilbo Jos de Paula Jnior (Co-orientador)

_________________________________ Pesq. Rogrio Faria Vieira

_________________________________ Prof. Jos Eustquio de Souza Carneiro (Orientador)

Aos meus pais, Osvaldo e Elzeli A minha noiva, Alice Ao meu irmo Matheus Dedico

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AGRADECIMENTOS

A Deus, pela proteo em todos os momentos de minha vida. Universidade Federal de Viosa (UFV) e ao Programa de Ps-Graduao em Gentica e Melhoramento, pela oportunidade de realizar o mestrado. Empresa de Pesquisa Agropecuria de Minas Gerais (Epamig), pela infraestrutura disponibilizada para a realizao de parte desse trabalho. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (CNPq), pela concesso da bolsa de estudos e Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG), pelo apoio financeiro ao projeto. Ao professor e orientador, Jos Eustquio de Souza Carneiro, pela orientao, pelos ensinamentos e pela confiana durante esses anos. Aos pesquisadores, Hudson Teixeira, Trazilbo Jos de Paula Jnior e Rogrio Faria Vieira, pelos ensinamentos desde o incio da graduao, pela amizade e por todo apoio que sempre me foi dado. Ao professor e co-orientador, Eduardo Mizubuti, pela confiana, pacincia, pelas importantes sugestes e pelo grande aprendizado que obtive ao fazer parte de sua equipe nesses ltimos meses. Aos colegas do Laboratrio de Biologia de Populaes de Fitopatgenos (BIOPOP), em especial a Robson e Braz pela ajuda durante a realizao desse trabalho. Aos funcionrios e estagirios da Empresa de Pesquisa Agropecuria de Minas Gerais (EPAMIG-UREZM), pela ajuda e agradvel convvio. Aos funcionrios e colegas do Programa Feijo da UFV Aos meus pais, Osvaldo e Elzeli, pelas oraes, por no terem medido esforos para que eu chegasse at aqui, pelo amor e pelo apoio nos momentos mais difceis.
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 minha noiva Alice, pela pacincia, carinho, pelos momentos de alegria, por sofrer junto comigo nos momentos difceis, enfim, por me fazer uma pessoa mais forte. Ao meu irmo Matheus, pelo apoio e sinceridade. Aos meus familiares e amigos pelo suporte em todos os momentos de minha vida. A todos os professores que contriburam com minha formao acadmica desde a graduao em Agronomia, sem os quais no teria obtido xito.

MUITO OBRIGADO!

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BIOGRAFIA

Miller da Silva Lehner, filho de Osvaldo Lehner e Elzeli de Ftima da Silva Lehner, nasceu na cidade de Viosa, Minas Gerais, no dia 20 de novembro de 1985. Cursou o primrio na Escola Estadual Madre Santa Face, em Viosa, Minas Gerais. De 1997 a 2003, cursou o ensino fundamental e mdio na Escola Estadual Effie Rolfs, em Viosa, Minas Gerais. Em maro de 2005, iniciou o curso superior em Agronomia pela Universidade Federal de Viosa (UFV), colando grau em janeiro de 2010 como Engenheiro Agrnomo. Em maro de 2010, iniciou o curso de Mestrado em Gentica e Melhoramento, na Universidade Federal de Viosa (UFV), submetendo-se defesa em julho de 2011.

NDICE

RESUMO --------------------------------------------------------------------------- vii ABSTRACT --------------------------------------------------------------------------- viii 1. INTRODUO GERAL -------------------------------------------------------- 1 2. REVISO DE LITERATURA ------------------------------------------------- 2 3. MATERIAL E MTODOS ----------------------------------------------------- 8 3.1 AMOSTRAGEM E ISOLAMENTO ------------------------------------------ 8 3.2 EXTRAO DE DNA --------------------------------------------------------- 9 3.3 GENOTIPAGEM COM MARCADORES SSR ---------------------------- 10 3.4 ANLISE DOS DADOS ------------------------------------------------------ 10 4. RESULTADOS ------------------------------------------------------------------ 12 5. DISCUSSO -------------------------------------------------------------------- 18 6. CONCLUSES ----------------------------------------------------------------- 24 7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS --------------------------------------- 24
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 RESUMO

LEHNER, Miller da Silva, M.Sc., Universidade Federal de Viosa, julho de 2011. Estrutura gentica da populao de Sclerotinia sclerotiorum em feijoais de Minas Gerais. Orientador: Jos Eustquio de Souza Carneiro. Co-orientadores: Eduardo Seiti Gomide Mizubuti, Trazilbo Jos de Paula Jnior e Hudson Teixeira O conhecimento sobre a estrutura gentica da populao de Sclerotinia sclerotiorum importante para direcionar as estratgias de controle do mofo-branco do feijoeiro, principalmente o desenvolvimento e uso de cultivares resistentes ao patgeno. Objetivou-se estudar a estrutura gentica das populaes de S. sclerotiorum em lavouras de feijo em Minas Gerais. Analisaram-se 127 isolados provenientes de quatro regies produtoras de feijo (subpopulaes) em Minas Gerais quanto ao polimorfismo identificado por oito marcadores microssatlites. Houve alta diversidade gentica, com maior parte da variao decorrente de diferenas entre indivduos dentro das subpopulaes. Identificaram-se 65 hapltipos, sendo 49 representados por um nico isolado e 59 alelos. No houve evidncia de acasalamento aleatrio nas subpopulaes. Maior frao clonal foi registrada na subpopulao da Zona da Mata. A populao est moderadamente estruturada. Contudo, no houve diferenciao gentica entre as subpopulaes do Noroeste, Zona da Mata e Tringulo Mineiro. Houve diferena da subpopulao Sul em relao s demais. Pela anlise de agrupamento detectou-se a existncia de seis grupos, com a presena de imigrantes entre eles. A maioria dos isolados da subpopulao Sul constituiu um nico grupo. Nos outros grupos houve mistura de indivduos das diferentes subpopulaes. A alta variabilidade gentica observada nas populaes de S. sclerotiorum, implica em maiores cuidados na seleo de materiais resistentes ao mofo branco. O processo de seleo deve ser realizado em diferentes regies de Minas Gerais a fim de minimizar os riscos de suplantao de resistncia.
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ABSTRACT

LEHNER, Miller da Silva, M.Sc., Universidade Federal de Viosa, July, 2011. Population genetic structure of Sclerotinia sclerotiorum in bean producing areas of Minas Gerais. Adviser: Jos Eustquio de Souza Carneiro. Co-advisers: Eduardo Seiti Gomide Mizubuti, Trazilbo Jos de Paula Jnior and Hudson Teixeira.

Knowledge about the genetic structure of the population of Sclerotinia sclerotiorum can help decide the most adequate white mold management strategies, especially the development and use of resistant cultivars. The objective of this work was to study the genetic structure of populations of S. sclerotiorum on bean crops in Minas Gerais. We quantified the genetic variability of 127 isolates from four beanproducing regions (subpopulations), based on eight microsatellite markers. There was high genetic variability, with most variation due to differences among individuals within subpopulations. We identified 59 alleles and 65 haplotypes, with 49 haplotypes represented by a single isolate. There was no evidence of random mating in the subpopulations. Highest clonal fraction was recorded for the Zona da Mata subpopulation. The total population is moderately structured. However, there was no genetic differentiation between subpopulations of Noroeste, Zona da Mata, and Tringulo. However, all three subpopulations differed from that of Sul. Six cluster of isolates were detected, with evidence of immigrants among them. Most of the isolates from Sul subpopulation constituted a single group. In other groups there was mixing of individuals from other subpopulations. The high genetic variability observed in the population of S. sclerotiorum warns for greater care in the selection of bean genotypes resistant to white mold. The selection process should be performed in different regions of Minas Gerais in order to minimize the risk of supplanting resistance.

