CITOGENTICA

La unin de la biologa molecular con la gentica dio origen a la citogentica. Esta disciplina se ocupa de las bases cromosmicas y moleculares que explican los fenmenos de la herencia y de importantes problemas aplicados a la medicina, la ganadera y la agricultura. El principal objetivo es ofrecer un concepto genera de las bases cromosmicas sobre las cuales se asientan los principios de la herencia descubiertos por Mendel, Morgan y otros. Consideraremos tambin, en forma concisa, las diversas aberraciones cromosmicas no slo desde el punto de vista celular, sino tambin las que pueden producirse en la especie humana y el papel que desempean los cromosomas en la evolucin de las especies. LEYES DE LA HERENCIA MENDELIANA Mendel realiz cruzamientos entre arvejas (pisum sativum) que tenan pares de caractersticas diferentes y contrastantes. Ej: utiliz plantas con flores blancas y rojas, con semillas lisas y rugosas, o amarillas y verdes, de tallos altos y bajos, etc. Despus de los primeros cruzamientos, observ los hbridos resultantes en la primera generacin filial (F1). Luego cruz los hbridos F1 entre s y estudi los resultados en la segunda generacin filial (F2). La ley de la segregacin enuncia que los genes se distribuyen sin mezclarse. En un cruzamiento realizado entre progenitores (P) con semillas amarillas y verdes, encontr, en la primera generacin, que todos los hbridos tenan semillas amarillas y, por lo tanto, slo la caracterstica de uno de los padres. En el segundo cruzamiento (F2), las plantas presentaban las caractersticas de sus antepasados, con una proporcin del 75% para las semillas amarillas y del 25% para las verdes, o sea, en una relacin 3:1.

Mendel sostuvo que el color de las semillas era controlado por un factor que se transmita a la descendencia por medio de los gametos. Este factor conocido a hora como gen poda transmitirse sin mezclarse con otros genes. Mendel enunci que el gen era susceptible de separarse en el hbrido para entrar en gametos diferentes y distribuirse en la descendencia de los hbridos. A causa de ello, a este principio se le denomin ley de la segregacin de los genes. Posteriormente observ que las plantas con semillas amarillas en la F2 posean diferentes constituciones genticas. Un tercio de este grupo siempre daba semillas amarillas en la generacin F3, pero los otros dos tercios originaban plantas con semillas amarillas y verdes en la proporcin 3:1. El 25% de las plantas de la F2 con semillas verdes, cuando se cruzaban entre s, producan siempre semillas verdes en la generacin F3. Ello demuestra que existen 2 lneas puras para ese carcter. Si presentamos por letras a los genes en los entrecruzamientos, designando con la A para el gen de carcter amarillo y con la a al gen para el carcter verde, tendremos el siguiente resultado: En la primera generacin (F1) se hallan presentes ambos genes A y a pero slo A produce el carcter visible (amarillo), porque es dominante. El gen a permanece oculto y se denomina recesivo. En el hbrido F1, los dos genes se separan y pasan a gametos diferentes. La mitad de los gametos llevar el gen A y la otra mitad el gen a. Como cada individuo produce dos tipos de gametos en cada sexo, existen 3 combinaciones posibles en la F2. Esto da como resultado la relacin 1:2:1, ya que el 25% corresponde a plantas AA con semillas amarillas puras, 50% a plantas Aa con semillas amarillas hbridas y 25% a plantas aa con semillas verdes puras. 1

