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UNIVERSIDAD INTERAMERICANA DE PUERTO RICO RECINTO METROPOLITANO PROGRAMA DE TECNOLOGIA MDICA

PROCEDIMIENTOS EN EL LABORATORIO DE INMUNOHEMATOLOGIA

PROF. NITZA V. RIVERA ROSA MT ASCP 2011

REGLAS APLICADAS AL LABORATORIO DE BANCO DE SANGRE GENERAL 1. Todo estudiante efectuar las pruebas asignadas individualmente. Se proveer a cada estudiante muestras desconocidas numeradas . Los estudiantes siempre trabajaran el desconocido que corresponda a su numero asignado en el programa. NO se repondrn muestras ni se repetirn laboratorios por motivo de ausencias. 2. Los estudiantes deben traer al laboratorio el procedimiento escrito y la hoja de reporte del informe de laboratorio que corresponde. 3. El estudiante seguir en todo momento las reglas de seguridad. El uso de equipo de seguridad es compulsorio . No podr realizar el laboratorio correspondiente sino cumple con esta regla. REACTIVOS: 1. Las mayoras de los reactivos utilizados estn acomodados en cajitas de metal rotuladas. Cada 5 estudiantes utilizaran los reactivos de la caja que le corresponda. Los reactivos no pueden ser intercambiados de una caja a otra. En nmero de la caja utilizada se incluir en el reporte. 2. Al final de cada laboratorio, las cajas con los reactivos se guardaran en la nevera . Es responsabilidad de cada estudiante velar porque esto se cumpla. Perdern 5 puntos del informe de laboratorio todos los estudiantes del grupo que no cumpla esta regla. 3. Los reactivos que no se encuentren en las cajitas de metal estarn localizados en la mesa central. Los estudiantes utilizaran estos reactivos en esta mesa y bajo ningn concepto los llevaran al rea de trabajo. PROCEDIMIENTO: 1. Todos los procedimientos se llevaran a cabo en tubos 12 x 75mm. 2. Rotule con marcador permanente de forma clara e incluya el numero de la muestra. 3. Siempre aada sueros o anti-sueros antes que las clulas a una razn de 2:1. (2 gotas de suero y 1 gota de clulas) 4. Examine los tubos al final de cada paso del procedimiento para asegurarse que se aadi los reactivos o muestras. 5. En cada fase de reaccin, examine cada tubo de reaccin utilizado contra un fondo de luz brillante y compare con las ilustraciones. Gradifique todo resultado positivo comparando la reaccin con las ilustraciones provistas. Reporte resultado gradificado. 6. Confirme todo resultado negativo con clulas control. INFORME: 1. Los informes se entregarn al finalizar el laboratorio en la hoja de informe correspondiente. 2. La puntuacin del laboratorio se distribuye de la siguiente forma: Laboratorios (4) 10 puntos cada uno 40 puntos Puntualidad, organizacin y ejecucin -- 10 puntos Total: 50 puntos El total constituye el 10% de la nota del curso.

Equipo y Materiales utilizados en todos los laboratorios 1. Centrifuga serolgica 2. Bao seco a 37C 3. Lmpara amplificadora 4. Transfer Pipets (Goteros) 5. Gradillas rojas PRUEBAS DE ANTIGLOBULINA (COOMBS TESTS)

I. METODO INDIRECTO (IAT, Coombs Indirecto) Esta prueba se utiliza para la deteccin de la presencia de anticuerpos incompletos y anticuerpos que fijan complemento, en suero despus de la adicin de clulas sensitizadas. Muestras: Suero del paciente y suspensin de clulas de paciente al 2-5% Reactivos: 1. Salina 0.85% 2. Albumina 22% 3. Clulas O comerciales detectoras de anticuerpos (Tro de Clulas I,II,III ) 4. Antihuman Globulin (AHG) Poliespecfico (Anti IgG, C3d) 5. Clulas Control de Coombs (IgG-coated Check cells ) Procedimiento: 1. Rotule 4 tubos de la siguiente forma: I, II, III y AC(Autocontrol). Incluya el # del desconocido. 2. Aada 2 gotas de suero del paciente a cada tubo rotulado. 3. Aada 1 gota de clulas I al tubo rotulado I, 1 gota de clulas II al tubo rotulado II y 1 gota de clulas III al tubo rotulado III. 4. Aada 1 gota de la suspensin de clulas del paciente al tubo rotulado AC. 5. Mezcle gentilmente y selle con papel de parafina. 6. Centrifugue por 20 segundos en la centrifuga serolgica a mxima velocidad. 7. Resuspenda el botn de clulas suavemente hasta despegarlo del fondo del tubo. 8. Observe la reaccin contra fondo de luz brillante. Gradifique y anote resultado de cada tubo en el informe como Fase Salina (Sal RT). 9. Aada 2 gotas de Albumina 22% a cada tubo, mezcle e incube tapado a 37C de 15-30 minutos. 10. Centrifugue por 20 segundos. Resuspenda el botn de clulas e interprete. Anote el resultado como Albumina 37C. 11. Lave cada tubo con salina fisiolgica: Procedimiento de lavado: a. Resuspenda el contenido del tubo b. Llene con salina fisiolgica partes del tubo dispensndola por las paredes usando botella dispensadora. c. Selle con papel de parafina e invierta varias veces suavemente d. Centrifugue por 1 minuto a velocidad mxima

