Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Brucella

Genul Brucella cuprinde 7 specii, cu numeroase biotipuri, care infecteaz animalele i se pot transmite de cele mai multe ori accidental omului de ex. Brucella melitensis (capre, oi), Brucella abortus (vaci), Brucella suis (porci), Brucella canis (cini). Sunt cocobacili gram negativi (de multe ori colorai bipolar), cu dimensiuni de 0,5-0,6 m / 0,6-1,5 m, imobili, prezentnd eventual o structur capsular, nesporulai, localizai n mod caracteristic intracelular, aerobi facultativ anaerobi, catalazo pozitivi, relativ inactivi metabolic, care se dezvolt relativ dificil pe mediile de cultur intrnd n categoria bacteriilor pretenioase cu necesiti nutritive complexe, sunt bacterii fastidioase (mai ales atunci cnd se realizeaz cultivarea iniial, din p.p.). Brucelele sunt microorganisme parazite pentru o serie de animale sau pentru om, capabile s determine infecii acute, cronice sau infecii inaparente. Cronicizarea depinde de capacitatea de multiplicare n celule fagocitare. Formele cele mai grave apar ca urmare a infeciei cu Brucella melitensis, urmat de infecia cu Brucella suis, Brucella abortus i respectiv Brucella canis. Transmiterea la om poate fi realizat pe cale digestiv, cutanat i mai rar pe cale respiratorie. De la nivelul porii de intrare, microorganismele ajung la nivelul ganglionilor limfatici regionali, depesc aceast barier i pe calea ductului toracic ajung n snge iar pe cale sangvin n organele cu sistem reticulohistiocitar i la nivel osos. Incubaia este n medie de 2-3 sptmni, ns uneori pot trece cteva luni ntre momentul infectrii i apariia fenomenelor clinice. Debutul este de obicei insidios, manifestat prin astenie, indispoziie, cefalee, artralgii, febr moderat, transpiraii abundente. n perioada de stare simptomele sunt polimorfe, bruceloza fiind una din bolile extrem de greu de recunoscut clinic. Febra ondulant (care crete n cursul dup amiezii i scade n timpul nopii) nsoit de frisoane are o valoare istoric. n realitate, curba febril are un aspect variabil. Transpiraiile abundente nocturne, cu un miros caracteristic, astenia, durerile sub diverse forme reprezint alte elemente care pot fi comune n cursul bolii. S-au descris circa 200 de semne clinice care pot apare n bruceloz. Durata bolii poate fi de 3-4 sptmni, dar cel mai frecvent depete 3 luni, ajungnd n formele cronice la ani de zile. n formele cronice diagnosticul se stabilete foarte dificil. Diagnosticul brucelozei n principiu, n realizarea diagnosticului se pornete de la aspecte clinice i epidemiologice, ns diagnosticul de laborator este esenial, reprezentnd unica metod cert pentru un diagnostic pozitiv. Diagnosticul de laborator n bruceloz poate fi bacteriologic (direct) sau serologic. Diagnosticul bacteriologic include urmtoarele etape. 1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd regulile cunoscute (vezi capitolul 6), n special ct mai rapid dup debutul bolii i nainte de iniierea antibioterapiei. Produsul patologic este reprezentat cel mai frecvent de snge, dar s-ar putea recolta i prin puncie ganglionar, puncie medular (rata de izolare crete), puncie hepatic sau splenic, sau ar putea fi reprezentat de LCR, urin, bil, lapte, materiale necroptice etc n funcie de simptomatologie i stadiul bolii. n continuare vom discuta situaia n care se
1

