MICROBIOLOGIA GERAL Uma populao microbiana, sob condies naturais, contm muitas espcies diferentes.

Os microbiologistas devem ser capazes de isolar, enumerar, e identificar os microrganismos em uma amostra, para ento classific-los e caracteriz-los. Isolamento e Cultivo de Culturas Puras Os microrganismos na natureza normalmente existem em cultura mistas, com muitas espcies diferentes ocupando o mesmo ambiente. Ao determinar as caractersticas de um microrganismo, ele deve estar em cultura pura, ou seja, em que todas as clulas na populao so idnticas no sentido de que elas se originaram de uma mesma clula parental. Em laboratrio, os microrganismos so cultivados ou desenvolvidos em material nutriente denominado meio de cultura. O tipo de meio utilizado depende de vrios fatores: consideraes sobre a origem do material a ser analisado a espcie que se imagina estar presente nesta amostra as necessidades nutricionais dos organismos

Tcnicas de isolamento de microrganismos: O material a ser analizado colocado no meio de cultura - inculo - O processo de inoculao pode ser feito mediante: tcnica de esgotamento por meio de estrias superficiais - a amostra semeada na superfcie do meio solidificado com uma ala de semeadura para esgotar a populao, assim em algumas regies do meio, clulas individuais estaro presentes. tcnica de semeadura em superfcie - uma gota da amostra diluida colocada na superfcie do gar e com o auxlio de uma ala de semeadura de vidro (ala de Drigalky) esta gota espalhada sobre o meio. mtodo de pour-plate - a amostra diluida em tubos contendo meios liquefeitos (45 oC). Aps homogeneizao so distribuidos em placas de Petri; e aps a solidificao dos meios as placas so incubadas. As colnias se desenvolvero tanto acima quanto abaixo da superfcie (colnias internas).

Em cada uma dessas tcnicas o objetivo diminuir a populao microbiana, assim as clulas individuais estaro localizadas a uma certa distncia umas das outras. As clulas individuais, se estiverem distante o suficiente, produziro uma colnia que no entra em contato com outras colnias. Todas as clulas em uma colnia tm o mesmo parentesco. Para isolar uma cultura pura, uma colnia individual transferida do meio para um tubo de ensaio. Conservao das Culturas Puras Uma vez que os microrganismos tenham sido isolados em cultura pura, necessrio manter as culturas vivas por um perodo de tempo com o objetivo de estud-las. Para armazenar por um perodo curto, as culturas podem ser mantidas temperatura de refrigeradores (4 a 10 oC). Para armazenar por um perodo longo, as culturas so mantidas em nitrognio lquido (-196 oC) ou em freezers (-70 a -120 oC), ou ainda congeladas, e ento desidratadas e fechadas vcuo em um processo denominado liofilizao. Alguns dos mais usados mtodos de conservao: transferncia peridica para meios novos sob camada de leo mineral liofilizao congelamento

As colees de culturas so bancos de microrganismos e outras clulas que esto disposio de pesquisadores, professores, investigadores de patentes, e todo aquele que necessite estudar um tipo particular de microrganismos - um conjunto de clulas de referncia de uma coleo de cultura padro. As clulas so congeladas em cubas de nitrognio lquido ou liofilizadas para resistir a qualquer variao que possa destruir a identidade da clula original. Preparo dos Microrganismos para a Microscopia Luminosa Existem dois mtodos gerais utilizados para preparar espcimes microbiolgicas para observao por meio do microscpico luminoso. Tcnica entre lmina e lamnula e gota pendente - utiliza uma suspenso de microrganismos vivos em uma gota ou uma camada lquida. Estas 2

preparaes (a fresco) so especialmente teis quando a estrutura de um microrganismo pode ser distorcida pelo calor ou agentes qumicos, ou quando o microrganismo no se cora facilmente. Tcnicas de Colorao - a camada fina do espcime seca e corada, assim os microrganismos ficam fixados superfcie e apresentam-se corados para facilitar a visualizao. Usadas para mostrar as vrias estruturas dos microrganismos, para identificar e separar suas estruturas internas e para ajudar a identificar e separar microrganismos similares. As principais etapas do preparo de um espcime microbiano corado para exame microscpico so: Confeccionar um esfregao, ou uma camada fina do espcime sobre uma lmina de vidro Fixar o esfregao seco lmina, usualmente com o calor, para fazer aderir o microrganismo lmina Colorao com um ou mais corantes: Colorao Simples - a colorao de microrganismo com uma nica soluo de corante; ex: azul de metileno para leveduras, ou bolores. Colorao diferencial - envolve mais de uma soluo de corante; ex: colorao de lcool-cido para bactria causadora da tuberculose; distingue esta bactria patognicica, por meio da cor (vermelho, pelo corante principal), de outras bactrias (azul, pelo corante do fundo) encontradas em amostras como saliva e escarro. Colorao de Gram - neste processo, o esfregao bacteriano tratado com os reagentes na seguinte ordem: o corante prpura cristal violeta, a soluo de iodo (substncia que fixa o corante no interior da clula), o lcool (remove o corante de certas bactrias) e o corante vermelho safranina. Bactrias Gram-positivas, retm o corante cristal violeta e aparecem Bactrias Gram-negativas, perdem o cristal violeta quando tratadas coradas em violeta-escuro com lcool, so ento coradas com o corante safranina e aparecem coradas em vermelho

