Transformacin de Escherichia coli con DNA plasmdico.

Introduccin: Las bacterias poseen 3 mecanismos de intercambio de material gentico (ya que carecen de reproduccin sexuada) entre individuos de la misma especie y, en ciertos casos, entre distintas especies. Dichos mecanismos son conjugacin, transduccin y transformacin. La conjugacin y transduccin estn explicadas en la gua de Tps, nosotras haremos hincapi en la transformacin, ya que sta es la que realizamos en el laboratorio. La transformacin es la adquisicin de DNA desnudo del medio extracelular por una clula bacteriana (que se denomina competente). Este estado de competencia es transitorio y generalmente se debe a un crecimiento rpido o a falta de nutrientes. Cuando ingresa a la clula puede ocurrir que el DNA se degrade o se puede incorporar al cromosoma bacteriano por recombinacin y si el DNA es un plsmido incluso puede quedar como un elemento replicativo autnomo dentro de la clula. Este mecanismo que acabamos de explicar es natural y requiere la expresin de una compleja maquinaria celular. A diferencia de este proceso que es natural, en la transformacin en el laboratorio la competencia en clulas bacterianas es inducida para la introduccin de plsmidos (no es un estado natural de la clula). Estas bacterias fueron previamente crecidas en un medio de cultivo con LB lquido, colectadas durante la fase log y tratadas con CaCl2 para neutralizar las cargas negativas de los fosfatos del DNA y de los fosfolpidos de la membrana bacteriana para disminuir la repulsin natural entre las cargas y as facilitar el ingreso del DNA plasmdico a la clula( se resuspendieron en una solucin fra que contena este compuesto).Se utilizaron cepas del laboratorio de Escherichia coli previamente tratadas como se explic y el DNA plasmdico que extrajimos en el TP1.Tambin realizamos un control negativo, uno positivo y uno de viabilidad que sern explicados a lo largo del trabajo prctico. Es importante recordar que los plsmidos utilizados tienen un origen de replicacin de alto nmero de copias y el gen de la lactamasa, una enzima que degrada ampicilina para as poder lograr que slo crezcan las bacterias que contienen al plsmido, ya que las bacterias de E. coli no tienen esta enzima y no resisten la ampicilina (que va a estar en nuestro medio de cultivo). El objetivo del trabajo es transformar E. coli con el plsmido que purificamos en el TP1 y calcular la eficiencia de una preparacin de clulas competentes. Desarrollo: Recibimos 3 tubos eppendorf con 50 microlitros de bacterias competentes en hielo y los numeramos del 1 al 3. Al tubo 1 le agregamos 2 microlitros de agua estril (control negativo), ya que al agregarle agua estril, las bacterias no van a resistir la ampicilina por lo que en la caja de petri no esperamos ver nada la clase siguiente), al tubo 2 le agregamos 2 microlitros de nuestro plsmido diluido 1/100 y al tubo 3 le agregamos 2 microlitros de plsmido control preparado por los docentes (este tubo es nuestro control positivo). Ya que las bacterias competentes tenan sus membranas alteradas las tuvimos que manipular cuidadosamente y para evitar contaminacin todos los pasos realizados se realizaron cerca de un mechero encendido y con las manos limpias en alcohol. Dejamos los 3 tubos 20 minutos en hielo y luego los colocamos rpidamente del hielo a un bao a 42 durante 1 minuto y medio para que se produzca un shock trmico. Este paso se realiza para que el DNA plasmdico ingrese a las clulas ya que la combinacin de Ca2+ y la temperatura hacen que se formen poros en las membranas plasmticas bacterianas. Luego pusimos los 3 tubos nuevamente en hielo durante 5 minutos para enfriarlos rpidamente (no se pork!!) y pasados los 5 minutos le agregamos 950 microlitros de LB lquido (sin ampicilina), homogeneizando por inversin y los colocamos en un bao a 37 durante 30 minutos. Este paso lo realizamos como un medio

