Ministrio da Sade Secretaria de Polticas de Sade Programa Nacional de DST e Aids

Tcnica de Colorao de GRAM

Braslia 2001

MINISTRIO DA SADE Jos Serra Ministro de Estado da Sade Cludio Duarte Secretrio de Polticas de Sade Paulo Roberto Teixeira Coordenador Nacional de DST/AIDS-MS Miriam Franchini Coordenadora de Produo do Projeto TELELAB

Autores: Cludia Renata Fernandes Martins Jos Antnio Pinto de S Ferreira Luiz Fernando de Ges Siqueira Lus Alberto Peregrino Ferreira Maria Lusa Bazzo Miriam Franchini Oscar Jorge Berro Slvio Valle Assessoria Pedaggica: Maria Lcia Ricciotti Ribinik Martistela Arantes Marteleto Tcnica de Coloraao de Gram. Brasilia: Ministerio da Sade, Programa Nacional de Doenas Sexualmente Transmissveis e AIDS, 1997. 63 p.: iI. (Srie TELELAB) 1. Gram I. Programa Nacional de Doenas Sexualmente Transmissveis e AIDS, (Brasil). II. Srie TELELAB

Os responsavis pela implatao do TELELAB empenharam toda sua capacidade profissional para tornar este projeto digno da qualidade tcnica e cientfica e da eficincia que nossa coordenadora geral sempre imprimiu s realizaes do Programa Nacional de DST/AIDS do Ministrio da Sade. Dra. Lair Guerra de Macedo Rodrigues, exemplo de coragem e liderana, dedicamos este trabalho.

Pedro Chequer

APRESENTAO.........................................................................................................................6 INTRODUO E MODIFICAES AO MTODO DE GRAM.....................................9 PREPARAO DOS CORANTES E TCNICA DE COLORAO DE GRAM...................................................................................................................................................15
material necessrio para preparar os corantes..................................................................17 preparao da violeta-de-metila....................................................................................18 preparao do lugol e da safranina.................................................................................19 armazenamentos dos corantes.......................................................................................20 tcnica de colorao de Gram......................................................................................20

PRINCPIO DE FUNCIONAMENTO.................................................................................23 CONTROLE DE QUALIDADE.............................................................................................27 RESULTADOS..........................................................................................................................31 FRMULAS................................................................................................................................37 BIOSSEGURANA........................................................................................................41 - 63 CONSIDERAES FINAIS...................................................................................................57 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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Agora voc faz parte do Sistema de Educao a Distncia para profissionais da sade envolvidos com o diagnstico laboratorial das Doenas Sexualmente Transmissveis e Aids - DST/AIDS - TELELAB. O TELELAB foi criado para levar at voc cursos com informaes indispensveis para que seu trabalho seja realizado dentro dos padres de qualidade estabelecidos pelo Programa Nacional de Doenas Sexualmente Transmissveis e Aids, do Ministrio da sade - PN-DST/AIDS-MS. Assistindo ao programa de vdeo e estudando este manual voc ter a oportunidade de verificar o que pode ser mudado no seu dia-adia e o que pode ser mantido. Assim, voc ter mais confiana nos resultados do seu trabalho e mais tranqilidade no que se refere sua segurana pessoal.

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Para obter o certificado, voc dever acertar no minmo 80% do ps-teste. Depois da correo do seu teste pelo PN-DST/AIDS, voc receber o certificado.

Ao final deste curso voc ser capaz de: identificar os procedimentos e tcnicas recomendados pelo PN-DST/AIDS - MS para preparao dos corantes e para a realizao da colorao Gram; e executar a colorao de Gram, obedecendo aos critrios tcnicos, critrios de controle de qualidade e cuidados de biossegurana recomendados.

