Prctica #4 de Microbiologa General

Mtodos de Cultivo de Microorganismos

Introduccin:
Para efectuar el estudio de los microorganismos, se han diseado diversos mtodos que permiten cultivarlos bajo condiciones artificiales, en los que es posible cultivarlos bajo condiciones experimentales y manejar un solo tipo de microorganismo. Una de las tcnicas ms usadas en el laboratorio de microbiologa consiste en transferir una muestra microbiolgica de un ambiente determinado a un medio de cultivo, lo que permite obtener cultivos microbianos. Al efectuar este procedimiento, es necesario considerar que en el rea de trabajo, existen muchos otros microorganismos; debido a esto, es necesario tomar precauciones para impedir que stos penetren y contaminen los cultivos en estudio. Por otra parte, para considerar no slo el aspecto nutricional, sino tambin las condiciones ambientales de su hbitat natural, por lo que en el medio de cultivo se debe ajustar el pH y concentracin de sales y durante la incubacin condiciones tales como la temperatura, aireacin la luminosidad. La aplicacin de estos procedimientos ha permitido propagar a los microorganismos en cultivos mixtos, as como su aislamiento y la obtencin de cultivos puros, facilitando de este modo, el estudio, caracterizacin, aplicacin y control de los mismos. La forma de sembrarlos y cultivarlos depende del tipo de microorganismo y propsito especfico del estudio.

Objetivos:
Aplicar la tcnica adecuada para preparar el rea de trabajo y evitar contaminaciones. Organizar el material para su fcil manejo e identificacin. Manipular adecuadamente los cultivos puros. Seleccionar y aplicar las tcnicas de siembra adecuadas para alcanzar propsitos especficos. Organizar e interpretar los resultados del estudio macroscpico y microscpico de bacterias.

Marco Terico:
Cultivar un microorganismo significa promover intencionalmente el desarrollo de ste en medios de cultivo y condiciones de laboratorio controladas. La poblacin de microorganismos desarrollada en un medio se denomina cultivo. Cuando ste contiene una sola especie de microorganismo, se denomina cultivo puro o axnico, cuando contiene ms de una especie de microorganismos se denomina cultivo mixto. Un cultivo tipo contiene una especie conocida de microorganismos y es conservada en el laboratorio para realizar diversos ensayos y estudios. Un cultivo axnico consiste en una sola especie microbiana, proveniente de una sola clula. Los cultivos axnicos son muy raros en la naturaleza. En los medios naturales -por ejemplo, en el suelo, agua, o en el cuerpo humanoexisten cultivos mixtos. En un cultivo mixto, viven muchas y diferentes especies de forma conjunta. Un cultivo axnico se obtiene artificialmente en el laboratorio. A la hora de obtener un cultivo axnico se han de tomar precauciones especiales, ya que los microorganismos estn por todas partes, en la naturaleza, en el laboratorio yen los instrumentos y recipientes usados en los experimentos. Estos microorganismos no deseados o contaminantes deben ser eliminados de un cultivo para que ste pueda ser axnico. El segundo paso para obtener un cultivo axnico es inocular o introducir, una sola clula de un microorganismo en un medio slido o liquido, esterilizado previamente. De esta manera, aislamos un solo microorganismo del resto y se podr multiplicar en condiciones favorables. Un clon est constituido por una poblacin de clulas