La ley de la distribucin independiente enuncia que los genes que estn en cromosomas diferentes se distribuyen en forma independiente durante la meosis. Mientras el principio de la segregacin se aplica al comportamiento de un solo par de genes, la ley de la distribucin independiente describe el comportamiento simultneo de dos o ms pares de genes localizados en diferentes pares de cromosomas. Los genes que estn en cromosomas separados se distribuyen independientemente durante la meiosis y la descendencia que resulta es hbrida en dos loci. Se muestra el entrecruzamiento entre un cobayo oscuro de pelo corto (BBSS) y otro castao de pelo largo (bbss). El animal BBSS produce slo gameto BS y el bbss solamente gametos bs. En la generacin F1, la descendencia es heterocigota para el color y la longitud del pelo. Fenotpicamente son todos oscuros y de pelo corto. Cuando dos de los hbridos de la F1 se aparean entre s, como cada uno forma cuatro tipos de gametos (BS,Bs, bS y bs) al producirse la fecundacin se originan en los cigotos 16 combinaciones diferentes. 9 individuos de la F2 son de pelo oscuro y corto, 3 de pelo oscuro y largo, 3 de pelo castao y corto y uno de pelo castao y largo. Esta relacin fenotpica de 9:3:3:1 es caracterstica del cruzamiento de 2 pares de genes ABERRACIONES CROMOSMICAS Cromosomas en metafase. Los cromosomas son las unidades dentro de las cuales estn organizados los genes. En las clulas eucariontes, c/cromosoma consiste de una fibra continua de DNA doble hlice y protenas asociadas. El trmino cromosoma, derivado del griego fibra coloreada (W. Waldeyer 1888). En los procariontes el nico cromosoma es circular. En los eucariontes los cromosomas estn en el ncleo. Fue descrito por W. Flemming en 1879, los cromosomas pueden observarse como estructuras individuales definidas por el microscopio ptico durante la mitosis. C/organismo tiene un nmero determinado de cromosomas con apariencia morfolgica distinta. En 1956 Tjio, Levan, Ford y Hamerton establecieron que el hombre tiene 46 cromosomas y no 48 como se crea. El funcionamiento normal del sistema gentico se mantiene por la constancia del material hereditario presente en los cromosomas. Accidentalmente pueden producirse cambios en el cariotipo que tienen diversas consecuencias genticas. As los cromosomas pueden modificar su nmero (conservando una estructura normal) o sufrir alteraciones en sus estructuras, denominndose aberraciones numricas y estructurales. En las poliploidas las clulas contienen mltiplos del nmero haploide de cromosomas, diferentes del diploide. Se muestra loas 2 clases principales de cambios en el nmero de cromosomas. En las poliploidas hay una modificacin en el nmero de los conjuntos haploides, pero el cariotipo se presenta equilibrado. En las clulas triploides existen tres conjuntos haploides similares; en las tetraploides cuatro; etc. En las clulas somticas los casos de poliploida pueden originarse por la duplicacin del nmero de cromosomas con supresin de la citocinesis, y en los gametos por la no separacin de los cromosomas en cualquiera de las dos divisiones meiticas.

En las aneuploidas est afectado el nmero diploide de uno de los pares de cromosomas homlogos. En las aneuploidas hay ganancia o prdida de uno o ms cromosomas, de modo que el conjunto deja de ser equilibrado. No obstante, como la alteracin es cuantitativa, el mensaje genticocontenido en cada cromosoma se mantiene intacto, aunque, como se ver ms adelante, las aneuploidas pueden causar graves alteraciones en el hombre. 2

Las aneuploidas se producen por una falla en la separacin de los cromosomas homlogos, denominada no disyuncin. La causa inmediata de la no disyuncin es la no separacin de una de las cromtidas hermanas en la anafase; as, al arribar la clula a la telofase, esa cromtida permanecer en una de las clulas hijas junto con la otra cromtida hermana. Ello da lugar a una lnea celular que carece de un cromosoma de ms. La no disyuncin se produce generalmente en la meiosis, pero tambin puede ocurrir en la mitosis. La meiosis no disyuntiva da origen a un gameto aneuploide que, cuando se une a un gameto normal forma un cigoto portador de una aneuploida. Si al gameto aneuploide le falta un cromosoma, el cigoto resultar monosmico. Si le sobra un cromosoma el cigoto ser trismico. As en los individuos monosmicos se produce la prdida de uno de los cromosomas, mientras en los trismicos hay un cromosoma de ms. La mitosis no disyuntiva puede ocurrir en la divisin mittica que precede a la formacin de los gametos o en las clulas derivadas de la divisin del cigoto. En el primer caso, los efectos son similares a los que se producen en la meiosis no disyuntiva, pero en el segundo dado que la no disyuncin tiene lugar ben los primeros estadios del desarrollo embrionario se originan mosaicos, es decir, individuos que exhiben lneas celulares somticas con dos o ms cariotipos diferentes. Existen varias clases de aberraciones cromosmicas estructurales Las aberraciones cromosmicas estrcturales deben ser diferenciadas de las mutaciones gnicas, en las cuales los cambios se producen a nivel molecular al verse alterado el cdigo gentico. Para comprender el mecanismo por el cual se producen las aberraciones cromosmicas estructurales es necesario recordar el concepto de estructura uninmica. De acuerdo con este en el perodo G1 c/cromosoma est compuesto por una sola molcula de ADN. Despus de la replicacin del ADN (perodo S), en el perodo G2 y parte de la mirtosis, cada cromosoma contiene 2 cromtidas y en consecuencia dos molculas de ADN. En las aberraciones cromosmicas estructurales se produce una alteracin en la organizacin de uno o ms cromosomas. As la ruptura de una o de las dos cromtidas puede conducir, segn el caso, a la prdida de un segmento cromosmico fenmeno denominado delecin o deficiencia, a la duplicacin de un segmento, a la trasnlocacin de segmentos entre cromosomasno homlogos o a la inversin de un segmento dentro del propio cromosoma. En todos estos casos es posible detectar los defectos analizando los cromosomas en su estado de mxima compactacin (metafase). Delecin: La prdida de material cromosmico puede ser terminal (en un extremo del cromosoma) o intersticial (en un segmento intermedio del cromosoma). En el primer caso la aberracin es el resultado de una sola rotura, y en el segundo, de dos. Usualmente las deleciones son letales en la condicin homocigota y esto indica que la mayora de los genes son imprescindibles para el desarrollo del organismo.