de recuperacin, para que las clulas se estabilicen y comiencen a expresar el gen de la - lactamasa antes de plaquear las muestras en un medio de cultivo con ampicilina. Como ltimo paso plaqueamos 100 microlitros de los 3 tubos en placas de Petri con LB agar (slido) que contena ampicilina. Dejamos las muestras y a la clase siguiente observamos qu haba en las 3 placas. Nosotras no realizamos el control de viabilidad, lo realiz otro grupo, que fue agregarle LB slido sin ampicilina y los resultados fueron un csped de bacterias por lo que las bacterias estaban vivas. Resultados Al analizar las placas, pudimos observar las siguientes situaciones: En la placa correspondiente a la suspensin de bacterias del tubo nmero 1 (control negativo) no obtuvimos ninguna colonia. En la placa correspondiente a la suspensin de bacterias del tubo nmero 2 (plsmido diluido 1/100 de nuestro grupo) no obtuvimos ninguna colonia. En la placa correspondiente a la suspensin de bacterias del tubo nmero 3 (plsmido control purificado por los docentes) obtuvimos un nmero de al menos 430 colonias. Finalmente calculamos la eficiencia de transformacin: Eficiencia= 4300UFC = 4.300.000 ufc/g DNAp 0,001 g DNAp Discusin En el caso de la placa nmero 1 (control negativo), no observamos ninguna colonia de bacterias, esto era de esperarse ya que al no haber adquirido el DNA plasmdico, carecan del gen de la -lactamasa, que las hace resistentes a la ampicilina. Debido a esto, las bacterias mueren y no forman colonias. En el caso de la placa nmero 2 (nuestro plsmido purificado), no observamos ninguna colonia. Esto fue algo que nos llamo la atencin, ya que si todo hubiese salido correctamente las bacterias deberan haber adquirido el plsmido, lo cual las hubiese hecho resistentes a la ampicilina y serian capaces de formar colonias. Nuestra hiptesis es que hubo una complicacin cuando comenzamos a realizar el experimento, ms precisamente, al momento de agregar el plsmido al tubo nmero 2 o cuando tuvimos que mezclar por inversin. En el caso de la placa nmero 3 (control positivo), observamos al menos 430 colonias. Este era el resultado esperado ya que las bacterias haban sido mezcladas con el plsmido control previamente purificado por los docentes. Finalmente, analizamos los resultados de los dems grupos y sacamos las siguientes conclusiones: Algunos equipos, obtuvieron 0 colonias en sus 3 tubos. Probablemente hayan cometido algn error en el procedimiento, ya que afecto a los 3 por igual. Por otro lado, otros obtuvieron colonias en el tubo numero 1 que se supone debe dar 0 colonias, ya que es el control negativo. Creemos que esto se debe a que hubo una contaminacin que pudo haber sido causada por varios motivos: no trabajar lo suficientemente cerca del fuego (que crea un ambiente estril alrededor de la llama del mechero de bunsen), no haber higienizado bien el lugar de trabajo o no haberse desinfectado correctamente las manos antes de manipular la micro pipeta. Cuestionario 1) Qu informacin se obtiene de las placas correspondientes a los tubos 1,2 y 3? Y del control de viabilidad? Esta placa sirve de control negativo, no se ven bacterias ya que no tienen el gen de resistencia a la ampicilina, no se introdujo DNA plasmdico a esta solucin sino agua y

