CAPTULO 15 B

IBLIOTECA DE ADNC EN EL BACTERIOFAGO LAMBDA

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BIBLIOTECA DE ADN C EN EL BACTERIOFAGO LAMBDA

CLAUDIA SANTINI , ALESSANDRA LUZZAGO1
1

Dipartimento di Biotecnologia, Istituto di Ricerche di Biologia Molecolare P. Angeletti (IRBM), Pomezia, Roma, Italia.

INTRODUCCIN
En los ltimos aos, la tecnologa de presentacin de pptidos o protenas sobre
la superficie de bacterifagos ha mostrado ser muy til en el descubrimiento de ligandos de un receptor especfico. Una aplicacin muy interesante de esta tecnologa es la construccin de bibliotecas de ADN complementario (ADNc). Las bibliotecas que expresan ADNc se utilizan desde hace algunos aos para identificar antgenos o molculas que interaccionan con una segunda molcula, la cual, a su vez, se utiliza como sonda. Incluso en la actualidad, la utilizacin de las bibliotecas tradicionales, construidas generalmente con vectores derivados del fago lambda, es extremadamente trabajosa desde el momento en que la entera complejidad de una biblioteca determinada, debe ser plaqueada e hbridarse con el ligando de inters (por ejemplo, un anticuerpo), el cual, por ende, debe ser utilizado en grandes cantidades. La presentacin del producto de expresin del ADNc sobre la superficie del fago, en vez de intracelularmente como en el caso de las bibliotecas tradicionales, da la posibilidad de seleccionar la protena a partir de una mezcla de fagos extremadamente compleja y con el empleo de cantidades mnimas del anticuerpo o ligando de inters. Mltiples ciclos sucesivos de seleccin permitiran la identificacin del dominio proteico de inters en poco tiempo y sin un gran gasto de materiales. Los vectores de presentacin ms comnmente utilizados se derivan de fagos filamentosos (f1, M13), en los cuales los pptidos o protenas pueden ser fusionados al extremo amino de la protena pIII o pVIII de la cpsida del fago [1].

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CAPTULO 15

Aunque las protenas pIII y pVIII de los fagos filamentosos se han utilizado con xito en numerosas aplicaciones, su uso para la construccin de repertorios complejos de origen natural como las bibliotecas de ADNc ha sido muy limitado hasta nuestros das. Esto se debe, probablemente, a limitaciones que presentan ambas protenas de la cpsida para estas aplicaciones. El producto del gen III tolera inserciones de dominios proteicos de un tamao considerable, pero est presente en la cpsida del fago en un nmero reducido de copias, lo que no permite una presentacin multivalente de tales dominios. Esta ltima caracterstica hace que la presentacin mediante la protena III no sea adecuada para la seleccin con ligandos cuya concentracin o afinidad no se conoce, como es el caso de los anticuerpos presentes en el suero de pacientes. Por el contrario, pVIII puede generar una exposicin multivalente, pero no se logra presentar los dominios proteicos grandes de manera eficiente. Otra limitacin comn a los dos sistemas surge del hecho de que las protenas de fusin deben atravesar necesariamente la membrana plasmtica de la bacteria husped para poder ser presentada en la superficie del fago filamentoso. Esto hace muy poco probable que las protenas sean presentadas con eficiencia puesto que su plegamiento correcto ocurre normalmente en el citoplasma de la bacteria. Para resolver esta limitacin, recientemente se desarrollaron varios vectores de presentacin basados en diferentes sistemas de fagos filamentosos [2-6]. El bacteriofago lambda es uno de los vectores de particular inters por su utilizacin para la presentacin de protenas codificadas por ADNc. En el caso del fago lambda, no es necesaria que la protena a presentar atraviese la membrana porque el virus se ensambla dentro de la bacteria. Este fago est compuesto por una cabeza icosadrica que contiene dos protenas, gpE y gpD, y una cola compuesta principalmente por otra protena denominada gpV. La protena D, que forma parte de la cpsida, tiene un peso molecular de alrededor de 12 kD y es esencial para la estabilidad de la partcula viral. Estudios de microscopia electrnica han demostrado que la protena D, presente en alrededor de 405 copias por fago, se ensambla en forma de trmeros que se muestran como protuberancias en la superficie de la cpsida [7]. Se ha visto recientemente que la protena D tolera fusiones con protenas de tamao considerable. Esta fusin se puede llevar a cabo tanto en el extremo amino como en el extremo carboxilo de la protena [4, 5] y el producto de fusin obtenido se ensambla en la cpsida del fago y es accesible a ligandos como los anticuerpos. En este captulo se expone la construccin y seleccin de bibliotecas de ADNc mediante el uso de un sistema basado en la protena D del fago lambda.

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VECTOR PARA LA PRESENTACIN DE PROTENAS EN BIBLIOTECAS DE ADNC

El vector pRH825 permite la presentacin de dominios proteicos fusionados al extremo carboxilo de la protena D del fago lambda [8]. Este vector tiene las siguientes caractersticas: 1. Expresin de la protena D natural y del producto de fusin en una proporcin controlada. De hecho, en el ADN de este fagmido est presente el gen que codifica la protena D natural con un codn de terminacin mbar al inicio. El gen modificado es regulado por un promotor inducible por IPTG. La produccin de la protena nativa puede ser regulada en una cepa supresora de la mutacin mbar, mientras que la produccin de la protena recombinante puede ser regulada a partir de la concentracin de IPTG. 2. Clonacin orientada de los insertos. En el extremo 3 del gen que codifica la protena D existen dos sitios de restriccin (SpeI y NotI) para la clonacin de genes heterlogos. 3. Resistencia a ampicillina. Permite el aislamiento de los fagos no slo a partir de las placas de lisis, sino tambin como un replicn autnomo en una colonia bacteriana. 4. Presencia de sitio de recombinacin Lox P. En presencia de la protena Cre este sitio permite la escisin o la insercin en el genoma del fago del plsmido que contiene el gen que codifica la protena D modificada.

PROCEDIMIENTO 1. P REPARACIN DE CLULAS COMPETENTES PARA LA INFECCIN POR EL BACTERIOFAGO LAMBDA

1. Inocular una o ms colonias de la cepa bacteriana BB4 (SupE supF hsdR F proAB lacIq lacZM15) en un erlenmeyer de 250 mL que contenga 100 mL de medio LB y maltosa 2 %. 2. Incubar a 37 C con agitacin vigorosa. Cuando el cultivo se vuelva turbio, transferir las clulas a un tubo Falcon de 50 mL, centrifugar por 15 min a 3 300 xg (4 000 rpm en una Heraeus) a 4 C y resuspender el pellet celular en MgSO 4 10 mM hasta una DO600nm=2 aproximadamente. La suspensin bacteriana puede mantenerse a 4 C durante uno o dos das sin variaciones en la eficiencia de la infeccin.

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CAPTULO 15

PROCEDIMIENTO 2. P REPARACIN DEL VECTOR

1. Preparar 40 alcuotas de 600 L de clulas BB4 e infectar cada una con alrededor de 104 partculas del fago pRH825. Incubar a TA por 15 min. Aadir a cada alcuota 10-12 mL de top agar NZY (para 1 L: 5 g NaCl, 5 g extracto de levadura, 10 g casaaminocidos, 15 g agar bacterilgico, 7 g de agarosa y 2 g de MgSO 4 7H 2 O). 2. Mezclar y vertir el contenido sobre placas Petri (150 mm) que contengan agar NZY. Incubar durante toda la noche para permitir la formacin de las placas de lisis que deben confluir. 3. La elucin de los fagos se debe realizar aadiendo a cada placa 8-10 mL de tampn SM (para 1 L: 5,8 g de NaCl, 2 g de MgSO 4 7H 2 O, 50 mL de Tris HCl 1 M pH 7,5 y 5 mL de una solucin de gelatina 2 %). Colocar las placas a 4 C con agitacin durante 8 h aproximadamente. 4. Recuperar los fagos recolectando la solucin que se encuentra en las placas, transferirlos a tubos de centrifuga y aadir 20 L de cloroformo a cada suspensin fgica. 5. Centrifugar durante 20 min a 17 300 xg a 4 C (9 000 rpm en rotor GSA de centrifuga Sorval) para eliminar el debris celular. Precipitar las partculas de fago con polietilenglicol (PEG) 8 000 y NaCl a una concentracin final de 10 % y 1 M, respectivamente. 6. Disolver el precipitado e incubar en hielo por 1 h (o a 4 C durante toda la noche). Centrifugar por 20 min a 17 300 xg a 4 C. Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento en un volumen equivalente a 1/10 del volumen inicial. 7. Aadir igual volumen de cloroformo, mezclar el contenido del tubo por inversin suave y centrifuguar durante 5 min a 3 300 xg a 4 C. Recuperar la fase acuosa, que contiene las partculas de fago. 8. Adicionar 0,75 g de CsCl para cada mL de suspensin fgica. Mezclar suavemente para disolver el CsCl y distribuir la solucin en tubos de polipropileno de ultracentrifuga (Beckmann, 12,5 mL) Llenar los tubos completamente. Balancear el rotor con tampn SM/CsCl y centrifugar a 4 C por 48 h, a una velocidad de 137 519 xg (rotor SW40 en ultracentrifuga Beckmann). 9. Recuperar con una jeringuilla la banda opaca que se encuentra en el centro del tubo de centrifuga. Eliminar el CsCl de la preparacin de fagos mediante dilisis a TA por 1 h con el siguiente tampn: NaCl 10 mM, Tris HCl 50 mM pH 8, MgCl2 10 mM. Emplear un volumen de dilisis de alrededor de mil veces el volumen de la suspensin fgica. Transferir el tubo de dilisis a un recipiente que contenga el mismo tampn fresco durante 1 h.

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10. Medir el volumen de la suspensin fgica. Adicionar EDTA pH 8 a una concentracin final de 20 mM, proteinasa K 50 g/mL y SDS a una concentracin final de 0,5 %. Mezclar por inversin e incube a 56 C por 1 h. Dejar la digestin a TA por 1 h. 11. Realizar una extraccin con fenol, otra con fenol/cloroformo y otra con cloroformo. En cada caso recuperar la fase acuosa. 12. Precipitar el ADN del bacterifago con acetato de sodio pH 7 a una concentracin final de 0,3 M y 2 volmenes de etanol. Invertir el tubo y dejarlo a TA. Generalmente el ADN del bacteriofago lambda se puede recuperar directamente de la solucin enrollndolo en la punta de una pipeta pasteur. Una vez que el ADN queda atrapado en la punta de la pipeta se sumerge por unos segundos en un tubo Eppendorf con 1 mL de etanol 70 %. Despus secar el ADN a TA hasta que quede transparente. Resuspender el ADN en un volumen apropiado de tampn TE (pH 7,6). En caso de que la cantidad de ADN no fuera suficiente para recuperarlo con una pipeta Pasteur, centrifugue a 12 000 rpm por 10 min en una centrifuga de tubos Eppendorf. 13. Verificar la integridad de la preparacin de ADN en un gel de agarosa 0,5 %. Se debe calentar el tubo con el material a 68 C por 10 min antes de aplicar en el gel para abrir los extremos cohesivos del ADN. 14. Digerir 50 g de ADN del vector pRH825 con 400 U de SpeI y 400 U de NotI (Boehringer Mannheim, Alemania) en tampn H 1X con 20 L de BSA 1 mg/mL, en un volumen final de 200 L. Incubar la mezcla de reaccin a 37 C durante 16 h. 15. Verificar que la digestin sea completa mediante el anlisis de una alcuota de la reaccin (0,2 g) en un gel de agarosa 0,5 % en paralelo con una alcuota de ADN no digerido. Recordar que los tubos deben inocularse previamente a 68 C. 16. Purificar el ADN digerido mediante una extraccin doble con fenol/cloroformo y otra extraccin adicional con cloroformo. 17. Precipitar el ADN con 0,2 volmenes de NaAc 3 M pH 6 y 0,6 volmenes de isopropanol. Mezclar con inversin e incubear por 5 min a TA. Recuperar el ADN con la ayuda de una pipeta pasteur previamente alargada en la punta. Secar a TA. En caso de que la pastilla de ADN no fuera visible, entonces centrifugar 5 min a 12 000 rpm en una centrifuga de tubos Eppendorf. 18. Resuspender el ADN en un volumen apropiado de tampn TE pH 7,6.

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CAPTULO 15

CMO OBTENER UNA VASTA COLECCIN DE INSERTOS

El mtodo ms comnmente utilizado para fragmentar el ADN de alto peso molecular cuando se est generando una bibliotecas de fagos es la digestin con enzimas de restriccin, la utilizacin de ADNasa o la fragmentacin mecnica [9-11]. Estas metodologas requieren gran cantidad de material de partida, son muy trabajosas y pudieran llevar a una representacin no casual de regiones particulares del ADN, en dependencia de la metodologa empleada. Ms recientemente se han utilizado con xito oligonucletidos pequeos que contienen secuencias casuales en la tcnica de extensin con cebadores aleatorios (RPE, del ingls random primer elongation), tanto de ADN como de ARN, con el fin de obtener copias complementarias del ADN molde [12, 13]. En el procedimiento que hemos utilizado se emplean cebadores aleatorios del interior del genoma, a travs de oligonucletidos que contienen secuencias fijas que permiten la insercin directa en el genoma viral sin manipulaciones posteriores [8]. Este procedimiento se lleva a cabo en tres etapas: 1. Elongacin con nanmeros aleatorios de secuencia constante en el extremo 5 (sitio de reconocimiento de la enzima de restriccin SpeI). 2. Elongacin con nanmeros de secuencia aleatoria en el extremo 3 (sitio de reconocimiento de la enzima de restriccin NotI). 3. Amplificacin mediante PCR de la molcula que contiene las dos secuencias constantes. Se ha visto que este procedimiento es muy eficaz para generar fragmentos aleatorios por la gran variedad de clones identificados en un solo ciclo de seleccin a partir de una biblioteca del virus de la hepatitis C (HCV) con el empleo de tres anticuerpos monoclonales humanos contra este virus [8].

PROCEDIMIENTO 3. P REPARACIN DE LOS INSERTOS DE ADNC

1. Sntesis de la primera hebra (realizar esta reaccin 5 veces): aadir 30 pmol del cebador Fse (5-GGCCGGCCAAC(N)9 -3) a una solucin que contiene 180 ng de ADNc en tampn universal 1X (TU) (TU 10X: Tris 100 mM pH 7,5, MgCl2 50 mM, DTT 75 mM), en un volumen final de 30 L. 2. Hervir la mezcla durante 5 min y enfriar en hielo por otros 5 min. Aadir 30 L de una solucin que contenga 30 U del fragmento Klenow de la ADN polimerasa I (5U/L), 90 g de BSA y 12 L de dNTP (25 mM de cada uno en la solucin madre), en tampn TU 1X. Incubar a 37 C por 6 h.

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3. Purificar la primera hebra de ADNc en una columna Quiaquick (Quiagen, ) segn las instrucciones de la casa productora. Llevar el volumen a 60 L con agua destilada. En caso de que el ADN de partida fuera el genoma bacteriano completo se debe utilizar una columna G-50 para la purificacin (5 prime-3 prime, Inc.). 4. Sntesis de la segunda hebra: mezclar 20 L del producto purificado de la primera hebra con 10 pmol del cebador NotI (5-GCGGCCGCAAC(N)9 3), en un volumen de 40 L en TU 1X. 5. Repetir el paso anterior hasta agotar el producto de la sntesis de la primera hebra. Despus de hervir la solucin por 5 min y haberla enfriado en hielo por otros 5 min, aadir 20 L de la mezcla que contiene el fragmento Klenow e incubar la reaccin a 37 C por 6 h. Purificar el producto de sntesis de la segunda hebra en una columna Wizard (Promega, EUA) para eliminar los fragmentos pequeos de ADNc. 6. Amplificar el producto de sntesis de la segunda hebra mediante PCR utilizando, por cada 10 L del producto, 100 pmol de cada cebador (cebadores SpeI/Fse I [5-GCACTAGTGGCCGGCCAAC-3] y NotI [5GGAGGCTCGAGCGGCCGCAAC-3]) y Supertaq polimerasa (HT Biotechnology Ltd.) en un volumen final de 100 L, siguiendo el siguiente esquema: un primer ciclo de 5 min a 94 C y 30 s a TA; 30 ciclos de 30 s a 94 C, 30 s a 52 C y 1 min a 72 C; y un paso final de extensin a 72 C por 5 min. 7. Purificar el producto de PCR mediante una columna Wizard (Promega, EUA) siguiendo las instrucciones de la casa productora. Verificar la integridad del ADN en un gel de agarosa 1,5 % con un marcador de peso molecular y semicuantificar el producto de amplificacin, que debe estar entre 150 y 600 pb.

PROCEDIMIENTO 4. C ONSTRUCCIN DE LA BIBLIOTECA

1. Digerir los insertos de ADNc con las enzimas de restriccin SpeI y NotI en tampn H (Boehringer Manheim, Alemania). Utilizar alrededor de 100 U de las enzimas por g de producto de amplificacin. Incubar la digestin a 37 C durante 16 h. 2. Purificar el producto de la digestin en una columna Wizard (Promega, EUA). 3. Realizar las reacciones de ligacin a escala piloto utilizando 500 ng del vector digerido y una relacin molar vector: inserto correspondiente a 1:0; 1:0,5; 1:1; 1:2 y 1:4.

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CAPTULO 15

4. Efectuar esta reaccin en un volumen final de 15 L en presencia de 1 000 000 U de T4 ADN ligasa (New England BioLabs, Reino Unido). Incubar a 16 C por 16 h. 5. Realizar la encapsidacin in vitro de 7,5 L del ADN ligado utilizando las mezclas de empaquetamiento del fago lambda segn las instrucciones del juego de reactivos de Amersham Pharmacia biotech., Suecia. 6. Vertir a travs de unidades formadoras de placas (UFP) en placas Petri sobre un csped de clulas BB4 preparadas segn las instrucciones del mismo juego de reactivos empleado en el paso anterior. 7. La seleccin de la mejor relacin molar entre el vector y el inserto se basa en dos aspectos: el nmero total de placas obtenidas de las diferentes reacciones de ligacin y la secuenciacin de algunos clones seleccionados al azar para verificar que no se clonaron mltiples insertos. En el caso de ligacin en ausencia de insertos, el nmero de placas debera ser al menos 100 veces inferior al nmero de placas obtenidas en las mejores condiciones de reaccin. 8. Rapetir n veces la reaccin de ligacin seleccionada para obtener una biblioteca de ADN de alrededor de 107 clones independientes. Encapside in vitro todo el ADN ligado utilizando el juego de reactivos de empaquetamiento del fago lambda (Amersham Pharmacia biotech, Suecia). En caso de que el nmero de reacciones de ligacin fuera muy elevado, extraiga el ADN con fenol/cloroformo y concntrelo mediante precipitacin con etanol absoluto antes de utilizarlo en la reaccin de empaquetamiento. 9. Infectar alcuotas de 600 L de clulas BB4 con 105 UFP aproximadamente e incubar a TA por 15 min. Vertir sobre placas de Petri (150 mm) con agar NZY. 10. Incubar las placas Petri a 37 C hasta obtener placas de lisis visibles, pero sin llegar a confluencia (8-10 h) y recuperar las partculas de fago por elucin con tampn SM, como se describi anteriormente. Eliminar el debris celular por centrifugacin y concentrar los fagos mediante precipitaciones con PEG/NaCl. 11. Despus de resuspender la pastilla de fagos en tampn SM, centrifugar nuevamente antes de determinar el ttulo de las bibliotecas en UFP. Aadir dimetilsulfxido (DMSO) hasta una concentracin final de 7 % y congelar la biblioteca a -80 C en alcuotas. La produccin de fagos quimricos es una condicin esencial durante la construccin de bibliotecas para no invalidar la incorporacin de dominios proteicos de gran tamao o con secuencias aminoacdicas particulares. Por lo tanto, en este estado se aconseja utilizar nicamente cepas bacterianas supresoras de la mutacin mbar (como BB4) y no utilizar IPTG, el cual es necesario slo cuando se desee sobreexpresar el producto de fusin.

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Los protocolos que se describen a continuacin corresponden a procedimientos de seleccin realizados con anticuerpos monoclonales humanos, pero con las modificaciones necesarias se pueden aplicar a cualquier ligando de inters.

PROCEDIMIENTO 5. SELECCIN POR AFINIDAD

1. Adicionar en pocillos individuales de una placa de ELISA (Nunc) 200 L de una solucin de anticuerpos especficos para la regin Fc de IgG humana (PIERCE) a una concentracin final de 10 g/mL, en tampn NaHCO3 50 mM pH 9,6. Incubar 4 C durante 16 h. 2. Lavar varias veces con PBS 1X/Tween 20 0,1 % (PBS/Tween). Aadir a cada pocillo 300 L de solucin de bloqueo (SB: leche descremada 5 %, Tween 20 0,1 %, BSA 0,25 % [p/v] en PBS 1X). Incube a 37 C durante 1 h. 3. Eliminar la solucin de la placa y aadir 200 L de SB con los anticuerpos monoclonales humanos (10 g/mL). Incubar a 4 C por 16 h o a TA por 6 h. 4. Lavar varias veces con solucin de dilucin del (Tris 10 mM pH 7,5; MgCl2 5 mM; NaCl 0,2M; gelatina 0,1 %). Aadir a cada pozo 1010 UFP de la biblioteca que se utilizar para la seleccin. Incube a 4 C por 16 h. 5. Para eliminar los fagos no especficos, lavar 4 veces con SB y otras 4 veces con la solucin de dilucin de . En cada paso de lavado dejar la solucin de lavado por 5 min. Para recuperar los fagos especficos, adicione a cada pocillo 200 L de clulas bacterianas preparadas como se describi anteriormente e incubar a 37 C por 20 min. 6. Recuperar las clulas infectadas y vertirlas por UFP sobre un csped de clulas BB4. Utilizar 3 placas de Petri (150 mm) con agar NZY. Incubar a 37 C durante toda la noche y recuperar los las partculas de fago segn se explic previamente. Estos fagos sern utilizados en ciclos sucesivos de seleccin o analizados inmunolgicamente. Recientemente se observ que el vector pRH825 tiene cierta inestabilidad, lo que se manifiesta a travs de la prdida del inserto cuando se hace una serie numerosa de amplificaciones. Por lo tanto, es recomendable realizar dos ciclos sucesivos de seleccin con este vector en particular.

PROCEDIMIENTO 6. I NMUNOSELECCIN
1. Infectar 600 L de clulas BB4 con una dilucin adecuada de fagos, de manera que se viertan alrededor de 103 UFP sobre un csped de clulas BB4 en placas Petri de 150 mm. Incubar a 37 C durante toda la noche.

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CAPTULO 15

2. Colocar cuidadosamente un filtro de nitrocelulosa (Schleier & Schuell BA85, Alemania) en la superficie de la placa e incubar a TA por 2 h. Marcar los filtros hacindoles orificios con una aguja. 3. Retirar el filtro de la placa e incubrlo en solucin de bloqueo para realizar un tamizaje inmunolgico (leche descremada 5 %, NP40 0,1 %, NaN3 0,05 % en PBS 1X), durante 1 h a TA. Diluir el anticuerpo hasta una concentracin adecuada en solucin de bloqueo e incubar durante 16 h a 4 C. 4. Lavar los filtros exhaustivamente con PBS 1X que contenga NP40 0,1 % (PBS/NP40) e incubar por 4 h a 4 C con un anticuerpo secundario anti-Ig humana conjugado con fosfatasa alcalina. Diluir el anticuerpo 1/5 000 en solucin de bloqueo. 5. Lavar los filtros sucesivamente con PBS/NP40 y desarrollar la reaccin enzimtica con tampn de revelado: Tris HCl 100 mM pH 9,6; NaCl 100 mM, MgCl2 5 mM, nitro blue tetrazolio (NBT) 330 g/mL y 5-bromo-4cloro-3-indolilfosfato (BCIP) 165 g/mL. En caso de que las placas de lisis no fueran confluentes, abrir el filtro con una aguja en los puntos correspondiente a las seales positivas para recuperar los clones de inters. Incubar por 10-20 s en Ponceau y luego lavar inmediatamente con agua destilada para poder ver todas las placas presentes en el filtro. Recuperar los clones positivos tomando como gua los filtros correspondientes.

PROCEDIMIENTO 7. ELISA
Este protocolo permite realizar el ensayo a partir de lisados fgicos no purificados y con el empleo de anticuerpos especficos contra el fago . Otra alternativa sera purificar las partculas virales mediante un gradiente de CsCl y unirlas directamente a la placa de ELISA. 1. Adicionar a cada pocillo de la placa de ELISA (Nunc) 100 L de una solucin de IgG especficas contra las protenas del fago obtenidas de suero de un conejo inmunizado con el virus y purificadas mediante afinidad por protena G a una concentracin de 1 g/mL en tampn NaHCO3 50 mM pH 9,6. Incubar a 4 C por 16 h. 2. Lavar varias veces con PBS 1X que contenga Tween 20 0,05 % (PBS/Tween). 3. Adicionar a cada pocillo 300 L de solucin de bloqueo (leche descremada 5 %, Tween 20 0,15 %, BSA 0,25 %, NaN3 0,1 % en PBS 1X). Incubar a 37 C por 1 h. 4. Eliminar la solucin de bloqueo y aadir a cada pocillo 100 L del lisado de fagos con 109 UFP. Incubar a 37 C por 2 h.

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5. Diluir el anticuerpo en solucin de bloqueo y adicionar, adems, un lisado de clulas BB4* a 200 L/mL, 100 L/mL de suero preinmune de conejo y 2,5 x 1010 /mL de partculas de fago salvaje. Incubar la mezcla por 4 h a TA (el lisado bacteriano y el fago salvaje pueden ser utilizados tambin en los ensayos de inmunoseleccin si el fondo fuera muy elevado). 6. Eliminar la solucin que contiene el fago, lavar exhaustivamente con PBS/ Tween y adicionar el suero. Incube a 4 C por 16 h. 7. Lavar exhaustivamente con PBS/Tween y aadir el anticuerpo monoclonal especfico para la cadena G de las inmunoglobulinas humanas (Sigma A2064, EUA) conjugado con fosfatasa alcalina. El conjugado se debe diluir 1/ 5 000 en solucin de bloqueo. Incubar a 4 C por 4 h. 8. Lavar exhaustivamente con PBS/Tween y desarrollar la reaccin de revelado mediante la adicin de 100 L de tampn sustrato a cada pocillo (p-nitrofenilfosfato 1 mg/mL en dietanolamina 19 % pH 9,8). Determinar los valores de DO405 y DO620 en un lector de placas de ELISA.

PROCEDIMIENTO 8. S ECUENCIACIN DEL ADN

Las secuencias se pueden determinar a partir de los productos de la amplificacin por PCR de placas de lisis individuales: 1. Tomar una placa de lisis individual con una pipeta Pasteur y diluir en 50 L de tampn SM. Aadir 2 L de cloroformo, agitar y centrifugar por 20 s. Utilizar 1 L de la fase acuosa en la reaccin de PCR. 2. Utilizar 20 pmol del oligo 5-CACGTTCCGTTATGAGGATGT-3 (se encuentra 94 nucletidos despus del sitio SpeI), 20 pmol del oligo 5-TCAGCAGCTACAGTCAGAATT-3 (se encuentra 180 nucletidos antes del sitio NotI), 1 L del producto de PCR en tampn SM, 0,2 mM de cada dNTP en el volumen final de la reaccin, Tampn 1X de SuperTaq polimerasa y 1 U de SuperTaq polimerasa (HT Biotechnology, Ltd.). Utilizar el siguiente programa: 30 ciclos de 1 min a 94 C, 1 min a 60 C y 1 min a 72 C, y; un ltimo paso de extensin a 72 C por 10 min.

*El lisado de clulas BB4 se prepara a partir de un cultivo de clulas incubadas toda la noche en medio LB con D-maltosa 0,2 %. Centrifugar las clulas y resuspenderlas en un volumen de PBS correspondiente a 1/100 del volumen inicial. Lisar las clulas en una prensa francesa o por sonicacin.

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CAPTULO 15

Figura 15.1. Representacin esquemtica del vector pRH825. Genoma de un fago lambda que presenta un codn de terminacin mbar en el gen de la protena D. El plsmido pRH825 esta flanqueado por el sitio Lox P que permite la escisin del genoma del fago en las bacterias que produzcan la recombinasa Cre. En el plsmido hay una copia adicional del gen que codifica la protena D bajo el control del promotor ptrc. El gen est modificado en el extremo 3 para permitir la clonacin de los insertos (los sitios de restriccin SpeI y NotI se encuentran subrayados).

REFERENCIAS
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BIBLIOTECA DE ADNC EN EL BACTERIOFAGO LAMBDA

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