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Introduo O mtodo tintorial predominante utilizado em bacteriologia o mtodo de Gram. A bacterioscopia, aps colorao pelo mtodo de Gram com diagnstico presuntivo, de triagem, ou at mesmo confirmatrio em alguns casos, constitui pea importante e fundamental na erradicao e no controle das Doenas Sexualmente Transmissveis (DST). Essa tcnica simples, rpida e tem capacidade de resoluo, permitindo o correto diagnstico em cerca de 80% dos pacientes em carter de pronto atendimento em nvel local. Os custos com investimento e manuteno so consideravelmente baixos diante da eficcia alcanada com os resultados imediatos dos testes. Essa tcnica requer instalao simples, necessitando apenas de uma sala pequena com disponibilidade de gua e gs, onde dever ser instalado um balco com pia e um bico de Busen, eventualmente substitudo por uma lamparina ou espiriteira. So ainda necessrios: microscpio com objetiva de imerso e bateria para a colorao de Gram. Os corantes devem ser preparados pelo prprio laboratrio ou por um laboratrio habitado que assegure a qualidade do produto. Finalmente, e mais importante, so necessrios tcnicos de laboratrio treinados, responsveis e conscientes do valor do seu trabalho. A colorao de Gram recebeu este nome em homenagem a seu descobridor, o mdico dinamarqus Hans Cristian Joaquim Gram. Em 1884, Gram observou que as bactrias adquiriram cores diferentes, quando tratadas com diferentes corantes. Isso permitiu classific-las em dois grupos distintos: as que ficavam roxas, que foram chamadas de Grampositivas, e as que ficavam vermelhas, chamadas de Gram-negativas. Aps descrio do mtodo, inmeras propostas de modificao foram feitas. Neste manual, voc vai conhecer a tcnica, os corantes e os procedimentos para a correta realizao da colorao de Gram, recomendados pelo Programa Nacional de Doenas Sexualmente Transmissveis e Aids do Ministrio da Sade.
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Quais as modificaes feitas ao mtodo de Gram? O mtodo original utilizava violeta-de-genciana. Hoje se utiliza um outro tipo de cristal violeta, a violeta-de-metila. importante ressaltar que a soluo de violeta-de-metila, em sua preparao, j contm fixador qumico. Devido a isso, a fixao do esfregao em chama caiu em desuso e atualmente contra-indicada. O diferenciador h 100 anos era uma mistura de solventes. Hoje se usa apenas o lcool etlico (99,5 Gay Lussac). Este mais seguro do que o lcool acetona utilizado por HURK, que requeria grande habilidade do operador para que no ocorresse a hiperdescolorao. Alm do que, no permitia uma boa reprodutibilidade da tcnica. Entretanto, a modificao mais importante foi a do corante secundrio, tambm chamado de corante de fundo. A fucsina fenicada de Gram foi substituda pela safranina. Foi baseado no espectro de cores que substituiu a fucsina pela safranina. A safranina mantm-se mais distante da violeta no espectro de cor, diferenciado com maior nitidez as bactrias Gram-negativas que se destacam das Gram-positivas e da colorao de fundo, que assume a cor vermelho-claro. Veja a figura 1, na pgina seguinte:

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Safranina

Fucsina Violeta

Violeta

Figura1: representao, no espectro de cores, da distncia entre a safranina e a fucsina, em relao violeta.

Quais as diferenas bioqumicas entre a safranina e a fucsina?

SAFRANINA Corante cido Pertencente ao Grupo das Triarilpirazinas Solvel em gua Corante Bsico

FUCSINA

Pertencente ao Grupo dos Triarilmetanos Insolvel em gua

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PREPARAO DOS CORANTES E TCNICA DE COLORAO DE GRAM

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O que preciso para preparar os corantes de Gram? Para preparar os corantes, voc vai precisar de: 1 bquer de 500 ml; 1 bquer de 1 litro; 1 balana gramatria ou eletrnica; 2 bastes de vidro; 1 proveta de 200 ml; 1 proveta de 500 ml; 1 esptula ou uma colher de caf; violeta-de-metila; lcool etlico (99,5 Gay-Lussac) lcool metlico (99,5 Gay-Lussac) axalato de amnia; iodeto de potssio; iodo metlico; safranina; e gua destilada.

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Como preparar a violeta-de-metila? (vide Frmulas) A) Primeira soluo: Se voc utilizar uma balana gramatria ou eletrnica, coloque o papel de pasagem no prato e pese o papel. Adicione a este valor 2 gramas de violeta-de-metila. Siga atentamente as instrues contidas no manual do equipamento. Assegur-se de que sua balana foi certificada pelo INMETRO. Transfira a violeta-de-metila para o bquer de 500 ml. Junte 100 ml de lcool etlico e, em seguida, 100 ml de lcool metlico. Misture lentamente com o auxlio do basto de vidro. Deixe descansar por alguns minutos e repita o procedimento de mistura vrias vezes, at conseguir a completa dissoluo do corante. B) Segunda soluo: Pese 4 gramas de oxalato de amnia. No bquer de 1 litro, junte o oxalato de amnia metade da gua destilada (200 ml). Misture lenta e constantemente como na 1 soluo, at conseguir a completa dissoluo, observando se no restaram resduos no fundo do bquer. Voc observar que o preparo desta soluo vai desencadear uma reao endotrmica, isto , a soluo ficar ligeiramente gelada. Para acelerar o processo de dissoluo do sal, voc pode aquecer em banho-Maria a 37 C. C) Preparo final: Junte as duas solues (A e B) e utilize o restante da gua destilada (200 ml) para recuperar os resduos da violeta-de-metila no bquer. Deixe descansar por 24 horas e filtre em papel de filtro comum, acondicionando o corante em frasco de vidro escuro, previamente lavado, seco e rotulado.