simplemente es para verificar que el LB agar-ampicilina funciona correctamente. Del tubo 2 y 3, realizando clculos, podemos calcular la eficiencia de las bacterias transformadas. El control de viabilidad es para confirmar que las bacterias utilizadas en los 3 tubos estn vivas, por eso el resultado es un csped de bacterias ya que a dicho tubo no se le agreg ampicilina. 2) Por qu es necesario incubar las bacterias a 37 antes de extenderlas sobre la placa de Petri? En necesario para que las bacterias se estabilicen luego del shock trmico que sufrieron y comience a replicarse dentro de las clulas el plsmido con el gen de resistencia al antibitico( esto se realiza previo al plaqueo en un medio de cultivo con ampicilina porque si las bacterias no tienen este gen mueren) 3) Qu ocurre con el DNA plasmdico una vez dentro de la clula? Una vez que ingresa a la clula, el plsmido transforma a la bacteria y queda como un elemento replicativo autnomo dentro de la clula (replica su DNA dentro de ella) que no tena plsmido al principio. 4) Cmo caracterizaron Avery, MacLeod y McCarthy al principio transformante? A qu conclusin llegaron? El principio transformante fue observado primeramente por Griffith que realiz un experimento que 16 aos despus siguieron Avery, MacLeod y McCarthy. El experimento que realiz Griffith fue con ratones y cepas R (rugosos, que no daan a los ratones) y cepas S(lisos, que son mortales) de pneumocos. Inyect pneumocos S muertos por calor junto con R vivos y observ que los ratones moran a causa de neumona que causaban los pneumocos S. Las conclusiones fueron que algn componente presente en las cepas S, transformaba a las R en S y por lo tanto, en mortales para los ratones pero no se saba cul hasta que Avery, MacLeod y McCarthy descubrieron que era el DNA el principio transformante ya que realizaron los mismos experimentos varias veces pero con enzimas (una a la vez) que degradaran componentes celulares. Cuando trataron los pneumococos S con DNasas (degradadoras de DNA), los ratones sobrevivieron y no se realiz la transformacin por lo que la conclusin fue que el ADN contena el material gentico. 5) Las bacterias transformadas, se extienden con una placa de Petri con medio LB slido, para facilitar la identificacin de las colonias. 6) Se transforma una cepa sensible a la ampicilina con 1.5 ng de un plsmido que porta resistencia a dicho antibitico, con un inserto que corresponde a la zona promotora del gen de insulina humana. Luego de incubar toda la noche las placas de Petri con medio slido con ampicilina a 37 se cuentan 200 colonias. A) Calcule la eficiencia de transformacin. B) Por qu es til utilizar un plsmido que porta el gen de resistencia a la ampicilina? A) Eficiencia= 2000 UFC = 1.333.333.333 ufc/g DNAp 0,0015 g DNAp B) La utilidad de usar un plsmido resistente a la ampicilina, reside en que como la cepa que se busca transformar es sensible a dicho antibitico, esto le brinda a la bacteria la capacidad de sobrevivir en un medio con ampicilina y formar colonias. Introduccin Uno de los mecanismos por los cuales las bacterias intercambian material gentico entre s es el de trasformacin. ste consiste en la adquisicin, por la bacteria, de ADN desnudo proveniente del medio extracelular. Dentro de ella el mismo puede ser