Duplicacin: En esta aberracin un segmento cromosmico est representado ms de una vez en un mismo cromosoma. Las duplicaciones producen efectos menos graves para los individuos que las delecciones.

Inversin: Aqu un segmento de un cromosoma se invierte 180. Las inversiones se denominan pericntricas cuando el segmento afectado incluye al centrmero y paracntricas cuando no lo incluye.

Translocacin: Esta aberracin cromosmica se produce como consecuencia de la rotura simultnea de dos cromosomas no homlogos y el ulterior intercambio de los respectivos segmentos entre esos cromosomas.

Cuando en cada cromosoma la rotura ha tenido lugar al lado del centrmero, ambos cromosomas pueden fusionarse entre s, lo que da origen a un cromosoma metacntrico de mayor tamao. Este proceso denominado translocacin robertsoniana ha acontecido durante la filogenia de muchas especies, en las cuales han aparecido nuevos cromosomas y el nmero de stos se ha reducido.

Las radiaciones y mutgenos qumicos pueden producir roturas en los cromosomas. Como las mutaciones gnicas, las aberraciones cromosmicas estructurales pueden producirse en forma espontnea, pero su frecuencia aumenta por efecto de las radiaciones ionizantes (rayos X, rayos B, rayos G, luz ultravioleta). Por la accin de determinados agentes qumicos mutgenos o por la de ciertos virus. SEGREGACIN DE GENOTIPOS PARENTERALES La segregacin (distribucin) de los genotipos de los padres (genotipos parenterales) en la descendencia depende de la combinacin de alelos en los padres. En cada caso siempre referido a un locus gnico determinado. Las leyes mendelianas establecen la combinacin esperada de alelos en la descendencia de una pareja parenteral. Segn el efecto del genotipo sobre el fenotipo en el estado heterocigtico, un alelo puede clasificarse como dominante o recesivo. Por lo tanto existen tres modos bsicos de herencia: 1. Autosmica dominante. 2. Autosmica recesiva. 3. Ligada al cromosoma X para genes localizados en el cromosoma X no es importante distinguir entre dominante y recesivo. Dado que los genes del cromosoma Y se transmiten siempre del padre a todos los hijos varones, y como el cromosoma Y carga solo unos pocos genes causales de enfermedades, la herencia ligada al cromosoma Y puede no tomarse en cuenta al considerar la herencia monognica. HERENCIA MONOGNICA El termino herencia monogenica se aplica cuando se puede reconocer el efecto fenotpico de un nico gen. Esto se documenta en un pedigr. Para los seres humanos se acostumbra asignar nmeros romanos a las generaciones sucesivas, comenzando con el I para la primera generacin de la cual se cuenta con alguna informacin. Dentro de una generacin a cada individuo se le asigna un numero arbido. Los individuos tambin pueden asignarse con combinaciones de nmeros no superpuestas, para clculos computarizados. HERENCIA AUTOSMICA DOMINANTE El patrn de herencia en un pedigr con un rasgo autosmico dominante se caracteriza por los siguientes atributos: 1. Los individuos afectados se relacionan de manera directa en una o ms generaciones sucesivas. 2. Tanto los varones como las mujeres estn afectados en una relacin 1:1. 3. La proporcin esperada de descendencia afectada y no afectada de un individuo afectado es 1:1 (50%). Una consideracin importante en los trastornos autosmicos es si una mutacin nueva se presenta en un paciente sin padres afectados. Los pedigrs 2 y 3 muestran una nueva mutacin en la generacin II. En algunas alteraciones autosmicas dominantes el portador de la mutacin no manifiesta la enfermedad. Esto se 4