4 e. Decante de un solo golpe teniendo cuidado de no remover el botn de clulas. Si no puede eliminar todo el sobrenadante en el primer intento debe volver a llenar el tubo con salina y centrifugar nuevamente. f. Repita todos los pasos 2 veces mas. g. Al finalizar la ultima lavada debe eliminar la mayor cantidad de salina posible, escurriendo el tubo invertido sobre papel secante. 12. Aada 2 gotas de AHG a cada tubo, mezcle y centrifugue por 20 segundos. 13. Resuspenda el botn de clulas, interprete y reporte el resultado en la fase AHG. 14. Confirme los resultados negativos aadindole 1 gota de clulas control (Check cells). Centrifugue por 20 segundos , interprete y reporte el resultado en la fase CCC. 15. Evale los resultados obtenidos y utilizando la hoja que acompaa a las clulas comerciales (Tro), identifique (el) los posibles anticuerpos en las reacciones positivas.

Rh D 1 + 2 + 3 0 C + 0 0 E 0 + 0 c 0 + + e + 0 + M + + +

MNSs N 0 0 + S + + 0 s + + +

P Lewis P1 Lea Leb + + 0 + 0 + + 0 + K 0 0 +

Kell k + + +

Sexlinked 37oC AGT CCC Kpa Jsa Fya Fyb Jka Jkb Xga Sex 0 0 + 0 + + + / 0 0 + + + 0 + / 0 0 0 + 0 + + / Duffy Kidd

II. Mtodo Directo (DAT) Esta prueba es utilizada para demostrar la presencia de clulas sensitizadas con IgG o complemento. Muestra: Suspensin de clulas del paciente al 2-5% Reactivos: 1. AHG poliespecfico 2. CCC(Check cells) 3. Salina 0.85% Procedimiento: 1. Rotule 1 tubo con el # de su desconocido 2. Aada 1 gota de la suspensin de clulas 3. Lave 3 veces con salina fisiolgica siguiendo el procedimiento de lavado. 4. Aada 2 gotas de AHG, mezcle y centrifugue por 20 segundos. 5. Resuspenda el botn de clulas e interprete gradificando y comparando con las ilustraciones. 6. Confirme el resultado negativo, aadiendo 1 gota de CCC. 7. Centrifugue por 20 segundos e interprete. 8. Reporte los resultados en el informe.

5 DETERMINACION DE GRUPO ABO Y TIPO RH (METODO DE TUBO) I. GRUPO ABO Muestra: Suero y suspensin de clulas del paciente al 2-5% Reactivos: 1. Antisueros: Anti-A(azul), Anti-B (amarillo) 2. Clulas comerciales: A1 y B 3. AHG A. Prueba en Clulas (Forward): 1. Rotule 2 tubos con el # de desconocido como : A , B 2. Aada 2 gotas de Anti A al tubo rotulado A y 2 gotas de Anti B al tubo rotulado B. 3.Aada 1 gota de la suspensin de clulas del paciente a todos los tubos, mezcle suavemente. 4. Centrifugue todos los tubos por 20 segundos a velocidad mxima. 5. Resuspenda el botn de clulas e interprete los resultados: Aglutinacin : positivo No-aglutinacin: negativo 6. Reporte los resultados en la hoja de informe B. Prueba en Suero (Reverse): 1. Rotule 2 tubos con el # de desconocido como: Cel A, Cel B 2. Aada 2 gotas del suero del paciente a cada tubo. 3. Aada 1 gota de las clulas comerciales A1 al tubo rotulado Cel A , 1 gota de la clulas B al tubo rotulado Cel B. 4. Mezcle suavemente y centrifugue a mxima velocidad por 20 segundos. 5. Resuspenda el botn de clulas e interprete los resultados: Aglutinacin : positivo No-aglutinacin: negativo 6. Reporte los resultados en la hoja de informe II. Prueba de Rh (Mtodo de tubo) Muestra: Suspensin de clulas del paciente 2-5% Reactivos: 1. Antisuero: Anti-D 2. Rh control (Albmina) Procedimiento: 1. Rotule 2 tubos con el # de desconocido: D, Rh control 2. Aada 2 gotas de Anti D al tubo rotulado D y 2 gotas de Albumina 22% al tubo rotulado Rh control. 3. Aada 1 gota de la suspensin de clulas del paciente a todos los tubos.

