Reporte Tcnico

RT-ID-015/2004

Incidencia de la agitacin en el crecimiento microalgal en biorreactores

Jorge Eliach1, Gastn Bourges1, Medina3,4, Miguel Lara2,5
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Liliana

Dur2, Mabel

Alumnos adscriptos del Laboratorio de Energas Alternativas (Conicet - UNR). Facultad de Ciencias Exactas, Ingeniera y Agrimensura. Universidad Nacional de Rosario 2 Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional de Rosario. 3 Consejo de Investigaciones. Universidad Nacional de Rosario. 4 Departamento de Matemtica. Escuela de Formacin Bsica. Facultad de Ciencias Exactas, Ingeniera y Agrimensura. Universidad Nacional de Rosario 5 Conicet

Disciplinas: Ingeniera Mecnica, Microbiologa, Fsica Aplicada

1 de Septiembre 2004 Revisado

Secretara de Ciencia y Tcnica Facultad de Ciencias Exactas, Ingeniera y Agrimensura Universidad Nacional de Rosario Av. Pellegrini 250 - 2000 Rosario Argentina http://www.fceia.unr.edu.ar/secyt

Este documento es publicado por la FCEIA para su consulta externa. El mismo se publica como Reporte de Investigacin para divulgacin de las tareas cientficas que se desarrollan en la FCEIA, Universidad Nacional de Rosario. Los autores conservan los derechos de autora y copia de la totalidad de su trabajo aqu publicado. Luego de su posterior eventual publicacin externa a la FCEIA, los requerimientos debern dirigirse a los autores respectivos. El contenido de este reporte refleja la visin de los autores, quienes se responsabilizan por los datos presentados, los cuales no necesariamente reflejan la visin de la SeCyT-FCEIA. Tanto la SeCyT-FCEIA como los autores del presente reporte no se responsabilizan por el uso que pudiera hacerse de la informacin y/o metodologas publicadas. Cualquier sugerencia dirigirla a: rtsecyt@fceia.unr.edu.ar

En este lugar debera explicitarse si el presente trabajo est basado en un manuscrito que ha sido remitido a publicacin a los efectos de evitar su envo a revisin por parte de un par, ya sea local o externo a la Facultad, y acelerar de esta manera la difusin del reporte tcnico.

Incidencia de la agitacin en el crecimiento microalgal en biorreactores

Jorge Eliach1, Gastn Bourges1, Liliana Dur 2, Mabel Medina 3,4, Miguel Lara 2,5
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Alumnos adscriptos del Laboratorio de Energas Alternativas (Conicet - UNR). Facultad de Ciencias Exactas, Ingeniera y Agrimensura. Universidad Nacional de Rosario 2 Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional de Rosario. 3 Consejo de Investigaciones. Universidad Nacional de Rosario. 4 Departamento de Matemtica. Escuela de Formacin Bsica. FCEIA. UNR. 5 Conicet La spirulina (Arthrospira platensis) es una microalga que se utiliza como un suplemento dietario en alimentacin humana y animal. El objetivo de este trabajo es evaluar la incidencia de la agitacin del medio lquido de cultivo en el crecimiento microalgal, con respecto a un cultivo que no es agitado. Para ello se compara la productividad de un cultivo spirulina en dos sistemas de biorreactores, uno con agitacin, y otro sin agitacin, manteniendo constante otros parmetros significativos. Se concluye que la agitacin es un factor que incide en forma positiva sobre el crecimiento de nuestro cultivo de spirulina. Palabras claves: spirulina; biorreactores; cultivo de microalgas

Spirulina (Arthrospira platensis) is a microalgae used as nutritional supplement in human and animal feeding. Cultivation is carried out in a liquid medium. The objective of this report is to show how the culture agitation impacts in the microalgae growth. The spirulina productivity in two biorreactores systems, one with agitation and the other one without agitation, maintaining constant other significant parameters is compared. The conclusion is that agitation is a factor that impacts in positive form on the growth of our spirulina culture.