denomina ausencia de penetrancia, pero es ms una excepcin que la regla. El grado de manifestacin puede variar dentro de una familia. Esto se denomina expresividad variable. HERENCIA AUTOSMICA RECESIVA El patrn de herencia en un pedigr con un rasgo autosmico dominante se caracteriza por lo siguiente: 1. La segregacin esperada de los genotipos de los hijos de pacientes heterocigticos es 1:2:1 (25% homocigticos normales, 50% de heterocigticos y 25% de homocigticos afectados). 2. Ambos sexos se ven afectados con igual frecuencia con una relacin 1:1. 3. Los padres heterocigticos tienen un riesgo del 25% de descendencia afectada. En los ejemplos mostrados en el pedigr 1 los padres no afectados (II-3 y II-4) deben de ser heterocigticos; lo mismo se aplica para I-1 y I-2 del pedigr 2. En el pedigr 3, los ancestros del nio afectado (IV-2) pueden rastrearse hacia atrs hasta los ancestros comunes (I-1 y I-2) de los padres, que son primos hermanos. La consanguinidad parental (lazo de sangre de los padres, III-1 y III-2) se indica por una lnea doble en el pedigr. De esta observacin se puede deducir que la homocigosidad del individuo afectado (IV-2) es el resultado de la transmisin del alelo mutante de uno de los ancestros tanto a travs de la lnea paterna como de la materna. HERENCIA LIGADA AL CROMOSOMA X. El patrn de herencia de genes localizado en el cromosoma X se caracteriza por: 1. Afectar solo a los varones (solo existen raras excepciones cuando la madre es portadora de dos alelos mutantes). 2. Los varones afectados heredan el alel mutante nicamente de su madre. 3. No existe transmisin de un varn a otro. Una mujer heterocigtica para una mutacin en el cromosoma X tiene un riesgo del 50% de tener un hijo varn afectado. Ella tambin transmitir el cromosoma X portador de la mutacin al 50% de sus hijas mujeres, pero como ellas sern heterocigticas, no se vern afectadas. El pedigr del panel 1 muestra la distribucin de los tres cromosomas X parentales (uno del padre, dos de la madre) en la descendencia (1). El panel 2 muestra la distribucin correspondiente de los cromosomas X e Y de los padres a la descendencia (2). La proporcin de mutaciones nuevas en la herencia ligada al X es relativamente alta (3,4). Esto se debe a que los varones afectados con una enfermedad grave ligada al cromosoma X no pueden reproducirse y transmitir la mutacin a la descendencia. Como un tercio de los cromosomas X de la poblacin estn presentes en los varones y como una enfermedad severa ligada al cromosoma X es incompatible con la reproduccin, estos X (portados por los varones) sern eliminados de la poblacin. Sin embargo sus mutaciones sern remplazadas por mutaciones nuevas. Por lo tanto, un tercio de los varones con enfermedades severas ligadas al cromosoma X, sin antecedentes familiares, tienen una mutacin nueva (regla de Haldane). La herencia tpica ligada al cromosoma X es fcil de reconocer (5). Las mujeres con un hijo y un hermano afectados, o con dos hijos afectados, deben ser heterocigticas. Se las denomina heterocigotas obligadas. Las que pueden serlo o no, son las heterocigotas facultativas (III-5 y IV-2). LIGAMIENTO Y RECOMBINACIN El termino ligamiento se refiere a la observacin de que dos o mas genes que se encuentran en el mismo cromosoma se heredan juntos. La situacin contraria se da cuando los genes no se heredan juntos porque se encuentran en diferentes cromosomas o porque estn en el mismo cromosoma pero muy alejados. En este ultimo caso los dos genes se distribuirn en una relacin 1:1, en forma independiente. En 1902 Correns informo por primera vez el ligamiento de genes. Bateson y col. detectaron ligamiento en los genes que determinan los 5