descendientes de un solo microorganismo. Una colonia es un clon lo suficientemente grande como para ser visible sobre la superficie de un medio slido. Un cultivo microbiano que ha estado creciendo por cierto tiempo en el mismo tubo o matraz, debe ser transferido a un medio de cultivo nuevo, de otra manera el crecimiento y sobrevivencia no pueden continuar. En esta transferencia se deben considerar dos aspectos bsicos referentes a: no introducir microorganismos indeseables (contaminantes) y concentracin o carga microbiana de la muestra (inculo) a sembrar. Para impedir la contaminacin de los cultivos, es necesario tener plena conciencia de la ubicuidad de los microorganismos, lo que determina que el are y todas las superficies estn densamente pobladas por microorganismos, de este modo en la transferencia de una muestra microbiolgica a otro recipiente, se deben tener una serie de cuidados que eliminen los riesgos de contaminacin. Estos incluyen el rea de trabajo, el lavado de las manos, la esterilizacin de todos los utensilios y medios de cultivo a emplear y realizar la transferencia del microorganismo en una zona estril, la que se obtiene trabajando cerca de la flama del mechero. Al conjunto de procedimientos realizados para prevenir o evitar la contaminacin se le llama tcnica asptica; el seguimiento cuidadoso y detallado de la misma evita accidentes tales como: La contaminacin y prdida del cultivo en estudio La salida y dispersin de microorganismos del cultivo, lo que ocasionara la contaminacin de utensilios, productos y del personal. Este ltimo aspecto es particularmente importante cuando se trabaja con cultivos de microorganismos patgenos.

Con relacin a la concentracin del inculo, un error frecuente del principiante consiste en tomar muestras grandes, lo que es innecesario. Una colonia de bacterias del tamao de la cabeza de un alfiler contiene varios millones de microorganismos, es obvio que con una cantidad pequesima (casi invisible) que se adhiera al asa, ser ms que suficiente para efectuar una transferencia exitosa. Dispositivos empleados en la transferencia de muestras microbianas: hisopo, pipeta (para uso microbiolgico son terminales y la parte superior o boquilla debe estar protegida con filtro de algodn), pipeta Pasteur, cable de Kolleo portasa con alambre de platino dispuesto en forma de: aguja, asa, esptula y/o gancho. En la transferencia de microorganismos se emplean agujas, asas de inoculacin, hisopos, pipetas o pipetas Pasteur que debern esterilizarse previamente. La utilizacin de estos dispositivos, as como de los diferentes medios de cultivo tiene aplicaciones especficas. Por ejemplo: los medios lquidos se preparan en tubos o matraces que se cubren con tapones de algodn o tapones especiales. Un cultivo lquido puede ser transferido mediante un asa microbiolgica, un hisopo, pipeta o pipeta Pasteur; el inculo se deposita dentro del caldo o medio lquido. En este tipo de cultivos los microorganismos presentan un desarrollo particular que se manifiesta en la superficie o a travs de todo el lquido. Una de las ventajas que presenta este tipo de cultivo se refiere a la posibilidad de agitarlos acelerando la velocidad de microorganismos anaerobios, por otra parte, en este tipo de cultivos, las poblaciones se encuentran suspendidas y e fcil homogenizarlas, lo que permite estandarizar la concentracin del inculo. La desventaja que presentan, e que en ellos e difcil detectar contaminacin a simple vista. Los medios semislidos e preparan en tubos, se inoculan con aguja de siembra (asa recta) o pipeta Pasteur; en este ltimo caso es necesario calentar el medio y cuando se encuentra en estado lquido y a una temperatura de aproximadamente 42C se agrega el inculo, se homogeniza y se deja solidificar. Estos medios se emplean para estudiar la movilidad de los microorganismos y para favorecer la separacin de microorganismos con diferentes requerimientos de oxgeno. Los medios slidos e preparan en tubos