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1. INTRODUO O Brasil o maior produtor e consumidor de feijo (Phaseolus vulgaris L.) A produtividade mdia no Brasil de cerca de 900 kg/ha (CONAB, 2009/2010). Em Minas Gerais, Estado segundo maior produtor nacional, o rendimento mdio do feijoeiro nas trs pocas de plantio, na safra de 2009/2010, foi de 1453 kg/ha (Companhia Nacional de Abastecimento, 2010), acima da mdia nacional, mas em patamar ainda considerado baixo. A ocorrncia de doenas est entre os principais fatores responsveis por essa baixa produtividade (Paula Jnior et al. 2008). Dentre elas, destacam-se as causadas por fungos habitantes do solo (Paula Jnior e Zambolim 2006). Estes diferentemente daqueles que afetam a parte area, podem sobreviver por longos perodos sem a presena de restos culturais ou de hospedeiros alternativos (Paula Jnior et al. 2008). O mofo-branco, causado por Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, considerado, atualmente, a doena mais destrutiva dos feijoeiros irrigados do pas, principalmente em monocultivos sucessivos na mesma rea, nas safras de outonoinverno (Valarini e Spadotto 1995; Paula Jnior et al. 2004). H muitos desafios para o estabelecimento de prticas efetivas de manejo do mofo-branco. O controle qumico por meio de fungicidas eficiente (Paula Jnior e Zambolim 2006), mas o custo pode ser alto para muitos agricultores. Vale salientar que o patgeno pode infectar mais de 400 espcies vegetais (Purdy 1979; Boland e Hall 1994), incluindo plantas daninhas, e pode produzir estruturas de sobrevivncia que se mantm viveis no solo por vrios anos (Cook et al. 1975; Adams e Ayers 1979; Steadman 1983). Portanto, qualquer medida de controle adotada de forma isolada tender ao insucesso. A alternativa mais vivel para o controle do mofo-branco do feijoeiro seria o desenvolvimento e uso de cultivares tolerantes e/ou resistentes. No entanto, o xito dos programas de melhoramento visando o desenvolvimento dessas cultivares pressupe considerar a variabilidade do hospedeiro e patgeno. Logo compreender a estrutura gentica da populao de S. sclerotiorum epidemiologicamente importante e tem implicaes diretas no manejo da doena (McDonald e Linde 2002).

O objetivo foi estudar a estrutura gentica de S. sclerotiorum nas reas produtoras de feijo em Minas Gerais. Foram estabelecidos os seguintes objetivos especficos: i) Mensurar a variabilidade existente entre e dentro das subpopulaes; ii) Determinar como a variabilidade gentica da populao do patgeno est distribuda nas regies produtoras de feijo.

2. REVISO DE LITERATURA A espcie S. sclerotiorum pertence ao filo Ascomycota, classe Discomycetes, ordem Leotiales, famlia Sclerotiniaceae, gnero Sclerotinia (Bolton et al. 2006). O fungo est amplamente distribudo (Purdy 1979) e quando em ambiente favorvel, o patgeno capaz de infectar folhas, flores, vagens, sementes, hastes e frutos. H uma gama extensa e diversa de hospedeiros, incluindo culturas agrcolas importantes, como soja, algodo, alface, repolho, batata, tomate industrial, girassol, amendoim e ervilha (Boland e Hall 1994; Hartman et al. 1999; Purdy 1979), alm de plantas daninhas, como pico, carrapicho, caruru, mentrasto e vassoura (Paula Jnior e Zambolim 2006). Segundo Bolton et al. (2006), nos Estados Unidos as perdas anuais em decorrncia do mofo-branco ultrapassam os 200 milhes de dlares. Na ausncia de hospedeiro suscetvel, o fungo pode persistir por longo perodo no solo, por meio de estruturas de resistncia de formato irregular e colorao escura, conhecidas como esclerdios. Estas, a princpio apresentam colorao branca e, posteriormente, tornam-se negras e duras. Podem sobreviver no solo por mais de 10 anos e so altamente resistentes a substncias qumicas, calor seco de at 60oC e congelamento (Coley-Smith e Cooke 1971). A germinao dos esclerdios pode ser miceliognica, com a produo de hifas, ou carpognica, com a produo de apotcios. Para germinar carpogenicamente, os esclerdios necessitam de perodo de condicionamento no solo (Schwartz e Steadman 1978; Hunter et al. 1984; Huang e Kozub 1991; Ferraz et al. 1999). Os apotcios constituem o estgio sexual do fungo. Estes podem originar-se de esclerdios enterrados no solo at 5 cm de profundidade. Cada esclerdio pode produzir de um a 20 apotcios, em cada um dos quais so formados ascos, com oito