Keywords: spirulina; bioreactors; microalgae culture

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mmedina@fceia.unr.edu.ar malara @fceia.unr.edu.ar

1. Introduccin
Entre los procariotas auttrofos existen tres tipos de bacterias fotosintticas: las bacterias verdes, las bacterias fotosintticas purpreas y las Cianobacterias. Como sucede en las plantas, estas bacterias capturan la luz mediante pigmentos especficos. Las Cianobacterias se parecen a las plantas y a las algas en que contienen clorofila a, escinden el agua durante la fotosntesis y desprenden oxgeno. No fotosintetizan almidn sino un tipo de glucgeno llamado grnulo de poliglucano. Las clulas viejas forman grandes grnulos de cianoficina considerada qumicamente como una protena especial con slo dos aminocidos: arginina y cido asprtico. Cuatro gneros se destacan por su inters agronmico y en la alimentacin: Nostoc, Anabaena, Cylindrospermum y Arthrospira platensis (spirulina). Los tres primeros gneros citados son fijadores de nitrgeno atmosfrico que acumulan en las vacuolas de gas y en los heterocistos para cubrir sus necesidades nutricionales y fisiolgicas. Cuando las citadas microalgas se utilizan como biofertilizantes, aportan al suelo, adems de los nutrientes mencionados, sustancias que actan como factores de crecimiento en vegetales superiores, por lo que aumenta su valor como fertilizantes.

1.1 Microalga spirulina

La spirulina ha sido el alimento tradicional de los aztecas y de los Kanembous de Tchad. Es ms rica en protenas que la carne y actualmente es cultivada en grandes establecimientos en Estados Unidos, India, China y Tailandia. En la naturaleza, la spirulina crece en lagos y lagunas con medio alcalino en clima clido (Jourdan, 1999). Se presenta en forma de filamentos espiralados (Figura 1) constituidos por clulas yuxtapuestas, la reproduccin es asexuada y se realiza por divisin de filamentos (Vonshak, 1997). Esta microalga posee unas caractersticas muy especiales desde el punto de vista nutricional ya que se trata de una fuente natural de protenas, con una concentracin variable entre el 55 y Figura 1. Imagen microscpi- 70% de sustancias asimilables de alta calidad (Falquet, 1996). ca de la espirulina. La digestibilidad est entre el 88 y el 92%, este amplio margen obedece a la composicin celular de la misma, ya que su pared celular est formada por mucopolisacridos que permiten que el organismo pueda extraer los nutrientes presentes con mayor facilidad, sin gasto energtico. Entre las vitaminas que contiene se encuentran la A, B1, B2, B3, B6 y B12, cido flico, biotina, inositol, cido pantolnico, beta caroteno y vitamina E, junto con minerales que actan como potentes antioxidantes que permiten la neutralizacin de los radicales libres. Presentes estn tambin los siguientes minerales: Calcio, Fsforo, Hierro, Sodio, Potasio, Zinc, Cobre, Manganeso, Germanio, todos en concentraciones apreciables. Conviene sealar tambin que la biodisponibilidad del hierro es un 60% ms elevada que en las maneras habituales de suministro de este metal en las formas dietarias. Puede utilizarse como suplemento en la alimentacin de diversos animales: rumiantes, cerdos, aves, peces y crustceos, como una fuente proteica o como complemento de protenas en dietas balanceadas. Aumenta el valor comercial de ciertas especies, por ejemplo; mejora la coloracin de la piel y de la yema de huevos en aves y tambin aumenta la vitalidad, el peso y la coloracin en peces (Fox 1999).