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Como preparar o lugol? (vide Frmulas) Para preparar essa soluo, pese 4,5 gramas de iodeto de potssio. Transfira o iodeto de potssio para um bquer contendo 450 ml de gua destilada. Com o auxlio de um basto de vidro, misture at a completa dissoluo. Em seguida, pese 3 gramas de iodo metlico e junte soluo de iodeto de potssio. Continue misturando at a completa dissoluo. Armazene em frasco de vidro escuro, previamente lavado, seco e rotulado. Como preparar o lugol diludo para uso? Em um frasco conta-gotas escuro, junte 2 ml de lugol concentrado com 38 ml de gua destilada. Como preparar a safranina? (vide Frmulas) Pese 2,5 gramas de safranina. Dissolva bem o p em 500 ml de gua destilada, misturando bem at conseguir a completa dissoluo. Guarde em frasco escuro previamente lavado, seco e rotulado.

Lembre-se A boa prtica laboratorial recomenda a identificao de todos os seus reagentes. Voc deve incluir o nome do corante, a concentrao e a data de preparao.

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Como armazenar os corantes? Os recipientes utilizados para os corantes devem ser de cor mbarescuro, pois, de forma geral, as substncias corantes sofrem ao da luz, produzindo alteraes variadas. Os corantes devem ser colocados em frascos de 1 litro e distribudos em frascos conta-gotas com cerca de 100 ml de capacidade, para uso dirio. Sempre que os frascos conta-gotas forem reabastecidos, filtre o corante. Este procedimento evitar os inconvenientes advindos da precipitao do corante. Como fazer a colorao de Gram? Antes de iniciar a colorao, assegure-se de que o esfregao esteja seco. No fixe o esfregao em chama, pois este processo promove a desidratao brusca dos constituintes celulares. Lembre-se de que a violetade-metila j contm fixador qumico. Para fazer a colorao, siga os seguintes passos:

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1. Cubra o esfregao com violeta-de-metila e deixe por aproximadamente 15 segundos; 2. Adicione igual quantidade de gua sobre a lmina coberta com violeta-de-metila e deixe agir por mais 45 segundos;
Figura 1: material para colorao de Gram.

3. Escorra o corante e lave em um filete de gua corrente; Cubra a lmina com lugol diludo (1/20) e deixe agir por aproximadamente 1 minuto; 4. Escorra o lugol e lave em um filete de gua corrente; 5. Adicione lcool etlico (99,5 GL) sobre a lmina; descorando-a, at que no desprenda mais corante; 6. Lave em um filete de gua corrente; 7. Cubra a lmina com safranina e deixe agir por aproximadamente 30 segundos; 8. Lave em um filete de gua corrente; 9. Deixe secar ao ar livre, ou seque suavemente, com o auxlio de um papel de filtro limpo; 10. Coloque uma gota de leo de imerso sobre o esfregao; e 11. Leia em objetiva de imerso (100 X).

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Como funciona a colorao de Gram? Desde o trabalho original de Hans Gram, vrios pesquisadores tentaram, com pouco sucesso, determinar o mecanismo envolvido no mtodo de colorao. Conceitos diversos tm sido apresentados, tais como: 1. A existncia de um substrato Gram-positivo e especfico; 2. As b a c t r i a s G r a m - p o s i t i v a s e G r a m - n e g a t i v a s possuiriam diferentes afinidades com o corante primrio cristal de violeta; e 3. A existncia de diferentes graus de permeabilidade na parede dos microrganismos Gram-positivos e Gram-negativos. Este ltimo o mais aceito atualmente. Tanto a espessura da parede celular, quanto as dimenses dos espaos intersticiais, por exemplo, dimetro do poro, parecem ser determinantes do resultado final da colorao de Gram. Segundo esse conceito, quando as estruturas celulares so cobertas pela violeta-de-metila, todas se coram em roxo. Com a adio do lugol, tambm chamado de mordente, ocorre a formao do completo iodo-pararosanilina. Esta reao tem a propriedade de fixar o corante primrio nas estruturas coradas. Algumas estruturas perdem a cor violeta rapidamente, quando se aplica um agente descorante, como lcool etlico, enquanto outras perdem sua cor mais lentamente ou no perdem a cor. A safranina cora as estruturas que foram descoradas.

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As bactrias que tm a parede celular composta por murena (peptdeoglicano - peptdeo de cido n-acetil murmico), durante o processo de descolorao com lcool etlico, retm o corante. J as bactrias com parede celular composta predominantemente por cidos graxos (lipopolissacardeos e lipoprotenas) perdem o complexo iodo-pararosanilina, assumindo a cor do corante de fundo. Veja as figuras 1 e 2. Gram +
peptdeoglicano (MURENA)

Gram peptdeoglicano (MURENA)

membrana citoplasmtica

membrana citoplasmtica

espao periplasmtico

membrana externa lipopolissacardeo

Figura 1. Esquema da parede das bactrias Gram-positivas

Figura 2. Esquema da parede das bacterias Gram-negativas

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Como fazer o controle de qualidade do mtodo de colorao de Gram? O controle de qualidade uma atividade obrigatria da rotina diria. Para realizar o controle de qualidade dos corantes e da colorao de Gram, voc precisa de duas cepas bacterianas: a Gram-positiva dever ser um Streptococcus pyogenes ATCC - American Type Culture Collection - n 19.615 e a Gram-negativa dever ser a Escherichia coli ATCC n 25.922.