Informaes utilizadas para Caracterizar os Microrganismos As tcnicas laboratoriais para caracterizar os microrganismos variam desde uma microscopia relativamente simples anlise de material gentico encontrado na clula. As principais categorias de informaes usadas para caracterizar espcies diferentes so : Caractersticas Morfolgicas - tamanho, forma e arranjo das clulas Caractersticas Metablicas - maneira pela qual o microrganismo desenvolve os processos vitais Caractersticas Antignicas - os anticorpos produzidos em animais de laboratrios podem ser usados para detectar a presena de antgenos nicos em culturas bacterianas e so usados para caracterizar os microrganismos Caractersticas Patognicas - importante determinar se o microrganismo causa doena (patognico) ou no causa doena (no-patognico) Caractersticas Genticas - a maioria dos microbiologistas conta atualmente com tcnicas que permitem realizar anlises genticas para classificar ou identificar os microrganismos ou compreender a sua atividade. A sonda de DNA um exemplo de procedimento gentico rpido e amplamente utilizado uma fita de DNA de uma espcie conhecida misturada com uma fita de uma espcie desconhecida. Se os microrganismos so da mesma espcie, as duas fitas se combinaro, ou se ligaro. Esta combinao aparece como uma fita dupla de DNA com um marcador ligado. Classificao dos Organismos Vivos Como fazer para determinar os nomes dos microrganismos e como catalog-lo de forma sistemtica? As denominaes especficas no mundo biolgico, surgem da sistemtica, que pode ser descrita como "a cincia do desenvolvimento de um arranjo ordenado das espcies, dentro de cada uma das principais categorias de organismos". Sistemtica = Taxonomia. A cincia da taxonomia inclui a classificao (arranjo), nomenclatura (nomes) e identificao (descrio e caracterizao) dos organismos vivos. Os organismos que compartilham certas caractersticas comuns, so agrupados em grupos taxonmicos denominados taxa (singular txon). O txon bsico a espcie, que uma coleo de cepas com caractersticas similares. Depois segue com: ESPCIE-GNERO-FAMLIA-ORDEM-CLASSE-DIVISOREINO 4

Regra dos nomes - SISTEMA BINOMIAL DE NOMENCLATURA Cada espcie recebe um nome constitudo de duas palavras (ex. Neurospora crassa). O primeiro termo o nome do gnero e sempre se inicia com letra maiscula. A denominao do gnero uma palavra latina ou grega (um novo trmo composto de razes latina ou grega, ou o nome latinizado de uma pessoa masculino, feminino, ou neutro). Os nomes prprios dos microrganismo so sempre escrito em itlico. O segundo trmo do nome de um microrganismo, especfico (espcie), escrito em letras minsculas e usualmente descritivo: adjetivo que modifica o nome (Bacillus albus - Bacillus branco) adjetivo sob a forma de participio presente de um verbo (Clostridium dissolvens - que dissolve) substantivo no caso, possesivo que modifica o nome genrico (Salmonella pullosum - Salmonella dos pintos) nome de carter explicativo (Bacillus radicicola - Bacillus habitante da raz)

Ocasionalmente, necessrio subdividir uma espcie em variedades. Tal atitude tomada quando existem diferenas numa espcie, insuficientes para a criao de uma nova espcie, como por exemplo; a amostra de Streptococcus lactis que produz um aroma de malte e que designada de Streptococcus lactis var. maltigenes Meios com finalidades especiais - MEIOS ESPECIAIS So utilizados quando se quer isolar, identificar ou contar os microrganismos, eles fornecem informaes especficas sobre os microrganismos Meios para Anaerbios: os primeiros cultivos de anaerbios foram em camadas profundas de meios solidificado, assim podem crescer pois a camada de gar da superfcie exclui o oxignio atmosfrico a adio de um agente redutor ao meio remove o oxignio - MEIO REDUZIDO - ex. tioglicolato de sdio para anaerbios estritos, como as arqueobactrias produtoras de metano por exemplo, o cuidado deve ser maior. Deve-se: (1) ferver o meio para que a maior parte do oxignio dissolvido seja retirado 5

(2) adicionar o gs N2, livre de oxignio, nos tubos contendo o meio (3) adicionar um agente redutor, p.ex. a cistena remove os ltimos traos de oxignio (4) esterilizao do meio (recomendvel a utilizao de vlvula de selagem no topo do frasco para prevenir a entrada de oxignio) Meios Seletivos Serve para selecionar um microrganismo permitindo um tipo particular de microrganismo ou suprimindo o crescimento de outros microrganismos. Exemplos : gar sabourand para fungos; gar verde brilhante para Salmonella; o corante verde brilhante adicionado ao meio inibe as bactrias Gram + comuns do trato intestinal; o gar feniletanol inibe o crescimento de Gram-negativas, mais no das Gram-positivas. Recentemente os antibiticos vem sendo adicionado aos meios, tornando-os seletivos para os microrganismos resistentes estes agentes antimicrobianos Meios Diferenciais Servem para diferenciar os vrios tipos de microrganismos em uma placa com gar. Exemplo: se uma amostra de secreo da garganta semeada numa placa de gar sangue, pode-se diferenciar as batrias hemolticas (produzem enzimas que lisam as clulas vermelhas formando uma zona clara ao redor da colnia) das no hemolticas (que no dissolvem as clulas vermelhas, e portanto no formam este halo ao redor das colnias) Meios Seletivos/Diferenciais Agem tanto como seletivos como diferenciais, so particularmente teis em microbiologia de sade pblica, como na determinao da qualidade da gua ou na identificao de causas de infeco alimentar. Exemplo: gar MacConkey - contm sais biliares e corante cristal violeta, os quais inibem o crescimento de Gram+ e permitem o desenvolvimento de Gram-negativas, e ainda a lactose, que distingue as Gram + (produtoras de cido a partir do acar tornando-as vermelhas) das Gram-negativas (no produtoras de cido)