degradado, incorporarse al genoma bacteriano por recombinacin o, si se tratase de un plsmido, permanecer como tal. Cuando las bacterias se encuentran en un estado fisiolgico en el que son capaces de realizar transformacin, se dice que son competentes. Dicho estado transitorio est asociado a un crecimiento rpido y falta de nutrientes. En 1928, Frederick Griffith observ por primera vez el fenmeno de transformacin experimentando con bacterias Streptocuccus pneumoniae. Trabaj con dos cepas de esta bacteria causante de la neumona en ratones. Una de las cepas produca la muerte del ratn mientras que la otra no. Sabiendo esto, incub un lisado de bacterias letales con bacterias inocuas vivas, con lo que luego inyect a los ratones, los cuales enfermaron y murieron. Este experimento prob que haba algo de las bacterias mortales que era tomado por las bacterias inocuas, transformndolas y volvindolas letales. En 1944, Avery, MacLeod y McCarty, realizando diferentes tratamientos a los componentes de pneumococos letales muertos para luego continuar el experimento de Griffith, demostraron que aquel principio transformante era el ADN. In vitro, se puede hacer competentes a las bacterias al incubarlas en un medio fro con el ADN plasmdico que se desea introducir y CaCl2. Esta tcnica altera la pared celular y permite que el ADN adsorba sobre la membrana bacteriana, la cul tiene menor fluidez por efecto de las bajas temperaturas. Luego, se debe producir un shock trmico (pasaje brusco a 42C) durante 90 para que se formen poros en la membrana de la bacteria, por los que el DNA pasa al interior de la misma. Posteriormente, se debe dejar que las bacterias se estabilicen en un medio de cultivo (LB) sin antibitico a temperatura ptima, para que comiencen a expresar el gen de resistencia al antibitico determinado (que est contenido en el plsmido introducido) que permitir seleccionarlas al plaquearlas en LB conteniendo dicho antibitico. Cabe aclarar que el ADN plasmdico debe tener un origen de replicacin para poder replicarse autnomamente dentro de la clula. Descripcin del experimento En este trabajo prctico se utiliz el ADN plasmdico extrado en el TP1. Se trabaj con tres tubos eppendorf, cada uno con 50l de bacterias competentes en hielo los cuales se rotularon 1, 2 y 3. Posteriormente, se agreg al tubo 1 5l de agua esterilizada (control negativo), al tubo 2 5l del plsmido control (control positivo), y al tubo 3, 5l del plsmido obtenido en el TP1; estos tubos se dejaron en hielo durante 20 min. Para evitar la contaminacin de las preparaciones con otras bacterias, esporas de hongos, etc. libres en el ambiente, toda manipulacin de las mismas fue realizada en condiciones de esterilidad, cerca de una fuente de calor (mechero Bunsen). Luego se realiz el shock trmico para que se formen poros transitorios en la membrana de las bacterias y entren los plsmidos. El mismo consiste en tomar del hielo los tubos y pasarlos inmediatamente a un bao a 42C durante un minuto y medio indefectiblemente, para luego pasar al hielo nuevamente durante cinco minutos. Luego se agregaron 950l de LB lquido a los tres tubos y se los mezcl por inversin para luego incubarlos en bao trmico durante 30 minutos a 37C. El LB es un medio de cultivo que contiene bacto-triptona 10g, extracto de levadura 5g, NaCl 5g y se le agrega agua hasta llegar a un litro; esta solucin sirve para estabilizar a las bacterias (dado que vienen de un shock) y para que comiencen a expresar el gen de resistencia al antibitico. Para concluir, se prepararon tres placas de Petri con LB slido con ampicilina (antibitico); luego, se agreg a cada una de ellas el contenido de uno de los tubos con bacterias (tubos 1, 2 y 3), y se incub en estufa durante 18Hs a 37C. Posteriormente, las placas fueron retiradas de