Ateno Para informao sobre a obteno de cepas-padro, comunique-se com o:

TELELAB - PN- DST/AIDS- MS Telefax gratuito: 0800 61-2436

Como fazer a manuteno das cepas-padro? Para manter as cepas bacterianas do controle de qualidade em seu laboratrio, voc dever repic-las, a cada 15 dias, em gar nutriente (tubo com gar inclinado). O controle da pureza das cepas bacterianas dever ser realizado a cada 2 meses. As cepas devero ser repicadas em placas (mtodo do esgotamento por estrias) e identificadas segundo procedimentos microbiolgicos tradicionais. Aps confirmao da pureza das cepas, estas devero voltar a ser estocadas em tubos com gar nutriente. O mtodo detalhado e os protocolos de estoque acompanharo as cepas fornecidas por meio do Programa Nacional de Doenas Sexualmente Transmissveis e Aids do Ministrio da Sade.
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Como preparar as lminas de controle de qualidade para uso dirio? Obedea ao seguinte procedimento. Prepare uma suspenso de Streptococcus Pyogenes e Escherichia Coli. Para isso, pipete 2 ml de soluo salina estril em um tubo de ensaio limpo e estril. Junte uma alada do Streptococcus Pyogenes e outra de Escherichia Coli. Muita ateno com os procedimentos tcnicos e cuidados de biossegurana durante a execuo. Flambe a ala bacteriolgica antes e aps a utilizao com cada uma das cepas bacterianas. No se esquea de esfriar a ala aps a flambagem. Prepare 30 lminas para utilizar durante 1 ms, pipetando uma gota da suspenso bacteriana sobre cada uma das lminas de vidro, limpas, secas e desengurduradas. Deixe as lminas secarem naturalmente. Estoque-as em um porta-lminas em temperatura ambiente. Lembre-se de identificar o porta-lminas.

O controle de qualidade dever sempre ser realizado ao trmino da preparao dos corantes, mesmo que seja uma simples diluio, como no caso do lugol e todas as vezes que o procedimento de colorao for realizado.

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Veja, nas figuras de 1 a 6, alguns resultados que podem ser obtidos:

Figura1: Controle de qualidade da colorao de Gram. Cocos Gram-positivos e bacilos Gram-negativos.

Figura 2: Leveduras apresentando apenas elementos leveduriformes.

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Figura 3: Leveduras apresentando filamentos micelianos e elementos leveduriformes.

Figura 4: Trichomonas vaginalis coroado pelo Gram.

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Figura 5: Diplococos Gram-negativos intracelulares sugestivos de Neisseria gonorrhoeae.

Figura 6: Bacilos Gram-negativos intracelulares sugestivos de Haemophilus ducreyi.

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Frmulas

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Violeta-de-metila:
1 Soluo: Violeta-de-metila............................................................................................................2,0g lcool etlico (99,5 Gay-Lussac)....................................................................100,0 ml lcool metlico (99,57 Gay-Lussac)..............................................................100,0 ml 2 Soluo: Oxalato de amnia..................................................................................................4,0 g gua destilada......................................................................................................400,0 ml Misturar as duas solues, deixar em repouso por um perodo de 24 horas, ao abrigo da luz, aps o perodo de repouso, filtrar em papel de filtro comum e estocar em frasco escuro previamente lavado e seco.

Lugol:
Iodeto de potssio.........................................................................................................4,5g Iodo metlico...................................................................................................................3,0g gua destilada.........................................................................................................450,0ml Misturar o Iodeto de potssio na gua, at a completa dissoluo. Acrescentar o lodo metlico e continuar misturando at dissolver completamente. Diluir antes de usar, a uma concentrao de 1/20, com gua destilada.

Safranina:
Safranina....................................................................................................................................2,5g gua destilada.........................................................................................................500,0ml Misturar bem o p na gua at a completa dissoluo. Ateno: Identifique cada frasco com o nome do corante e a data do preparo.
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Para cuidar de sua segurana, da segurana de seus colegas de trabalho e do meio ambiente, obedea aos procedimentos bsicos de biossegurana em laboratrios:

Figura 1. Smbolo de risco biolgico

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Todo cuidado pouco na manipulao de materiais biolgicos, tais como soro, sangue ou secrees, fluidos orgnicos, tecidos etc. Redobre suas precaues, pois esses materiais so potencialmente infectantes e muitas vezes esto contaminados com agentes etiolgicos diferentes do que se est pesquisando, ou ainda desconhecidos. Nunca pipete com a boca e jamais cheire placas de cultura. A inativao do soro em banho-maria a 56C por 30 minutos no elimina o potencial infectante da amostra. Lembre-se de que, com a automao, aumentou muito o nmero de amostras processadas em laboratrio e, conseqentemente, aumentou tambm o risco de contaminao. Como voc sabe, difcil afirmar que um profissional se contaminou, de fato, em servio. Isso faz com que as doenas infecto-contagiosas causadas por acidentes de trabalho no sejam devidamente notificadas; em conseqncia, as medidas de segurana envolvendo o biorrisco acabam no sendo implementadas.