Meios de Enriquecimento Utilizados para selecionar microrganismo que est presente em determinado local, em pequenas quantidades com relao populao. O meio favorece o crescimento da espcie desejada, mas no o crescimento das outras espcies presentes em uma populao mista. Ao contrrio do meio seletivo, nenhum agente inibido utilizado para prevenir o crescimento de microrganismos indesejveis. Um exemplo so as bactrias que oxidam o fenol - que podem ser isoladas de amostras do solo, utilizando um meio de enriquecimento, constituido de sais de amnia, e fenol como nica fonte de carbono e energia - assim somente os microrganismos capazes de oxidar o fenol estaro presente em grande nmero depois de vrios cultivos seletivos Meios de Estocagem Utilizado para a manuteno da viabilidade e das caractersticas fisiolgicas de uma cultura, a qual pode exigir um meio diferente daquele timo para o seu crescimento o desenvolvimento rpido e luxuriante pode estar associado com a rpida morte celular. Assim p.ex., a glicose, que favorece com freqncia o crescimento, tambm desenvolve maior quantidade de cidos no meio, sendo prefervel omitir a glicose na preparao de um meio de estocagem. Condies Fsicas para o cultivo dos Microrganismos A temperatura, os gases do meio, e o pH so os principais fatores fsicos, que juntos criam condies timas para o crescimento celular. 1. Temperatura: De grande influncia no cresciemnto dos microrganismos - todos os processo de crescimento so dependentes de reaes qumicas, as quais so afetadas pela temperatura. A temperatura na qual uma espcie de microrganismo cresce mais rapidamente a temperatura tima de crescimento - em temperaturas mais favorveis para o crescimento, o nmero de divises celulares por hora, chamada de taxa de crescimento, dobra para cada aumento de temperatura de 10 oC. Para qualquer microrganismo particular h 3 temperaturas importantes a conhecer : mnima, tima e mxima (nesta ltima as enzimas so danificadas pelo calor e a clula para de crescer). Os microrganismos podem ser divididos em 3 grupos de acordo com a variao de temperatura na qual crescem melhor: 7

Psicrfilos - crescem em baixas temperaturas (15 - 20 oC). Alguns morrem se expostos temperatura ambiente (25 oC). A temperaturas muito alta, certas enzimas e a membrana citoplasmtica podem ser danificadas. Existem bactrias, fungos, algas e protozorios que so psicrfilos. Em temperaturas de 4-10 oC os microrganismos psicrfilos deterioram alimentos estocados por longo perodos. So encontrados principalmente em guas frias e solos, tais como os oceanos e regies polares. Alguns gneros so : Pseudomonas, Flavobacterium, Alcaligens. Mesfilos - crescem em temperaturas moderadas (25 - 40 oC). A maioria dos microrganismos pertencem a este grupo. As bactrias saprfitas, os fungos, as algas e os protozorios crescem no limite mnimo da variao de temperaturas mesfilas (25 oC), e os parasitrios de humanos e animais no limite mximo dessa variao (40 oC) Termfilos - crescem a altas temperaturas (40 - 85 oC). Podem ser encontrados em reas vulcnicas, em misturas de fertilizantes e em nascentes quentes. A maioria so procaritos, nenhuma clula eucaritica cresce em uma temperatura superior a 60 oC - a perda de funo da membrana citoplasmtica a baixa temperatura pode ser o que determina a temperatura de crescimento mnima dos termfilos

2. Atmosfera Gasosa Os microrganismos no seu habitat natural necessitam de quantidades variadas de gases tais como : O2, CO2, N2, CH3 . Alguns gases so utlizados no metabolismo celular; outros podem ter sido excludos de uma cultura por serem txicos s clulas. O O2 e CO2, so os dois gases principais que afetam o crescimento de clulas microbianas. De acordo com a resposta ao O2 os microrganimismos so divididos em 4 grupos: Aerbios - requerem oxignio para o crescimento (padro: 21% de O2). Alguns aerbios podem crescer mais lentamente quando o O2 limitado. Se os microrganismos crescem em meio lquido podem rapidamente utilizar o O2 dissolvido na camada superficial do meio. Para evitar este problema, as culturas lquidas de microrganismos aerbios so algumas vezes agitadas (shaker) para aumentar o suprimento de O2 dissolvido e produzir um estoque celular maior num tempo de incubao menor. Existem alguns grupos de microrganismos que requerem nveis elevados de CO2 - Neisseria gonorrhoea 8

- 5 a 10% de CO2. Neste caso pode-se colocar a placa com meio semeado com o microrganismos dentro de uma jarra hermeticamente fechada, contendo uma vela acessa, a qual queimar enquanto tiver O2 suficiente para manter esta combusto (C + O2 --- CO2), assim a atmosfera dentro da jarra vai conter uma quantidade de O2 reduzida e uma concentrao de CO2 aumentada. Facultativos - crescem na presena de O2 ou podem tambm crescer em anaerobiose. Quando em condies de anaerobiose, obtm energia pelo processo metablico chamado fermentao. Ex. genros da famlia bacteriana Enterobacteriacea (Escherichia coli), leveduras (Saccharomyces cerevisae) Anaerbios - aqueles que podem ser mortos pelo oxignio. No utilizam o O2 para reaes de produo de energia. Alguns at toleram baixas concentraes de oxignio : Clostridium perfringens - altamente tolerantes ao O2 Clostridium tetani - moderadamente tolerantes ao O2 Methanobacterium - anaerbios estritos Microaerfilos - podem utilizar oxignio nas reaes qumicas para a