ascsporos cada. Durante o perodo funcional de 5 a 10 dias, cada apotcio pode liberar mais de dois milhes de ascsporos (Schwartz e Steadman 1978). Nos ltimos anos, como resultado de inovaes tecnolgicas aplicadas ao processo produtivo, doenas do feijoeiro causadas por patgenos de solo tm se destacado (Paula Jnior et al. 2004; Paula Jnior e Zambolim 2006). O cultivo de plantas hospedeiras em sucesso, o uso de gros como sementes, a alta densidade de plantas, a fertilizao excessiva e o cultivo no outono-inverno com piv-central criaram um ambiente altamente favorvel ao desenvolvimento de fungos de solo, como S. sclerotiorum. Os sintomas iniciais da doena ocorrem em reboleiras nas lavouras, principalmente nos locais com alta densidade de plantas e/ou crescimento vegetativo abundante. Geralmente, o sintoma inicial a murcha da planta. Depois, so observadas manchas encharcadas nas folhas, hastes e vagens, seguidas por crescimento de miclio branco e cotonoso, o que originou a denominao mofobranco. Com o progresso da doena, so formados esclerdios facilmente visveis a olho nu, dentro do tecido infectado e sobre ele (Hall e Steadman 2005). Os tecidos doentes tornam-se secos, esbranquiados, leves e quebradios. As sementes infectadas so pequenas, sem brilho, descoloridas, enrugadas e mais leves, ou podem no apresentar qualquer alterao visvel. Segundo Steadman (1975), S. sclerotiorum pode ser isolado de menos de 0,5% de sementes assintomticas e de cerca de at 12% de sementes com algum sintoma ou sinal da doena. As infeces primrias so iniciadas principalmente pelos ascsporos, os quais necessitam de gua livre e de uma fonte exgena de energia, geralmente ptalas de flores senescentes e/ou tecidos lesionados cados no solo ou ainda retidos nas plantas (Abawi e Grogan 1975; Steadman 1979). Folhas e hastes contaminadas com ascsporos em contato com o solo mido, assim como folhas e hastes em contato com esclerdios na superfcie do solo tambm podem iniciar a doena. As infeces secundrias decorrem do contato entre plantas doentes e sadias. Nos tecidos colonizados pelo patgeno ocorre a produo de esclerdios, que ao carem no solo, podem ser incorporados, juntamente com os restos da cultura, nas operaes de arao e gradagem. No solo, os esclerdios so capazes de sobreviver por vrios anos na ausncia das espcies hospedeiras (Cook et al. 1975; Steadman 1983). Em condies favorveis (10-25C), os esclerdios presentes na camada
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superior do solo germinam e produzem os apotcios (Abawi e Grogan 1979). Os ascsporos, principal inculo inicial do mofo-branco, podem sobreviver por at 12 dias no campo (Abawi e Grogan 1975). Eles podem ser carreados via correntes areas para diferentes partes da planta, para outras plantas na mesma rea, e ainda, para cultivos prximos. Propgulos do fungo podem ser introduzidos nas reas isentas e disseminados a longas distncias por meio de sementes infectadas por miclio ou por lotes contaminados com esclerdios (Napoleo et al. 2001; Vieira e Paula Jnior 2006). Sementes infectadas por S. sclerotiorum podem apodrecer e no germinar e sobre as sementes podem ser formados esclerdios, ou seja, miclio dormente nas sementes pode disseminar o fungo (Tu 1989) e contribuir para o acmulo de inculo no solo e aumento da intensidade da doena nas reas produtivas (Juliatti et al. 2001). importante evitar a entrada do patgeno em reas indenes, pois uma vez presente torna-se muito difcil erradic-lo (Paula Junior et al. 2006). Deve-se sempre usar sementes com boa qualidade sanitria e limpar mquinas e implementos agrcolas provenientes de reas infestadas antes de serem empregados em reas isentas da doena. Onde j ocorre a doena, alm do controle qumico, recomenda-se tambm adotar o sistema de plantio direto, menor densidade de plantas e a utilizao de cultivares de porte ereto (Paula Jnior et al. 2006). Estes propiciam maior insolao e circulao de ar entre as plantas, o que cria um ambiente menos favorvel ao patgeno. Os principais cultivares de feijo so suscetveis, portanto, embora custoso, o principal mtodo de controle da doena tem sido a utilizao de fungicidas. Fontes de resistncia fisiolgica (restrio ao desenvolvimento de leses em tecidos da haste) tm sido identificadas a partir de inoculaes em casa de vegetao (Miklas et al. 1998, Miklas et al. 2006). A combinao desse tipo de resistncia com mecanismos de escape, como por exemplo, o porte ereto das plantas, parece ser boa estratgia para diminuir as perdas em decorrncia da doena. Marcadores microssatlites tem boa preciso e reprodutibilidade, por isso tm sido muito utilizados em estudos genticos. O alto nvel de variao detectado por esses marcadores aumenta a resoluo do estudo de genealogia e diversidade gentica, reduzindo o nmero de marcadores requeridos para distinguir os gentipos (Caixeta et al. 2009).
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Diversidade composta de dois aspectos, riqueza e equitabilidade. Riqueza o nmero de gentipos presentes em uma populao. Equitabilidade diz respeito a como os gentipos esto distribudos dentro das populaes. Em populaes de microrganismos, ndices de diversidade gnica e genotpica so necessrios para estimar a diversidade gentica (Grunwald et al. 2003). Diversidade gnica funo do nmero e frequncias de alelos em cada loco. Embora mltiplos locos sejam geralmente usados, diversidade estimada para cada loco, separadamente. Diversidade genotpica funo do nmero e frequncia de combinaes allicas e pode ser feita entre locos diferentes (Milgroom 1996). Os ndices de diversidade genotpica mais utilizados so N1 (Hill), H (Shannon-Wiener) e, principalmente, o G (Stoddart e Taylor 1988) (Grunwald et al. 2003). McDonald e Linde (2002) definem estrutura gentica como a quantidade e distribuio da variao existente entre e dentro das populaes. consequncia da interao entre as cinco foras evolutivas (mutao, migrao, seleo, deriva e recombinao). O conhecimento da estrutura gentica poder mensurar o potencial evolutivo de uma populao. Fitopatgenos com grande potencial evolutivo tm maior risco de suplantar a resistncia existente em alguns cultivares, ou mesmo, desenvolver resistncia a fungicidas ou antibiticos. As populaes naturais de S. sclerotiorum ocorrem como um mosaico de clones, que mantm entre si a tendncia do isolamento gentico (Kohn et al. 1991; Anderson e Kohn 1995; Cubeta et al. 1997). Anlises filogenticas de clones usando sequncias de DNA de quatro regies geogrficas indicaram populaes predominantemente clonais, sem evidncias de que trocas genticas atuais ou recombinao entre gentipos individuais tenham ocorrido (Carbone et al. 1999). Entretanto, Kohn 2001, sugeriu tratar-se de espcie geneticamente heterognea. A populao mundial de S. sclerotiorum composta de subpopulaes, algumas das quais so mais velhas ou permaneceram isoladas ou endmicas; outras so mais recentes ou altamente dispersas. O mesmo autor verificou que amostragens realizadas em lavouras de regies de clima subtropical revelaram maior recombinao entre indivduos do que em lavouras em clima temperado. Poucos gentipos clonais de S. sclerotiorum predominaram em todas as amostras. Atallah et al. (2004), por meio de ndices de associao e desequilbrio de ligao, notaram indcios de recombinao sexual em duas regies produtoras de
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batata no Estado de Washington, EUA. A presena de diferentes grupos de compatibilidade micelial (MCG) em isolados oriundos de um nico apotcio substanciou ainda mais essa observao. Entretanto, ao analisar todas as populaes como apenas uma, rejeita-se a hiptese de recombinao sexual na populao. No total 82 MCGs foram identificados, 64 deles compostos por apenas um isolado. O nmero de alelos por loco variou de 2 a 5, dos 25 primers utilizados, apenas 11 exibiram polimorfismo. A estrutura gentica de uma populao de 276 isolados de S. sclerotiorum, coletados em quatro regies (populaes regionais) produtoras de canola no Ir, foi estudada por Hemmati et al. (2009). Um esclerdio retirado de cada planta foi considerado como um isolado, e a uniformidade gentica de cada isolado foi obtida atravs da tcnica de ponta de hifa. Seis primers microssatlites fluorescentes foram utilizados nas anlises. O nmero de alelos obtidos variou de 3 a 8. Os resultados indicaram alto nvel de clonalidade e 80 hapltipos foram identificados, sendo que 7,5% deles ocorreram mais de 10 vezes, embora nenhum tenha sido detectado nas quatro populaes. A diversidade genotpica foi considerada moderada e variou de 12 a 22%. Apenas 4% da variao gentica total foram devidos a variaes entre as populaes, ou seja, a grande maioria da variao (96%) foi detectada dentro das populaes regionais. As populaes foram caracterizadas por predominncia de estrutura clonal. Entretanto, baseado em testes de acasalamentos aleatrios, houve indcios de que recombinao gamtica ocorreu nas populaes. Um estudo conduzido na Austrlia comparou isolados coletados em flores infectadas com ascsporos com isolados coletados em leses no caule de canola, em anos diferentes (Sexton et al. 2006). Foram identificados 55 hapltipos. Menos de 10% da variao foi atribuda diferena entre os dois anos. O desequilbrio de ligao mensurado indicou a ocorrncia tanto de reproduo clonal quanto sexual. Os resultados sugeriram que no existiu uma diviso gentica entre os isolados que colonizaram as flores e aqueles presentes nos caules. Dez marcadores SSR foram usados para caracterizar uma populao de 79 isolados de S. sclerotiorum coletados em campos de feijo no cerrado brasileiro (Gomes et al. 2011). Alta diversidade gentica foi encontrada. O ndice de diferenciao gentica das populaes (Fst) foi alto (0,29) e a anlise de varincia molecular detectou alta variao (71,2%) dentro das populaes de S. sclerotiorum
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analisadas. A variao gentica de populaes de S. sclerotiorum da Nova Zelndia foi estudada com a tcnica southern blotting (Carpenter et al. 2009). Houve alto nvel de variao e ocorrncia de fluxo gnico (migrao) entre as populaes de S. sclerotiorum analisadas. A variabilidade gentica de 40 isolados brasileiros de S. sclerotiorum coletados em diferentes hospedeiros (feijo, tomate, pimenta, lentilha, alface, girassol, cenoura, rabanete canola e repolho) foi estudada com marcadores RAPD. Pela anlise de agrupamento (UPGMA, distancia gentica de Jaccard) no houve relao da regio geogrfica ou hospedeiro com os grupos. A alta variabilidade gentica entre os isolados indicou ocorrncia de reproduo sexual. Houve 99 % de variao entre indivduos, cultura hospedeira no teve efeito significativo (Litholdo Jnior et al. 2011). Em estudo recente Ekins et al. (2011) utilizaram marcadores RAPDs, RFLPs e testes de compatibilidade micelial para estudar a estrutura gentica de S. sclerotiorum em lavouras de girassol na Austrlia. Com base na anlise de 40 isolados obtidos de 10 esclerdios, os autores concluram que h apenas um gentipo de S. sclerotiorum por esclerdio. Tambm no houve diferena entre gentipos oriundos de ascsporos pertencentes a uma mesma asca. Foi observado tambm que o mesmo gentipo infecta flores (proveniente de ascsporo) e caules (proveniente de esclerdio) o que indica no haver especializao entre gentipos provenientes de ascsporos ou esclerdios. No houve diferenciao entre as populaes e a maior parte da variao foi atribuda variabilidade dentro das populaes. At o momento, os estudos sobre a estrutura gentica de populaes de S. sclerotiorum tm reportado alta diversidade gentica em regies tropicais (Gomes et al. 2011; Litholdo Jnior et al. 2011; Sexton et al. 2006; Sexton e Howlett 2004). Populaes clonais foram detectadas principalmente em regies temperadas (Kohli et al. 1992; Cubeta et al. 1997). Apesar de alta diversidade, acasalamento aleatrio no caracterstica das populaes, embora haja indcios de recombinao (Hemmati et al. 2009; Sexton et al. 2006; Atallah et al. 2004). Em muitos trabalhos observou-se compartilhamento de hapltipos (Hemmati et al. 2009; Cubeta et al. 1997; Kohli et al. 1995). A migrao de indivduos (fluxo gnico) que pode ocorrer tanto por esclerdios associados s sementes ou ascsporos por correntes de ar (Abawi e

