Pgina |1

Pgina |2

INGRIDI DIAS CESARIO ISABELA BORTOLLETO JUCILEIDE SOUSA TABITA MAIRA MURARO LUIZA BRISA RODRIGUES LUCIA LITWIN TEIXEIRA EDUARDO PEREZ MANZO JUNIOR

DESENVOLVIMENTO E APLICAO DE CULTURA DE BACTERIAS

Trabalho apresentado para obteno de nota no mdulo de Estudo do MIP, do curso de Medicina Veterinria, turno matutino, da Universidade Metodista de So Paulo. Orientao: Prof Ms. Leandro Ribeiro

SO BERNARDO DO CAMPO 2012

Pgina |3

RESUMO

Durante o procedimento foi utilizado suabis para coletar diversas amostras de possveis locais contaminados. O material coletado foi aplicado em placas de bactrias em Agar e com o mesmo material foram feitos algumas laminas. As placas de cultura foram levadas para estufa por 24 horas para desenvolvimento das culturas. Com o material coletado foi feito novas laminas, e juntas, antes da cultura e ps cultura foi feita a colorao (utilizamos o mtodo de colorao de Gran aps o material ser fixo na lamina por fogo). Com as laminas prontas avaliamos em microscopio, utilizando aumento de 1000x que leo de imerso.

Palavra chave: Bactria; Cultura.

Pgina |4

SUMRIO

1 INTRODUO......................................................................................................................6

1.1 CLULAS.................................................................................................................6
1.2 PERMANGANATOS DE POTSSIO................................................................................8 1.3 SULFATO DE COBRE PENTA-HIDRATADO.................................................................8 1.4 DILUIO...........................................................................................................................9 2 OBJETIVO.............................................................................................................................9 2.1 OBJETIVOS SOLUO.....................................................................................................9 2.2 OBJETIVO DILUIO.......................................................................................................9

3 MTODOS E MATERIAIS......................................................................................10 3.1 MTODOS.....................................................................................................................10

3.1.1 Preparo da soluo 1........................................................................................................10 3.1.2 Preparo da soluo 2........................................................................................................11 3.1.3 Preparo de diluio da soluo 1......................................................................................12 3.1.4 Preparo de diluio da soluo 2......................................................................................13 3.2 MATRIAS PARA PREPARO DAS SOLUES...........................................................13 3.3 MATRIAS PARA PREPARO DAS DILUIES.........................................................14 3.4 CALCULOS PARA O PREPARO DAS SOLUES 1 E 2.............................................16 3.5 CALCULOS PARA O PREPARO DAS DILUIES A E B...........................................17 4 RESULTADOS.....................................................................................................................18 5 DISCUSSSO......................................................................................................................19 5.1 DISCUSSAO SOLUES.................................................................................................19 5.2 DISCUSSAO DILUIO..................................................................................................19 6 CONCLUSO......................................................................................................................20 REFERNCIAS......................................................................................................................21

Pgina |5

1 INTRODUO

O estudo dos microrganismos est muitas vezes dependente da possibilidade de cultivar e manter microrganismos viveis no laboratrio. As necessidades nutricionais especficas dos microrganismos variam de espcie para espcie, sendo possvel distinguir vrios grupos nutricionais de microrganismos. Com o conhecimento dos nutrientes necessrios ao crescimento dos microrganismos, possvel a formulao de meios de cultura que promovam o crescimento de um determinado microrganismo no laboratrio. O isolamento de um determinado microrganismo em cultura pura a partir de uma populao mista (por exemplo, presente numa amostra de solo, na gua de um rio, num esgoto, num alimento ou tecido contaminado, etc.) envolve, em geral, o uso de meios de cultura slidos e o recurso a tcnicas de isolamento de colnias, como seja pelo mtodo de espalhamento em placa, ilustrado na animao ao lado. Este mtodo permite obter colnias individualizadas e espacialmente separadas que, teoricamente, so originadas a partir de uma nica clula, correspondendo, por isso, a uma cultura pura de um microrganismo particular. Sabe-se, contudo, que cerca de 90% a 99% do nmero total de microrganismos que existem no Ambiente (por exemplo, no solo, gua ou ar) no so cultivveis em meios de cultura e outras condies laboratoriais conhecidos. Este fato tem limitado a possibilidade de serem isolados, a partir do Ambiente, microrganismos com potencial interesse para aplicaes biotecnolgicas. Contudo, presentemente, em consequncia do grande desenvolvimento das tcnicas da Biologia Molecular nas ltimas dcadas, o microbiologista pode identificar e estudar os microrganismos com base na anlise direta das suas macromolculas (em particular do seu DNA), sem que seja necessrio isol-los em meios de cultura laboratoriais. Entre as tcnicas da Biologia Molecular que permitem este progresso salienta-se a Reao em Cadeia da Polimerize. (PELCZAR, 2005).

