BIOTECNOLOGIA MDICA 1 de junio de 2012

Diseo y estandarizacin de una prueba de PCR para el diagnstico de Chagas causada por Trypanosoma cruzi.
Universidad Catlica de Santa Mara Ingeniera Biotecnolgica- Biotecnologa Mdica Arqque Flores Fresia, Pilco Chambilla Edith I. Resumen La enfermedad de Chagas es causada por el parsito Trypanosoma cruzi. Esta enfermedad comprende una fase aguda, seguida de una fase crnica, con una parasitemia escasa y una clnica que va desde la ausencia de sntomas hasta una cardiopata severa. El diagnstico presenta limitaciones, debido a la baja sensibilidad de las tcnicas parasitolgicas y la baja especificidad de las inmunolgicas. Las tcnicas de PCR son una alternativa, pero estas deben ser estandarizadas y validadas antes de su uso. El objetivo de este trabajo es validar las tcnicas de PCR para la amplificacin de ADN de minicrculo de kinetoplasto (PCR-ADNk) y ADN satlite (PCR-ADNsat) de T. cruzi. Para la validacin de la prueba se utilizaran 30 muestras de sangre y 20 de suero de pacientes diagnosticados previamente, y 25 de sangre y 15 de suero, muestras de xenodiagnstico en pacientes en fase aguda, que resulten positivas Adems, se analizaran 2 muestras de sangre y suero de individuos, negativos para las tcnicas de diagnstico parasitolgico e inmunolgico y sin factores de riesgo de la enfermedad, los cuales deben ser negativo por ambas PCRs. Utilizados como control. Se harn las pruebas en suero y sangre para determinar la mejor eleccin de muestra para un diagnstico en laboratorio. Se har el uso de las dos tcnicas de PCR en conjunto, ya que en estudios anteriores1, todos los pacientes con enfermedad de Chagas confirmada resultaron positivos (100%) por lo menos en una de las PCR evaluadas en muestras de sangre1. Palabras claves: Trypanosomacruzi, Diagnstico Molecular, PCR, ADN satlite, kinetoplasto. II. Antecedentes: La infeccin humana por T. cruzi puede presentarse de diferentes formas segn las circunstancias y situaciones. La interaccin parsito-hospedero es bastante dinmica en el caso de la enfermedad de Chagas humana, y est relacionada a mltiples factores y condicionantes ligados al tripanosoma (cepa, virulencia, inoculacin), al hombre (edad, sexo, intercurrencias) y al medio ambiente. En la infeccin humana se reconocen tres fases: una fase corta, aguda; un perodo largo asintomtico, llamada fase indeterminada; y una fase larga crnica con manifestaciones clnicas. Referente al diagnstico de laboratorio, se basa en aquellos procedimientos que ponen en evidencia el parsito (Los tripomastigotes en sangre perifrica), o en aquellos que permiten detectar anticuerpos especficos. Si bien la demostracin de la presencia del parsito es el diagnstico de certeza, slo
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ZULANTAY, Ins Adriana. Enfermedad de Chagas crnica. Granada: editorial de la universidad de Granada., 2006. Presentado en el Instituto de Biotecnologa Grupo de bioqumica y parasitologa molecular, para la obtencin de grado de doctor.

BIOTECNOLOGIA MDICA 1 de junio de 2012 es posible practicarlo con mayor xito en la etapa aguda de la enfermedad, cuando la concentracin de anticuerpos es baja. Los mtodos de deteccin del parsito se discriminan en mtodos directos y mtodos indirectos.2 Las diferentes presentaciones evolutivas pueden ser: Pacientes portadores de una etapa aguda (adquirido vectorial, adquirido transfusional, congnito, inoculacin accidental, otras vas) Pacientes crnicos inaparentes asintomticos (infectados) Pacientes crnicos sintomticos (cardiopatas, megaformaciones viscerales) Pacientes crnicos en reactivacin de su infeccin (HIV-SIDA, transplantados, etc.)