o matraces dependiendo de la cantidad o de las necesidades, despus de esterilizarlos, estos se inclinan o vierten en cajas de Petri. La siembra se realiza con el asa, inoculando la superficie del agar con mucha suavidad; en estos medios, los microorganismos al multiplicarse forman agregados que se hacen visibles a simple vista; a estos agregados se les denominan colonias, las que presentan caractersticas que varan con el tipo de microorganismo cultivado y el medio de cultivo empleado. En cualquier medio de cultivo es de primordial importancia ajustar el pH, ya que an cuando la mayora de los microorganismos crecen mejor en pH neutro, algunos requieren de pH alcalino o cido, por lo que al proporcionar un pH adecuado se favorecer el crecimiento del microorganismo de inters y la obtencin del cultivo. Con este mismo propsito durante la incubacin se deben proporcionar las condiciones adecuadas para el microorganismo en estudio. El crecimiento ptimo de los microorganismos se presenta a temperaturas que la mayora de las veces estn relacionadas con la de su hbitat natural. Algunos microorganismos crecen por debajo de 15C, otros requieren temperaturas ms elevadas (30 a 45C) y algunos hasta 80C. Para alcanzar y mantener estas temperaturas se puede usar una incubadora microbiolgica o un bao de agua a temperatura constante, en tanto que para lo microorganismos que presentan su crecimiento ptimo a temperaturas entre 20 y 25C se pueden incubar en la gaveta o cajn del laboratorio, a temperatura ambiente. En general las incubadoras microbiolgicas satisfacen las necesidades en cuanto a los rangos de temperatura requeridas por los microorganismos. La desventaja que tienen es que estos aparatos funcionan con are seco, lo que determina la deshidratacin de los medios de cultivo. Por lo tanto, el crecimiento de cualquier cultivo experimental que se realice en incubadora no debe prolongare por ms de nueve das. Con relacin a las necesidades gaseosas, no todos los microorganismo crecen en presencia de oxgeno atmosfrico; los que slo crecen en presencia de are se llaman aerobios obligados; los que slo crecen en ausencia de oxgeno se denominan anaerobios obligados o estrictos, un tercer grupo se adapta a las dos condiciones y se le conoce como facultativos. Existe una cuarta categora que comprende bacterias que requieren oxgeno, pero slo lo utilizan cuando ste existe en concentraciones reducidas; a estos se les llama microaeroflicos. El desarrollo de estos diferentes grupos e favorece mediante la agitacin de los cultivos o mediante la exclusin de oxgeno para lo que se emplean sustancias reductoras o equipos especiales. Las bacterias son organismos procariticos, se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza, habitan en el agua, el suelo, en la superficie o en el interior de plantas y animales incluyendo al hombre. Pueden vivir en forma libre o en simbiosis con otros organismos, ya sea como parsitos, comensales o mutualistas. Fisiolgicamente este grupo presenta caractersticas muy variables, hay bacterias mviles e inmviles fotosintticas y quimiotrficas, auttrofas y hetertrofas; se desarrollan en un rango muy amplio de temperatura, pH y condiciones gaseosas. En el estudio de cultivos bacterianos algunos de los criterios que se emplean para caracterizarlas incluyen: tamao, morfologa celular, forma de agrupacin, reaccin a la tincin de Gram, formacin de esporas, movilidad, presencia de inclusiones de reserva y caractersticas culturales en medios lquidos y slidos en los que presentan patrones de desarrollo en cuanto a la forma, tamao, elevacin y color de las colonias.