Figura 2. Estanques en produccin de spirulina Por lo anteriormente dicho, el cultivo de estas cianobacterias es importante desde el punto de vista econmico y social. La produccin comercial se realiza en estanques de varias decenas de metros de largo por 4 o 5 metros de ancho, con una profundidad media de 15 cm, con una cubierta tipo invernadero (Figura 2). En los estanques se realiza un control constante de las variables: temperatura, agitacin, alcalinidad, salinidad y control microbiano de crecimiento que son -2 fundamentales para optimizar la produccin. Se considera como produccin media 10 gr m -1 da . Para cosecharlas, se separaran del medio de cultivo por filtracin, y luego son secadas como nica forma de garantizar la conservacin de sus propiedades en el tiempo (Chini Zittelli et al., 1996). Para dar idea de la importancia de este cultivo, la industria de la spirulina en China est desarrollndose rpidamente como un programa estratgico nacional. En 1997, haba 80 lugares de produccin, con un total de produccin anual de ms de 350 toneladas de polvo seco y un rea de produccin de 106 m2 (Ding-Mei Li, Yu-Zao Q, 1997). En Argentina, su cultivo comenz en la dcada del noventa. El grupo de investigacin del Laboratorio de Energas Alternativas (Facultad de Ciencias Exactas, Ingeniera y Agrimensura Conicet), a travs de un proyecto de I+D, se encuentra trabajando en colaboracin con una empresa productora de spirulina en la localidad de San Jorge, Provincia de Santa Fe. El conocimiento de las tcnicas de cultivo y produccin es una herramienta indispensable en la obtencin masiva de este alimento altamente proteico.

1.2 Condiciones de cultivo de la microalga spirulina

El cultivo de la microalga spirulina se realiza comercialmente en estanques que pueden ser a cielo abierto o con cubiertas tipo invernadero (Figura 2). El cultivo en estanques abiertos se caracteriza por la baja produccin por unidad de rea y la no uniformidad de la calidad del producto. Una mejora considerable es el aporte de cubiertas, ya que se cultiva en un ambiente controlado, protegido de la polucin y con posibilidades de acondicionamiento trmicos. El cultivo en biorreactores se reduce a casos muy puntuales y generalmente se realiza en laboratorios. Se entiendo por biorreactor el sistema cerrado que permite el crecimiento de organismos fotoauttrofos (microalgas). Como ejemplos de biorreactores en uso, podemos citar los tubulares, planos, serpentina, manifold, etc (Tredici, 2002). Son motivo de activa investigacin para lograr una produccin donde la calidad de la masa microalgal est asegurada. Uno de los mayores problemas que presenta la explotacin comercial de spirulina y otras microalgas es el bajo rendimiento por unidad de superficie cultivada (Richmond et al., 1990). Los cultivos de spirulina en estanques pequeos y muy controlados pueden llegar de 15 -2 a 19 g m da-1 y de estos valores menos de la mitad se obtiene en grandes explotaciones comerciales (Vonshak and Richmond, 1988). Pequeos bioreactores cerrados, operando por
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pocas semanas o meses, estrictamente controlados han alcanzado rendimientos de 25-28 g m-2 da -1 (Tredici and Chini Zittelli, 1997) Cuando se quiere cultivar industrialmente, es necesario controlar las siguientes variables (Zarrouk, 1966): Temperatura: El crecimiento de la spirulina se da entre 25-40 0 C, siendo el rango de mayor produccin entre 35-40 0 C. Alcalinidad del medio: Los mejores resultados se obtienen con valores de pH 10-11. Radiacin: La mayor produccin se da entre 30-50 klux. Salinidad: Entre 1500 - 5250 g m-2 , en un estanque de 15 cm de profundidad. Agitacin: Se recomienda una velocidad de 30 cm/s