En un centro de atencin mdica, en rea de baja prevalencia, la frecuencia de presentacin de estas formas evolutivas generalmente se ordenara como: Pacientes crnicos asintomticos inaparentes (infectados) Pacientes crnicos sintomticos (cardiopatas, megaformaciones digestivas, etc.) Pacientes agudos congnitos Pacientes crnicos en reactivacin de su infeccin Pacientes agudos adquiridos

Esta distribucin y frecuencia genera: o o o o Un desconocimiento por parte del personal de salud acerca de esta patologa y etiologa. Una falta de planificacin de la capacidad diagnstica de los laboratorios en el tema. Carencia de reconocimiento de la enfermedad en los diagnsticos probables y como problema de salud publica del rea Un desconocimiento comunitario originado en su naturaleza clnico evolutiva (infeccin crnica) y en las carencias de extensin del conocimiento de los tcnicos hacia la poblacin.

Luego de la etapa aguda sobreviene un largo perodo, habitualmente entre 10 y 30 aos, en el cual se encuentran la mayor parte de los pacientes infectados (aproximadamente el 70 %), es la denominada Etapa Crnica Indeterminada. (otras denominaciones: asintomtica, preclnica, subclnica), y que est definida por:
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Reacciones serolgicas positivas para la enfermedad Xenodiagnstico positivo, aproximadamente un tercio del os pacientes estn asintomticos Examen clnico normal Electrocardiograma normal

Storino R, Auger S, Wojdyla D, Urrutia MI, Jrg M. Anlisis descriptivo multivariado de la enfermedad deChagas en 2260 pacientes. RevArgenCardiol 1998; 66: 17-39.

BIOTECNOLOGIA MDICA 1 de junio de 2012 Radiografa de trax normal Estudios digestivos de esfago-gastro-duodeno y clon por enema normales.

En las ltimas dcadas esta etapa ha centrado el inters de los investigadores, puesto que la aparicin de metodologa diagnstica ms precisa ha puesto de manifiesto que estos pacientes tienen alteraciones funcionales y anatmicas ya en esta etapa. Forma de estudio de estos pacientes Etapa crnica indeterminada: por definicin los pacientes asintomticos, con serologa y/o xenodiagnstico positivos deben tener un electrocardiograma y una radiografa de trax normales y estudios digestivos baritados normales para encontrarse en esta etapa. De ser as no estara justificada la realizacin de otros estudios. Actualmente han sido propuesto una serie de estudios a aquellos pacientes que estn en esta etapa, como ser Holter, ergometra y ecocardiografa. Incluso se incluyen los mismos en la definicin de etapa indeterminada. Si tenemos en cuenta que la gran mayora de los pacientes chagsicos se encuentran en esta etapa, la realizacin de todos estos exmenes se tornaran prcticamente insolventables desde el punto econmico por ningn sistema de salud latinoamericano, adems de no contar con dicha tecnologa en las zonas rurales, donde predomina la enfermedad. Esto se agrava an ms si tenemos en cuenta que se sugiere adems su realizacin en forma anual como seguimiento de los pacientes. El electrocardiograma debe ser realizado anualmente, dado que se ha constatado que los mismos agregan hasta en un 6-7 % en estudios de seguimiento electrocardiogrfico a 10 aos. Aun as en dichos estudios la aparicin de estos trastornos no se acompa de un pronstico desfavorable, por la ausencia de compromiso de la funcin sistlica cardiaca. Por ello el electrocardiograma debe ser la herramienta de ayuda al mdico clnico de asistencia de primer nivel que habitualmente es el que debe resolver y tratar a estos pacientes, y de su perspicacia y sagacidad depender la derivacin hacia otros centros de mayor complejidad, para su correcto tratamiento (estudios de mayor complejidad, colocacin de marcapasos, etc.). Si el paciente con serologa positiva presenta alteraciones en el electrocardiograma (son altamente sugestivos la existencia de bloqueo de rama derecha, en ms del 50 % asociado o no a hemibloqueo anterior izquierdo, bloqueos de la conduccin aurculo-ventricular, bradicardia sinusal y extrasistola ventricular compleja ) y/o cardiomegala en la radiografa de trax, son evidencia del compromiso cardiaco y por lo tanto pasan a estar en la fase crnica de la enfermedad, pudiendo ser o no sintomticos. En estos casos se justifica la realizacin de metodologa ms exhaustiva, como ser: Ecocardiograma bidimensional para valorar la fraccin de eyeccin ventricular del ventrculo izquierdo, cambios morfolgicos y remodelacin de cavidades, y trastornos de la motilidad sectorial parietal, que la pueden hacer similar a la cardiopata isqumica, aneurisma de punta y masas intracavitarias.