Tcnicas de Siembra:
Mtodo: Siembra por Estras en Placa
Es el mtodo ms fcil y el ms usado para obtener cultivos axnicos. Para ello, con un asa de siembra se toma una muestra de la poblacin mixta y a continuacin se hacen estras sobre la superficie de un medio slido preparado en una placa Petri (a las placas Petri tambin se les denomina simplemente placas). Conforme se van haciendo estras en zigzag con el asa, cada vez se van depositando en la superficie del medio menos microorganismos. A continuacin, se flamea el asa, se toca en la regin donde se han realizado las ltimas estras y se contina la siembra con la misma tcnica, en la superficie de medio sin sembrar an. Repitiendo este proceso varias veces se logra separar clulas individuales. A continuacin, las placas se incuban en un lugar adecuado, permitiendo que las clulas aisladas experimenten un nmero suficiente de divisiones para formar colonias visibles. Aunque cada colonia posiblemente representa un clon derivado de una sola clula, no podemos asegurarlo. Quizs, dos clulas quedaron depositadas tan juntas que han originado una nica colonia mixta. Por tanto, para asegurarnos de que hemos obtenido un cultivo axnico, conviene repetir el procedimiento a partir de una colonia bien aislada en la primera placa. Las colonias que se desarrollen la segunda vez, sern, casi con toda seguridad, cultivos axnicos. Tcnicas de Estriado: 1. Estriado simple o continuo: Esteriliza el filamento del asa de siembra y toma la parte de la caja de petri que contiene el medio de cultivo sembrado. Cercas del mechero espera que se enfre el asa y toma una colonia de la placa. Regresa la caja a su tapadera, ahora, toma una placa con agar estril (donde se vaya a sembrar) y con cuidado de no romper el agar, inocula la muestra en un extremo de la placa y con el asa en posicin ligeramente horizontal realiza las estras (muy juntas), oscilando el asa de siembra sobre la superficie de una porcin pequea del agar; mediante un balanceo sucesivo y rpido de la mueca. 2. Estriado en cuadrantes: La mayor parte del inculo e descarga en los cuadrantes 1y 2, lo que permite obtener colonias separadas en 3 y 4; Con un asa de siembra, previamente esterilizada, se toma una muestra del cultivo de microorganismos y se extiende sobre un rea pequea de la superficie de la placa con medio, en forma de estras muy juntas, pero sin hacer presin para no daar el medio. Se flamea el asa, se enfra y despus de rozar la siembra realizada previamente, se extiende de nuevo por otra zona de la placa haciendo nuevas estras. Este proceso se repite sucesivamente, flameando y enfriando el asa al comienzo de las sucesivas siembras en estra. Se lleva la placa a incubar, a la temperatura adecuada, siempre en posicin invertida. Mediante esta tcnica se obtienen colonias aisladas a partir de una muestra que contenga un elevado nmero de bacterias. Procedimiento: 1. 2. 3. 4. Esterilizar un asa de siembra por flameado en la llama de un mechero Introducirla en la suspensin bacteriana para recoger una muestra Sembrar haciendo estras sobre la superficie de un medio slido en una placa Petri, y Volver a esterilizar el asa, tocar en la zona de la placa ya sembrada y hacer un segundo grupo de estras en una regin nueva de la placa. Repetir el proceso una tercera y una cuarta vez, hasta conseguir que los grupos de clulas se diluyan y se separen clulas aisladas. 5. Despus de la incubacin, se desarrollan colonias aisladas. Para estar seguro de que el cultivo es puro, repetir el proceso entero; para ello tomar una colonia aislada y sembrar por estras una segunda placa.