realizeaz o hemocultur prin metode clasice sau n sisteme de cultivare rapide, de tipul BactAlert, Bactec sau Septi-Chek (vezi i capitolul 31). 2. Examinarea microscopic a produsului patologic nu aduce de regul informaii utile diagnosticului, n special dac este vorba de snge. Se poate folosi tehnica imunofluorescent care uneori duce la rezultate pozitive. 3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se poat obine colonii izolate i respectiv o cultur pur, care se va identifica (vezi i capitolele 9 i 10). Toate speciile au cerine nutritive complexe necesitnd pentru dezvoltare medii mbogite cu substane nutritive (aminoacizi, proteine serice, glucoz, sruri, vitamine, ser, snge etc). Se recomand efectuarea hemoculturilor n mediul bifazic (solid-lichid), ex. tip Castaneda. Cultura se incubeaz n atmosfer de 5-10% CO2, la 37C pentru o perioad de minim 2-3 zile; culturile negative trebuie urmrite pn la 4 sptmni. n cazul mediului bifazic, vom nsmna panta de mediu solid la fiecare 2-3 zile, fr a deschide flaconul. 4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere: Caractere morfotinctoriale: Sunt cocobacili gram-negativicu cu dimensiuni de 0,5-0,6 m / 0,6-1,5 m, dispui izolat sau n perechi, lanuri scurte, grupat. Se pot colora bipolar. Poate fi necesar o prelungire a timpului de recolorare cu fucsin, altfel sunt palid colorai. Caractere de cultur: Pe mediile mbogite corespunztoare nutritiv, pot produce dup 2-3 zile colonii de tip S, cu un diametru de circa 1 mm; dimensiunea coloniilor se mrete astfel nct la 1 sptmn de incubare diametrul poate fi de 6-7 mm; pot fi identificate (n special dup incubare prelungit) colonii de tip R sau M Examinate folosind o surs de lumin la 45, coloniile apar transparente, galben-deschis, asemntor picturilor de miere n timp ce n lumina reflectat prezint o transparen cenuiualbstruie Caractere biochimice: Brucella spp. dup repicare pe un mediu neselectiv prezint un metabolism oxidativ Microorganismele sunt catalazo pozitive, n timp ce testarea reaciilor oxidazei, ureazei i producerii de H2S pot da rezultate variabile; se pot utiliza sisteme clasice de testare, dar este posibil i utilizarea galeriilor API (ex. API 20E) Testm necesitatea n CO2, pentru izolare Se mai pot verifica metabolizarea glucozei, lactozei precum i sensibilitatea la diferii colorani inclui de ex. n medii de cultur (ex. tionin sau fucsin bazic) Caractere antigenice: Utilizm seruri imune anti-Brucella adsorbite, prin reacii de aglutinare pe lam (exist reacii ncruciate); n cazul unei reacii pozitive, la nivelul laboratoarelor de referin se pot realiza reacii de aglutinare pe lam cu seruri imune monospecifice (anti-A, M sau anti-R n cazul coloniilor de tip R) Testarea sensibilitii la bacteriofagi (lizotipia) se poate utiliza n studii epidemiologice sau n scop de cercetare, fiind rezervat laboratoarelor de referin; spre exemplu fagul Tbilisi lizeaz tulpinile de B. abortus, poate liza la concentraii crescute tulpinile de B. suis, dar nu lizeaz tulpinile de B. melitensis, B. canis sau tulpinile n form R Alte teste utilizate n identificare la nivelul centrelor de referin: tehnici ale biologiei moleculare (exist sonde nucleotidice specifice pentru diferite biotipuri izolate mai frecvent, de ex. 1 i 3 aparinnd B. melitensis; se ncearc punerea la punct a PCR, pentru diagnosticul brucelozei).
2

5. Antibiograma (verificarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice) se realizeaz prin metoda difuzimetric standardizat, i este util att n scopul supravegherii apariiei unor tulpini rezistente la medicamentele antimicrobiene ct i pentru stabilirea tratamentului corespunztor n cazul unei maladii infecioase n general dificil de tratat. Diagnosticul serologic Este de multe ori necesar, innd cont de dificultile ntlnite n cursul diagnosticului bacteriologic. Utilizm antigene cunoscute i ncercm s determinm prezena anticorpilor specifici n sngele pacientului, valoarea titrului anticorpilor i respectiv evoluia acestui titru n dinamic. Trebuie s menionm c anticorpii de tip IgM cresc n infecia acut (n cteva sptmni) dar persist i n infecia cronic sau chiar i dup tratamentul antibiotic realizat corespunztor (timp de 1-2 ani). Anticorpii de tip IgG apar dup circa 3 sptmni de la debutul brucelozei, ating o valoare maxim la 6-8 sptmni i persist n cazul unei infecii cronice. n special din punct de vedere istoric discutm i putem practica n cadrul lucrrilor practice, aglutinarea pe lam (Huddleson, reacie calitativ, de screening). Cea mai cunoscut i utilizat tehnic de diagnostic serologic este reacia de aglutinare n tuburi (Wright) prin care putem determina att titrul anticorpilor de tip IgM ct i cel al anticorpilor de tip IgG. Avnd n vedere faptul c n bruceloz apar i anticorpi blocani (Ac de tip IgA care blocheaz activitatea aglutinant a Ac IgM sau IgG), care pot persista ani de zile, exist dificulti i n ceea ce privete interpretarea rezultatelor obinute n diagnosticul serologic. Pentru a simplifica, considerm c un titru 1/160 este sugestiv, n timp ce o cretere de 4 ori n dinamic a titrului, poate confirma diagnosticul de bruceloz. Exist o serie de variante tehnice care permit reducerea erorilor de interpretare: diluarea suplimentar a serurilor de cercetat testul de blocare (adugm tuburilor n care reacia Wright este negativ cte 1 pictur de ser imun anti-Brucella; dac reacia rmne negativ i nici n acest caz nu apare aglutinarea, concluzionm c n serul de cercetat exist anticorpi blocani) testul Coombs utilizarea unei tehnici de tip ELISA pentru detectarea Ac de tip IgM i IgG care apar fa de proteinele membranei externe etc. Diagnosticul imunobiologic Datorit faptului c n infecia cu Brucella spp. este stimulat n special rspunsul imun mediat celular, diferii autori menioneaz utilizarea intradermoreaciei cu brucelin n investigarea unui caz suspect de bruceloz. IDR cu brucelin poate identifica existena unei stri de hipersensibilitate de tip IV, fa de antigenul brucelos.