BIOTECNOLOGIA MDICA 1 de junio de 2012 Estudio de Holter: para poner de manifiesto la aparicin de arritmias ventriculares (extrasistolia ventricular compleja y corridas de taquicardia ventricular, tan caractersticas de esta miocardiopata) y que a diferencia de las observadas en la cardiopata isqumica son ms estables y mantenidas. Tambin alteraciones como ser la prdida de la variabilidad RR de la frecuencia cardiaca que son sugestivas del compromiso autonmico parasimptico que es la afectacin autonmica ms relevante, y que es comprobable tambin por alteraciones en las respuestas a la respiracin profunda y al ortostatismo. Prueba ergomtrica graduada, para detectar capacidad funcional, aparicin de extrasistola durante el esfuerzo. Otros estudios podrn realizarse de acuerdo al paciente en particular, como en cualquier otra cardiopata. La aparicin de sintomatologa digestiva (disfagia, constipacin) en un paciente chagsico debe llevar a la realizacin de estudios radiolgicos contrastados. Los estudios funcionales, manometra esofgica, trnsito esofgico con radiocoloides, vaciamiento gstrico, para la puesta en evidencia del compromiso visceral digestivo se reservan para los estudios de investigacin y en algunos pacientes seleccionados, no debiendo ser realizados en forma sistemtica. Diagnstico clsico:

El parsito Trypansoma cruzi en un frotis delgado de sangre.

El diagnstico de la enfermedad de Chagas se puede hacer a travs de la observacin del parsito en un frotis de sangre bajo el microscopio. Para la visualizacin de los parsitos, se hace un frotis de sangre delgado y otro grueso y se les tie. Sin embargo, el frotis de sangre funciona bien solo en la fase aguda de la infeccin, cuando se ven los parsitos circulando en la sangre. El diagnstico de la enfermedad de Chagas crnica se hace despus de tener en cuenta el cuadro clnico del paciente y la probabilidad de que est infectado, por haber vivido en un pas donde la enfermedad es endmica. El diagnstico se hace generalmente mediante por los menos dos pruebas serolgicas diferentes.

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La PCR, con gran sensibilidad, se emple con xito en la deteccin e identificacin del T. cruzi, en heces de triatominos y en sangre total o suero de pacientes chagsicos.3 La elevada sensibilidad y especificidad de la PCR para el diagnstico de la infeccin por T. cruzi, que vara entre el 96 al 100%, la convierte en una excelente tcnica para el seguimiento quimioteraputico del tratamiento en pacientes con enfermedad aguda. De acuerdo a los resultados publicados anteriormente, se lleg a la conclusin que la sensibilidad de la PCR supera ampliamente a la de las tcnicas convencionales directas que poseen baja sensibilidad en pacientes o animales experimentales que padecen una infeccin crnica en la cual el nmero de parsitos circulantes es muy reducido para detectarlos por tcnicas parasitolgicas.3De ah la importancia radical que hoy reviste la utilizacin de la tcnica de PCR, constituyendo un diagnstico de certeza de la infeccin, al demostrar la presencia del parsito. III. Planteamiento del problema: Cmo lograr diseo y posterior validacin, de las tcnicas de PCR para el tratamiento etiolgico del paciente infectado por el T. cruzi en la fase aguda o crnica asintomtica de la enfermedad. IV. Justificacin: Todos los pases que estn afectados por la trypanosomiasis americana necesitan efectuar "screenings" poblacionales frecuentes con diversos objetivos; seleccionar donantes seronegativos, seleccionar embarazadas y nios menores de 15 para tratamiento mdico, pero las tcnicas convencionales no siempre ofrecen las facilidades tcnicas ni de infraestructura como para aplicarlas en el campo. Ello ha demostrado la necesidad de un cambio de estrategia en el diagnstico serolgico de la infeccin por T. cruzi, la cual puede ser abordada mediante la prueba de PCR asegurando el diagnstico y efectividad del mismo.4 El uso de PCR abre una nueva perspectiva en el campo del diagnstico de la infeccin chagasica, demostrando ser una herramienta sensible y especifica.