6 4. Mezcle suavemente y centrifugue a mxima velocidad por 20 segundos. 5. Resuspenda el botn de clulas e interprete los resultados: Aglutinacin : positivo No-aglutinacin: negativo 6. Reporte los resultados en la hoja de informe

III. Weak D: Procedimiento para confirmacin de resultado D-negativo 1. Incube los tubos con reaccin negativa a 37C por 15-30 minutos. 2. Centrifugue por 20 segundos, resuspenda e interprete. 3. Si el resultado continua negativo, lave con salina siguiendo el procedimiento de lavado. 4. Aada 2 gotas de AHG, centrifugue, resuspenda e interprete. 5. Confirme los resultados negativos adicionando las clulas CCC. 6. Reporte como D positivo o D negativo

PRUEBAS DE COMPATIBILIDAD (CROSSMATCH) Pruebas realizadas para asegurarse que una unidad particular de sangre puede ser transfundida con seguridad a un paciente. Muestras: Suero del paciente y Suspensin de clulas del paciente suspensin de clulas del donante Reactivos: 1. Salina 0.85% 2. Albmina 22% 3. AHG 4. Check cells (CCC) Procedimiento: 1. Rotule 2 tubos con el # del paciente : Ma (Mayor) y AC 2. Aada 2 gotas del suero del paciente a ambos tubos. 3. Aada 1 gota de la suspensin de clulas del donante al tubo rotulado Ma y 1 gota de la suspensin de clulas del paciente al tubo rotulado AC 4. Mezcle suavemente y centrifugue por 20 segundos a velocidad mxima. 5. Resuspenda el botn de clulas e interprete. Anote resultado por fases. Si el resultado es positivo (aglutinacin/ hemolisis), verifique Grupo de paciente y Donante. 6. Aada 2 gotas de Albumina 22% a cada tubo. Incube a 37C de 15-30 minutos. 7. Centrifugue ambos tubos por 20 segundos, resuspenda, interprete y anote resultados. 8. Efecte el procedimiento de lavado. 9. Aada 2 gotas de AHG, mezcle y centrifugue por 20 segundos. 10.Resuspenda el botn de clulas e interprete. Anote resultados. 11. Confirme los resultados negativos adicionando 1 gota de CCC. 12. Centrifugue, resuspenda e interprete. 12. Reporte resultado final como Compatible o No-Compatible

8 IDENTIFICACION DE ANTICUERPOS Muestra: Suero de paciente con IAT positivo / Eluado positivo Reactivos: 1. Panel de clulas O comerciales con antgenos conocidos 2. Salina 0.85% 3. Albumina 22% 4. AHG Procedimiento: 1. Rotule de 11 tubos con nmeros del 1al 10 y el tubo 11: AC adems # del paciente. 2. Aada 2 gotas del suero del paciente a todos los tubos. 3. Aada 1 gota de las respectivas clulas del panel a los tubos rotulados 1-10 (Ej: Clula #1 al tubo #1, etc). Adicione una gota de la suspensin de clulas del paciente al tubo AC. 4. Mezcle cada tubo suavemente y centrifugue 20 segundos a velocidad mxima. 5. Resuspenda el botn de cada tubo, interprete gradificando y anote los resultados de cada tubo en la hoja del panel bajo la columna: Fase IS(RT). 6. Aada 2 gotas de Albumina 22% a todos los tubos e incube a 37C por 15-30 minutos. 7. Centrifugue por 20 segundos. Resuspenda el botn de clulas e interprete gradificando. Anote el resultado bajo: Albumina 37C. 8. Efecte el procedimiento de lavado. 9. Aada 2 gotas de AHG, mezcle y centrifugue por 20 segundos. 10.Resuspenda el botn de clulas e interprete gradificando Anote resultados bajo: AHG 11. Confirme los resultados negativos adicionando 1 gota de CCC. 12. Centrifugue, resuspenda e interprete. Anote en columna CCC. 13. Identifique el(los) anticuerpos presentes siguiendo los pasos:

9 1. Busque todos los resultados negativos en la fase que presente mayores resultados positivos. Cruce todos los positivos en las reacciones del panel 2. Elimine los antgenos en la parte superior del panel que por lo menos tres(3 de su reacciones haya sido cruzada. 3. De aquellos antgenos no cruzados , busque el patrn que mas se asemeje al patrn que se obtuvo en la prueba. 4. En este punto , puede encontrar otros antgenos de baja frecuencia que no fueron cruzados. Si las reacciones de estos antgenos coinciden con las reacciones positivas del anticuerpo identificado, no considere estas reacciones. 5. Cuando no es posible descartar la presencia de un segundo o tercer anticuerpo, busque tres(3) clulas que sean positivas para el anticuerpo identificado y negativas para el segundo o tercer anticuerpo. Esto confirmara o descartara la presencia de el segundo o tercer anticuerpo. 6. Cuando el (los) anticuerpos han sido identificados, asegrese que por lo menos 3 clulas que posean este antgenos sean positivas y 3 clulas que no lo posean sean negativas. Siempre verifique los resultados de los posible anticuerpos obtenidos en el IAT. 7. Como confirmacin final tipifique las clulas del paciente para el antgeno correspondiente al anticuerpo identificado. Este debe carecer de este antgeno , a menos que tenga Autocontrol positivo. 8. Si se obtiene un patrn de reactividad que no coincide con ningn antgeno, considere que el anticuerpo este mostrando efecto de dosis y reacciona solamente con clulas homocigticas. Elimine solamente las homocigticas negativas