produo de energia (1 a 15% de O2). No suportam nveis de O2 de 21% presentes na atmosfera, como requerem os aerbios, mais podem utilizar o O2 em nveis mais baixos. A tolerncia moderada ao oxignio deve-se alta susceptibilade aos radicais perxidos e o perxido de hidrognio que so formados nas culturas incubadas sob condies de anaerobiose. Exemplo : Campylobacter jejuni (provoca diarria em humanos) 3. pH - Potencial Hidrogeninico O pH timo normalmente bem definido para cada espcie. Encontra-se no valor mediano de variao de pH sobre o qual o crescimento acontece, diferentemente da temperatura tima. Para o melhor crescimento do microrganismo num meio cido ou bsico, ele deve ser capaz de manter o seu pH intracelular em torno de 7.5, no importando qual o valor do pH externo. A maneira de obter o pH da clula viva nessa faixa, expulsando ou absorvendo ons hidrognio (at um certo limite). As

variaes de pH podem ser mortal ao cultivo de microrganismo, isto pode ser prevenido pela adio de um tampo ao meio pH de alguns ambientes: guas de escoamento de solos vulcnicos e de minas : pH = 1 a 3 guas de nascentes : pH = 10 solos ricos em amnia : pH = 11 oceanos : pH = 8; guas polares : pH = 6

4. Outras condies Os microrganismos podem apresentar outras necessidades como: a luz, para os organismos fotossintticos. Alm da funo ligada ao metabolismo celular e aos nutrientes, a gua influencia o crescimento por meio da presso osmtica e da presso hidrosttica. Presso Osmtica - fora com a qual a gua se move atravs da membrana citoplasmtica de uma soluo contendo uma baixa concentrao de solutos para uma contendo alta concentrao de soluto. As clulas podem estar em um meio: (a) Isotnico - onde a concentrao de solutos em um meio igual quela no interior da clula. No h movimento de gua para dentro e para fora da clula (b) Hipertnico - onde a concentrao de solutos fora da clula maior que no interior. A gua flui para fora da clula resultando na desidratao e contrao do protoplasto. (c) Hipotnico - a concentrao de soluto no interior da clula maior que fora dela. A gua flui para dentro da clula, o influxo da gua fora o protoplasto contra a parede celular. Se a parede for fraca, pode romper-se; o protoplasto pode inchar, e eventualmente rompe. Presso Hidrosttica - a presso exercida pelo peso da gua que permanece na superfcie dela. Os microrganismos dependentes de presso so chamados barfilos, estes microrganismos morrem um meio com baixa presso hidrosttica, pois contm vesculas de gs que se expandem com grande fora na descompresso e rompem as clulas.

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Reproduo e Crescimento dos Microrganismos O crescimento em uma cultura microbiana normalmente significa um crescimento no nmero total de clulas devido reproduo dos organismos individuais na cultura. Dois fenmenos ocorrem : (1) o crescimento, ou reproduo das clulas individualmente; (2) crescimento ou aumento na populao de uma cultura microbiana Reproduo em Microrganismos Eucariticos Na natureza a reproduo ocorre de duas maneiras: (1) Reproduo Assexuada - basicamente resulta em novas clulas idnticas s originais

(2) Reproduo Sexuada - permite a troca de material gentico e assim a gerao de um novo ser

O ciclo celular dos eucaritos Todas as clulas eucariticas perfazem um ciclo celular semelhante, com exceo dos gametas. A duraco do ciclo celular varia de um tipo de clula para outra. As fases do ciclo pode ser resumida : 11

G1 - fase de crescimento - a clula cresce e sintetiza protenas S - fase de sntese de DNA - a clula continua a crescer e a sntese de DNA ocorre no ncleo at que a quantidade de DNA seja duplicada G2 - fase de crescimento - o crescimento celular atinge o seu mximo M - mitose - a sntese de macromolculas quase cessa e o ncleo sofre mitose Reproduo em Microrganismos Procariticas A maioria das bactrias se multiplicam pelo processo de reproduo assexuada FISSO BINRIA TRANSVERSA - onde as clulas dividem-se individualmente em 2 clulas-filhas de tamanho aproximadamente igual

Alguns procariotos reproduzem-se assexuadamente por outros modelos de diviso celular : (1) Brotamento - ex. Rhodopseudomonas acidophila

(2) Fragmentao - ex. Nocardia

(3) Formao de Exospros - ex. Streptomyces

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Crescimento de uma cultura bacteriana Durante o crescimento ativo de uma cultura microbiana as populaes de clulas crescem exponencialmente, aumentando por meio de uma progresso geomtrica (2n). O intervalo de tempo requerido para que cada microrganismo se divida conhecido como TEMPO DE GERAO, os quais so fortemente influenciados no somente pela composio nutricional do meio mais tambm pelas condies fsicas de incubao. Curva de crescimento bacteriana

Fase de

Taxa de

crescimento crescimento

Caractersticas nenhum aumento no nmero de

(a) - Lag

zero

clulas, aumentam de tamanho, so sintetizadas novas enzimas para as clulas se adaptarem ao novo meio condies de crescimento balanceado;

(b) Exponencial ou Log

mxima ou constante

as clulas so uniformes em termos de composio qumica e atividade metablicas e fisiolgicas. Pico da atividade e eficincia fisiolgica acmulo de produtos metablicos txicos e/ou exausto de nutrientes.