Russomando G, Rojas de Arias A, Almirn M, Figueredo A, Ferreira ME, Morita K. Trypanosomacruzi: Polymerasechainreaction-baseddetection in driedfeces of Triatoma infestans. ExperimParasitol 1996; 83: 62-66. 4 TECHNICAL REPORT INTERNATIONAL MEETING: New diagnostic tests are urgently needed to treat patients with Chagas disease. MdecinsSansFrontires. Campaign for Access to Essential Medicines. Rio de Janeiro, Brazil, 30-31 August 2007. RevSoc Brasil Med Trop2008; 41: 315-9.

BIOTECNOLOGIA MDICA 1 de junio de 2012 V. Hiptesis: Las tcnicas de PCR-ADNk y PCR-ADNsat sern capaces de detectar pequeas cantidades de ADN del parsito permitiendo el diagnstico precoz de la enfermedad de Chagas. VI. Objetivos
1. Validar la tcnica de PCR para la amplificacin de ADN de minicrculo de kinetoplasto (PCRADNk) de T. cruzi. 2. Validar la tcnica de PCR para la amplificacin de ADN de satlite (PCR-ADNsat) de T. cruzi.

VII. Material y mtodos 7.1 Tratamiento de muestras biolgicas 7.1.1. Aislado parasitario Trypanosoma cruzi aislado (TcDm28). A partir del aislado parasitario se realizaran las diferentes extracciones de ADN y posteriormente se emplearan como control en las PCRs para la deteccin de ADN de minicrculo de kinetoplasto y de ADN satlite. 7.1.2. Muestras de Pacientes Se analizaran 30 muestras de sangre y 20 de suero, las cuales sern pareadas con las de sangre. De estas muestras, 25 de sangre y 15 de suero pertenecern a pacientes chagsicos diagnosticados anteriormente mediante mtodos parasitolgicos (xenodiagnstico) e inmunolgicos a travs de las tcnicas ELISA, Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) y Hemaglutinacin Indirecta (HAI), para el momento de la toma de muestra se espera que los pacientes tengan resultado de xenodiagnstico negativo y serologa positiva. Dichas muestras sern facilitadas por el Hospital ESsalud Arequipa. Por otro lado se evaluaran 4 muestras de sangre y suero de donantes de banco de sangre que resultaran positivos a la deteccin inmunolgica, siendo negativos a las tcnicas parasitolgicas. Adems, se examinaran 3 muestras de triatominos (Rhodnius prolixus) alimentados con sangre de un paciente con Chagas agudo, los cuales sern suministrados Facultad de Medicina de Universidad Catlica de Santa Mara. De igual manera, se analizaran 24 muestras de sangre y suero de individuos, negativos para las tcnicas de diagnstico parasitolgico e inmunolgico (ELISA y Hemaglutinacin Indirecta) y sin factores de riesgo de la enfermedad. 7.2 Cultivo de parsitos El aislado parasitario TcDm28 se cultivara in vitro y se expandir en medio LIT (Liver InfusionTryptose) con suero fetal bovino al 10%. En la fase de crecimiento logartmico se recolectaran los