Mtodos: Vertido en Placa y Extensin en Placa

En estos mtodos, las suspensiones de clulas microbianas se diluyen antes de su siembra en placa. Se siguen estas tcnicas cuando la muestra contiene tantos microorganismos, que la dilucin no se puede realizar en una sola etapa. Por ejemplo, una suspensin con mil millones de clulas por mililitro debe ser diluida 107 veces para obtener una suspensin con un centenar de clulas por mililitro. Por tanto, se realizan diluciones seriadas (en varias etapas), normalmente de diez en diez, pero a veces de cien en cien. Para realizar diluciones de diez en diez, se aade 1 ml de la suspensin bacteriana a 9 ml (le medio estril o solucin salina, igualmente estril. Se agita vigorosamente para diluir las clulas y el proceso se repite cuantas veces sea necesario. A continuacin, se puede proceder de dos maneras diferentes. En el mtodo de vertido en placa, las muestras diluidas se mezclan con agar fundido y se vierten en placa. Algunas colonias quedarn embebidas en el agar y otras crecern en la superficie. Las colonias superficiales se extendern y sern ms grandes. En el segundo mtodo (extensin en placa), las muestras diluidas se siembran directamente en la superficie de la placa de agar, extendindolas con ayuda de un asa de Diralsky de cristal estril. La suspensin se absorbe en el agar, dejando las clulas microbianas sobre la superficie. En ambas tcnicas las placas se incuban hasta la aparicin de las colonias. Como en el mtodo de siembra por estra, no existe la seguridad de que las colonias que aparecen en las placas sembradas por extensin o en el agar solidificado sembrado por el mtodo del vertido en placas sean cultivos axnicos hasta que se repita el proceso. Las dos tcnicas de siembra por dilucin presentan la ventaja de que permiten obtener un mayor nmero de colonias aisladas que el mtodo de siembra por estra, por tanto se eligen cuando se ha de seleccionar una cepa a partir de una mezcla con varios tipos de microorganismos. Procedimiento: 1. Tomar 3 tubos conteniendo 9ml de SSP. 2. Homogenizar las muestras a estudiar. 3. Usando tcnicas de asepsia transfiera 1ml de la suspensin microbiana al primer tubo, mezclar bien con movimientos suaves. 4. Extraer 1ml de esta mezcla y llevar al segundo tubo. Posteriormente mezclar. 5. Repetir esta operacin hasta completar 3 tubos. Rotular los tubos con las diluciones. 6. Las diluciones son: Tubo 1: 1/10. Tubo 2: 1/100. Tubo 3: 1/1000. 7. Inmediatamente colocar 0.1ml de cada dilucin, en tres placas Petri diferentes. 8. Verter aproximadamente 15ml de agar nutritivo licuado y enfriado a 45-50C a cada una de las placas Petri rotuladas igual que los tubos. 9. Mover las placas suavemente seis veces, describiendo crculos en el sentido de las agujas del reloj. Repetir el mismo nmero de veces, en el sentido contrario. Mover las placas de atrs hacia adelante seis veces. Estos movimientos se realizan con el fin de dispersar la mezcla. 10. Dejar enfriar en posicin horizontal. 11. Incubar en posicin invertida a 37C por 24horas.

Mtodo: Transplante o Resiembra

Para el mantenimiento, estudio y preservacin de los cultivos puros se necesita realizar resiembras de los cultivos a los medios frescos. La siembra se efecta utilizando el asa o aguja bacteriolgica que permita una desiminacin de los grmenes en el medio de cultivo.

Materiales: 1. 2. 3. 4. 5. Tubos con caldo nutritivo. Tubos con agar nutritivo recto. Tubos con agar nutritivo en pico de flauta (inclinado). Asa y aguja de Kolle. Cepas en medios lquidos y slidos: Bacillus sphaericus, Bacillus subtilis, Pseudomonas sp.

Procedimiento: 1. Con la mano izquierda tomar un tubo con la fuente de inculo. 2. Destapar el tubo con el dedo meique de la mano derecha y sostener el tapn entre los dedos. 3. Flamear la boca del tubo y el aguja o asa de Kolle. 4. Con el aguja o el asa de Kolle, picar la colonia y volver a flamear el tubo para proceder a colocar su respectivo tapn de algodn. 5. Con la mano izquierda tomar el tubo con el medio a sembrar y destaparlo con el dedo meique de la mano derecha. 6. Flamear el tubo y hacer la siembra del inculo por: Picadura en agar recto (aguja), Estras en agar inclinado, Suspensin en medio lquido. 7. Colocar en la estufa para su incubacin a 37C por 24horas. En todos los cultivos realizados, se puede distinguir: Caractersticas morfolgicas de las colonias: 1. 2. 3. 4. 5. Forma: Puntiforme, circular, filamentosa, rizoide, fusiforme, irregular. Elevacin: Plana, elevada, convexa, pulvinada, ondulado. Margen: Entero, ondulado, lobulado, crenado, filamentoso, enrollado. Superficie: Lisa, rugosa, radiada. Consistencia: Dura, blanda, mucosa, hilante.