(c) Estacionria

zero

Algumas clulas morrem, outras crescem e se dividem. O nmero de clulas viveis diminue

(d) - Morte

negativa

acmulo adicional de produtos metablicos inibitrios. A taxa de morte 13

 acelerada; o nmero de clulas diminue de modo exponencial. Tipicamente todas as clulas morre em dias ou meses Medida de crescimento da populao Os microbiologistas utilizam uma variedade de tcnicas para quantificar o crescimento microbiano. Os mais comuns so: (1) Contagem Microscpica - muito comum, aplicada para quantificar clulas em vacinas, leite e culturas, e expresso em nmero de clulas/ml (2) Contagem Celular Eletrnica - muito comum, aplicada para quantificar clulas em vacinas, leite e culturas, e expresso em nmero de clulas/ml (3) Contagem em Placa - muito comum, aplicada para quantificar clulas em vacinas, de leite, culturas, solos e alimentos, expresso em UFC/ml (unidade formadora de colnia) (4) Membrana Filtrante - aplicada para quantificar clulas em vacinas, de leite, culturas, solos e alimentos, expresso em UFC/ml (unidade formadora de colnia) (5) Turbidez - aplicado para ensaio microbiolgico, estimativa de unidades de absorbncia da massa de clulas em caldo ou outras suspenses (6) Contedo de Nitrognio - muito comum, aplicado para a medida indireta da massa celular, expresso em mg de N/ml (7) Peso Seco - muito comum, aplicado para a medida indireta da massa celular, expresso em mg de N/ml (8) Produtos Metablicos - aplicados a ensaios microbiolgicos e medidas indiretas da atividade metablica (crescimento), expressa em quantidade do produto/ml Cultura Contnua Usadas para simular o habitat natural de uma espcie microbiana para estudar sua estabilidade gentica em relao ao tempo. Nas indstrias, manter as clulas em fase de crescimento logartmico ativo cessar o volume mximo de produtos desejados. Culturas Sincrnicas As clulas se dividem todas ao mesmo tempo, mais pode se conseguir isto (por um determinado perodo), por exemplo semeando uma cultura em uma temperatura 14

razovel para seu crescimento, mantendo-a nessa temperatura, onde elas metabolizaro lentamente, mas no se dividiro. Quando a temperatura rapidamente aumentada para a de crescimento timo da clula, estas sofrero divises sincronizadas (ao mesmo tempo). As culturas sincrnicas permitem aos pesquisadores estudar o crescimento microbiano, a organizao e a morfognese durante estgios particulares do ciclo de diviso celular.Na verdade no prtico analisar uma nica clula microbiana, por causa do seu tamanho diminuto. Entretanto, se todos as clulas em uma cultura esto no mesmo estgio de crescimento a informao que se pode extrair de toda a populao de clulas pode ser extrapolada para fornecer informaes aplicveis a uma nica clula. Controlar - destruir, inibir ou remover. Vrios so os agentes fsicos e qumicos que podem ser utilizados para manter os microrganismos em nveis aceitveis. Processos usados: aquecimento, baixas temperaturas, radiao, filtrao e dessecao. O mtodo de escolha depende do tipo de material que contm o microrganismo: (1) meio de cultura; (2) produtos farmacuticos; (3) superfcie de instrumentos cirrgicos; (4) sala de cirurgia de um hospital; (5) alimento de consumo humano. Substncias qumicas que matam os microrganismos, ou previnem o seu crescimento so chamados de agentes ANTIMICROBIANOS (antibacterianos, antivrus, antifngicos, antiprotozorios) Antimicrobianos: Que matam os microrganismos - MICROBICIDA (bactericida, fungicida, viricida) Esterilizao - destruio de todos os microrganismos presentes em um material, incluindo esporos. Que apenas inibem o crescimento dos microrganismos - MICROBIOSTTICOS (fungisttico ou bacteriosttico) Aspectos fundamentais que se deve aplicar aos agentes fsicos e qumicos: 1. Padro de morte em uma populao microbiana O critrio de morte de um microrganismo em Microbiologia baseado em uma nica propriedade: a capacidade de se reproduzir. Assim a morte de um microrganismo definida como a perda da capacidade de reproduo. A avaliao da eficincia de um agente microbicida pode ser testada cultivando uma amostra do material tratado para determinar o nmero de sobreviventes. 2. Condies que influenciam a atividade antimicrobiana 15

Tamanho da populao microbiana - quanto maior mais tempo para morrer Concentrao do agente microbicida - quanto menor a concentrao mais tempo leva para destruir Tempo de exposio ao agente microbicida - quanto maior o tempo de exposio maior ser o nmero de clulas mortas Temperatura em que so expostos ao agente microbicida - quanto mais alta a temperatura mais rapidamente a populao morta Natureza do material que contm os microrganismos - tempo de exposio menor - meio fluido e pH 5.0 Caractersticas dos microrganismos que esto presentes

3. Mecanismo de destruio das clulas microbianas: Conhecendo o mecanismo de ao de um dado composto possvel predeterminar as condies sob as quais atuar mais eficientemente, alm de tambm revelar que espcies de microrganismos sero mais susceptveis quele agente. Os possveis mecanismos esto associados com os principais aspectos estruturais : alterao do estado fsico do citoplasma, inativao de enzimas, ou rompimento da membrana ou parede celular - podem levar morte da clula Agentes Fsicos Altas Temperaturas : calor mido, calor seco, incinerao 1. Calor mido Mais eficiente que o calor seco para destruir os microrganismos - leva menos tempo e a temperaturas menores. Causa desnaturao e coagulao das protenas vitais, as enzimas, enquanto o calor seco causa oxidao dos constituintes orgnicos da clula (queima lentamente). Os endosposporos bacterianos so as formas mais resistentes de vida Clulas vegetativas de bactrias - mortas de 5-10 min a 60-70 oC Clulas vegetativas de fungos - mortas de 5-10 min a 50-60 oC Esporos de fungos - mortas de 5-10 min a 70-80 oC

O calor mido utilizado para matar os microrganismos pode ser na forma de: vapor, gua fervente, gua aquecida a temperaturas abaixo do seu ponto de ebulio (100
o

C)