1.3 Agitacin
En la superficie del medio de cultivo se forma una capa compacta y densa de spirulina debido al crecimiento competitivo de las mismas, que limita el paso de la luz al fondo del recipiente, actuando como aislante trmico y formando una estratificacin en el perfil de vertical de temperatura del medio de cultivo. Se ha podido medir (en los estanques de Figura 2) hasta 10 0 C de diferencia entre la superficie y el fondo del estanque. Esto limita el crecimiento del alga a la superficie del lquido, desaprovechndose la mayor parte del volumen del estanque. Como respuesta a este problema, se utiliza la agitacin del medio de cultivo para: Permitir que mayor nmero de individuos puedan exponerse a la luz solar o artificial. Permitir mayor intercambio gaseoso entre el medio ambiente y el medio de cultivo, favoreciendo la liberacin del oxgeno generado por la respiracin. Disminuir la estratificacin y formacin de cogulos o grumos, que impiden el paso de la radiacin hacia el interior del medio de cultivo. Disminuir la precipitacin de sales del medio de cultivo, manteniendo una mezcla de sales ms homognea. Estos efectos benefician el crecimiento y productividad del cultivo (Richmond et al. 1990). Sin embargo, el verdadero rol de la agitacin en el aumento de la produccin alga l todava debe ser evaluado. Se han observado efectos positivos provocados por una intensa agitacin sobre la productividad solamente en cultivos algales que se desarrollan en estanques agitados por ruedas de paletas. En biorreactores cerrados, con utilizacin de bombas, el efecto positivo puede ser enmascarado debido al dao mecnico que sufren las paredes de las clulas. En biorreactores de columnas de burbujeo, la provisin de aire sirve para el doble propsito de proveer turbulencia y remocin del oxgeno. As, es ms difcil evaluar si la influencia sobre la productividad se debe al grado de turbulencia alcanzado o proviene del bajo contenido de oxgeno disuelto en el medio.

2. Objetivos del trabajo

El objetivo de este trabajo es mostrar cmo incide la agitacin del medio de cultivo en el crecimiento microalgal al exponer las clulas a un rgimen de luz ms adecuado, con respecto a un cultivo que no es agitado. Para ello se compara la productividad de un cultivo spirulina en dos sistemas de biorreactores, con agitacin y sin agitacin, manteniendo constante otros parmetros (temperatura, radiacin y composicin del medio de cultivo).

3.Material y mtodo
Los materiales utilizados durante la experiencia son: Cmara de ambiente controlado Biorreactores (recipientes cilndricos de 2,25 litros de capacidad) Resistencia y ventilador centrfugo Termocupla Microscopio ptico Cmara de Neubauer Dispositivo mecnico de agitacin Dispositivo de radiacin La metodologa empleada consisti en medir el crecimiento (aumento de nmero de clulas) de una muestra usando un diseo experimental de bloques al azar con tres repeticiones y las evaluaciones se hicieron durante 30 das con lecturas a intervalos de 4 das, repitindose en dos perodos subsiguientes. La medicin del nmero de clulas se hizo por conteo directo al microscopio con cmara de Neubauer. El conteo se realiz teniendo en cuenta la longitud de los filamentos de las cianobacterias, considerando solamente aquellas que tenan entre dos y cuatro espiras. Este criterio se adopt porque no se vieron al microscopio clulas con ms de cuatro espiras, y aquellas que tenan menos de dos no se consideraron.

4. Desarrollo de la experiencia
Para lograr el objetivo, se procede a cultivar las microalgas en seis recipientes cerrados (fotobiorreactores) en condiciones idnticas de temperatura, medio de cultivo y radiacin. Para ello se dispone de una cmara de ambiente controlado (Figura 3). La temperatura se mantiene constante en la cmara a 30 0 C, el medio de cultivo es el de Zarrouk y la radiacin es suministrada por tubos que generan un radiacin uniforme de 30 Klux, durante un perodo de doce horas diarias. Tres de los recipientes se agitarn mecnicamente, los otros tres se mantendrn en reposo (Figura 4).

4.1 Cmara de cultivo de ambiente controlado

La cmara de cultivo (Figura 3) se disea de forma tal que minimiza las prdidas de calor para mantener la temperatura constante, a travs de una estructura en madera y un recubrimiento en poliestireno expandido. El volumen interior debe permitir el conjunto agitado de tres recipientes (botellas) y los otros recipientes en reposo a un lado del agitador (Figura 4).

PLANO X-Y

PLANO Z-Y

Poliestireno

Madera

Figura 3. Cmara de ambiente controlado. Consta de un armazn de madera y un revestimiento de poliestireno expandido para minimizar las prdidas de energa.