Caractersticas pticas de las colonias y pigmentacin: 1. 2. 3. 4. 5. Opaca: No permite el pasaje de la luz. Translcida: Slo permite el paso de escasa cantidad a la luz. Iridiscente: Con reflejos metlicos cuando se expone a la luz. Butirosa: Con aspecto semejante a la grasa. Pigmentacin: Ninguna. Color especfico.

Caractersticas de crecimiento en estras sobre agar inclinado: 1. 2. 3. 4. Cantidad: Escasa, moderada, abundante. Margen o borde de crecimiento: uniforme, liso o presentando irregularidades. Consistencia de Crecimiento: Butiroso, viscoso, fibroso. Pigmentacin: Coloracin del cultivo verde, amarillo, rojo, azul, etc.

Crecimiento en cultivo por picadura: 1. Crecimiento limitado a la lnea de inoculacin. 2. Crecimiento con propagacin fuera de esta lnea. 3. Crecimiento superficial, en profundidad o ambas a la vez.

Crecimiento en caldo nutritivo: 1. Cantidad: Escasa, moderada, abundante. 2. Distribucin en caldo: Uniformemente distribuido, crecimiento limitado a la superficie, desarrollo que se acumula como sedimento (granuloso o viscoso). 3. Olor: Ptrido, a frutas aromticas o imperceptible.

Condiciones Ambientales Idneas para Microorganismos en Laboratorio

el

Cultivo de

Un medio se formula para suministrar todos los nutrientes que un microorganismo necesita para crecer, pero esto no es suficiente. En el laboratorio, tambin es preciso aportar las condiciones ambientales adecuadas. Tanto la temperatura como el pH deben estar dentro del intervalo apropiado; con respecto al oxigeno, segn el caso, ser aportado o eliminado. Temperatura Cada especie bacteriana se caracteriza por un intervalo de temperatura en el cual presenta su crecimiento ptimo. Pero, en general, los microorganismos crecen ms rpidamente cuando se aumenta la temperatura, sin llegar hasta un punto en el cual se daan las protenas. As pues, para favorecer un crecimiento rpido, las bacterias se suelen cultivar a la temperatura ms alta a la cual crecen bien, y que suele ser la de su medio natural. Escherichia coli la bacteria que ms frecuentemente se utiliza en investigacin, se encuentra en el intestino humano y de otros mamferos. Este microorganismo crece ptimamente a 37C, la temperatura del cuerpo humano. Los cultivos se mantienen a temperatura constante en incubadores o en baos de agua, ambos controlados termostticamente. Los incubadores, o estufas, son cmaras con aire adecuados para el crecimiento tanto de cultivos slidos como lquidos, preparados en cualquier recipiente, incluyendo placas Petri, tubos de ensayo, o matraces. Los medios lquidos, distribuidos en tubos o matraces, tambin pueden ser incubados en baos de agua caliente. Estos baos resultan cmodos para incubar los cultivos que tienen que manipularse con frecuencia, en la misma mesa de trabajo. pH El pH ptimo depende de la especie bacteriana, pero cada una de ellas crece en un intervalo de pH relativamente estrecho. Casi todas las bacterias crecen mejor a valores de pH prximos a la neutralidad, en el intervalo de 6,5 a7,5. Sin embargo, los hongos crecen mejor entre 4,5 y 6,0.Aunque el pH de un medio sea el adecuado cuando se inicia el cultivo, a menudo el crecimiento microbiano lo modifica. Esto sucede porque algunos microorganismos usan selectivamente algn componente cido o bsico del medio; o bien, porque algn producto de su metabolismo es un cido o una base. Para disminuir los cambios de pH en los medios definidos se suelen utilizar tampones. En los medios complejos no suele ser esencial, porque sus materiales naturales actan como tampones dbiles. Los tampones ms eficaces para valores neutros de pH son los fosfatos y el carbonato clcico. Ambos se aaden normalmente como nutrientes (fuente de fsforo y calcio); pero si se desea que acten como tampones se precisarn cantidades mayores.