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(a) Vapor d'gua: O vapor d'gua sob presso a mais prtica e segura aplicao do calor mido. O aparelho destinado a este fim a AUTOCLAVE, desenvolvida no sculo XIX. Procedimento do funcionamento da autoclave: A cmara de parede dupla da autoclave primeiramente lavada com vapor fluente para remover todo o ar. ento preenchida com vapor puro e mantida a uma determinada temperatura e presso por um perodo especfico de tempo. essencial que todo o ar residual inicialmente presente na cmara seja completamente substitudo por vapor d'gua - se o ar estiver presente reduzir a temperatura interna da autoclave, e a temperatura e no a presso no interior da cmara que mata os microrganismos. Uma autoclave usualmente operada uma presso de 15 lb/pol2, na qual a temperatura de vapor de 121 oC. Leva mais tempo para um calor penetrar em um material viscoso ou slido do que em um matterial fluido. Quanto maior o volume mais tempo para o calor penetrar. (b) gua Fervente: gua levada ao ponto de ebulio : 100 oC. Mata microrganismos vegetativos presentes no lquido. Os materiais ou objetos contaminados no so esterilizados com seguraa pos alguns endosporos bacterianos podem resistir a 100
o

C por mais de 1 hora. gua em ebulio no considerado um mtodo de

esterilizao (c) Temperaturas abaixo do seu ponto de ebulio (100 oC) Pasteurizao. Aquecimento lento a baixas temperaturas. Mata as clulas vegetativas de patgenos, mas no esteriliza. 2. Calor Seco: Calor seco ou ar quente em temperaturas suficientemente altas levam os microrganismos morte. Leva mais tempo que o calor mido. H materiais que no podem ser esterilizados por calor mido, neste caso o calor seco o preferido. 3. Incinerao: uma prtica de rotina: ala ou agulhas de semeaduras bacteriolgicas no bico de Bunsen. Baixas Temperaturas: Temperaturas abaixo de 0 oC inibiro o metabolismo dos microrganismos em geral. No mata, preserva-os como forma de latncia. Ex. freezer domstico: - 20 oC; freezer: - 70 oC; nitrognio lquido: -196 oC Radiaes: Energia na forma de ondas eletromagnticas transmitidas atravs do espao ou atravs de um material. As radiaes magnticas so classificadas de 17

acordo com seus comprimentos de onda: Quanto maior, menos energia (contedo energtico). Radiaes de alta energia (comprimento de onda baixo) podem matar as clulas, inclusive microrganismos - raios X, gama e luz UV Filtraes: As membranas filtrantes so teis para esterilizao, e separao de diferentes tipos de microrganismos e para coletar amostras microbianas. Tamanho dos poros que retem ou no os microrganismos : bactrias - 0.5 a 1.0 m (geral) leveduras - 1.0-5.0 m x 5-30 m

Alguns tamanhos de poros comerciais: 0.25 m ; 0.45 m ; 0.5 m ; 1 m Dessecao: Clulas microbianas vegetativas quando dessecadas interrompem suas atividades metablicas, levando a um declnio na populao total vivel. No processo chamado liofilizao os microrganismos so submetidos desidratao extrema em temperaturas de congelamento mantidas em ampolas fechadas vcuo Agentes Qumicos: Aplicao dos compostos qumicos. Reduo do nmero de microrganismos na superfcie de material inanimado (assoalhos, mesas, e utensilios domsticos). Em leses de pele para prevenir a infeco Eliminao de microrganismos patognicos da gua potvel e de piscinas

No existe um nico composto qumico que seja ideal para todos os propsitos. Assim importante conhecer algumas propriedades para que se possa escolher o mais adequado: as vantagens que o agente apresenta quando utilizados em determinadas situaes as principais categorias de agentes qumicos antimicrobianos algumas de suas caractersticas e suas utilizaes prticas e como atuam nos microrganismos

Esterilizante - um composto qumico que realiza uma esterilizao. Estril um termo absoluto, ou seja, um material est estril ou no. No pode ser "parcialmente estril" ou "quase estril"

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Desinfetante - uma substncia qumica que mata as formas vegetativas de microrganismos patognicos, mais no necessariamente suas formas esporuladas. Refere-se normalmente a substncias utilizadas em objetos inanimados Germicida - sinnimo do desinfetante; entretanto os microrganismos mortos por um germicida no so necessariamente patgenos. So usados mais termos especficos como fungicida, bactericida, etc Anti-sptico - um composto qumico usualmente aplicado na superfcie do corpo humano para prevenir a multiplicao dos microrganismos. Mata os microrganismos, ou inibe seu crescimento e sua atividade metablica Saneador - agente que mata 99,9% dos microrganismos contaminantes de uma rea. So normalmente aplicados em objetos inanimados (copos, talheres, pratos e utenslios em restaurantes), e tambm na limpeza de equipamentos de laticneos e industrias de alimentos Caractersticas de um agente qumico ideal Atividade antimicrobiana - a capacidade de uma substncia de inibir ou preferencialmente matar os microrganismos - Esta sempre a primeira exigncia Solubilidade - a substncia deve ser solvel em gua ou outros solventes (lcool) em quantidades necessria ao seu uso efetivo Estabilidade - o armazenamento da substncia durante um perodo razovel no deve resultar em uma perda significativa de ao antimicrobiana Ausncia de toxicidade - no deve prejudicar o homem ou os animais Homogeneidade - as preparaes devem ser uniformes em sua composio (os componentes ativos devem estar presentes em cada aplicao) Inativao mnima por material estranho - alguns compostos qumicos antimicrobianos combinam facilmente com protenas, diminuindo a quantidade de substncia qumica disponvel para agir contra os microrganismos Atividade em temperatura ambiente ou corporal - no deve ser necessrio aumentar a temperatura alm daquela normal encontrada no ambiente, onde os compostos qumicos so utilizados Poder de penetrao - a ao antimicrobiana limitada ao local de aplicao, entretanto a ao na superfcie algumas vezes necessrias 19