Botellas en reposo

Botellas agitadas

Forzador de aire

Fuente de calor

Figura 4. Distribucin en planta de las botellas en reposo y de las botellas agitadas en el dispositivo agitador. Abajo, a la izquierda se ubica un ventilador con resistencia que proporciona aire caliente.

4.2 Fotobiorreactores
Para el desarrollo de la experiencia se utilizaron botellas transparentes de 2,25 litros de capacidad, de plstico, que permiten el ingreso de radiacin por la parte superior y por los laterales. La relacin rea / volumen es de 0.5 m-1 .

Las botellas agitadas se colocaron sobre el dispositivo agitador. Algunos de los factores que se tuvieron en cuenta para el mejor funcionamiento consistieron en que el volumen del medio de cultivo fuera el mximo permitido sin que se derrame lquido durante la agitacin ( 1 dm3 ) y que la botella tuviera una perforacin que permita el intercambio gaseoso con la atmsfera (Figura 5).

Figura 5. Esque ma de la botella a agitar, con tapa y con un orificio para aireacin.

4.3 Dispositivo agitador

El dispositivo agitador que se disea consta de una base basculante sobre la que apoyan las botellas, movida por un motor elctrico. La agitacin se realiza durante 15 minutos por hora y en el perodo de luz (de 8:00 horas a 20:00 horas). 4.3.1 Funcionamiento del dispositivo mecnico (Figura 6) El arranque y la parada del motor elctrico est controlada por un timer, que cierra el circuito de alimentacin. Cuando este arranca, el eje de transmisin comienza a rotar hasta que hace contacto con la barra (7), esto produce el descenso de la base oscilante (5), y la compresin del resorte (2). Al continuar el movimiento, el eje de transmisin zafa de la barra (7), haciendo que se dispare el resorte (2), haciendo girar la base (5) en sentido contrario, lo que produce la agitacin de las botellas. La velocidad de giro del eje de transmisin es de 8 revoluciones por minuto, siendo el descenso del extremo de la barra de contacto (7) de 60 mm. (Figura 7)

Eje de transmisin

Figura 6. Dispositivo de agitacin 1) Motor elctrico con reductor de velocidad. 2) Resorte. 3) Base de madera. 4) Soporte de botella. 5) Base oscilante. 6) Eje base oscilante. 7) Barra que transforma el movimiento rotatorio del eje de transmisin, en un movimiento oscilatorio de la base oscilante.

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Figura 7. Detalle del apoyo sobre el resorte de la barra y del vstago solidario al eje de transmisin. 4.3.2 Generacin de calor Se coloc un ventilador centrfugo funcionando continuamente, para que homogeneizara la temperatura en la cmara, y una resistencia conectada al sistema de control, de esta forma se produca el control instantneo de la temperatura gracias a la radiacin generada por la resistencia y la homogenizacin de la misma por medio de la conveccin generada por el ventilador centrfugo. Cabe aclarar que el ventilador centrfugo tiene la toma de aire en forma axial (en la parte superior) y lo impulsa en forma tangencial a las aspas (plano horizontal), lo que permite una recirculacin y renovacin del aire dentro de la cmara de cultivo. La disposicin de la resistencia y del ventilador centrfugo, dentro de la cmara de cultivo se muestra en la Figura 8.

Resistencia

Sentido de circulacin del aire.

Ventilador centrfugo

Figura 8. Esquema del movimiento del aire en la cmara de ambiente controlado

4.3.3 Sistema de control de temperatura

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Consta de una termocupla (Figura 9) conectada a un sensor de temperatura por medio de un dispositivo de alimentacin de intensidad para la resistencia elctrica.
PLANO Y-Z PLANO X-Y

Fuente de radiacin.

Sentido de circulacin del aire.

Termocupla

Termocupla

Figura 9. Esquema del sistema de control de temperatura en la cmara de ambiente controlado Esta disposicin responde a la necesidad de que el punto de control est lo mas alejado de la fuente de radiacin, como as del efecto de la conveccin generada por el ventilador.