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Use sempre Equipamento de Proteo Individual (EPI): avental ou jaleco longo de mangas compridas e punho retrtil, luvas descartveis, culos de proteo, pipetadores manuais ou automticos e, quando for o caso, protetor facial.

Os EPI so regulamentados pelo Ministrio do Trabalho e seu uso visa a minimizar a exposio do tcnico aos riscos e evitar possveis acidentes nos laboratrios. Note que, s vezes, os profissionais de laboratrio precisam de um tempo para se adaptar ao uso dos equipamentos na sua rotina. O importante que voc se adapte e incorpore a utilizao dos EPI sua prtica profissional. O uso indevido dos EPI, ao invs de proteger, poder ocasionar acidentes.

Figura 2. Ilustrao dos principais Equipamentos de Proteo Individual (EPI)

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Evite a formao e disperso de aerossis. Aerossis so micropartculas slidas e lquidas com dimenses aproximadas entre 0,1 e 50 micra que podem, caso contenham microorganismos, permanecer em suspenso e plenamente viveis por vrias hora. A pipetagem, flambagem de alas, abertura de frascos e ampolas, manipulao de seringas, agulhas, lancetas, lminas e outros assemelhados podem gerar e propagar aerossis.

Abertura de frascos, ampolas, tubos e garrafas de cultura requer cuidados especiais. Envolva a parte a ser aberta com um pedao de gaze. Utilize um pedao de gaze para cada material, prevenindo assim a contaminao cruzada. Descarte-a imediatamente em hipoclorito de sdio a 2 %. Centrfugas, agitadores e maceradores, quando manipulados sem as precaues e abertos antes da total parada ou trmino da operao, igualmente podem contaminar o ambiente laboratorial.

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Jamais reencape agulhas. Esse procedimento uma das principais causas da contaminao de profissionais de sade por microorganismos, existentes no sangue e em outros fluidos orgnicos, como por exemplo, o vrus da hepatite B e o HIV. Aps a coleta, voc deve descartar esse material diretamente em recipiente de paredes rgidas com tampa, contendo hipoclorito de sdio a 2 % em volume superior a metade do recipiente. Lembre-se: Cada mililitro de sangue contaminado com o vrus da hepatite B contm 100.000.000 de partculas virais, que podem permanecer viveis por at uma semana. Basta uma dessas partculas para contaminar a pessoa.

Figura 3. Ilustrao do descarte de agulha em recipiente apropriado

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Reduza ao mximo o manuseio de resduos, em especial os perfurocortantes. Descarte o rejeito perfurocortante diretamente em recipiente de paredes rgidas, contendo hipoclorito de sdio a 2 %. Deixe em imerso total no mnimo por 24 horas e, em seguida, faa a autoclavao desse material.

Esta uma regra bsica para diminuir os riscos de acidente nos laboratrios. fundamental que os materiais perfurocortantes sejam autoclavados depois da imerso em hipoclorito de sdio a 2%. S ento esses materiais devem ser encaminhados ao lixo hospitalar. O acondicionamento dos resduos de laboratrio deve seguir a Norma Brasileira (NBR) 9190 da Associao Brasileira de Normas Tcnicas- ABNT, que recomenda sacos brancos leitosos para os resduos potencialmente infectantes e hospitalares e escuros para o lixo comum. Os profissionais responsveis pela limpeza e conservao devem ser bem orientados e usar equipamentos de proteo. Todos os recipientes para descarte devem estar identificados. Lembre-se de que, pela legislao brasileira, quem gera o resduo o responsvel pela sua eliminao e controle. No caso dos materiais reutilizveis, como vidraria e utenslios, deposite-os em recipiente contendo o desinfetante prprio, pelo tempo de contato recomendado e, em seguida, faa a autoclavao. Depois, lave normalmente esses materiais e guarde-os para uso posterior.

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Identifique e sinalize os principais riscos presentes em seu laboratrio. Produtos e reas que oferecem risco devem ser marcados com os devidos smbolos internacionais em etiquetas auto-adesivas padro. Veja, a seguir, os principais smbolos associados aos riscos em laboratrios.