la estufa y conservadas en heladera una semana (para frenar el crecimiento de las colonias bacterianas de manera que sean identificables y no se forme un csped). Resultados: Control de viabilidad: Al plaquear bacterias en LB sin ampicilina, se espera observar un csped ya que no hay agente selectivo que mate algunas bacterias y otras no; todas crecen normalmente en dicho medio. De no observarse colonias o de encontrar muy pocas, esto significara que las bacterias ya estaban muertas antes del plaqueo, o que el LB no se prepar correctamente, etc. Afortunadamente, en este control se observ un csped de bacterias. Control negativo (Tubo 1): Dado que las bacterias del tubo 1 se incubaron con H2O estril, se presume que las mismas no tienen plsmido con gen de resistencia a ampicilina y, por lo tanto, al plaquearlas en LB con el antibitico es de esperarse que no se observen colonias ya la ampicilina matara a las bacterias. Efectivamente, esto es lo que se observ en la placa 1. Por lo tanto, las bacterias (que son las mismas en los tres tubos) no expresan resistencia a ampicilina por s mismas ni hubo ningn tipo de contaminacin con bacterias resistentes. Control positivo (Tubo 2): El plsmido control, preparado por los docentes, es el mismo que el extrado por el grupo en el TP1, por lo tanto, dicho plsmido contiene el gen de resistencia a ampicilina. Se supone que este plsmido est intacto y no tendr problemas para expresarse en bacterias transformadas con el mismo. Por lo tanto, al observar la placa 2 se esperara contar algunas colonias, correspondientes a aquellas bacterias que fueron transformadas con dicho plsmido ya que la placa contiene ampicilina, lo que significa que toda bacteria que no exprese la resistencia morira. De hecho, trascurrido el tiempo de incubacin, se contaron en la placa 158 colonias. Este control asegura que las bacterias fueron hechas competentes correctamente y pueden expresar la resistencia a antibitico que le confieren los plsmidos. Placa 3, del plsmido extrado en el TP1: Transcurrido el tiempo de incubacin de las bacterias en placas de LB slido con ampicilina, se espera observar colonias correspondientes a aquellas bacterias que fueron transformadas con el plsmido extrado en el TP1, (el que se supone en buenas condiciones, de manera tal que se exprese en las bacterias volvindolas resistentes al antibitico). En este experimento se contaron 311 colonias. Eficiencia de transformacin para el plsmido control: De los 5l contenidos en el tubo de plsmido control, 1ng corresponda a plsmidos. El contenido de este tubo se agreg a los 50l de bacteria del tubo 2, volumen que luego se llev a los 1000l agregando LB lquido. Por lo tanto, en 1000l de solucin, haba contenido 1ng de plsmido. De estos 1000l se extrajeron 100l para el plaqueado. Si en 1000l haba 1ng de plsmido, entonces en 100l haba 0.1ng. En la placa se

contaron 158 colonias, es decir que 0.1ng de plsmido se corresponden con 158 UFC. Finalmente, para expresar la eficiencia de transformacin en trminos de unidades formadoras de colonias por microgramo de plsmido se calcul que si a 0.1ng corresponden 158 colonias, entonces a 1000ng (1g) corresponden 1580000 colonias. Es decir, la eficiencia de transformacin para el control de ADN plasmdico es de 158x104 UFC/g Conclusiones: Siendo que los resultados de los controles y del plaqueado del tubo 3 fueron los esperados, puede considerarse que los procedimientos se realizaron correctamente. Dado que la cantidad de colonias obtenidas en la placa 3 casi duplica la obtenida en la placa 2 (de control positivo) sobre la que se calcul la eficiencia de transformacin de las bacterias competentes, se deduce que el plsmido del tubo 3 estaba mucho ms concentrado que el del tubo 2; es decir, ms bacterias pudieron transformarse con el plsmido del tubo 3 que con el del tubo 2 debido a las concentraciones relativas, ya que las bacterias y los plsmidos son los mismos para cada caso. Tambin puede haber ocurrido que al manipular las bacterias competentes con sus membranas alteradas, algn movimiento o golpe al tubo 2 haya destruido algunas bacterias y otras no, por lo tanto la cantidad de bacterias contenidas en el tubo 2 fuera menor a las contenidas en el tubo 3. Otras posibles causas pueden ser que no se hayan incubado en iguales condiciones las bacterias con los diferentes plsmidos, siendo las condiciones ms ptimas para un caso que para el otro. INTRODUCCIN A LA BIOLOGA MOLECULAR Y CELULAR