colores de las flores y en los que determinan la forma alargada del polen del denominado guisante de olor (Lathyrus odoratus). La proporcin que existe entre la transmisin conjunta y la transmisin por separado permite hacer una estimacin de la distancia entre los genes. El termino ligamiento se refiere a los loci gnicos, no a los alelos especficos. Los alelos ubicados en loci muy prximos, que se heredan juntos, constituyen un haplotipo. Los alelos de diferentes loci que se heredan juntos con mayor o con menor frecuencia que lo esperado por sus frecuencias individuales, muestran desequilibrio de ligamiento (p. 164). La sintena (H.J. Renwick, 1971) hace referencia a los loci gnicos ubicados en el mismo cromosoma, sin importar su ligamiento ni la distancia que los separa. TCNICAS EN CITOGENTICA CITOGENTICA CONVENCIONAL 1. Estudio citogentico convencional de las neoplasias hematolgicas 2. En sangre perifrica (SP) y mdula sea (MO) 3. Citogentica: Estudio de los cromosomas de las clulas hematopoyticas en su fase de mxima concentracin (metafase) 4. Cariotipo: Ordenacin de los cromosomas en 22 parejas de cromosomas autosmicos y una pareja de cromosomas sexuales Ventajas 1. En un solo experimento, analizamos todo el genoma celular, con informacin de todos los cromosomas. 2. Bajo costo econmico 3. Disponibilidad 4. Alteraciones cromosmicas numricas y estructurales 5. Significacin clnica establecida Inconvenientes 1. Requiere cultivo de tejido fresco 2. Analiza clulas slo en divisin 3. Lenta en tumores slidos (2 semanas), aunque en neos hematolgicas, se puede en 24-72h 4. Precisa personal experimentado 5. Baja sensibilidad 6. Poco poder de resolucin en alteraciones cromosmicas complejas, microdelecciones. Muestras 1. Mdula sea extrada mediante puncin esternal o de cresta ilaca, en un tubo estril de heparina sdica 2. Sangre Perifrica extrada en un tubo de 10ml de heparina sdica 3. Biopsia ganglionar guardada en un tubo con medio de cultivo Siembra 1. Se realiza la siembra de los cultivos en condiciones estriles en la cmara de flujo laminar 2. Se siembra 0.5ml en dos Falcons de cultivo estril (preparados con 10ml de caldo de cultivo a 20C) 3. Segn Dx de la muestra, se cultiva 24 - 72h, con o sin TPA

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Sacrificio de los cultivos Aadir 0.1 ml del antimittico Colcemid y se deja en estufa de CO2 a 37C durante 1. 30 las mieloblsticas (LAM, LMC, SMD, SMPC) 2. 2 las linfoblsticas (SLPC, LNH) Pasamos el contenido a un tubo de centrfuga, y lo centrifugamos 10 a 1200 rpm Posteriormente, decantamos el sobrenadante, dejando el botn (pellet) y resuspendemos Choque Osmtico: 8 ml de ClK 0.075M gota a gota, agitando, y lo dejamos 30 al bao mara (37C) Centrifugamos, decantamos, y se aaden 5ml del fijador Carnoy (metanol:cido actico 3:1) agitando. 10 a temperatura ambiente Repetimos el paso anterior, dejando 30 en nevera Centrifugamos, decantamos, y aadimos 1ml de Carnoy Resuspendemos y pasamos a un tubo NUP Portaobjetos 1. Porta previamente guardado a 4C con metanol. Secamos, cubrimos con fijador (Carnoy) y mientras decantamos se tiran 1 2 gotas de la preparacin. Se flamea y se deja secar. 2. Miramos en microscopio invertido para ver la densidad celular y la extensin de los cromosomas 3. Se hacen 4 extensiones de cada cultivo 4. 24h en estufa de desecacin a 60C, para envejecer 5. Para la tincin 1. Solucin de tripsina 12 segundos 2. Lavamos con PBS 2 segundos 3. Giemsa al 5% 5 minutos 4. Lavar y mirar al microscopio 6. Se cubren 7. Metafer para seleccionar metafases Leucemias agudas LAM Momento Dx Evolucin Pre/Post Tx LAM INFANTIL LAM (da sig.) LAP Dx Dx Dx Recada Evolucin LAL Dx - Adultos Dx - Nios Evolucin Pre/Post Tx Cultivo 2x24h + ADN + ARN + Criopreserv. 2x24h 2x24h 2x24h 24h + 48h 1x24h + 1x48h 1x24h + 1x48h 1x24h + 1x48h 2x24h 2x24h 2x24h 2x24h 7 Cariotipo S S S S S S S Consultar S S S Consultar FISH CYTOCELL Consultar Consultar 7, 8, MLL CYTOCELL PML/RAR PML/RAR Consultar BCR/ABL + MLL BCR/ABL + MLL + TEL/AML1 + E2A Consultar Consultar