Ausncia de poderes corrosivos e tintoriais - os componentes no devem corroer ou desfigurar metais nem corar ou danificar os tecidos Poder desodorizante - o desinfetante ideal deve ser inodoro ou apresentar um odor agradvel Capacidade detergente - um agente antimicrobiano que tem propriedades detergente tem a vantagem de ser capaz de remover mecanicamente os microrganismos da superfcie que esta sendo tratada Disponibilidade a baixo custo - o produto deve ser facilmente encontrado e de baixo custo

Principais Grupos de Desinfetantes e Anti-spticos: 1. Fenol e Compostos Fenlicos: Soluo de fenol 5% mata rapidamente as formas vegetativas dos microrganismos, porm os esporos so muito mais resistentes. O fenol por ser txico e apresentar odor desagradvel no muito utilizado como desinfetante ou anti-sptico. Tem sido substitudo por vrios derivados qumicos, os quais so menos txicos para os tecidos e mais ativos para os microrganismos. 2. lcoois: Em concentrao entre 70 e 90 % as solues de etanol so eficientes contra as formas vegetativas dos microrganismos. No utilizado para esterilizar um objeto porque no mata os endosporos bacterianos (Bacillus anthracis pode sobreviver no lcool por 20 anos). O metanol no utilizado como agente bactericida - altamente txico. Quanto maior for a cadeia de carbono do lcool maior suas propriedades bactericida, porm os lcoois maiores como o proplico e isoproplico j no so mais solveis em gua. Os lcoois proplicos e isoproplicos 40 a 80% so bactericidas para clulas vegetativas. O lcool etlico 70% e o lcool isoproplico 90% (mais eficiente contra vrus) so utilizados como anti-spticos de pele e como desinfetantes de termmetro clnicos de uso oral, e de certos instrumentos cirrgicos. Mecanismo de ao: capazes de desnaturar protenas; como so solventes de lipdeos, lesam as estruturas lipdicas da membrana das clulas microbianas 3. Halognios: Iodo cloro e bromo - fortes agentes oxidantes e altamente reativos destruindo os componentes vitais da clula microbiana

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Metabolismo de todos os organismos - crescimento e reproduo Autotrficos - podem usar o CO2 da atmosfera como nica fonte de carbono (bactrias fotossintticas e plantas), a partir da qual constri todas suas biomolculas contendo carbono Heterotrficos - no podem usar o CO2 da atmosfera, podem obter carbono a partir de um ambiente na forma de molculas orgnicas complexas como a glicose (animais superiores e muitos microrganismos) As bactrias fixadoras de nitrognio fixam aproximadamente 193.000.000 de toneladas de nitrognio por ano. So necessrias 10 molculas de ATP (adenosina trifosfsto) para fixar 1 molcula de nitrognio. A amnia (NH3) necessria para todos os seres vivos, que utilizam para a biossntese de aminocidos, nucleotdeos Catabolismo - a quebra de macromolculas em pequenos compostos Anabolismo ou Biossntese - sntese de macromolculas a partir de compostos pequenos Principais fontes de energia dos microrganismos quimiotrficos - obtm energia por degradao de nutrientes ou substratos qumicos ( a energia liberada e armazenada, e os produtos finais acumulados) quimioheterotrficos - so organismos quimiotrficos, que degradam compostos orgnicos para obter energia quimioautotrficos - so organismos quimiotrficos, que degradam compostos inorgnicos para obter energia

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fototrficos - utilizam luz como fonte de energia. Possuem certos pigmentos que absorvem a luz e armazenam sua energia Transporte de Nutrientes para o interior das Clulas A maioria dos nutrientes so transportados atravs da membrana citoplasmtica por protenas especiais : protenas carreadoras. No entanto molculas de gua e alguns nutrientes solveis em lipdeos (constituintes da membrana) podem passar livremente atravs da membrana por um processo chamado difuso simples. Mais a maioria no entra na clula por este tipo de transporte. Existem 2 transportes mediados por carreadores : difuso facilitada e transporte ativo. Os 3 tipos de transporte de nutrientes para o interior da clula : Difuso Simples - entra livremente at um equilbrio do meio externo com o meio interno. No requer energia metablica Difuso Facilitada - as molculas dos nutrientes se ligam inicialmente protena carreadora. No requer energia metablica e tambm ocorre um movimento de molculas de uma maior concentrao para uma menor, at que a concentrao do lado interno e do lado externo estejam em equilbrio Transporte Ativo - a maioria dos nutrientes so transportados para dentro da clula assim. Ocorre no sentido de uma baixa para uma alta concentrao - a clula pode concentrar altos nveis de nutrientes que so adequados para as atividades metablicas, nveis que podem ser centenas de vezes maior dentro da clula que aqueles existentes fora dela. Requer consumo de energia metablica A gentica o estudo das semelhanas - Hereditariedade - e diferenas -Variabilidade Cromossomos de Clulas Procariticas e Eucariticas Um cromossomo uma estrutura densa no interior da clula que carrega fisicamente informaes hereditrias de uma gerao para outra Diferenas entre os cromossomos de clulas procariticas e eucariticas : Clulas Procariticas contm somente um cromossomo consiste de uma nica molcula de DNA de fita dupla na forma circular no possui membrana nuclear Clulas Eucariticas h mais do que um cromossomo por clula cada cromossomo consiste em uma nica molcula longa de DNA de fita 22