4.4 Dispositivo de iluminacin

En la experiencia, para simular el efecto de la luz solar, se dise un dispositivo formado por 8 tubos que generan un uniforme radiacin de 30 Klux, durante un perodo de doce horas diarias (8:00 - 20:00 horas). El dispositivo que se observa en la Figura 10, detalla la disposicin de los tubos. El encendido y apagado se controlaba por medio de un timer.

Tubos

Estructura de metal.

Figura 10. Disposicin de los tubos que se ubican en la parte superior de la cmara de ambiente controlado

4.5 Dificultades encontradas

Los mayores inconvenientes encontrados fueron con la generacin de calor.

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4.5.1 Falla del ventilador Durante la primera experiencia se utiliz un ventilador de corriente continua. En un momento dado fall la conexin elctrica del mismo, deteniendo su funcionamiento por algunas horas. Como la resistencia elctrica que generaba el calor segua funcionando, ya que no haba movimiento convectivo forzado del aire, el sensor no registraba el incremento de temperatura, debido a que la resistencia transmite por radiacin y el sensor esta muy alejado de la misma. Esto gener un elevado incremento de la temperatura en zonas cercanas a la resistencia, al estar el ventilador muy cerca de la misma, alcanz temperaturas muy elevadas, derritindose sus aspas plsticas. La temperatura alcanzada dentro de la cmara de cultivo super en algunas zonas de la misma los 70 0 C (sobre todo en las zonas aledaas a la resistencia elctrica). Como resultado, slo algunas de las algas de las botellas ms alejadas a la fuente de calor pudieron resistir. Para que eso no vuelva a ocurrir, se coloc un ventilador centrfugo, que funcionaba continuamente con un buen caudal de aire. 4.5.2 Falla del sensor Otro inconveniente surgi cuando fall el sensor de temperatura de la cmara. Esto produjo que la temperatura mxima aumente, haciendo que el calentador genere ms calor que el necesario. Como resultado, la temperatura de la cmara super en poco tiempo los 45 0 C. Esto no fue suficiente para destruir por completo todas las clulas.

5. Resultados
En la grfica de la Figura 11 se muestran los resultados promedio obtenidos de las tres series de mediciones de 30 das realizadas. En un prximo trabajo se mostrar el anlisis estadstico de estos datos. Se puede observar un aumento en el nmero de microalgas en las botellas que fueron agitadas con respecto al nmero de microalgas contado en las botellas que permanecieron en reposo. Otra observacin realizada fue que la coloracin de la masa algal era ms oscura y homognea en los biorreactores que se agitaban con respecto al color del medio de cultivo de los que estaban en reposo. Estos ltimos mostraban una concentracin de microalgas en la superficie, transformando el medio de cultivo en una masa heterognea.

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32 30 28 26 24 22

Cultivo sin agitacin Cultivo con agitacin

Clulas l x 10

20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

-1

Da

Figura 11. Grfica que compara el crecimiento de las clulas por litro en los biorreactores en reposo y agitados.

6. Conclusiones
La agitacin es un factor que afecta en forma directa al crecimiento de un cultivo de spirulina. Es posible que esto se deba a las siguientes razones: Permite que mayor nmero de individuos puedan exponerse a la luz Favorece el intercambio gaseoso entre el medio ambiente y el medio de cultivo, permitiendo que escape el oxigeno generado durante la fotosntesis, e introduciendo dixido de carbono de la atmsfera. Disminuye la estratificacin y formacin de cogulos o grumos, que impiden el paso de la radiacin hacia el interior del medio de cultivo. Impide la precipitacin de sales del medio de cultivo, manteniendo una mezcla de sales ms homognea. Por otro lado una agitacin muy violenta producira dao mecnico en la pared celular, por lo que cabra investigar cul sera la agitacin ptima.

Agradecimientos
Este trabajo se ha realizado en el marco del Proyecto ING84, Anlisis de procesos de transferencia de calor y materia en procesos agroindustriales. Aplicaciones a la produccin de microalgas. Los autores agradecen al Ing. Agr. Armando Cassinera su aporte en la ejecucin de los dispositivos.

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Referencias
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