Grogan 1979; Kohli et al. 1992), parece ser caracterstica de populaes de S. sclerotiorum.

3. MATERIAL E MTODOS

3.1 Amostragem e isolamento As amostras do patgeno foram constitudas de esclerdios formados em feijoeiros com sintomas de mofo-branco em lavouras localizadas em quatro regies do Estado de Minas Gerais (Figura 1). Um total de 127 isolados foi coletado em 19 localidades nas regies Noroeste, Tringulo Mineiro/Alto do Paranaba, Zona da Mata e Sul de Minas Gerais. O tamanho das amostras variou de 19 (Tringulo Mineiro) a 43 (Noroeste de Minas) (Tabela 1). Juntas, essas regies so responsveis por aproximadamente 74 % da produo de feijo em Minas Gerais (IBGE 2009). Maior parte da produo (38,24 %) vem da regio Noroeste. A coleta de esclerdios nessa regio foi feita em grandes reas de cultivo, sob piv central, onde se cultivava feijo do grupo carioca. Situao diferente da Zona da Mata, onde as amostras do patgeno foram obtidas em pequenas lavouras, sem irrigao, todas cultivando feijo vermelho. Para a anlise de distribuio geogrfica dos isolados, informaes de latitude e longitude do local de coleta foram registradas com aparelho porttil de sistema de posicionamento global (GPS). Sempre que possvel descritores dos locais de coleta (tipo de vegetao, tipo de solo, pluviometria mdia, temperatura mdia etc.), assim como informaes sobre o manejo da cultura (cultivar, agrotxicos, irrigao etc.) foram registrados. Os esclerdios foram imersos em soluo de etanol 70% por 3 min e de hipoclorito de sdio 1%, tambm por 3 min. Em seguida, eles foram imersos em gua esterilizada e transferidos, assepticamente, para 20 mL de meio batata-dextrosegar (BDA Acumedia), suplementado com 200 mg/L de cloranfenicol, em placas de Petri de 9 cm de dimetro. As placas com os esclerdios foram mantidas em B.O.D a 23 oC no escuro, por 7 a 10 dias. Para assegurar a manuteno da identidade gentica de cada isolado, aps a germinao dos esclerdios e formao da colnia, segmentos nicos de
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extremidades de hifas de cada isolado foram transferidos assepticamente para novas placas com BDA. As culturas foram mantidas a 23oC no escuro, por at 15 dias, sendo ento preservadas a 4oC, tambm no escuro. Em todas as anlises realizadas neste trabalho utilizaram-se culturas oriundas de extremidade de hifas.

3.2 Extrao de DNA A biomassa fngica foi obtida pelo crescimento micelial em meio lquido sinttico (10 g de sacarose; 2 g de asparagina; 2 g de extrato de levedura; 1 g KH2PO4; 0,1 g de MgSO4.7H2O; 0,44 mg de ZnSO4; 0,48 mg de FeCl3.6H2O; e 0,36 mg de MnCl2.H2O por 1L H2O) a 23 oC, no escuro, por seis a 10 dias. O miclio obtido foi seco em temperatura ambiente por aproximadamente 24 h seguido da extrao de DNA. As extraes de DNA foram realizadas seguindo o mtodo CTAB (Doyle e Doyle 1990), com modificaes. A biomassa foi macerada em nitrognio lquido utilizando pistilo e almofariz. Posteriormente, a massa micelial foi transferida para tubos de microcentrfuga (1,5 mL) e adicionou-se 750 L de soluo CTAB 2X e 15 L de 2--mercaptoetanol por tubo. Os tubos foram colocados em banho-maria a 65oC, por 30 min. Em seguida adicionou-se 500 L de fenol-clorofrmio-lcool isoamlico a cada tubo (25:24:1 v/v), homogeneizados e centrifugados a 14.000g, por 5 min. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo de 1,5 mL com adio de 500 L de clorofrmio-lcool isoamlico (24:1 v/v), as amostras foram homogeneizadas e centrifugadas novamente a 14.000g, por 5 min. Alquotas de 360 L do sobrenadante foram transferidas para novos tubos, aos quais foi adicionado 324 L de isopropanol resfriado. Estas suspenses foram mantidas a -20oC, por 10 min, logo aps foram centrifugadas a 14.000 g, por 7 min. O sobrenadante foi descartado e o pellet formado foi lavado duas vezes com 500 L de etanol 70%. Aps o descarte do etanol, os tubos foram postos a secar em temperatura ambiente. O pellet final foi ressuspendido a 37oC, por 2 h, em 50 L de soluo tampo (1 mL tris-HCl (1M); 200 L EDTA (500 mM); 98,8 mL H2O). A qualidade e concentrao do DNA extrado foram mensuradas por espectrofotometria (Nanodrop), e a concentrao final ajustada a 20 ng/L.

3.3 Genotipagem com marcadores SSR Foram utilizados oito locos SSR descritos por Sirjusingh e Kohn (2001). Esses locos foram utilizados para a caracterizao de populaes de S. sclerotiorum de diferentes locais: Brasil (Gomes et al. 2011), Ir ( Hemmati et al. 2009), Turquia ( Mert-Tu rk et al. 2007), Austrlia (Sexton e Howlett 2004) e, principalmente, na Amrica do Norte (Sirjusingh e Kohn 2001; Atallah et al. 2004). Para permitir a anlise de mais de um loco ao mesmo tempo, cada primer foi marcado com um dos trs corantes fluorescentes 6-FAM, NED e HEX. Os seguintes primers e suas respectivas fluorescncias foram: 7-2:AF377902 (NED), 92:AF377903 (6-FAM), 12-2:AF377906 (HEX), 13-2:AF377907 (HEX), 36-4: AF377914 (NED), 92-4: AF377919 (6-FAM), 106-4:AF377921 (HEX) e 1144:AF377923 (6-FAM). As reaes de PCR multiplex foram realizadas com kit especfico para primers microssatelites (Typeit Microsatellite Kit, QIAGEN, USA), totalizando 9 L de reao. As reaes de PCR multiplex foram feitas nestas condies: um ciclo a 95 oC por 5 min, seguido por 95 ciclos a 95 oC por 30 s, 55 oC por 90 s e 72 oC por 30 s, e 60 C por 30 min. A concentrao do produto da PCR foi mensurada em espectrofotmetro e ajustada para aproximadamente 25 ng por loco. Posteriormente, 1 L do produto da PCR foi misturado a 8 L de formamida deionizada Hi-DiTM (Applied Biosystems, USA) mais 1 L de um marcador de 600 bp marcado com um fluorforo (rox). Os fragmentos foram ento separados por um sistema de capilaridade em sequenciador ABI Prism 3100. O tamanho das bandas foi mensurado automaticamente por meio do programa GeneMarker 1.91.