Oxgeno
La concentracin de oxgeno del medio es un determinante crtico para el crecimiento bacteriano. Algunos microorganismos, a los cuales se denomina aerobios estrictos, no pueden vivir sin oxgeno porque lo necesitan para obtener energa. Otros microorganismos, llamados anaerobios

estrictos, no pueden vivir en presencia de oxgeno, para ellos es un agente txico. Otros tipos de organismos, como los anaerobios facultativos o los anaerobios aerotolerantes, pueden crecer tanto en presencia de oxgeno como en su ausencia. Los anaerobios facultativos utilizan el oxgeno si disponen de l, pero tambin pueden crecer sin l. Los anaerobios aerotolerantes no utilizan el oxgeno, pero tampoco les afecta negativamente. Los organismos microaerfilos requieren ambientes con bajas tensiones de oxgeno; las altas tensiones, como las que existen en el are son txicas para ellos. Por tanto, dependiendo del microorganismo que se vaya a cultivar, se tendr que suministrar, restringir o eliminar el oxgeno. Suministrar oxgeno a las bacterias que lo necesitan para crecer, o que crecen ms rpidamente en su presencia, representa una dificultad tcnica. Los organismos aerobios que crecen en la superficie de las placas de agar, obtienen suficiente cantidad de oxgeno de la atmsfera, aunque el interior de toda colonia es completamente anaerobio. Cuando los microorganismos crecen en medios lquidos es ms difcil, porque no existe demasiado oxgeno disuelto en el agua y los microorganismos aerobios lo consumen rpidamente. Todos los cultivos lquidos con ms de uno o dos centmetros de profundidad deben oxigenarse. Esto se lleva a cabo haciendo pasar una corriente de aire a travs del cultivo o agitndolo vigorosamente de forma continua. En casi todos los laboratorios de microbiologa existen agitadores, que son plataformas en las cuales se pueden colocar los matraces convenientemente sujetos, para ser sometidos a un movimiento de rotacin o a una agitacin de vaivn, que mezclan el aire con el cultivo. El suministro de oxgeno a los cultivos de cientos de litros, como los que se utilizan para producir antibiticos, es un desafi para la ingeniera. Estos cultivos se remueven vigorosamente mediante grandes propulsores, mientras se fuerza a que pasen a travs de ellos enormes cantidades de aire. La exclusin del oxgeno del ambiente de los anaerobios tambin plantea problemas tcnicos. Muchos microorganismos anaerobios se pueden cultivar en tubos de ensayo expuestos al oxgeno, s el medio contiene un compuesto qumico que reaccione con el mismo, como el tioglicalato, que reacciona con el oxigeno manteniendo la parte inferior del tubo libre de oxgeno. Los anaerobios tambin pueden cultivarse en placas Petri, si estas se incuban dentro de unos contenedores, en los cuales se haya eliminado totalmente el oxgeno y se haya remplazado por un gas inerte como nitrgeno o argn. Tambin se puede llevar a cabo una eliminacin qumica del oxigeno. Para ello, se comercializan paquetes con unas mezclas (le reactivos que producen hidrgeno cuando se les aade agua; el hidrgeno reacciona con el oxgeno en presencia de un catalizador; la reaccin consume el oxgeno produciendo agua. Un mtodo muy sencillo para disminuir la concentracin de oxigeno (y al mismo tiempo producir anhdrido carbnico, el cual es beneficioso para ciertos microorganismos) es encender una vela dentro de un recipiente y cerrarlo hermticamente; la vela consumir oxgeno hasta que se extinga. Esta tcnica se utilizaba para cultivar anaerobios aerotolerantes, como las bacterias del cido lctico. Tambin ha sido utilizada para microacrfilos, especialmente cuando el dixido de carbono les favorece. Los microorganismos anaerobios estrictos, que mueren incluso con una breve exposicin al aire, pueden cultivarse en jarras de cristal hermticamente cerradas. Cuando se abren estos contenedores para aadir medio o tomar muestras, se utiliza una corriente de nitrgeno para sacar el aire de la vasija. A veces, se requieren tcnicas ms elaboradas. Es frecuente el uso de cmaras libres de oxgeno, en las cuales se trabaja usando unos guantes conectados a las mismas. Algunos laboratorios tienen habitaciones libres de oxgeno, donde los tcnicos trabajan con mscaras de oxgeno.