BIOTECNOLOGIA MDICA 1 de junio de 2012 parsitos y se centrifugaran a 4C durante 15 minutos a 3000 rpm y los sedimentos parasitarios se almacenaran a 70C hasta su uso. 7.3 Tcnica de extraccin de ADN con resina, Chelex100 (BioRad) Se realizara la extraccin de ADN a partir de parsitos en cultivo y de muestras de sangre completa y suero de los pacientes utilizando la resina Chelex100, para lo cual se tomara 200 L de muestra, se aadir 800 L de agua destilada estril, incubndose por 30 minutos a temperatura ambiente, luego se centrifugara, y se retirara el sobrenadante dejando 50 L, al cual se le aadir 200 L de Chelex100 al 5% y se incubara a 56 C durante 30 minutos, luego, se agitara en el vortex por 10 segundos, para volver a incubar a 100 C por 10 min, inmediatamente se centrifugara por 3 minutos, y se recogiera el sobrenadante que contiene el ADN. 7.4 Tcnica de PCR para la deteccin de ADN de minicrculo de kinetoplasto de T. cruzi: Para la deteccin de ADN de minicrculo de kinetoplasto de T. cruzi se utilizara el protocolo de Wincker y col. , que amplificara una banda de 330 pares de bases (pb) empleando los cebadores 121 5- AAATAATGTACGGGTGAGATGCATGA-3, y 122 5-GGGTTCGATTG GGGTTGGTGT-3. Dicho protocolo ser modificado para adaptarlo a las condiciones del laboratorio. Las condiciones de reaccin seran: Desoxinucletidos tri-fosfato (dNTP), 200 mol/L, cebadores 0,5 M, cloruro de magnesio 2 mM y Polimerasa 1U. La PCR se llevara a cabo mediante el siguiente programa: Desnaturalizacin inicial a 94C durante 10 minutos, seguido de 30 ciclos de Desnaturalizacin a 94C, por 30 segundos, Hibridacin a 63C por 30 segundos y Extensin a 72C por 30 segundos, terminando con una Extensin final a 72C, durante 10 minutos.

7.5 Tcnica de PCR para la deteccin de ADN satlite de T. cruzi . Se realizara la tcnica de PCR para la deteccin de ADN satlite de Trypanosoma cruzi segn el protocolo descrito por Moser y cols, empleando los cebadores especficos: TcZ1 (cebador directo) 5`-CGAGCTCTTGCCCACACGGGTGCT-3` y TcZ2 (cebador reverso) 5` CCTCCAAGCAGCGGATAGTTCAGG-3`. Estos cebadores permiten la amplificacin de una regin repetida de 188 pb del ADN satlite de T. cruzi. Las reacciones de amplificacin se realizaran segn el protocolo descrito, con modificaciones para adaptar lo a las condiciones del laboratorio. Las condiciones de reaccin fueron: desoxinucletidos trifosfato (dNTP), 200 mol/L, cebadores 0,5 mol/L, Cloruro de magnesio 2 mmol/L y Polimerasa 1U. La PCR se llevara a cabo mediante el siguiente programa: Desnaturalizacin inicial a 94C durante 10 minutos, seguido de 30 ciclos de desnaturalizacin a 94C, por 30 segundos.

BIOTECNOLOGIA MDICA 1 de junio de 2012 Hibridacin a 55C por 30 segundos y extensin a 72C por 30 segundos, terminando con una Extensin final a 72C, durante 10 minutos.