3.4 Anlise dos dados A frequncia allica por loco de cada populao e a diversidade gnica de todos os locos e de cada subpopulao foram calculadas por meio do programa Genepop 4.1 (Rousset 2008). Com o mesmo programa, o teste da razo de verossimilhana (teste G2) foi realizado para testar o equilbrio gamtico (H0=populao em equilbrio) de cada loco e de cada par de populaes. O teste baseado na razo entre duas funes de mxima verossimilhana: uma definida pelas
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frequncias genotpicas esperadas no equilbrio (L0) e a outra pelas frequncias genotpicas observadas (L1) (Cruz et al. 2011). Alguns ndices de riqueza, diversidade e equitabilidade foram calculados para estimar a diversidade gentica das populaes de S. sclerotiorum. A riqueza genotpica E(gn), foi estimada usando curvas de rarefao (Grnwald et al. 2003) para diminuir o erro devido a diferenas no tamanho das subpopulaes (n). Para mensurar a diversidade genotpica, empregaram-se os ndices N1 (Hill 1973), G (Stoddart e Taylor 1988) e H (Shannon-Wiener 1949) e os respectivos intervalos de confiana calculados pelo programa R (R Development Core Team 2008), com 1000 replicaes bootstrap. Como as subpopulaes possuem n diferentes, os ndices foram escalonados para o nmero de gentipos de cada subpopulao (Grunwald et al. 2003). Para comparar a equitabilidade entre as populaes, foi calculado (sem escalonamento) o ndice E5 (E5= G-1/N1-1). A frao clonal de cada populao foi calculada com base na frequncia dos clones de cada populao, n-G/n, em que n o tamanho da amostra e G o nmero de gentipos (Zhan et al. 2002). A diferenciao gentica entre as populaes foi comparada por meio da estatstica (Weir e Cokerham 1984), equivalente ao FST de Wright para dados haplides, calculada com o programa Multilocus 1.3 (Agapow e Burt 2003), com bootstrap de 1000 re-amostragens. O valor encontrado em cada par de subpopulaes indica se h diferenciao gentica entre elas. Da mesma forma, o ndice de associao IA, e rd foram calculados para testar a hiptese de equilbrio gamtico, ou seja, verificar se h indcios de acasalamento aleatrio entre os indivduos. Para isso, as estimativas de desequilbrio de ligao (IA e rd) foram comparadas com as esperadas no caso de acasalamentos ao acaso (hiptese nula). migrantes (Nm) tambm foi calculado (FST= 1/(1+4Nm)). A estatstica FST de Wright foi calculada (Genepop 4.1) para a populao total. Para estimar a distribuio da variao gentica entre e dentro das subpopulaes realizou-se anlise de varincia molecular (AMOVA) com o programa Arlequin ver. 3.5.1.2 (Excoffier e Lischer 2010) e 1000 simulaes. Para investigar ocorrncia de mistura entre as populaes, a anlise bayesiana de agrupamento foi realizada com o programa Structure 2.3.3 (Pritchard et al. 2000). O conjunto de dados foi analisado usando o modelo de mistura, com 10.000.000 de interaes Monte-Carlo Markov Chains (MCMC) e burn-in de 1.000.000. Todos
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O nmero de

os parmetros foram definidos com valores padro. O nmero de grupos (K) variou de 1 a 10 e a anlise foi repetida trs vezes independentes. O maior valor da probabilidade [Ln P (D)] definiu o nmero de grupos.

4. RESULTADOS Pela anlise dos oito locos SSR detectaram-se 59 alelos e 65 gentipos. O nmero de alelos por loco variou de 3 (loco 36-4) a 13 (loco 106-4) (Tabela 2). Dos 65 gentipos, 49 foram representados por um nico isolado (hapltipos nicos). Dois estiveram presentes em todas as regies representando 27,6 % da populao.

Figura 1- Mapa de Minas Gerais, com indicao de municpios de onde amostras de Sclerotinia sclerotiorum foram coletadas em campos de feijo. A diversidade gnica (H) foi maior no loco 12-2 (79,5%) e menor no loco 9-2 (11,8%), que apresentou polimorfismo apenas para os isolados das populaes Noroeste e Tringulo Mineiro (Tabela 2). A frao clonal variou de 21 % (Tringulo
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Mineiro) a 54,8% na subpopulao da Zona da Mata, onde 15 isolados foram representados por um nico gentipo. O nmero de hapltipos compartilhados variou de 3, entre as subpopulaes Noroeste e Sul e Noroeste e Tringulo, a 6, entre as subpopulaes da Zona da Mata e do Tringulo Mineiro. Hapltipos compartilhados foram um indicativo de fluxo gnico entre as subpopulaes. Os altos ndices de equitabilidade (E5) nas subpopulaes da regio Noroeste, Tringulo Mineiro e Sul indicaram que nessas subpopulaes os gentipos esto mais uniformemente distribudos em relao Zona da Mata (Tabela 1).

Tabela 1 - ndices de diversidade, riqueza e equitabilidade para quatro subpopulaes de Sclerotinia sclerotiorum amostradas em lavouras de feijoeiro no Estado de Minas Gerais, Brasil. Estatstica Noroeste N n de Hapltipos H' 43 28 0,93 (0,86-1,01)a N1 0,81 (0,66-0,95) G 0,61 (0,44-0,77) E(g19)

Subpopulaes Tringulo 19 15 0,97 (0,85-1,09) 0,92 (0,73-1,11) 0,83 (0,64-1,01) 15 Zona da Mata 42 19 0,81 (0,69-0,93) 0,57 (0,41-0,73) 0,32 (0,18-0,47) 10,69 Sul 23 18 0,97 (0,88-1,07) 0,92 (0,76-1,08) 0,84 (0,68-1,00) 15,49

14,86

E5 N H' N1 G E5 E(g19)
a

0,74 0,89 0,52 0,90 Tamanho da amostra ndice de Shannon-Wiener escalonado para ln(gobs) ndice N1 de Hill ndice de Stoddart e Taylor ndice de equitabilidade baseado na razo entre (G-1)/(N1-1) ndice de riqueza para o menor n amostral Nmeros entre parnteses indicam o intervalo de confiana calculado a partir da abordagem de bootstrap
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A subpopulao do Sul apresentou maior diversidade genotpica (ndices G e N1), em relao da Zona da Mata (Tabela 1), porm no difere das demais (Noroeste e Tringulo Mineiro). No houve diferena de diversidade genotpica entre as quatro subpopulaes baseadas no ndice H(Shannon-Wiener). Entretanto, foi detectada maior riqueza e equitabilidade nas subpopulaes do Noroeste, Tringulo Mineiro e Sul (Tabela 1). A riqueza (nmero de gentipos) estimada com curvas de rarefao para o menor n (E(g19)) variou de 10,7 (Zona da Mata) a 14,9 (Noroeste de Minas) (Figura 2). Contudo, os testes de associao aleatria detectaram altos nveis de desequilbrio de ligao entre pares de locos, tanto nas subpopulaes regionais, quanto na populao total. Em todas as subpopulaes, os valores de IA foram significativos, sugerindo baixa ocorrncia de acasalamento aleatrio (Tabela 4).