dupla enrolado em agregados de enrolado, espiralado e de forma altamente compacta - cerca de 1200 vezes maior que o tamanho da clula protenas histonas em intervalos regulares possui membrana nuclear apresenta forma linear, e a molcula de DNA cerca de 10 vezes mais longa Alm do cromossomo uma clula bacteriana pode conter uma ou mais estrutura de DNA chamados PLASMDIOS - molculas de DNA de fita dupla menores que os cromossomos e que podem replicar-se independentemente destes Uma clula que contm somente um de cada tipo de cromossomo um organismo chamado HAPLIDE. J que as bactrias tem 1 nico cromossomo, elas necessariamente so haplides. J a maioria das clulas eucariticas so DIPLIDES - contm 2 de cada tipo de cromossomo Replicao do DNA Nas Bactrias cromossomo circular (molcula de DNA de dupla fita) as duas fitas so desenroladas pela enzima DNAgirase (em um local especfico da molcula de DNA) formando duas forquilhas de replicao. Cada fita (separadas) serve de modelo para a fita nova, que se forma em complementariedade com a clula parental: Adenina com Timina (A-T); Guanina com Citosina (G-C). A enzima DNA polimerase assegura esta complementariedade pela adio de nucleotdeos fita nova complementar parental a medida que vai desenrolando vai formando as outras fitas as duas fitas novas j esto quase separadas as duas fitas se separam A diferena que a replicao do DNA se inicia em vrios pontos do DNA linear O Gene Um segmento de DNA que contm a sequncia de nucleotdeos para a produo de uma determinada protena. Uma vez que as clulas produzem 23

Nos Eucaritos

milhares de protenas, uma molcula de DNA contm milhares de genes, um para cada protena - um gene uma enzima A forma pela qual as clulas usam a informao no gene para produzir uma determinada protena : a informao no gene (DNA) copiada para uma molcula de cido ribonuclico (RNA mensageiro - mRNA) por um processo chamado transcrio o mRNA carrega as informaes transcritas da regio nuclear da clula para os ribossomos no citoplasma os ribossomos ento executam a traduo, um processo em que a informao no mRNA utilizada para sintetizar uma protena correspondente a partir de aminocidos Variabilidade nos Microrganismos Variabilidade est associada com duas propriedades fundamentais de um organismo: Seu Gentipo - representa o potencial hereditrio total de uma clula, referese a toda capacidade gentica de um organismo encontrado no DNA - clula bacteriana (DNA cromossmico e DNA plasmdico); clulas eucariticas (DNA cromossmico e DNA das mitocndrias; no caso de algas e plantas DNA dos cloroplastos). Seu Fentipo - representa a parte do potencial gentico que est atualmente sendo expressa por uma clula com determinadas condies - uma cor particular, ou o tamanho de uma colnia bacteriana, utilizao de compostos qumicos especficos (fonte de energia pelas leveduras); presena de cpsulas que pode ou no ser produzidas por certas bactrias dependendo de seu meio ambiente. Um nico gentipo pode resultar em muitos fentipos Alteraes Fenotpicas: O fentipo de um organismo pode ser influenciado tanto por : (1) condies ambientais; (2) pelo gentipo Exemplo: Bactrias do gnero Azomonas : na presena de sacarose ---- formam grandes colnias viscosas 24

na ausncia de sacarose ---- formam pequenas colnias no viscosas

Embora a bactria seja "sempre" potencialmente capaz de produzir o material viscoso - a presena ou ausncia do acar que determina se esta caracterstica ser expressa Alteraes Genotpicas: Pode ser resultante da (1) Mutao; ou (2) Recombinao Mutao: Mutante a clula ou o organismo que carrega o gene mutante. Tipo selvagem o organismo parental com o gene normal. Para selecionar o mutante p.ex. pode-se adicionar antibiticos ao meio - os selvagens morrero e os mutantes (resistentes ao antibitico) sobrevivero Os tipos de mutaes mais comuns: Mutao Pontual - resulta de uma substituio de um nucleotdeo por outro em um gene (num ponto s) Mutao por Deslocamento - ocorre com a adio ou perda de um ou mais nucleotdeos no gene - mutao de insero e de deleo Recombinao Leva a uma nova combinao de genes nos cromossomos. Nas bactrias este processo pode ocorrer devido tranferncia de genes cromossmicos de uma clula para outra. H trs tipos diferentes de transferncia de gene bacteriano: Transformao - a clula receptora adquire os genes de uma molcula de DNA livre presente no meio Transduo - o DNA da clula doadora transportado por um vrus (bacterifago) para a clula receptora Conjugao - dependente do contato clula-clula; pode envolver a transferncia de um plasmdio, como o plasmdio F em Escherichia coli Plasmdio - uma pequena molcula de DNA normalmente circular, auto-replicativa, que no faz parte do cromossomo bacteriana. Alguns carregam genes para resistncia a antibiticos, ou para enzimas que degradam substncias qumicas complexas, ou ainda so bacteriocinognicos

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Regulao da Expresso Gnica Uma clula contm mais de 1000 enzimas diferentes, e cada uma com efetiva atividade cataltica para algumas reaes qumicas. O controle prprio do metabolismo celular acompanhado pela regulao das enzimas - regulando a atividade das enzimas ou a sntese delas Induo Enzimtica - uma protena repressora (ligada regio operadora de um operon) inativada na presena de um indutor (lactose) - permitindo a ligao da RNA polimerase ao promotor e a transcrio do operon Represso pelo produto final - neste caso o repressor inativo e no impede a transcrio do operon; entretanto se o produto final da via metablica particular est presente, o repressor ativado, ligando-se na regio do operon e impedindo a transcrio do operon

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