7.6 Electroforesis de ADN en geles de agarosa La electroforesis en geles de agarosa se llevara a cabo segn el procedimiento descrito por Sambrook y Russell, para evidenciar los productos de las PCRs. La electroforesis se realizara en geles de agarosa (Sigma) al 1% en el caso de ADNk y al 1,5% en el caso de ADNsat, utilizando TAE (Tampn Tris Acetato 40 mmol/L, EDTA 0,5 M pH 8,0) y un sistema de electroforesis horizontal Minicell EC 370M. Se empleara un voltaje de 60-100V. Los geles se teirn con bromuro de etidio (0,5 g/ml). Las bandas de ADN se visualizaran con luz ultravioleta mediante el sistema Gel Doc 1000 de BioRad. El tamao de las bandas de ADN se estimara comparndolas con el tamao de los marcadores de ADN 100 pb (Promega). VIII. Cronograma Pasos Junio Julio

Tiempo 3 4 1 2 3 4 semana semana semana semana semana semana Aislado X parasitario Obtencin De X de muestra pacientes Cultivo de X X parsitos X Extraccin de ADN con resina ADN de minicrculo X Tcnica de de PCR kinetoplasto Deteccin de ADN X satlite Electroforesis de ADN en geles de agarosa X Anlisis de resultados Reporte de resultados Publicacin X X X

BIOTECNOLOGIA MDICA 1 de junio de 2012 IX. Presupuesto $ 700 900 1500 4000 1500 750 1480 800 230 270 12130

Obtencin de muestras Tratamiento de muestras Extraccin de ADN Tcnica de PCR Electroforesis Anlisis de resultados Publicacin Gastos adicionales tiles de escritorio Movilidad TOTAL

X. Bibliografa 1. CALVO MNDEZ M L, NOGUEDA TORRES B, ALEJANDRE AGUILAR R. The oral route: anaccessportforTrypanosomacruzi. RevLatinoamMicrobiol 1992; 34: 39-42. 2. Elas, C; Vargas, N; Zingales, B; Schenkman, S. Organization of satelite DNA in the genome ofTrypanosoma cruzi. Mol Biochem Parasitol 2003; 129: 1-9. 3. Ferrer E., Da Conceico F., Campioli P., Rivera M G, Lpez M., Lares M., Medina M., MorocoimaA., Herrera L. Estandarizacin de tcnicas moleculares para la identificacin y caracterizacin deTrypanosoma cruzi. Memorias del VI Congreso de Investigacin en la Universidad de Carabobo Valencia, Edo. Carabobo Venezuela. 2008, I: 532-536. 4. Russomando, G; Figueredo, A; Almiron, M; Sakamoto, M; Morita, K. Polymerase Chain reaction-Based Detection of Trypanosoma cruzi DNA in serum. J Clin Microbiol, 1992; 30: 2864-2868. 5. Sambrook, J., Russell, T. Molecular cloning: a laboratory manual, 2 De. Cold Spring Harbor, NewYork; 2001. 6. Storino R, Auger S, Wojdyla D, Urrutia MI, Jrg M. Anlisis descriptivo multivariado de la enfermedad de Chagas en 2260 pacientes. RevArgenCardiol 1998; 66: 17-39. 7. TECHNICAL REPORT INTERNATIONAL MEETING: New diagnostic tests are urgently needed to treat patients with Chagas disease. MdecinsSansFrontires. Campaign for Access to Essential Medicines. Rio de Janeiro, Brazil, 30-31 August 2007. RevSoc Brasil Med Trop2008; 41: 315-9. 8. ZULANTAY, Ins Adriana. Enfermedad de Chagas crnica. Granada: editorial de la universidad de Granada., 2006. Presentado en el Instituto de Biotecnologa Grupo de bioqumica y parasitologa molecular, para la obtencin de grado de doctor.

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Bibliografa virtual 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. www.cdc.gov/parasites/chagas/es/diagnostico.html cdiaec.uniandes.edu.co/Capitulo%202.pdf www.atgen.com.uy/uploads/File/.../Celquest%20CHAGAS%20002.p... www.scc.org.co/libros/CHAGAS/paginas%2025-31.pdf msal.gov.ar/htm/site/pdf/.../sintesis-guia_chagas23-09-10.pdf www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/001372.htm www.unne.edu.ar/Web/cyt/cyt/2001/3-Medicas/M-027.pdf salus-online.fcs.uc.edu.ve/pcr_diag_mol_chagas.pdf www20.gencat.cat/.../Professionals/.../Chagas/.../chagas_espan... - Espaa