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Tcnica de FISH Complemento de la tcnica de citogentica Hibridacin in situ: Marcar o identificar una secuencia de ADN con una sonda especfica que reconoce dicha secuencia Sonda: Secuencia de ADN marcadas con un fluorocromo, especficas, que reconocen una determinada secuencia del genoma Alteraciones cromosmicas numricas y estructurales tanto en clulas que no entran en divisin (interfase) como en clulas en divisin (metafase) La mayora de los dx hematolgicos se asocian a una alteracin citogentica determinada Confirmacin de dx clnicos, caracterizar grupos pronsticos y realizar monitorizacin de EMR Valoracin del quimerismo hematopoytico tras el trasplante de mdula sea alognico cuando existe discrepancia de sexo entre donante y receptor Menor S que otras tcnicas moleculares Identificacin de anomalas cromosmicas crpticas o difciles de detectar para la citogentica convencional Por el hecho de permitir identificar mutaciones en interfase, simplifica el procesamiento de la muestra al no requerirse cultivo 1. Tcnica sencilla y rpida 2. En determinados casos, en 4-5h se puede tener un dx Puede aplicarse en clulas depositadas en un portaobjetos de microscopia (frotis convencional, impronta de tejido, citocentrifugacin) hasta cortes de tejido incluidos en parafina Se ha usado esta tcnica para muestras en parafina almacenadas durante aos (hasta 12) a t ambiente Tcnica de eleccin (por delante de la PCR) para bsqueda de translocaciones que involucran a genes promiscuos, y para delecciones en MM, LLC. Variantes tecnolgicas 1. Hibridacin genmica comparada (CGH) 2. Cariotipo espectral (SKY-FISH) 3. Multiplex FISH (M-FISH) M-FISH y SKY-FISH 1. Consisten en marcar el ADN de cada cromosoma con un fluorocromo con espectro de emisin nico y diferenciable de lo dems 2. Se pinta a cada cromosoma de un color 3. Los cromosomas anmalos aparecern no uniformes 4. til en neos hematolgicas 5. Caracteriza correctamente translocaciones complejas y crpticas Ventajas 1. Permiten analizar todo el genoma 2. Enorme poder de resolucin 3. Identificacin de segmentos cromosmicos no identificados (gran avance en el conocimiento de los genes implicados en patologas) Inconvenientes 1. Requieren cultivo de tejido fresco 2. Analizan slo clulas en divisin 8

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Personal experimentado tanto en la realizacin como en la interpretacin Sensibilidad similar al cariotipo, aunque la informacin sea ms concluyente No detectan delecciones, inversiones o duplicaciones dentro de un cromosoma Elevado coste econmico Equipo informtico sofisticado

Muestras Preparaciones de citogentica convencional tras cultivo de mdula sea, sangre perifrica, ganglio u otros tejidos. La muestra obtenida de estos cultivos se conserva en solucin Carnoy. Tambin es aplicable a extensiones en fresco de muestras biolgicas. Preparacin Da 1 1. Extensiones: Eppendorf (donde se ha guardado el material de citogentica convencional) del congelador a 20C, se centrifuga, se decanta, y se resuspende con fijador nuevo 2. Una gota en un porta previamente tratado con metanol y secar a la llama o con plancha a 40 50C 3. Observar extensiones en microscopio invertido a 10X aumentos para ver la distribucin de ncleos y el secado 4. Guardar a T ambiente 24h 1. Si la muestra es urgente, se puede hibridar en el mismo da, dejando al menos 1h en temperatura ambiente Hibridacin - Da 2 1. En oscuridad 2. 7 l de tampn 3. 1 l de sonda 4. 2 l de agua destilada 5. Se colocan en el porta, tapar con un cubre y colocar en el Hybrite e incubar segn cada sonda (24h normalmente) Lavado y contratincin - Da 3 1. En oscuridad 2. Lavado post-hibridacin 1. Retiramos cubre, lavamos 2 en un bao a 74C con una solucin de lavado 2. Posteriomente, lavamos 1 en una solucin de lavado a distinta concentracin y a temperatura ambiente 1. Contratincin 1. Poner 10 l de DAPI II y cubrir 2. Poner a 20C en una caja oscura, envueltas en papel de aluminio, como mnimo 30 1C Microscopio de Fluorescencia Sondas centromricas: Mnimo de 200 ncleos, con los ncleos con 1, 2, 3 4 seales de hibridacin 1. Trisoma: Si >5% de clulas con 3 seales 2. Monosoma: Si >15% con 1 seal Sondas de locus especficos: Valorar mnimo de 100 ncleos o de 20 metafases 1. Valorable si >5% de clulas alteradas