PERIGO BIOLGICO
Entrada permitida somente para pessoas autorizadas
Natureza do risco: Funcionrio responsvel: Em caso de emergncia, chame por: Telefone diurno: Telefone residencial:

Figura 4. Smbolo de risco biolgico para entrada de laboratrio.

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Figura 5. Principais smbolos internacionais associados aos riscos em laboratrios.

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Verifique sempre as condies de funcionamento dos equipamentos de Proteo Coletiva (EPC): extintores de incndio, chuveiros de segurana, lava-olhos, pia para lavagem de mos, caixa de areia e cabine de segurana biolgica.

Existem trs tipos de cabines de segurana biolgica disponveis no mercado: as de classe I, classe II e classe III. So recomendadas para o uso em laboratrios clnicos as de classe II. Veja a figura , na pgina seguinte. Procedimentos que devem ser observados na cabine de segurana biolgica: Descontamine a superfcie interior, antes e depois do uso, com gaze estril embebida em desinfetante adequado; Ligue a cabine e a luz ultravioleta 20 minutos antes e deixe tudo ligado pelo mesmo tempo ao final de sua utilizao; Use avental de mangas longas, luvas descartveis e mscara; No efetue movimentos rpidos ou bruscos dentro da cabine e evite operaes que causem turbulncia; No use bico de Bunsen, pois pode acarretar danos ao filtro HEPA e causar desequilbrio do fluxo de ar. Se necessrio, use incinerador eltrico ou microqueimador automtico; e Mantenha as grelhas anteriores e posteriores da cabine desobstrudas. A cabine no um depsito. Evite guardar equipamentos ou quaisquer outros objetos no seu interior.

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CLASSE I

CLASSE II

CLASSE III

Figura 6. Ilustrao das cabines de segurana biolgica - classes I, II e III.

As cabines de classe I e II so consideradas como barreira de proteo parcial e a de classe III uma barreira de proteo total.
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Para descontaminao pessoal, de equipamentos e superfcies fixas, utilize desinfetantes eficientes e adequados. Use sempre produtos registrados no Ministrio da Sade.

No existe um desinfetante nico que atenda a todas as necessidades. fundamental conhecer os diversos agentes qumicos e sua compatibilidade de uso para evitar custos excessivos e utilizao inadequada. Para a descontaminao de amostras biolgicas na rotina dos laboratrios clnicos, recomendamos os compostos liberadores de cloro. O mais comumente utilizado o hipoclorito de sdio a 2 %. Sua forma mais ativa o cido hipocloroso (HOCI), que formado em solues com pH entre 5 e 8. A eficcia do cloro decresce com o aumento do pH e vice-versa. Cabe lembrar que a atividade desse cido diminuda na presena de matria orgnica, fato que deve ser considerado quando aplicado em superfcies contendo sangue e outros lquidos corpreos. Os hipocloritos tm sua estabilidade dependente de fatores como concentrao, temperatura, pH, luz, metais e prazo de validade. Os hipocloritos so corrosivos para metais. Objetos de prata, alumnio e at mesmo de ao inoxidvel so atingidos, quando imersos em solues rotineiramente utilizadas em laboratrio. O hipoclorito de sdio txico e causa irritao na pele e olhos. Se ingerido, provoca corroso das membranas e mucosas e sua inalao causa irritao severa no trato respiratrio. Jamais misture os hipocloritos com outras substncias qumicas, tais como desinfetante, lcool, solues germicidas etc. Aps o tratamento por 24 horas com hipoclorito de sdio a 2%, os materiais devem ser autoclavados. A autoclavao recomendada tendo em vista a possibilidade de o hipoclorito no atingir as partes do material a ser esterilizado. Caso isso no seja possvel, a alternativa o mtodo de fervura por perodo no inferior a 30 minutos.
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Observe, na tabela abaixo, a indicao de alguns agentes qumicos e seu espectro de ao antimicrobiana.

Eficincia antimicrobiana de alguns agentes qumicos desinfetantes frente a agentes microbianos.

Bactrias Etanol Formaldedo Glutaraldedo Comp. Cloro Fenis Quaternrios de amnia Iodforos + + + + + + +

Vrus lipoflicos + + + + + + +

Vrus hidroflos _ + + + _ + +

Microbatrias + + + + + _ _

Fungos + + + + + +

Esporos bacterianos _ + + + _ _ _

(+) Atividade ( - ) Ausncia de atividade ( V ) Varivel de acordo com o microorganismo

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Tenha muito cuidado com a manipulao e estocagem de substncias qumicas. Leia com ateno as informaes contidas nos rtulos.