Figura 2- Riqueza estimada pelo mtodo de rarefao E(gn), de quatro subpopulaes de Sclerotinia sclerotiorum amostradas em lavouras de feijoeiro em Minas Gerais, Brasil. O menor tamanho amostral das quatro subpopulaes amostradas, n=19 (linha vertical) foi usado para comparar a estimativa de riqueza entre as populaes Pela anlise de varincia molecular, AMOVA, estimou-se a porcentagem de variao total dentro e entre as populaes, com 84,5 % da variao total devida a variaes dentro das populaes (Tabela 3).

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Tabela 2. Nmero de alelos por loco e diversidade gnica por loco em cada subpopulao de Sclerotinia sclerotiorum usada nesse trabalho. Locus repetio tam (bp) na diversidade gnica (H) subpopulaes N TM ZM S T 0,82 0,59 0,45 0,70 0,64 0,82 0,81 0,73 0,86 0,79 0,42 0,64 0,30 0,66 0,46 0,40 0,46 0,29 0,66 0,42 0,22 0,29 0.00 0.00 0,12 0,65 0,44 0,09 0,54 0,41 0,18 0,44 0,29 0,30 0,28

7-2:AF377902 12-2:AF377906 13-2:AF377907 9-2:AF377903 106-4:AF377921 92-4:AF377919 36-4:AF377914

(GA)14 (CA)9 (GTGGT)6 (CA)9(CT)9 (CATA)25 (CT)12

148-172 9 211-223 7 275-320 8 352-416 6 371-377 4

114-4:AF377923 (AGAT)14(AAGC)4 336-412 9

484-568 13 0,75 0,71 0,34 0,70 0,60

CA6(CGCA)2CAT2 411-424 3

N = Noroeste, TM = Tringulo Mineiro, ZM = Zona da Mata, S = Sul, T = total da diversidade gnica em cada loco, tam = tamanho, na = nmero de alelos Tabela 3. Anlise de varincia molecular (AMOVA) de isolados de Sclerotinia sclerotiorum coletados em lavouras de feijo no Estado de Minas Gerais. F.V Entre populaes Dentro de populaes Total Fst: 0,15 Para a populao total, o valor Fst de Wright foi 0,15 (Tabela 3). Estimativas para os pares de populaes, baseadas na estatstica (estimador do Fst de Wright) indicam grande diferenciao gentica ( > 0,15) de todas as subpopulaes em relao quela do Sul de Minas (Tabela 5). No geral, no houve diferena entre as outras subpopulaes. Houve diferenciao moderada entre a subpopulao do Noroeste com a da Zona da Mata ( = 0,10). Esses resultados indicam que apenas a subpopulao do Sul de Minas diferencia das demais. As outras subpopulaes no esto fortemente estruturadas. O nmero de migrantes em cada populao variou de 0,5 (Zona da Mata) a 8,3 (Noroeste) (Tabela 5).
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G.L 3 123 126

S.Q 36,79 228,9 265,75

Componente de Varincia 0,34 Va 1,86 2,20

Porcentagem de Variao 15,5 84,5

Tabela 4- Estimativas do desequilbrio de ligao por meio do ndice de associao (IA) e da estatstica alternativa do ndice de associao multilocos (rd) entre populaes de Sclerotinia sclerotiorum em lavouras e feijoeiro, Minas Gerais, Brasil. Populao Noroeste Tringulo Mineiro Zona da Mata Sul Total ** IA 1,41** 1,87** 1,71** 1,58** 1,81** rd 0,20** 0,27** 0,29** 0,27** 0,26**

Significativo a 1% de probabilidade

Tabela 5- Estimativa da diferenciao da populao (diagonal superior) e nmero de migrantes (diagonal inferior) entre populaes de Sclerotinia sclerotiorum em lavouras de feijoeiro, Minas Gerais, Brasil. Populaes Noroeste Triangulo Mineiro Zona da Mata Sul
a b

Noroeste 8,31 b 2,11 1,04

Tringulo Mineiro 0,03 a 5,85 1,05

Zona da Mata 0,10* 0,04 0,50

Sul 0,19* 0,19* 0,33* -

de Weir e Cokerham (Equivalente ao FST de Wright para organismos haplides) Nmero de migrantes (Nm) estimado por FST= 1/(1+4Nm) Significativo a 1% de probabilidade Pelo teste da razo de verossimilhana (teste G2) detectaram-se os locos que

mais contriburam para a diferenciao das subpopulaes. De maneira geral, houve diferenciao da subpopulao Sul em relao s demais. Houve tambm pequena diferenciao entre as subpopulaes Noroeste e Zona da Mata, significativa nos locos 7-2, 114-4, 106-4 e 92-4. No houve diferenciao entre as populaes nos locos 12-2, 9-2 e 36-4 (Tabelas 6 a 9). Devido ausncia de polimorfismo, a estatstica G no pode ser calculada entre as subpopulaes Sul e Zona da Mata no loco 9-2.
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Tabela 6- Probabilidade pelo teste da razo de verossimilhana das frequncias allicas (G2) entre os locos 9-2: (diagonal inferior) e 106-4 (diagonal superior) Pop N TM ZM S 0,67 0,14 0,66 0,03 0,08 NA N TM ZM S 0,00** 0,00** 0,00**

Tabela 9- Probabilidade pelo teste da razo de verossimilhana das frequncias allicas (G2) os locos 114-4 (diagonal inferior) e 13-2 (diagonal superior) Pop N TM ZM S 0,32** 0,00** 0,03** 0,00** 0,00** 0,00** N TM 0,38 ZM 0,65 0,66 S 0,50 0,37 1,00

0,00** 0,00** 0,03

** Significativo a 1%

** Significativo a 1%

N = Noroeste, TM = Tringulo Mineiro, ZM = Zona da Mata e S = Sul NA = no aplicado Tabela 8- Probabilidade pelo teste da razo de verossimilhana das frequncias allicas (G2) entre os locos 7-2 (diagonal inferior) e 12-2 (diagonal superior) Pop N TM ZM S N TM 0.25 ZM 0.00** 0.38 S 0.00** 0.00** 0.00** 0,24 0,13 0,32 0,54 0,17 0,00** Tabela 9- Probabilidade pelo teste da razo de verossimilhana das frequncias allicas (G2) os locos 114-4 (diagonal inferior) e 13-2 (diagonal superior) Pop N TM ZM S N TM 0,02 ZM 0,00** 0,01** S 0,00** 0,00** 0,00** 0,37 0,01** 0,00** 0,10 0,00** 0,00**

** Significativo a 1% ** Significativo a 1% N= Noroeste, TM= Tringulo Mineiro, ZM= Zona da Mata e S= Sul Pela anlise bayesiana detectaram-se seis agrupamentos de indivduos, com ocorrncia de mistura de gentipos entre eles (Figura 3, painel A). O grupo 1 foi composto por isolados da regio Noroeste. Houve dois indivduos imigrantes (sinalizados com *) pertencentes subpopulao Tringulo Mineiro (Figura 3, painel B). O grupo 2 foi composto por 95% de isolados do Sul, com apenas um imigrante do Noroeste. 73,9 % dos indivduos do Sul foram agrupados separadamente, o que comprova que os isolados dessa regio so diferentes dos das demais regies. O
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terceiro grupo foi formado principalmente (59%) por isolados da Zona da Mata, havendo 29% de imigrantes do Noroeste, 7% do Sul e 5% do Tringulo Mineiro. Nos grupos 4 e 5, observou-se mistura equilibrada de indivduos do Noroeste, Tringulo e Zona da Mata, com apenas dois indivduos imigrantes do Sul no quinto grupo. Por fim, o sexto grupo teve a maioria de indivduos oriundos do Noroeste com um pouco de mistura de indivduos das outras trs regies. De maneira geral, os isolados do Sul pertenceram a um grupo, enquanto os isolados da Zona da Mata, Noroeste e Tringulo Mineiro, eram misturados aos outros cinco grupos. O resultado semelhante aos anteriores, que indicaram no haver diferenciao entre os indivduos amostrados nessas trs populaes.

Figura 3 - Anlise bayesiana de agrupamento. Painel A: grupos representados pelas diferentes cores. Painel B: ampliao do painel A, distribuio dos isolados (barras verticais) dentro dos grupos. As siglas N, TM, ZM e TM se referem regio geogrfica de cada isolado; Noroeste, Tringulo Mineiro, Zona da Mata e Sul de Minas, respectivamente. Os isolados marcados com *foram considerados isolados imigrantes (pertencentes outra populao). 5. DISCUSSO
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A populao de S. sclerotiorum apresentou alta variabilidade gentica nas reas produtoras de feijo em quatro regies de Minas Gerais. A diversidade allica nos locos SSR analisados para os isolados de Minas Gerais foi mais alta que a constatada em estudos realizados no Canad (Sirjusingh e Kohn 2001), Estados Unidos (Atallah et al. 2004), Austrlia (Sexton e Howlett 2004) e Turquia ( Mert-Tu rk et al. 2007). Entretanto, o nmero de alelos constatado recentemente na populao de S. sclerotiorum do cerrado brasileiro foi maior que o encontrado no presente estudo. No cerrado, o nmero de alelos variou de seis a 18, mesmo com menor nmero de isolados analisados (79) (Gomes et al. 2011). O menor nmero de alelos encontrados nos mesmos oito locos SSR analisados no presente estudo sugerem que h maior diversidade gnica no cerrado em relao a Minas Gerais. Neste estudo, apenas o loco 106-4 teve maior variao allica em relao aos isolados do cerrado. Menor nmero de alelos (trs) foi encontrado no loco 36-4 que foi reportado como monomrfico em trabalhos anteriores nos EUA e no Canad (Atallah et al. 2004, Sexton e Howlett 2004). Diferenas de prticas agronmicas, e da diversificao de hospedeiros podem interferir na diversidade encontrada nas populaes de S. sclerotiorum (Malvarez et al. 2007). Houve menor riqueza e maior frao clonal na subpopulao da Zona da Mata em relao s demais. Na Zona da Mata, a produo de feijo caracterizada pela agricultura familiar, com pequenas reas de cultivo e baixo nvel tecnolgico (Costa 2007). Ressalta-se ainda que o feijo (hospedeiro) na maioria das vezes semeado apenas na safra da seca (de fevereiro a junho). Nas outras regies, a produo de feijo realizada em reas extensas, o uso de pivs mantm a umidade do solo quase que continuadamente, h plantios mais adensados e hospedeiros cultivados durante praticamente o ano todo, devido ao plantio da soja. Em relao aos fatores ecolgicos, a umidade do solo fator determinante para a produo de apotcios (Abawi e Grogan 1979, Twengstrom et al. 1998, Bolton et al. 2006). Curiosamente, durante as coletas realizadas no presente estudo, no foram observados apotcios em esclerdios de S. sclerotiorum nas lavouras da Zona da Mata. Por outro lado, nas regies Noroeste e Sul, foi observada a presena dessas estruturas. A formao ou no de apotcios parece no interferir substancialmente na estrutura gentica de S. sclerotiorum em lavouras de feijo de Minas Gerais, pois em todas as subpopulaes no houve evidncia de acasalamento aleatrio. Por se tratar