Conservacin de los cultivos axnicos

Una vez que se obtiene un cultivo axnico, hay que mantenerlo en el laboratorio para poder trabajar con l o intercambiarlo con otros cientficos. Esto se puede llevar a cabo haciendo resiembras en un medio fresco, mensualmente o con otra periodicidad. Pero un cultivo puro tambin puede mantenerse viable durante aos sin hacerlo crecer peridicamente. A los cultivos que se mantienen en el laboratorio para su estudio y como referencia se les denomina cultivos de coleccin. Muchos laboratorios poseen una coleccin de cepas que se han aislado en el mismo o que han obtenido de las denominadas colecciones de cultivos tipo, que son organizaciones que mantienen un nmero

enorme de cultivos microbianos como un servicio a los microbilogos. Existen muchas tcnicas de mantenimiento de los cultivos puros, pero casi todas consisten en una desecacin (eliminacin del agua) o en un almacenamiento a baja temperatura. Los cultivos generalmente se desecan por liofilizacin (congelacin y desecacin). El mtodo consiste en lo siguiente: el cultivo lquido se vierte en un pequeo vial o ampolla de vidrio y se aade leche descremada para proteger las clulas durante el proceso. La mezcla se congela en hielo seco y se expone al vaci para su sublimacin (eliminacin del agua congelada). Durante el proceso de sublimacin las clulas permanecen congeladas. Posteriormente se procede al sellado de los viales, mientras an se mantiene el vaco. Los cultivos liofilizados se almacenan a temperatura ambiente. Para almacenar un cultivo empleando bajas temperaturas, se mezcla con sustancias protectoras, como la leche descremada, el glicerol, o el dimetilsulfxido (DMSO). Los tubos de ensayo se sellan y se almacenan por debajo de los - 50oC, en nitrgeno lquido o en un ultracongelador, capaz de alcanzar tan bajas temperaturas.

Imgenes:

Resultados:

Discusin de Resultados:
1. Se realizaron 3 tcnicas para sembrado de cultivo: en medio lquido (con caldo nutritivo), en medio semi-slido (medio SIM) y en placa (con estriado simple y en cuadrantes), con 6 diferentes bacterias para despus dejar incubar las bacterias. 2. Una vez incubadas las bacterias se observaron sus caractersticas macroscpicas o culturales y sus caractersticas microscpicas; Los resultados de estas observaciones realizadas se pueden ver en la tabla anterior, en la que se puede observar que cada una de ellas vara de a cuerdo a sus caractersticas especficas de crecimiento en los diferentes medios.

Conclusiones:
Por medio de esta prctica se logr utilizar las tcnicas aprendidas durante el transcurso del curso. Se logr aprender a realizar algunos de los mtodos que existen para cultivar bacterias y de esta manera observar sus caractersticas tanto macroscpicas como microscpicas e interpretacin de las mismas, con lo que se observ que para cada bacteria existen caractersticas diferentes que son las que las identifican y diferencian de otras bacterias, por lo que de esta manera se le puede llegar a identificar con su correcta siembra y observacin para anlisis posteriores o simplemente para la identificacin de una bacteria en algn medio u organismo.

Bibliografa:
1. Romero Cabello, R. Microbiologa y Parasitologa Humana: Bases etiolgicas de las enfermedades infecciosas. Editorial Panamericana, Mxico 2001. 2ed. Pp.257-429 2. http://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/jolope/GUIONPRACTICAS0506.doc 3. http://es.wikipedia.org/wiki/ 4. http://www.ucm.es/info/mfar/pdfs/GuiaMicro2.pdf