A estocagem de matria-prima deve ser feita em armrios apropriados, bem ventilados, ao abrigo da luz solar e calor. importante observar a incompatibilidade entre as diferentes substncias. Sempre que recomendado pelo fabricante, os agentes qumicos devem ser manipulados em capelas de exausto qumica devidamente instaladas. Ateno: No confunda capela de exausto qumica com cabine de segurana biolgica. Veja a seguir os riscos relacionados a cada categoria qumica: Categoria qumica e riscos relacionados

Grupo qumico
cidos Bases Cianetos e Sulfetos Lquidos inflamveis Slido Inflamvel

Risco
Corroso Corroso Envenenamento Incndio Incndio

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Seja sempre consciente da importncia de suas aes na preservao da biossegurana em seu local de trabalho: Lave as mos antes e depois de qualquer procedimento laboratorial; Nunca pipete com a boca; Jamais cheire placas de cultura; Dentro do laboratrio, no fume, no coma, no beba, no prepare refeies; Quando estiver usando luvas, no manuseie objetos de uso comum, como telefones, maanetas de portas e janelas, jornais, revistas etc; No guarde alimentos ou bebidas em geladeiras e congeladores para armazenagem de material biolgico; e Vacine-se rotineiramente contra a hepatite B.

Seguindo essas recomendaes, voc vai estar contribuindo para a diminuio de acidentes.

Se acontecer um acidente de trabalho em seu laboratrio, notifique imediatamente a sua chefia.

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CONSIDERAES FINAIS

Muitas das atividades aqui descritas j fazem parte do seu cotidiano. Faa uma reflexo sobre o que acabou de ler e verifique o que pode ser mantido, modificado e incorporado a seu trabalho e ao seu laboratrio para que a sua prtica profissional se desenvolva de acordo com os procedimentos tcnicos e cuidados de biossegurana recomendados pelo Programa Nacional de Doenas Sexualmente Transmissveis e Aids, do Ministrio da Sade. As questes colocadas a seguir facilitaro essa reflexo.

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Condies gerais do laboratrio As reas de circulao esto desobstrudas? Qual a situao geral quanto ao aspecto de limpeza? Qual o estado de conservao e manuteno de pisos, escadas, paredes e tetos? O local de trabalho est adequado para atividades envolvendo o risco biolgico? As bancadas e demais mobilirios do laboratrio esto em condies de uso? Existem bancadas apropriadas para trabalhos com solventes e demais substncias qumicas corrosivas? Existe pia diferenciada para lavagem das mos no laboratrio? Existem mecanismos de conteno que previnam a entrada de insetos e roedores? Existem programas de manuteno preventiva de equipamentos? Estocagem Os produtos armazenados e a rea de estocagem esto organizados com os devidos cuidados de segurana? Existe o cuidado de se estocar materiais e/ou substncia incompatveis separadamente?