TRABAJO PRCTICO N 3

TRANSFORMACIN DE Escherichia coli CON DNA PLASMIDCO

Introduccin Una transformacin ocurre cuando una bacteria obtiene DNA desnudo del medio extracelular. Objetivo El objetivo del trabajo prctico es transformar Escherichia coli con el plsmido purificado obtenido en el trabajo prctico anterior (Extraccin de DNA plasmdico). Metodologa 1. Se debi esterilizar el lugar de trabajo con alcohol al 70 % al igual que nuestras manos para obtener la ausencia total de microorganismo como pueden ser esporas, que compitan con nuestro plsmido por los nutrientes. Tambin se deben realizar todos los pasos con un mechero encendido a una distancia no mayor de los 20 cm. 2. Los 3 tubos eppendorf recibidos, con 50 l de bacterias competentes c/u se encuentran en hielo; tambin se recibi un cuarto tubo con el plsmido control de concentracin 0,5 g/l obtenido por los docentes y el tubo con el plsmido obtenido por nosotros en el trabajo prctico anterior. 3. Se diluy nuestra muestra en 2/20 con 18 l de agua destilada para obtener una dilucin de 1/100 de plsmido. Se mantienen todos los tubos en hielo y se los numera. Debido a que previamente al desarrollo de nuestro TP, en el laboratorio se indujo la competencia en clulas bacterianas para la introduccin de plsmidos, es necesario manipularlas con cuidado. Este tratamiento previo de acuerdo al mtodo Hanahan, consisti en la incubacin en hielo del DNA plasmdico con las clulas competentes en solucin de CaCl2, que servir para que el Ca2+ neutralice las cargas negativas de los fosfatos de DNA y de los fosfolpidos de la membrana bacteriana, disminuyendo en consecuencia la repulsin natural de estas biomolculas; esta solucin tambin altera la estructura de la pared celular que en conjunto con la baja temperatura que disminuye la fluidez de la membrana facilitar la entrada del DNA a las bacterias. Como segundo paso

dentro de este tratamiento se efectu un shock trmico pasando desde el hielo directamente a un bao de 42C por un minuto y medio para lograr que se formen poros en la membrana plasmtica de las bacterias y as pueda incorporarse el DNA plasmdico a las clulas. H2O 4. Se agregan a cada uno de los tubos lo que indica la siguiente tabla: |Tubo # |H2O estril |Plsmido control |Plsmido obtenido en el TP |1 |2 |3 | |2 l ||| ||2 l || |||2 l

5. Se los deja en hielo durante 20 minutos. 6. Se colocan las 3 tubos a 42C durante no ms de 90, es decir durante minuto y medio controlando rigurosamente el tiempo. 7. Se ponen los tubos en hielo con agua para que se enfren rpidamente durante 5 minutos. 8. Se agregan 950 l de LB lquido, que sirve como medio de cultivo, a cada uno de tubos numerados (1, 2 y 3), se homogeniza por inversin e incubar por 30 minutos a 37C en bao termosttico para lograr el mismo efecto de shock trmico explicado antes. 9. Transcurrido este tiempo se centrifugan las bacterias a 4500 rpm durante 10 minutos, se descarta el sobrenadante por volcado y se resuspende el pellet en el medio LB remanente. 10. Se plaquea la suspensin de bacterias, es decir se colocan 950 l de la muestra de bacterias en placas de petri que contienen LB slido con ampicilina, en una medida de 100 g/l. Tambin se plaquean 100 l de los tubos 1, 2 y 3 en placas (tambin numeradas) de LB sin ampicilina que sern el control de viabilidad. Tambin se toma un rastrillo que se bebe en alcohol y se lleva al fuego durante 5 segundos, se controla que no est a mucha temperatura para evitar romper el LB, y se rastrilla hasta que se seca la muestra y la friccin es evidente, con la placa parcialmente abierta para conservar las condiciones de esterilidad. 11. Se incuban todas las placas a 37C en estufa, durante 18 hs y se observan los resultados una semana despus. 12. Se debe calcular la eficiencia del trabajo de transformacin como nmero de UFC (unidades formadoras de colonias) por microgramo de DNA introducido para el control de DNA plasmdico elaborado por los docentes. Los medios de cultivo utilizados y preparados por los docentes son: LB Bacto-triptona 10 g Extracto de levadura 5 g

NaCl 5 g H2O llevar hasta 1 litro Se esteriliza autoclavando la solucin durante 20 minutos. LB slido A 1 litro de LB se le agregan 15 g de bacto-agar Se esteriliza autoclavando durante 20 minutos.