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de fungo homotlico, as consequncias da recombinao na variabilidade gentica da populao so pequenas (Ekins et al. 2011). Outra hiptese para menor variabilidade da subpopulao da Zona da Mata em relao s demais seria a possvel interferncia do processo de deriva gentica. Populaes de patgenos que sofrem reduo significativa de tamanho, causada por ausncia de hospedeiro, clima, etc., so menos diversificadas que aquelas que mantm altas populaes durante todo o ano (McDonald e Linde 2002). Conforme mencionado anteriormente, na Zona da Mata, a produo de feijo realizada predominantemente durante uma estao de cultivo por ano, portanto, espera-se haver menor tamanho da populao do patgeno. Ademais, a predominncia de poucos gentipos do patgeno pode tambm ser influenciada pelas caractersticas do cultivo de feijo nessa regio; feito por pequenos agricultores, que cultivam preferencialmente o feijo vermelho (Vieira et al. 2010). Os gros da safra anterior so usados para o plantio na safra seguinte (Fonseca et al. 2002), geralmente sem controle da qualidade fitossanitria. A troca e o comrcio desses gros prtica comum entre os agricultores (Fonseca et al. 2002). Tais fatos podem explicar a alta frequncia de um nico hapltipo nessa regio, j que a introduo do patgeno em reas indenes ocorre principalmente por sementes infectadas por miclio ou por lotes contaminados com esclerdios (Tu 1988; Napoleo et al. 2001; Vieira e Paula Jnior 2006). Dos 65 gentipos identificados, sete foram compartilhados entre duas ou trs regies, apenas dois estiveram presentes em todas as subpopulaes. O compartilhamento de gentipos indica migrao de indivduos entre subpopulaes. Estima-se que 77% a 90% dos ascsporos so depositados dentro de 100 m da fonte (apotcio) (Ben-Yephet e Bitton 1985). Por outro lado, alguns autores acreditam em disperso de ascsporos pelo ar a distncias de at 3 - 4 km (Cubeta et al. 1997). Desta forma, a reproduo sexual por meio de ascsporos, entre indivduos separados por longas distncias parece improvvel. A compra de sementes certificadas prtica incomum entre os produtores de feijo, mesmo em propriedades com maior nvel tecnolgico. Possivelmente, a migrao de indivduos ocorra por meio de esclerdios ou gros contaminados com miclio. Fungos que se reproduzem preferencialmente de forma assexuada geralmente tm estrutura populacionais clonais, ao contrrio dos que se reproduzem de forma
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sexuada cuja populao tende a ser mais diversa (Hemmati et al. 2009). Sclerotinia sclerotiorum apresenta ambas as fases (sexual e assexual) em seu ciclo de vida. Essa espcie pode se reproduzir assexuadamente por meio de esclerdios ou sexuadamente por autofecundao (Kohli e Kohn 1997). Entretanto, o fato de ser espcie homotlica no impede que haja recombinao entre os indivduos (Ekins et al. 2006). A recombinao sexual em fungos fitopatognicos tem implicaes diretas no manejo das doenas. Cultivares resistentes tendem a ser mais vulnerveis (terem a resistncia suplantada) e fungicidas menos efetivos (desenvolvimento de populaes resistentes) (Milgroom 1996). A hiptese de acasalamento aleatrio foi rejeitada em todas as subpopulaes, inclusive na populao total (composta pelas quatro subpopulaes). Vrios fatores, como seleo, fluxo gnico e deriva gentica podem causar desequilbrio gamtico nas populaes (Milgroom 1996). Foi observado fluxo gnico (nmero de migrantes) entre todas as populaes estudadas, principalmente entre as subpopulaes do Noroeste, Tringulo Mineiro e Zona da Mata, o que pode estar contribuindo para o desequilbrio observado. Apesar de no haver evidncia de recombinao, houve alta frequncia de gentipos nicos nas populaes. Ao comparar a distribuio dos alelos nos oito locos, entre os indivduos de uma regio (associao multilocos), observou-se que os indivduos so muito parecidos, com poucas diferenas de alelos. Isso explica os altos valores encontrados no ndice de associao (IA). A baixa diferena entre os indivduos dentro de uma populao resultaram em altos valores do ndice de associao. A ocorrncia de campos clonais de S. sclerotiorum com muitos gentipos em frequncias baixas foi reportado por Kohli e Kohn (1998), em estudo com 2747 isolados coletados em campos de canola no Canad. Segundo esses autores, a formao de novos gentipos pode ocorrer no apenas em decorrncia de meiose (reproduo sexual), mas tambm via mitose, aps a fuso de dois ncleos compatveis. Dessa forma, outros fatores podem estar gerando diversidade nas populaes de S. sclerotiorum em Minas Gerais. Embora alta clonalidade no tenha sido observada, acasalamento aleatrio no o principal fator que influencia a estrutura de gentica das subpopulaes de S. sclerotiorum em Minas Gerais. Em espcies homotlicas, reproduo sexual no necessariamente ir gerar recombinao e novos gentipos (Carbone e Kohn 2001). Por essa razo, o fato de S. sclerotiorum ser espcie homotlica, ajuda a explicar a alta riqueza gentica, porm
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ausncia de recombinao nas populaes estudadas. Segundo Kohli et al. (1992), variabilidade em populaes de S. sclerotiorum pode ser mantida por fatores como neutralidade seletiva, seleo transitria, fluxo gnico, recombinao sexual e mutao. Os mesmos autores classificam os ambientes povoados por S. sclerotiorum como neutros, devido s constantes mudanas de macro e microclima, hospedeiros, e prticas agronmicas. Situaes de forte presso de seleo tendem a gerar homogeneidade dentro das populaes, visto que poucos gentipos so selecionados. De forma anloga, na ausncia de forte presso de seleo, geralmente observa-se alto nmero de gentipos em baixa frequncia nas populaes. Essa situao parece ser condizente com o que foi observado nas populaes de S. sclerotiorum em Minas Gerais. Outra possvel explicao para explicar a alta riqueza genotpica encontrada nas populaes em Minas Gerais a ocorrncia de mutaes. Segundo McDonald e Linde (2002), as taxas de mutao tendem a serem maiores quanto maior o tamanho das populaes. Na maioria das lavouras amostradas nesse estudo, havia alta incidncia de S. sclerotiorum. Outro fato importante que dentro de uma mesma regio os gentipos dos indivduos eram similares, diferindo em poucos alelos na maioria das vezes. Essa caracterstica tpica de mutaes pontuais. Indivduos recombinantes costumam ter uma mistura dos gentipos parentais, tornando-se bem diferentes. Em populaes de fungos caracterizados por sistemas endogmicos, h evidncias de que a variabilidade gentica est fortemente associada ao acmulo de mutaes no genoma (Whittle et al. 2011). Portanto, mutaes podem ser fontes importantes de variabilidade nas subpopulaes de S. sclerotiorum em Minas Gerais. Nossa hiptese que a ocorrncia de mutaes e fluxo gnico entre as regies, so os principais mecanismos pelos quais a populao de S. sclerotiorum em Minas Gerais se mantm diversa. A populao de S. sclerotiorum em lavouras em Minas Gerais est moderadamente estruturada (Fst = 0,15). A conduo de experimentos que selecionam linhagens resistentes e/ou tolerantes ao mofo-branco, a principio, deve ser feita nas diferentes regies, visto que h diferenas entre as populaes de S. sclerotiorum. Um cultivar resistente, cujo processo de seleo for realizado com isolados pertencentes a um ou poucos locais, tender ao insucesso caso venha a ser cultivado em outras regies. Vale ressaltar que testes de virulncia entre os isolados de diferentes regies so necessrios para orientar os programas de melhoramento na
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escolha de isolados ou regies geogrficas onde os ensaios sero conduzidos. Aparentemente, as subpopulaes de S. sclerotiorum das regies Noroeste, Tringulo Mineiro e Zona da Mata tm estrutura gentica parecida. Nossa explicao que o fluxo gnico entre essas regies mediado provavelmente por sementes contaminadas com esclerdios, o que explica a no diferenciao dessas populaes. Quanto subpopulao do Sul, acredita-se que a diferenciao seja maior pela possibilidade de ser influenciada por gentipos que ocorrem em outras regies no amostradas, possivelmente de localidades do Estado de So Paulo, pela proximidade geogrfica. Ao analisar a distribuio dos indivduos em cada grupo formado com base em ancestralidade, observou-se que 73,9% dos indivduos pertencentes ao Sul foram agrupados separadamente. Indivduos das outras regies foram encontrados nos outros cinco grupos. Esse resultado est de acordo com os obtidos pela diferenciao das populaes por meio da estatstica , e confirmam que a subpopulao Sul se diferencia das demais. Foi observada tambm a presena de indivduos imigrantes dentro dos grupos. Existem vrios mecanismos pelos quais fungos fitopatognicos podem migrar de uma regio geogrfica para outra. No caso de S. sclerotiorum, a migrao de indivduos entre as reas de cultivo feita principalmente por meio de esclerdios misturados s sementes. Ascsporos so inculo mais importantes para a dinmica da doena dentro dos campos (Abawi e Grogan 1979). Na maioria dos estudos, maior porcentagem de variao de S. sclerotiorum atribuda variabilidade dentro das populaes. Gomes et al. (2011) utilizaram 10 marcadores SSR e encontraram 71,2 % de variao dentro das populaes. Hemmati et al. (2009), trabalharam com 276 isolados de S. sclerotiorum coletados em campos de canola no Ir e encontraram 96% de variao dentro das populaes. A variao dentro das populaes encontrada por Atallah et al. (2004), foi de 92,4%. Em nosso estudo 84,5 % da variao total foi atribuda variabilidade dentro das subpopulaes regionais. Grande parte dos 15,5 % da variao atribuda variabilidade entre populaes deve-se a diferena da subpopulao Sul em relao s demais. Pelo fato de ser fungo homotlico, era de se esperar essa maior variao dentro das populaes. Ademais, a probabilidade de ocorrer alguma recombinao entre indivduos que esto prximos geograficamente maior do que aqueles separados por longas distncias. Outra possvel explicao para esse fato a gerao
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de variabilidade via mitose aps fuso de ncleos compatveis (Kohli e Kohn 1998). A somatogamia (fuso de hifas) s possvel entre indivduos que esto prximos geograficamente (dentro da populao). Embora possvel, recombinao mittica no tem sido observada em populaes naturais (Kohli e Kohn 1998). No h informaes suficientes para afirmar que esse processo gere alguma variabilidade dentro das populaes de S. sclerotiorum em Minas Gerais. As implicaes dos resultados deste trabalho para o manejo do mofo-branco do feijoeiro em Minas Gerais so de muita importncia. O fato de as populaes serem variveis implica em possveis diferenas de virulncia e sensibilidade a fungicidas. Logo, a seleo de materiais para resistncia/tolerncia a S. sclerotiorum no Estado de Minas Gerais, deve ser realizada em diferentes regies, a fim de minimizar os riscos de uma prematura suplantao de resistncia.

6. CONCLUSES Existe variabilidade entre as populaes de Sclerotinia sclerotiorum, causadoras do mofo-branco do feijoeiro em Minas Gerais. O patgeno altamente varivel dentro das populaes em cada regio. Menor variabilidade foi encontrada na populao da Zona da Mata em relao s demais. As populaes de Sclerotinia sclerotiorum das regies Noroeste, Zona da Mata e Tringulo Mineiro tm estrutura gentica semelhante, entretanto h forte diferenciao entre a regio Sul e as demais.

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