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Local de higiene pessoal e de alimentao O local mantido limpo e em condies de higiene? Existe gua potvel disponvel? Existem sabo e toalha em condies de uso? Existe local para troca de roupa e guarda de objetos pessoais? Existe rea para alimentao separada da rea de laboratrio? Existe adequada organizao para coleta de lixo e demais rejeitos (no-infecciosos)? Refrigerao e Ventilao A temperatura de trabalho est entre 20 e 260C? As janelas esto protegidas contra o excesso de luz solar? Existe ventilao adequada, especialmente nas salas com cabines de fluxo laminar? Iluminao A iluminao geral adequada? Existe iluminao dirigida nas bancadas de trabalho? Servios O laboratrio tem suficiente abastecimento de gua, energia eltrica e gs? Existe adequada manuteno de fusveis, lmpadas e cabos eltricos? A limpeza e higienizao das caixas d`gua so realizadas com periodicidade recomendada?
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Segurana geral O laboratrio devidamente fechado e seguro quando no est ocupado? As portas e janelas so mantidas devidamente fechadas? Os materiais txicos e equipamentos de risco so estocados em rea segura? Preveno de incndio Existe sistema de alarme? As passagens pelas portas de emergncia esto desobstrudas? O sistema de deteco de incndio est em bom funcionamento e regularmente testado? Existe sinalizao de emergncia? Existem extintores de incndio para os diversos tipos de materiais e em quantidade suficiente? Os extintores esto dentro do prazo de validade? Existe sinal de no fumar na rea de laboratrio? A equipe est treinada em combate a incndio? Estocagem de lquidos inflamveis O local est separado do prdio principal? Existe ventilao suficiente para retirar vapores? O local est devidamente sinalizado? Existem lmpadas seladas para proteo contra ignio nos vapores? Existe advertncia de no fumar?
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Risco com eletricidade As instalaes esto de acordo com os padres estabelecidos pela ABNT? Existe fio de terra? Os equipamentos esto devidamente aterrados? Os equipamentos com potencial de risco de desligamento esto devidamente ligados a um circuito de emergncia para os casos de queda ou interrupo de energia? Os cabos de conexo aos diversos equipamentos esto em perfeito estado de manuteno? Cada equipamento est ligado em uma tomada; evita-se o uso de benjamim? Todas as tomadas tm sua voltagem identificada? Voc sabe onde fica o quadro-geral de fora da sua unidade? Gases e lquidos comprimidos Os diversos tipos de gases esto devidamente identificados? Os cilindros possuem vlvulas de segurana? Existe advertncia de no-utilizao de leo nas vlvulas? Os cilindros esto devidamente seguros contra quedas? Existe ventilao suficiente para evitar a formao de bolses de gases e exploses? Proteo pessoal Existem em quantidade suficiente: Lava-olhos? Chuveiros de emergncia? Protees contra radiaes, incluindo os dozmetros? Mscara contra partculas? Luvas descartveis? Pipetadores manuais e/ou automticos? culos de proteo e outros?
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Segurana e sade ocupacional Existe servio de sade ocupacional? Existe caixa com materiais para primeiros-socorros? Existem profissionais treinados em primeiros-socorros? Existem informaes sobre como agir em caso de emergncia, tais como: telefone de hospitais, pronto-socorros e bombeiros? Existe um programa de vacinao atualizado? Existe sinalizao educativa para prevenir o risco? Equipamento de laboratrio Os equipamentos esto validados e certificados quanto a seu uso? Existe procedimento de desinfeco de equipamentos antes de envi-los manuteno? As cabines de segurana biolgica e qumica so regularmente testadas? As autoclaves esto validadas? As centrfugas, rotores e frascos tm seus tempos de utilizao devidamente anotados? Vidrarias quebradas e trincadas so descartadas? Existem recipientes adequados para descartar frascos quebrados e material perfurocortante? As capelas de exausto para manipulao esto devidamente sinalizadas? Suas balanas esto certificadas pelo Inmetro? Seus congeladores, geladeira, fornos, estufas ou equipamentos termo-regulavis possuem sinais de controle e registro de temperatura?
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Material infeccioso, qumico e radioativo Os materiais biolgicos so recebidos em condies de segurana? Utilizam-se luvas descartveis, quando se est manipulando material biolgico? As bancadas so desinfetadas com a devida freqncia? Existe protocolo de descarte de material contaminado? Os desinfetantes so apropriados e devidamente validados? As substncias esto devidamente etiquetadas? Existe cartaz com os riscos e categorias toxicolgicas das diversas substncias? O estoque de radioistopos devidamente controlado? Existe procedimento de descarte de substncias qumicas e radioistopos? Existem procedimentos que visam a evitar contato entre substncias qumicas incompatveis? Utilize este manual, junto com o vdeo, como fonte permanente de consulta. Mantenha este manual sempre ao seu alcance e faa dele um instrumento a mais de trabalho. Voc tem comunicao direta e gratuita com o:

TELELAB - PN- DST/AIDS - MS Telefax gratuito: 0800 - 61- 2436

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REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS BARON, E.J. & FINEGOLD, S.N,, Appendix B, Formlas for commonly used stains. In: Bailey and Scotts diagnostic microbiology, 8 ed. St. Louis, 1990. Mosby. BARON, E.J,; PETERSON, L.R. & FINEGOLD, S.N,, Optical methods for laboratory diagnosis of infectious diseases. In: bailey and Scotts diagnostic microbiology, 9 ed.st.Louis, 1994, Mosby. BARTHOLOMEW, J.W., CROMWELL, T. & GAN, R.. Analysis of the mechanism of Gram differentiaton by use of filter paper chomatographic Technique. J.Bacteriol, 90:766, 1965. BOTTONE, E.J. The gram stain: The century-old quintessential rapid diagnostic test. Lab. Med. 19:288, 1988. CLARRINDGER, J.E. & MULLINS, J.M. Microscopy and Staining. In: Howard, B,J.; Klass, J. II & Rubin, S.J.eds. Clinical and Pathogenic Microbiology, 1987. Mosby. ST.Louis. DAVIES, J.A., ANDERSON, G.K. & BEVERIDGE, T.J. Chemical mechanism of the Gram stain and Synthesis of a new electron-opac marker for eletron microscopy which replaces the idione mordant of the stain. J. Bacteriol. 156:837, 1983. DOUGLAS, S.D. Microscopy. In: Lenette, E.H.,editor. Manual of Clinical Microbiology, 4 ed. Washington D.C., 1985, American Society for Microbiology. MANGELS, J.I., COX, M.E. & LINDENBERG, L.H. Methanol fixation: an alternative to heat fixation of smears before staning. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2: 129, 1984. RICE-SPEARMAN, L. The Gram Stain: Still a diagnostic tool? Clin. Lab. Sci. 6: 16, 1993.
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Agradecimentos:

s equipes da: Instituto de Sade Pblica do Distrito Federal - ISDF; Ao Laboratorio ControlBio, So Paulo; e ao Hospital Universitrio - Universidade Federal de Santa Catarina-UFSC.

Projeto Grfico, Diagramao e Arte-final: Coordenao Nacional de DST e Aids