Pgina |6

1.1 MEIO DE CULTURA

Os meios

de

culturas so

preparaes

qumicas

que

possuem

em

sua

formulao, nutrientes necessrios para que os microrganismos possam multiplicar-se permitindo seu estudo. Entre os principais componentes de um meio de cultura esto as fontes de carbono e energia como os acares, as fontes de nitrognio, fsforo e sais minerais. Outros componentes mais especficos podem ser encontrados em um meio especifico para um determinado organismo (meio seletivo), estes so os Fatores de Crescimento como

as vitaminas, aminocidos, e outros mais. Por outro lado podemos ter num meio agentes/constituintes que inibam o crescimento de determinados microrganismos, sendo estes tambm considerados meios seletivos. Alm de meios seletivo existem tambm meios que permitem diferenciar microrganismos (meios diferenciadores ou diferenciais), o exemplo mais simples a existncia de um indicador de pH que permite verificar se, por exemplo, um acar presente no meio '''metabolismo''' pois, ao ser, implica a produo de metablitos que acidificam o meio alterando o seu pH e consequentemente a alteram a cor do indicador de pH.
Quanto consistncia existem trs: slido, semi-slido, liquido. Quanto funo existem quatro: enriquecedor, seletivos, diferenciadores, manuteno. Quanto natureza existem duas: animados, inanimados. Meio de cultura utilizado: Agar sangue: meio no seletivo, crescimento

de bactrias gram e +, e Agar MacConkey: Seletivo gram -, inibe crescimento bactrias gram+.

Pgina |7

1.2

COLORAAO DE GRAM

A tcnica de colorao de Gram consiste em expor as clulas bacterianas seguinte sequncia: Corante primrio violeta de cristal: cora o citoplasma de prpura, independentemente do tipo de clula. Mordente soluo de iodo: aumenta a afinidade entre o violeta de cristal e a clula e forma com o corante um complexo insolvel dentro da clula. Agente descolorante lcool, acetona ou ambos: solvente lipdico. Contrastante safranina ou fucsina bsica: cora o citoplasma de vermelho. O que se verifica, quando se observam as diferentes bactrias sujeitas a esta colorao ao microscpio, que estas tm um comportamento diferente face colorao de Gram, o que permite classific-las em: Bactrias Gram-positivas (apresentam cor prpura) Bactrias Gramnegativas (apresentam cor vermelha). Estudos de microscopia eletrnica e anlises bioqumicas permitiram concluir que a parede celular bacteriana a estrutura responsvel pelo diferente comportamento das bactrias colorao de Gram. As bactrias Gram-positivo apresentam uma parede espessa, homognea, geralmente no estratificada e predominantemente constituda por peptidoglicano. Deste modo, o precipitado insolvel que se forma por aco do mordente, fica retido no interior da clula pela camada espessa de peptidoglicano, logo, estas clulas no so descoradas permanecendo com a colorao conferida pelo corante primrio (prpura). As bactrias Gram-negativo apresentam uma parede estratificada constituda por uma membrana externa e por uma camada mais interna que contm peptidoglicano e que mais fina que a das Gram-positivo. Deste modo, o precipitado insolvel, que se forma por aco do mordente, removido (camada de peptidoglicano mais fina que a das Gram-positivo e a membrana externa parcial ou totalmente solubilizada pelo agente descolorante), pelo que as clulas ficam descoloradas, corando de vermelho pelo contrastante. O peptidoglicano um heteropolmero rgido e insolvel na gua, constitudo por cadeias lineares de dois acares aminados NAG (cido n-acetilglucosamina) e NAM (cido n-acetilmurmico) ligados entre si por ligaes glicosdicas. As cadeias lineares ligam-se entre si atravs de cadeias de quatro aminocidos.

Pgina |8

2 OBJETIVO

Desenvolver culturas de bactrias em placa de petri para observao e classificao em microscpio.

3 MATERIAIS

Placas de Petri; Suabes; Estufa 37C; BHI; Bico de bunsen/Gs; Lmina; Meio de cultivo; Microscpio; leo de imerso; Cristal de Violeta; Luzol; lcool/acetona; Fucsina.

Pgina |9

4 MTODOS

4.1 MTODOS DE MEIOS DE CULTURA

Com alguns suabes foram coletados amostras de bactrias; Utilizando a tcnica do esfregasso foi semeado a amostra de bactrias nos gares Sange e MacConkey. Incubou-se os meios de cultivo slidos. Posteriormente observou-se as caractersticas das colnias que cresceram nos dois gares.

4.2 MTODOS DE COLORAAO DE GRAN

Cubra o esfregao com violeta-de-metila e deixe por aproximadamente 60 segundos; Escorra o corante e lave em um filete de gua corrente; Cubra a lmina com lugol diludo (1/20) e deixe agir por aproximadamente 60 segundos; Escorra o lugol e lave em um filete de gua corrente; Adicione lcool etlico (99,5 GL) sobre a lmina; deixe agir por aproximadamente 15 segundos; Lave em um filete de gua corrente; Cubra a lmina com fucsina e deixe agir por aproximadamente 30 segundos; Lave em um filete de gua corrente; Deixe secar ao ar livre; Coloque uma gota de leo de imerso sobre o esfregao; e Leia em objetiva de imerso (100 X).

P g i n a | 10

5 RESULTADOS
1 Agar: Conduto auditivo: Uma colnia de aspecto gelatinoso, transparente.

Obs.: mudou o tom da Agar sangue. Banheiro masculino: Varias Colnias no Agar sangue de aspetos

cremosos brancos e duas colnias amarelas. 2 Agar: Mesa de Raios-X: Uma colnia no Agar sangue de aspecto redondo

branco e cremoso, varias colnias agrupadas. 3 Agar: 4 Agar: agrupadas. 5 Agar: Corrimo do HOVET: Negativo Boto do elevador: Duas colnias Sendo 1 de cor branca redonda, Ferida da cabra: Duas colnias 1 com aspecto branco transparente Mesa de preparo cirrgico: Negativo

cremoso alta. 2 com aspecto circular achatada amarelado. Bebedouro do HOVET: Varias colnias de aspecto pequeno esferas

2 de cor vermelha redonda.

P g i n a | 11

7 CONCLUSO

Aps a realizao desta actividade pratica, conclumos que os objectos normais, de uso corrente possuem variados tipos de bactrias que em condies propcias se podem desenvolver e at provocar doenas. Recorre-se assim cultura, em meios apropriados, para se conseguir um elevado nmero de microorganismos, de modo que seja possvel estudar as suas caractersticas. Somente pela visualizao macroscpica no foi possvel a identificao

dosmicrorganismos encontrados, sendo necessrio fazer uma colorao especial para possvel identificao. Apesar dos ambientes parecerem incuos, observou-se uma grande quantidade de microrganismos

P g i n a | 12

BIBLIOGRAFIA
PELAZAR Jr. M; CHAN, E.Z.S; KREIG, N.R, Microbiologia, Conceitos e aplicaes. p. 167-169, So Paulo: Pearson Makron Books, 2005.

LEVINSON, W; JAWETZ, E; Microbiologia mdica e imunolgica. p. 103-115, Porto alegre: Artmed, 2006.

SENBERG, H.D; ROSENTHE,K.S; SMITH, J.W; SEZUK, J.B; SWURKOSZ, E.M; Microbiologia Mdica. p. 76,102,116, Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1992.