Cuestionario 1) Placa 1: Sabemos que se trabajaron en condiciones de esterilidad porque las bacterias fueron tratadas con agua destilada, por lo tanto nunca tuvieron el plsmido con resistencia a ampicilina, por eso no prosperaron. Si creca alguna bacteria es porque no se cumplieron con las condiciones de esterilidad. Placa 2: Este es un control positivo porque sabemos la masa del plsmido utilizado y tambin sabemos que la transformacin bacteriana se realiz correctamente al ver que hay colonias con resistencia a ampicilina. Placa 3: Aqu nos damos cuenta si pudimos aislar correctamente el plsmido del tp 1 y saber que no est daado. Al ver colonias resistentes a ampicilina sabemos que el plsmido est siendo expresado y que la transformacin bacteriana se realiz correctamente. Control de vialidad: Con este control sabemos si desde un comienzo trabajamos con bacterias vivas ya que esta placa no tiene ampicilina (no hay un factor de seleccin). Si no vemos colonias es porque no estaban vivas desde un comienzo o se cometi un error en el procedimiento como dejar pasar ms de 1:30 min en el shock trmico. 2) La incubacin a 37c permite que la clula se estabilice despus del shock trmico y comiencen a expresar el gen de resistencia al antibitico antes del plaqueo. 3) El DNA plasmdico queda dentro de la bacteria como una unidad gentica autnoma si tiene un origen de replicacin y un gen de seleccin. Si tiene ambas cosas quedar dentro de la bacteria. 4) Avery, McLeod y McCarty caracterizaron al principio transformante porque en un extracto libre de clulas de una sepa bacteriana mortal contra ratones, las trataron con enzimas degradadoras de sustancias orgnicas y luego mezclaban esta solucin con una sepa no mortal para ratones y se las inyectaban estos. El nico tratamiento que se obtuvo como resultado la no transformacin de la sepa no mortal y por lo tanto que vivieron los ratones fue cuando se trato al extracto libre de clulas con DNasas. De esta forma llegaron a la conclusin de que el DNA es el principio transformante.

5) Se extiendo sobre un medio LB slido para poder reconocer al cabo de un tiempo la cantidad de colonias que hay. Si fuera en un medio LB lquido no se formaran colonias y no me servira de nada porque no podra calcular por ejemplo la eficiencia de transformacin. 6) 1,5 ng plsmido y 200 colonias 200= 133,33 ng/ml= EFICIENCIA 1,5 Resultados Se contaron las colonias obtenidas en cada placa y se obtuvieron los siguientes resultados: | |Colonias Formadas |H2O estril |0 |Plsmido Control |154 |Plsmido Obtenido en el TP. |250 | | | |

A partir de estos datos se pudo conseguir la eficiencia de la transformacin y la concentracin inicial del plsmido obtenido del TP anterior: En una de las placas se coloco 1l correspondiente al plsmido control preparado por los docentes de concentracin 0,5 g/l, utilizando 2 l de nuestro plsmido, este tendra una concentracin de: 1g5l 2gx = 1l Ya que [pic], es la eficiencia de la transformacin en nuestro plsmido esta result ser: [pic]. Considerando que nuestro plsmido estaba diluido en 1/10 Para saber la cantidad de g/l que hay en nuestro plsmido planteamos: |g plsmido= 16,23g |

[pic] [pic] g = 0,162. 100 Entonces: 2l 16,23 g 1l x = 8,11 UFC/g de DNA introducido para el control de DNA plasmdico entregado por los docentes

Conclusin: