Sunteți pe pagina 1din 265

Partea a-I-a

Chimie judiciara

Ionel Mangalagiu Ramona Danac Costel Moldoveanu Gheorghita Zbancioc

I. INTRODUCERE II. CROMATOGRAFIA DE GAZE II.1. Introducere II.2. Concepte de baza II.3. Componentele cromatografului de gaze II.3.1. Gazul purtator II.3.2. Sistemul de introducere a probelor II.3.3. Temperatura coloanei II.3.4. Detectori utilizai n cromatografia de gaze III. TANDEMUL CROMATOGRAFIE -SPECTROMETRIE DE MASA III.1 Introducere III.2. Spectrometria de mas III.2.1. Generaliti III.2.2. Aspecte tehnice si aparatura III.2.2.1. Sistemul de introducere a probelor III. 2.2.2. Surse de ionizare utilizate n sistemul GC-MS III.2.2.3. Tipuri de analizoare utilizate n sistemul GC/MS III.2.2.4. Detectorii de ioni. IIII.2.2.5. Tipuri de interfee pentru sistemul GC/MS IIII.2.2.6. Puterea de rezolutie a spectrometrelor de masa III.3 Monitorizarea datelor in spectrometria de masa IV. REGULI GENERALE DE FRAGMENTARE IN SPECTROMETRIA DE MASA IV. 1. Introducere IV.2. Reactii de fragmentare IV.2.1. Fragmentari simple IV.2.2. Fragmentari insotite de transpozitia unui atom de hidrogen IV.2.3. Fragmentari complexe

IV.2.4. Fragmentari insotite de transpozitia a doi atomi de hidrogen IV.2.5. Fragmentari insotite de transpozitii de schelet V. APLICATII IN MEDICINA JUDICIARA V.1. Probe care se utilizeaza in medicina judiciara. Generalitati Modalitatea in care drogul/toxicul este conditionat si transportat Tipurile de impuritati, produsi de degradare, produsi secundari sau solventi care sunt prezenti in probele de drog/toxic Modalitatea in care proba drogul/toxicul se prezinta: in forma pura, amestec cu alte droguri, cu excipienti, cu adaos de produsi denaturati sau falsificati V.2. Probe biologice V.2.1. Introducere Metabolizarea drogurilor/toxicelor Administrare, transport, absortie, distributie si excretie V.2.2. Fluide biologice Singe, plasma, ser. Urina. Saliva V.2.3. Tesuturi si fluide postmortem Ficat, creier, bila, umoarea vitroasa, continut stomacal V.2.4. Probe neconventionale V.3. Pregatirea probelor V.3.1. Extractia si cromatografia in strat subtire V.3.1.1. Extracia V.3.1.2. Cromatografia in strat subtire V.3.2. Pretratamentul si prepararea probelor V.3.3. Derivatizarea chimica in medicina judiciara V.3.3.1. Reactii chimice utilizate in procesul de derivatizare V.3.3.2. Metode practice de derivatizare V.4. Droguri din opiu si derivati din familia opiaceelor V.5. Canabioide, Spice/Weed/ierburi a. canabioide naturale: canabis, hasis, marijuana, derivati

b. canabioide de sinteza din Spice/Weed/ierburi V.6. Amfetamine si derivati aminici V.7. Cocaina si derivati V.8. LSD si derivati BIBLIOGRAFIE

I. INTRODUCERE

Drogurile (aici incluzind si medicamentele cu potential de drog) au constituit dintodeauna o clasa de compusi de mare risc pentru oameni. Fie ca sunt procurate licit sau ilicit, consumul abuziv de droguri constituie o problema majora a societatii umane actuale. Potrivit raportului World Drug Report 2007, utilizarea abuzului de droguri (Drug Abuse, DA) pare sa se fi stabilizat in ultimii ani, dar circa 200 de milioane de oameni inc mai folosesc droguri ilicite in fiecare an. Drogurile care produc dependenta consumatorilor, care pot reduce penal responsabilitatea unui inculpat, sau care poate reduce aptitudinile de a desfasura anumite activitati, trebuiesc monitorizate constant in organismul uman, cel mai adesea in fluide si tesuturi. Aceleasi aspecte sunt vizate si in controalele antidoping la sportivi, deoarece folosirea sau abuzul de medicamente care stimuleaza masa musculara, pentru a creste nivelul de performanta, duce la tulburari secundare nedorite cum ar fi reducerea in greutate, surmenaj, boli psihice, etc. In plus, in ultimele decenii, s-a dovedit ca atit drogurile in sine cit si produsii lor de metabolizare constitue o sursa de poluare deloc de neglijat a mediului inconjurator. In toxicologia medico-legala, separarea, identificarea si dovedirea structurii diverselor substante, a capatat o importanta hotaritoare atit in cazul drogurilor ilegale cit si in cazul otravurilor (introduse accidental sau cu scopuri criminale). In prezenta exisat o adevarata strategie de screening toxicologica, deoarece exista citeva mii de droguri sau de pesticide care trebuiesc sa fie luate in considerare atunci cind se efectueaza o analiza. In ultimii ani, GC (cromatografia de gaze), MS-ul (spectroscopia de masa) si tandemul GC-MS-ul au cunoscut o dezvoltare spectaculoasa devenind practic metodele cele mai importante, performante si uzuale in criminologie, permitind

atit separarea cit si identificare diverselor clase de droguri. Pretratamentul diverselor tipuri de probe utilizate in toxicologia medico-legala a condus si la aprofundarea cunostintelor in ceea ce priveste tehnicele analitice utilizate in acest sens: extractie, cromatografie in start subtire, derivatizare. Scopul acestui manual este acela de a aduna intr-un tot unitar atit notiunile teoretice de baza din GC-MS cit si aplicatile acestor tehnici in medicina judiciara. Un accent deosebit a fost pus in cazul aplicatiilor in medicina judiciara pe informatiile din ultimile doua decenii, cu precadere din ultimii 10 ani. In acest manual sunt descrise cu precadere principiile de baza, aparatura precum si tehnicile si metodele de baza utilizate in toxicologia medico-legala. Spectrometrul de masa, in diferitele sale forme constructive, este acum parte integranta din fiecare laborator criminalistic. Practic, GC-MS in modul de functionare cu ionizare electronica (EI), constituie la ora actuala metoda de referinta pentru confirmarea testelor pozitive in analizele toxicologice folosite in medicina judiciara. Metodele GC-MS in modul de functionare cu ionizare electronica (EI) prezinta avantajul ca sunt reproductibile si deja sunt librarii de spectre care permite o identificare rapida a diverselor droguri, toxice, metaboliti, etc. Asa spre exemplu determinarea morfinei si cocainei din probele de singe prin GC-MS este in prezent un procedeu de rutina, complet automatizat, care dureaza circa 2 ore, si este recunoscut atit in medicina judiciara cit si in controlul antidoping. Numarul de posibilelor aplicatii medico-legale ale spectroscopia de masa este limitat doar de imaginaia expertului medico-legal.

II. CROMATOGRAFIA DE GAZE


II.1. Introducere II.2. Concepte de baza II.3. Componentele cromatografului de gaze II.3.1. Gazul purtator II.3.2. Sistemul de introducere a probelor II.3.3. Temperatura coloanei II.3.4. Detectori utilizai n cromatografia de gaze

II. CROMATOGRAFIA DE GAZE

II.1. Introducere
Metodele chimice de analiz care s prezinte o selectivitate i specificate ridicat sunt n general foarte puine. Separarea analitului de potenialii interfereni dintr-o prob este adesea necesar, dar nu este considerat ca un pas vital n procedurile analitice. Fr a grei, putem spune c cea mai performant metod de separare utilizat n analizele chimice este cromatografia, metod care i gsete aplicaii n toate domeniile tiinifice. Aplicaiile cromatografiei au avut o cretere exploziv n ultimii 40 de ani, aceasta nefiind datorat n exclusivitate doar apariiei mai multor tipuri noi de tehnici cromatografice, ci i datorit necesitii descoperirii unor metode foarte performante pentru caracterizarea amestecurilor chimice foarte complexe. Cromatografia cuprinde diverse i importante metode de analiz care permit chimistului s separe compui cu structur asemntore din amestecuri complexe. Multe din aceste separri sunt imposibil de realizat prin alte procedee de separare. n toate metodele de separare cromatografic, proba este dizolvat n faza mobil, care poate fi gaz, lichid sau fluid. Faza mobil este apoi trecut peste o faz staionar nemiscibil, care este fixat n interiorul unei coloane sau pe o suprafa solid. Cele dou faze sunt alese n aa fel nct componenii probei s se distribuie ntre acestea la variaia temperaturii. Acei compui care sunt puternic reinui de faza staionar se vor deplasa mult mai ncet n comparaie cu viteza de curgere a fazei mobile. n contrast , componeii care sunt mai slab reinui vor traversa faza staionar mai repede. Ca o consecina a acestor diferene de mobilitate, componeii

probei vor separa n benzi discrete cate pot fi apoi analizate calitativ i /sau cantitativ. Metodele cromatografice pot fi clasificate dup dou direcii. Prima clasificare se poate face n funcie de fenomenul fizic prin care cele dou faze sunt aduse n contact: - cromatografia pe coloan, n acest caz faza staionar este plasat n interiorul unor tuburi cu diametre foarte mici, iar faza mobil este forat s treverseze coloana fie prin diferen de presiune fie datorit gravitaiei; - cromatografie planar, cnd faza staionar este depus pe un suport plat sau n capilarele unei hrtii speciale. n acest caz faza mobil se deplaseaz peste faza staionar sub influena forelor capilare sau a gravitaiei. O clasificare mult mai riguroas a metodelor cromatografice are la baz tipul fazelor mobile i a fazelor staionare i tipul de echilibru care este implicat n transferul solutului ntre cele dou faze. Pe baza acestui criteriu cromatografia se mparte n trei mari categorii generale: -cromatografia de gaze; - croamtografia de lichide; - cromatografia fluidelor supercritice. n sens larg, cromatografia de gaze este considerat a fi o tehnic puternic si larg utilizat, comparativ cu alte tehnici instrumentale. Cnd este folosit corespunztor, cromatografia de gaze poate da informaii calitative i cantitative despre compuii individuali dintr-o prob. Cromatografia este n esen o metod fizic de separare, n care componenii unei probe sunt separai n funcie de distribuia acestora ntre dou faze, una staionar i una mobil. Separarea compuilor este practic realizat n funcie de volatilitataea i structura lor. Muli compui chimici nu pot fi analizai prin cromatografia de gaze datorit proprietilor lor fizice i chimice. Sistemul gaz cromatografic poate monitoriza doar acei compui care prezint o volatilitate apreciabil la o temperatur cuprins ntre 350-400 0C. De asemenea, aceti compui trebuie s fie stabili la temperaturi nalte i totodat,

10

trecerea lor rapid n stare de vapori s nu conduc la degradarea sau reacia lor cu ali compui. Uneori structura compuilor i masele lor moleculare pot fi utilizate ca indicatori poteniali, n ceea ce privete analiza lor prin cromatografia de gaze. O caracteristic de baz a compuilor chimici, care este de o mare importana pentru acest tip de analiz, este volatilitatea lor. Compuii cu o volatilitate sczut nu pot fi analizai prin aceast tehnic instrumental, acetia neputnd fi adui n stare de vapori fr a exista posibilitatea degradrii termice a lor. Punctele de fierbere ale compuilor studiai, nu reprezint ntotdeauna un factor care s caracterizeze volatilitatea acestora. Compuii pot avea puncte de fierbere ridicate, dar totodat pot fi i analizai prin cromatografia de gaze. n general, masa molecular i polaritatea compuilor sunt considerate n vederea stabilirii posibilitii studierii acestora cu sistemul gaz cromatografic (compuii nepolari cu mas molecular mare pot fi mult mai volatili dect compuii polari cu mas molecular mic). Astfel hidrocarburile cu masa molecular peste 500 uam sunt n mod obinuit analizate prin sisteme standard GC, iar cele cu masa molecular peste 1400 uam au putut fi analizate cu uurint prin echiparea sistemelor GC cu coloane speciale. Prezena grupelor funcionale polare (-OH, -NH2), de multe ori conduce la scderea volatilitii compuilor. Civa compui cu molecule mici (aminoacizi, zaharide) nu pot fi analizai cu prea mare uurin prin GC datorit numrului mare a grupelor polare. Urmrind aceai linie se poate arta c, n principiu compuii anorganici nu pot fi analizai prin tehnica gaz-cromatografic, aceasta datorit faptului c metalele i srurile nu prezint volatilitatea cerut de acest metod de analiz. n particular se cunosc doar civa compui organometalici caracterizai de o volatilitate crescut care se pot analiza prin cromatografie de gaze. n ultimii ani au aprut noi direcii n vederea aplicrii cromatografiei de gaze care au schimbat caracterul informaiilor cromatografice. Astfel, noile descoperiri din tehnologia coloanelor, au pus la punct coloane cu un diametru

11

foarte mic, ceea ce a condus practic la o cretere semnificativ a rezoluiei cromatogramelor ntr-un timp de analiz foarte scurt. Cromatografia de gaze a fost sistematic utilizat n ultimii 20 ani pentru analiza compuilor din amestecuri complexe n diferite domenii de cercetare (industria chimic, farmaceutic, petrochmic), i a devenit n ultimul timp o tehnic indispensabil n analizele poluanilor chimici de natur organic, din mediul nconjurtor.

II.2. Concepte de baza


Informaiile obinute de la o analiz sunt coninute n cromatogram, care este o nregistrare grafic, a concentraiei sau profilului de mas a componenilor din prob funcie de micarea fazei mobile prin coloan. Informaia dat numai de cromatogram include: o msur a complexitii probei bazat pe numrul de picuri observate; identificarea calitativ a componenilor din prob, bazat pe acurateea determinrii poziiei picurilor; informaii cantitative asupra concentraiilor relative sau mrimea fiecrui pic i o indicarea a performanei coloanei (Figura II.1). n timpul trecerii lor prin coloana cromatografic, moleculele probei , petrec o parte din timp n faza mobil i o parte n faza staionar. Toate moleculele petrec acelai interval de timp n faza mobil, acest timp fiind denumit ca timpul mort al coloanei i este echivalent cu timpul necesar pentru ca un solut nereinut s ajung la detector, de la momentul injectri.

12

Figura I.1. Cromatogram cu definia termenilor carcteristici

Timpul de reinere al unui solut (tR) este intervalul de timp scurs de la momentul injectrii probei n coloan i momentul cnd detectorul sesizeaz maximul picului de reinere. Timpii de reinere sau ali parametri derivai de la acetia, sunt utilizai n analizele calitative (identificare) iar aria picurilor sau de regul integrala (A) acestuia, fiind proporional cu cantitatea componentului ajut la cunatificarea componeilor din proba analizat:
t2

A = Sdt
t1

(II.1)

unde A este aria picului (n cm2 ); S este intensitatea semnalului dat de detector, t1 i t2 sunt timpii ntre care ncepe i se termin picul cromatografic considerat. Timpul de reinere (tR), reprezint practic timpul necesar unui component dintr-o prob de a trece din faza staionar n faza mobil (indicnd perioada pe care componentul chimic o petrece n coloan cromatografic). Acesta este dat de relaia:

tR =

L (1 + k ) = t M (1 + k ) u

(II.2)

13

unde L este lungimea coloanei (n cm); u este viteza liniar medie a fazei mobile (n cm/sec); k este un derivat al coeficientului de distribuie a componentului ntre cele dou faze ( k = K

VL , cu VL volumul fazei staionare n coloan (n cm3)i VM VM L = t M reprezint timpul mort sau u

volumul fazei mobile n coloan (n cm3));

timpul la care apare picul gazului purttor; (tR-tM) reprezint timpul de reinere ajustat. Se poate concluziona c substanele cu valori diferite pentru K vor avea timpi de reinere diferii. Fiecare component din prob dup ce este separat de coloan, genereaz un semnal caracterizat nu numai de momentul apariiei picului, ci i de lrgimea acestuia (picurile A i B din figura II.1). O descriere cantitativ a acestui feneomen este dat de numrul de talere ,N, ale coloanei, Numrul de talere teoretice se poate calcula cu relaia:
2 tR

N=

II.2

unde N reprezint numrul de talere i 2 variana picului eluat. Pentru picurile cu simetrie Gaussian, deviaia standard, , poate fi calculat din cromatogram cu urmtoarea relaie: 2d =d 2

(II.3)

unde d este jumtatea limii picului la 0,607 din nlimea picului considerat ( Figura II.1). Numrul talerelor (N) poate fi raportat la lungimea coloanei de separare (L), prin introducerea parametrului cantitativ H:

H=

L N

(II.4)

14

unde H reprezint echivalentul nlimii unui taler teoretic. Acest parametru este o funcie de viteza liniar medie a gazului purttor i de un numr de parametri experimentali. Gradul de separare (rezoluia) a doi componeni realizat de o colon poate fi exprimat cu relaia:
1 k N Rs = 4 k + 1 unde este factorul de separare (II.5)

= t R ( B) / t R ( A) = k B k

(II.6)
A

Separarea este n general complet dac Rs =1,5 i acceptabil dac Rs =1. n mod obinuit coloanele pachet operez cu valori mari ale lui k i de aceea raportul k/(k+1) este aproximativ unitar. n orice caz coloanele tubulare deschise opereaz cu valori mai mici ale lui k, deoarece raportul VM/VL este mai mare. Din acest motiv, pentru obinerea rezoluiei cerute este necesar un numr mai mare de talere teoretice pentru coloanele capilare.Un numr mare de talere teoretice se obine uor ntr-o coloan tubular deschis dac lungimea acesteia este mrit.

II.3. Componentele cromatografului de gaze


n general sistemul cromatografic este compus din apte componente majore ( Figura II.1): butelia de gaz purttor(1); sistemul de control al debitului de gaz (2); sistemul de introducere a probelor (3); termostatul coloanei (4); coloana (5); detectorul (6); nregistratorul sau sistemul de procesare a datelor (7).

15

Figura II.1. Schema unui sistem GC

Gazul inert sau faza mobil (N2) trece continuu cu un debit constant de la butelia (1) direct n sistemul de introducere a probei, prin coloan i ajunge apoi la detector. Viteza de curgere a gazului purttor este foarte bine controlat cu ajutorul unui flow controler (2), pentru a asigura o reproductibilitate a timpilor de reinere i pentru a minimaliza zgomotul detectorului. Probele sunt injectate (folosind de regul o microsering), n sistemul de introducere a probelor (3), caracterizat de o temperatur nalt, ceea ce permite vaporizarea probelor i trecerea lor n interiorul coloanei prin intermediul gazului purttor. n cazul compuilor cu o stabilitate termic critic probele pot fi introduse direct n coloan (on-column injection). Coloanele pachet sunt alctuite din tuburi de sticl sau oel n interiorul crora se gsesc particole solide (suportul solid). Acest suport solid este mbrcat ntr-un film subire i uniform al unui lichid caracterizat de un punct de fierbere foarte ridicat (faza staionar). Coloanele capilare sunt practic nite tuburi de sticl sau silice fuzibil, n interiorul crora este localizat faza staionar, sub forma unui film subire care ader pe perei. Dup ieirea din coloan gazul purttor i proba ajung direct la detector. Rolul acestuia este de a sesiza prezena componenilor unei probe i de a genera un semnal electric proporional cu cantitatea de component care ajunge la el. Detectorul va trimite semnalul rezultat la un nregistrator sau sistem de achiziie a

16

datelor pentru ca n final s se obin o cromatogram. n noile instrumente GC sistemul de date afieaz pe lng cromatogram i timpii de reinere i rezultatele integrrii picurilor cromatografice sub forma unui raport final de analiz.
II.3.1. Gazul purtator

Rolul gazului purttor este de a transporta proba de la injector, prin coloan pn la detector. Gazul purttor trebuie s fie inert ( s nu reacioneze cu nici unul din componeii probei sau cu faza mobil). Alegerea gazului purttor poate afecta att separarea ct i viteza analizei. Un al doilea rol foarte important al gazului purttor este acela de a furniza o matrice corespunztoare pentru detector la msurarea componenilor din prob. n cazul unui detector termic conductiv (TDC), gazele uoare cu o conductivitate termic mare sunt corespuztoare pentru obinerea unei sensibilti crescute i uniforme. n acest caz He i H2 sunt cele mai utilizate gaze purttoare. n cazul termistorilor utilizarea H2 ridic unele probleme deoarece este posibil ca acesta s reacioneze cu oxizii pmnturilor rare din care sunt confecionai detectorii. Detectorii flam ionizatori (FID) opereaz cel mai adesea cu He sau H2. n acest caz N2 d o sensibilitate de dou ori mai mare dect n cazul utilizrii H2, la FID. n unele cazuri H2 este utilizat drept gaz purttor la colanele capilare pentru efectuarea unei analize foarte rapide. Detectorii cu captur de electroni (ECD) utilizeaz de N2 foarte uscat sau a amaestec de argon i metan 5%. O alt condiie pe care trebuie s o ndeplineasc gazul purttor, este ca acesta s fie foarte pur. Aceast condiie este necesar a fi ndeplinit deoarece impuritile pot genera o serie de degradri ale fazei lichide. Coloanele din poliesteri, poliglicoli sau poliamide sunt predispuse la astfel de degradri prin reaciile acestora cu O2 sau apa. De asemenea urmele de ap pot desorbi unii contaminani din coloan provocnd un zgomot de fond ridicat (background) sau chiar aa numitele picuri fantom. Urmele de hidrocarburi din gazul purttor pot

17

cauza creterea zgomotului detectorului de tip FID i conduc totodat la diminuarea limitelor de detecie. nlturarea urmelor de ap i de hidrocarburi se poate realiza prin instalarea unor filtre de tip site moleculare, ntre butelia gazului purttor i cromatograf. Aceste site moleculare pot fi apoi regenerate prin nclzira lor la o temperatur de 3000C timp de cca 3 ore, n curent de slab de N2. Acurateea controlului debitului de gaz purttor este deosebit de important att pentru mrirea eficienei coloanei ct i pentru analizele calitative i cantitative. Pentru o analiz calitativ este esenial s existe o reproductibilitate a vitezelor de curgere care se reflect n acurateea reproductibilitii timpilor de reinere. Comparnd timpii de reinere sau ali parametri dervai ai unor compui necunoscui, cu cei ai unor standarde se pot identifica rapid i comod compuii respectivi, dar trebuie precizat c este posibil ca unul sau doi compui s aib acelai timp de reinere. Identificarea componenilor doar pe baza identitii picului nu este elocvent cromatografiei de gaze, chiar i cnd aceste instrumente sunt prevzute cu detectori selectivi. n general aceast metod necesit analize auxiliare cum ar fi: MS, RMN sau IR. Datorit proprietilor fizice i a concentraiilor diferite ale componenilor dintr-o prob, precum i a diferitelor condiii cromatografice (lungimea i diametrul coloanei, procentul de mas a fazei staionare, viteza fazei mobile) s-au dezvoltat mai multe tehnici de sampling, care sunt utilizate frecvent n analiza cromatografic de gaze. Mrimea probei analizate depinde foarte mult de tipul de coloan care este utilizat n analiz. Aceasta poate varia de la uniti de grame pn la uniti de nanograme (Tabelul II.2).
Tabelul II.2 Intervalul volumelor de prob pentru diferite tipuri de coloane. Tipul de coloan Diametrul Faza lichid Prob gazoas mm Capilar 0,25-0,5 0,5 m <10 L Cu eficien mare 2 3% 0,1-1,0 mL Obinuit 4,6 10% 0,1-10 mL 20 20% 0,1- 1 L Preparativ

Prob lichid 0,001-1 L 0,01-1 L 0,1-10 L 0,01-1.0 mL

18

De asemenea starea de agregare impune i tipul de sistem de introducere a probei n coloana cromatografic. Probele gazoase se introduc de regul utiliznd un sistem de de supape (Figura II.3). n poziia de ncrcare , curentul de prob gazos, trece continuu printr-o bucl, pn cnd n interiorul acesteia va fi numai proba. Volumul buclei cu prob este controlat prin lungimea i diametrul tubului. n poziia de introducere a probei n colon, sistemul de supape este rotit i gazul purttor transfer proba din bucl direct n coloan. Sistemul de supape are o reproductibilitate bun , este uor de manipulat i poate fi mult mai uor automatizat dect sistemul de introducerea probelor prin injectare.

Figura II.3. Schema unui sistem de supape folosit pentru probe gazoase a) poziia de nrcare cu prob; b) poziia de introducere n coloan

19

II.3.2. Sistemul de introducere a probelor

Majoritatea probelor analizate prin GC sunt n faz lichid, fie c proba nsi este lichid fie c este rezultatul solubilizrii unei probe solide. Acestea sunt vaporizate ntr-un sistem special nainte de a fi introduse n coloan. De cele mai multe ori pentru introducerea lor se folosesc seringi de la 1 la 10L (n funcie de mrimea coloanei i a probei). Se cunosc mai multe tipuri de sisteme de trecere a probelor lichide n stare de vapori (Figura II.4).

Figura II.4. Schema bloc a unui injector

La introducerea probei n injector, datorit temperaturii ridicate i constante, aceasta se vaporizeaz trecnd direct sub acinunea curentul gazului purttor n coloan. Volumul suplimentar este minimalizat pentru a asigura vaporizarea probei n coloan i pentru a reducerea dispersia. Acest tip de injector este foarte des utilizat mai ales n cazul compuilor sau probelor instabil termic (amino acizi, steroizi, pesticide, hidrocarbonate i chiar unele medicamente). n cromatografia de gaze se disting dou categorii de coloane. Prima categorie cuprinde aa numitele coloane capilare sau coloane tubulare deschise, care sunt de fapt nite tuburi deschise, caraterizate o permeabilitate crescut. n particular aceste tuburi sunt confecionate din silice fuzibil. n mod obinuit se ntlesc dou tipuri de asfel de coloane capilare, coloane capilare deschise n care faza lichid (staionar) acoper pereii interiori ai capilarei sub

20

forma unui film subire; coloane capilare n care faza lichid se afl depus pe un suport poros. Cea de a doua categorie, coloanele pachet, sunt coloanele care conin pachete de particole solide mai mult sau mai puin dense. Coloanele pachet clasice sunt acele coloane care au n interior diametre de cca 1mm sau chiar mai mici. Coloanele care au o densitate substanial mai sczut dect cele calasice au fost denumite pachet de coloane capilare. Creterea eficienei coloanelor pachet se poate realiza prin dou modaliti. Pe deoparte creterea eficienei poate fi realizat prin micorarea particulelor de pe suportul solid i o a doua modalitate este prin creterea lungimii coloanelor care conin particole de dimensiuni mai mari. n ambele situai, este necesar o micorare a presiunii n momentul utilizrii acestor coloane. nlimea talerului teoretic pentru o colan capilar este dat de relaia:
2 2D 11k 2 + 6k + r 2u0 2 kd f u0 f 2 H = m + f1 + 2 3 (1 + k )2 Ds 24(1 + k ) Dm u0

(II.7)

unde Dm este coeficientul de difuzie al componentului n faza mobil; Ds este coeficientul de difuzie al componentului n faza staionar; r este diametrul interior al capilarei; df este grosimea filmului subire al fazei lichide; k este factortul de capaciate al solutului; f1 i f2 sunt factorii de corecie pentru presiune: f1 = 9 P4 1 P2 1 2 8 P3 1

2 P 1 f2 = 3 P3 1
2

( (

)( ) )

(II.8)

unde P reprezint raportul presiunilor gazului purttor la intrarea i la ieirea din coloan (Pi/Pe), i uo este viteza liniar a gazului purttor la intrare n capilar sau: u0 = u L = f 2 tM f 2 (II.9)

n multe condiiile experimetale ntlnite n cromatografia de gaze, debitul de gaz poate fi considerat liniar. Debitul de gaz este proporional cu gradientul de presiune:

21

u(x ) =

k dp dx

(II.10)

n relaia II? k este o msur a permeabiliti coloanei i caracterizeaz viscozitatea dinamic a gazului purttor1. Se poate spune c un gaz purttor este ideal pentru toate condiiile practice numai atunci cnd viscozitatea acestuia este independent de presiune. Integrnd acest ecuaie se obine: u0 = k Pe2 Pi 2 2LPe

(II.11)

Valoarea obinut ajut la calcularea vitezei medii a gazului purttor prin coloan (realia II.9). Pentru coloanele capilare cu diametrul dc, permeabilitatea este dat de relaia:
k= d c2 32 .

Cu ajutorul relaie II.7 se pot determina valorile optime pentru nlimea unui taler (H) i pentru viteza de curgere (uo) a gazului purttor. n cele mai multe cazuri grosimea filmului fazei lichide este foarte mic, astfel c termneul al treilea din relaia II.7, care reprezint rezistena la transferul de mas a fazei lichide, se poate neglija. Astfel:
H min = u0,optim 1 d c f (k ) 2 1 8 Dm = d c f (k )

II.12
2

f (k ) =

(1 + 6k + 11k )
3(1 + k )
2

aceste relaii, rezultate n urma diferenialei ecuaiei II.7, dau condiiile optime pentru nlimea unui taler teoretic i viteza gazului purttor, n cromatografia de gaze. n urma consideraiilor fcute, se pot trage urtoare concluzii:

22

a) - numrul maxim de talere teroretice, care poate fi obinut pentru o coloan capilar este independet de tipul gazului utilizat. Deasemenea, scderea diametrului coloanei are ca rezultato cretere a numrului de talere pe unitate de lungime. b) - viteza optim pentru gazul purttor este n strns dependent cu diametrul coloanei (dc), cu factorul de presiune (f2) i cu natura acestuia (Dm). Dac factorul f2 este egal cu unitatea, viteza optim pentru gazul purttor este direct proporional cu coeficentul de difuzie (Dm), i invers proporional cu dimetrul cintern al capilarei. Gazele inerte, precum H2 i He au artat interval destul de mari pentru valoarea optim uopt, hidrogenul putnd da o nalaiz mult mai rapid (Figura II.5).

Figura II.5. Dependena H=f(uopt) pentru , N2, H2, He

Considernd n continuare, apoximaia lui f2 i negiljarea termenului care d rezstena la transferul de mas a fazei staionare, timpul de reinere pentru o

23

separarea unui component dintr-o prob nesit un anumit numr de talere teoretice (N) , i se poate calcula cu relaia.
t R = t M (1 + k ) = NH min (1 + k ) uoptim

(II.13)

de aici se poate vedea ca tR este proporional cu 1/dc, astfel c o reducere 1n diametru coloanei de cinci ori , va duce la o cretere a timpului analizei printr-un factor de 25. Pentru optimizarea separrilor cromatografice, raportul timpilor petrecui de solut n faz mobil i n faza staionar este foarte important2. Timpul n care solutul se afl in faza staionr este in strns legtur cu afinitatea acestuia fa de cele dou faze: k= t R tM =

(tR tM )
tM

(II.14)

Reinerea relativ pentru dou picuri adiacente ntr-o cromatogram poate fi descris de factorul de separare (), dat de relaia: Factorul de separare este o msur a selctivitii unui sistem cromatografic. De multe ori acest factor mai este numit i factor de selectivitate sau selectivitate.
II.3.3. Temperatura coloanei

Coloana cromatografic este termic controlat pentru ca separrile care sunt fcute, s poate fi reproductibile. Deasemenea este important pentru o coloan s pot fi operabil ntr-un interval larg de temperaturi, de la 180 peste 4000C. Controlul temperaturii coloanelor este este important i usor de realizat deaorece acest parametru de multe ori influeneaz separarea. Temperatura coloanei trebuie s fie suficient de rridicat pentru a asigurao analiz complet i intr-un timp rezonabil. Pe de alt parte temperaturile prea ridicate pot conduce la o diminuare a factorului de separare i a factorului de capacitate a componeilor din prob ceea ce de cele mai multe ori duce la o

24

rezoluie foarte mic. n acord cu o simpl aproximaie, timpul de reienre se dubleaz pentru fiecare scdere cu 300C a temperaturii coloanei. n multe cazuri, pentru separea componenilor unei probe temperaturile joase sunt preferate (Figura II.6).

Figura II.6. Efectul temperaturii n analiza unui amestec de hidrocarburi simple

n funcie de acest important parametru, metodele cromatografice sunt clasate n dou categori, analiz izoterm cnd temperatura coloanei este meninut constant pe tot parcursul analizei i analiz cu proggram de tempertur , cnd , pe parcursul efecturii analizei, temperatura coloanei crete n timp, deobicei cu o vitez liniar (5-400C/min). n figura II.7 este prezentat diferenele care apar n cazul celor dou metode de analiz. De obicei analiza cu program de temperatur este des utilizat n analiz amestecurilor ce conin componei cu temperaturile de fierbere foarte diferite.

25

Figura II.7. Comparaie ntre cromatogramele izoterm i cu program de temperatur

n analiza cu program de temperatur, temperatura iniial este sczut, asfel c primul pic cromatografic va fi datorat compusului cel mai volatil, urmnd ca urmtoarele picuri s fie pentru compuii cu volatilitate din ce n ce mai mic. n general intervalul n care operea z analiza cromatografic este cuprins ntre 60 280OC.
II.3.4. Detectori utilizai n cromatografia de gaze

Detectorul cromatografic genereaz un semnal electric proporional cu cantitatea componentului care prsete coloana. Detectorii pot fi clasificai n dou clase. a) detectori dependeni de concentraie; b) - detectori dependeni de viteza masic.

26

detectorii

dependeni

de

concentraie,

(TCD

ECD),

semnaluldetectorului este proporional cu concentraia probei din gazul purttor. n detectorii dependenie de viteza masic (FID), semnalul detectorului este dependent de masa probei care trece prin detector pe unitate de timp. Sensibilitate unui detector este definit ca fiind mrimea semnalului produs pentru o concentraie dat a unei probe sau pentru o anumit vitez masic. Un detector sensibil va genera un semnal intens pentru mrimea probei date. Acest sensibiltate poate fi determinat din panta dreptei, n care se reprezint dependena rspunsulului detectorului funcie de concentraia sau viteza masic a probei. Zgomotul detectorului generat de rspunsul acestuia ntr-un interval de timp scurt sau la ntmplare, este dependent de proprietile electrice ale detectorului, temperatura de lucru i debitul gazului purttor. Zgomotul este un factor care determin cantitatea minim de prob care poate fi detectat. Cantitatea de prob care genereaz un semanal de dou ori mai intens dect nivelul zzgomotului, este definit ca fiind cantitatea minim detectabil. Foarte des utilizai ca detectori n cromatografia de gaze sunt detectorul termic conductiv (TCD), flam-ionizator(FID), detector captur de electroni (ECD). Detectorul termic-conductiv (TCD). Principiul de funcionare care st la baza acestui detector este c un corp nczit va pierde cldur cu o anumit vitez deteminat de compoziia gazului nconjurtor. Deci viteza pierderii cldurii poate fi utilizat ca o msur a compoziiei gazului. Figura II.8 prezint schema unui detector termic conductiv, constituit dintr-un filament din tungsten, localizat n interiorul unei caviti. Cavitatea este protejat de o manta din oel inoxidabil, care menine temperatura la o valoare constant. Filamentul nclzit poate pierde cldur prin schimbul termic cu prile mai reci ale blocului din oel prin urmtoarele procese: a) conducie termic; b) convecie;

27

c) radiaie;

Figura II.8. Celul cu conductibilitate termic

Procesele majore sunt pierderea cldurii prin conducie termic gazoas i convecie forat. Aceste dou procese produc o pierdere de 75% a cldurii filamentului. Unele gaze purttoare precum He sau H2 pot cauza o rcire a filamentului mai mult pe baza conduciei termice. Cldura este trannsferat instantaneu prin conducie cnd moleculelegazului purttor ating filamentul nclzit. Cu ct vitezele de curgere sunt mai mari cu att viteza de pierdere a cldurii este mai mare. Din acest motiv TCD este sensibil la debitul de gaz. Diferenele ntre conductivitile termice ale gazelor sunt bazate pe mobilitatea sau viteza cu care moleculele gazului difuzeaz (moleculele mai mici au o mobilitate mai mare i o conductivitate termic ridicat). De aceea H2 i He, care sunt cele mai mici molecule au o cea mai mare conductivitate termic. Detectorul flam-ionizator (FID) Detectorii ionizatori opereaz pe baza principiului c conductivitatea electric a gazului este direct proporional cu concentraia particuleor ncrcate din gazul purttor.

28

n FID o flacr de H2 este folosit pentru ionizarea probelor. Gazul purttor de la coloan trece direct n flacra care ionizeaz o parte din moleculele organice. Prezena particoloelor ncrcate (ioni pozitivi i ioni negativi i electroni) n paiul liber al electrodului (Figura II.9) generaz un curent care este msurat de un rezistor. Voltajul rezultat este amplificat de un electrometru i trimis apoi la un un nregistrator. Se poate considera c spaiul liber al electrodului este un rezistor variabil a crui rezisten are o valoare dat de numrul de particole ncrcate din acesta spaiu. Cnd un compus organic ajunge n flacr el este supus combustiei particulele ncrcate sunt formate. Acesta va determina descreterea rezistenei spaiului liber i creterea curentului. Rspunsul nregistratorului este proporional cu cantitatea de compus organic eluat din coloan. Figura II.9 prezint schema unui detector asfel de FID.

Figura II.9. Detectorul flam-ionizator

29

Trebuie menionat faptul c detectorii tip FID rspund numai la compuii organici. Aceti detectori sunt corespunztori pentru analiza compuilor organici aflai n urme, n aer sau ap. Detectorul cu captur de electroni(ECD) Acest tip de detector se bazez pe msurarea scderii semnalului electric. n funcie de modul de realizare a curgerii gazului putrttor spre detector, o plcu de
63

Ni radioactiv ionizeaz gazul i procesul de formare a electronilor este lent

(Figura II.10). Aceti electroni migreaz la anod care n mod normal are un potenial de cca 90V . Colectare acestor ioni conduce la un curent de cca 10-8 A, care este amplificat de un electrometru.

Figura II.10. Detector captur de electroni

Existen unui component cu afinitate pentru electroni va produce o scdere a acestui curent staionar. Aceast pierdere de curent este afit ca un pic pozitiv. Cele mai moderne detectoare de acest tip, au posibilitatea meninerii curentului la o valoare constant pe baza unor pulsuri voltaice cu frecven variabil. Frecvena pulsurilor este proporinal cu concentraia probei i poate fi utilizat pemtru analize cantitative.

30

Acest detector este foarte sensibili la derivai polihalogenaai ai alcanilor, la carbonili conjugai, nitrii, nitrai, compui polinitroaromatici i specii organometalice. Este insensibil la hidrocarburi alcooli i cetone.

31

III. TANDEMUL CROMATOGRAFIE SPECTROMETRIE DE MASA


III.1 Introducere III.2. Spectrometria de mas III.2.1. Generaliti III.2.2. Aspecte tehnice si aparatura III.2.2.1. Sistemul de introducere a probelor III. 2.2.2. Surse de ionizare utilizate n sistemul GC-MS III.2.2.3. Tipuri de analizoare utilizate n sistemul GC/MS III.2.2.4. Detectorii de ioni. IIII.2.2.5. Tipuri de interfee pentru sistemul GC/MS IIII.2.2.6. Puterea de rezolutie a spectrometrelor de masa III.3 Monitorizarea datelor in spectrometria de masa

32

III. TANDEMUL CROMATOGRAFIE SPECTROMETRIE DE MASA


III.1 Introducere
Cromatogramele dau informaii cu privire la complexitatea (numrul de componeni), cantitatea (nlimea picului sau aria acestuia) i identitatea (parametrul de reinere) componenilor dintr-un amestec. Identificarea compuilor chimici prin luarea n considerare numai a parametrului de reinere este de cele mai multe ori nerelevant, chiar i n cazul analizei unor amestecuri mai simple. Cnd se poate stabili cu mare precizie identitatea unui component din prob, atunci informaiile cantitative provenite de la cromatogram sunt considerate a fi foarte bune. Situaia este invers la tehnicile spectrometrice deoarece acestea furnizeaz suficiente informaii calitative din care se poate deduce identitate substanei, cu un grad mai mare de certitudine. Cu toate acestea instrumentele spectrometrice au dou limitri practice.Adeseori n spectrometrie este destul de dificil s se obin toate informaiile cantitative din semnalele generate i pentru o real identificare cu aceste tipuri de instrumente este necesar s se foloseasc probe cu un nalt grad de puritate. Astfel tehnicile cromatografice i spectrometrice furnizeaz informaii complementare despre identitatea i concentraia componeilor dintr-o prob. Descoperirea unor spectrometre de mas capabile s asigure o eficien i rezoluie ridicat n determinarea structurii compuilor chimici din probe complexe, a condus la extinderea utilizrii lor ca detectori n tehnica combinat GC-MS. Detectorii conveionali de tip flamionizatori, sau detectori cu captur de electroni sunt nlocuii n prezent de detectori de mas selectivi sau detectori tip ion trap, care au avantajul c asigur un grad de specificitate deosebit de nalt, i n cele mai multe cazuri cu o sensibilitate ridicat.

33

Principala tehnic combinat de analiz i cel mai des utilizat, este cromatografia de gaze interpus spectrometriei de mas (GC/MS) i spectrometriei n infrarou cu transformat Fourier (GC/FTIR). Avantajele prezentate de tehnicile n tandem, de tipul GC-MS, duc la utilizarea acestora pe scar larg n vederea analizei produilor chimici (de natur organic, n special, sau anorganic) din mediul nconjurtor. Alte tipuri de tehnici cuplate utilizate n analizele compuilor chimici, dar cu o arie mai mic de aplicabilitate, sunt: cromatografia de lichide-spectrometria de mas (LC/MS), cromatografia de lichide-spectrometria n infrarou cu transformat Fourier (LC/FTIR) i cromatografia de lichide-rezonana magnetic nuclear; cromatografia n strat subire-spectrometria de mas (TLC/FTIR), cromatografia n strat subire-spectrometria n infrarou cu transformat Fourier (TLC/FTIR). n ultimul timp au fost puse la punct i tehnici n serie care permit realizarea cuplrii mai multor tipuri de instrumente analitice( GC/FTIR/MS). Toate aceste tehnici sunt caracterizate prin abundena de date pe care le pot furniza. Avantajul major al acestor metode de analiz const n faptul c permit folosirea calculatoarelor sau microprocesoarelor de mare putere, n vederea controlului proceselor care au loc n fiecare instrument analitic, achiziia, stocarea, vizualizarea i interpretarea datelor. Calculatoarele ofer de asemenea posibilitatea obinerii directe a spectrelor de mas i astfel interpretarea datelor spectrale devine mai puin dificil. Tandemul GC-MS furnizez o serie de avantaje complementare celor prezentate de cromatografia de gaze. Interfaa sistemului GC-MS, realizat de cele mai multe ori prin sisteme deosebit de complexe, are capacitatea de a asigura meninerea probei n condiii optime pentru analiz, evitnd descompunerea sau degradarea termic i permite totodat obinerea unor timpi de reinere reproductibili de la o analiz la alta.

34

III.2. Spectrometria de masa


III.2.1. Generalitati Spectrometria de mas este una din cele mai utilizate metode de analiz

pentru stabilirea structurii compuilor organici. La baza acestei metode au stat observatiile lui Wien (1898) privind posibilitatea devierii unui flux de ioni pozitivi de ctre un cmp magnetic sau electric. Desi primele spectre de masa au fost trasate in 1912 de catre J.J. Thomson, aplicarea larga a spectrometriei de masa a inceput in jurul anului 1940 cand Hoover abordeaza analiza cantitativa a amestecurilor de hidrocarburi. Dupa 1948, o serie de cercetatori ca Beynon, McLafferty, William si altii, in urma unor studii sistematice, stabilesc reguli generale si specifice de fragmentare care permit stabilirea structurii compusilor organici. Dificultatile majore in raspandirea larga a spectrometriei de masa a constituit-o si o constituie inca pretul mare si intretinerea dificila a aparaturii. Spectrul de mas este obinut prin transformarea probelor ntr-un amestec gazos de ioni i separarea acestora funcie de raportul m/z. Spectrometria de mas este considerat a fi cea mai aplicat tehnic analitic n cercetarea tiinific, deoarece este capabil s dea informaii despre calitatea i cantitatea compuilor organici i anorganici din amestecuri complexe, despre structura unui numr mare de specii moleculare complexe, despre raportul izotopilor atomilor dintr-o prob i despre structura i compoziia suprafeelor solide. n tabelul III.1 este prezentat evoluia acestei tehnici analitice de-a lungul anilor. De precizat c toate din aplicaiile prezentate n acest tabel se ntlnesc nc n laboratoarele moderne.
Tabelul III.1. Evoluia spectrometriei de mas. Eveniment -Descrierea comportrii ionilor n cmp magnetic -Dubla focalizare

Dat aproximativ 1920 1935

Aplicaii -Determinarea abundenelor izotopilor unui element -Obinerea unei rezolii mai nalte

35 -Comercializarea primului spectrometru de mas -Sursa tip scnteie -Stabilirea regulior de fragmentare a speciilor moleculare -Cuplarea spectrometrului de mas cu cromatograful de gaze -Spectrometre de masa n tandem -Noi tehnici de ionizare -Aplicarea transformatei Fourier la spectrometria de mas -mbuntirea surselor pentru compuii nevolatili 1950 1955 1960 -Analize cantitative ale produselor petroliere -Analize cantitative elementale -Identificare i analize structurale ale moleculelor complexe -Analize calitative i cantitative ale amestecurilor complexe -Analiza rapid a amestecurilor complexe -Creterea capacitii de elucidare a structurii compuilor -mbuntirea rezoluiei si a raportului semnal-zgomot. -Analiza polimerilor i a suprafeelor

1965 1970 1970 1980 1980

Un termen carcteristic n spectrometria de mas este raportul mas-sarcin (m/z) a ionilor atomici sau moleculari. Acest termen se obine prin divizarea direct a masei ionului rezultat, la numrul sarcinilor ionului dat. Deoarece majoritatea ionilor obinui n spectrometria de mas au o singur sarcin, termenul m/z este adeseori prescurtat la termenul mas. Aceast abreviere nu este tocmai corect n termeni strici, dar este des ntlnit n literatura de specialitate. In principiu spectrometria de masa consta in: a. obtinerea ionilor pozitivi (ionizarea probei); b. separarea acestor ioni in functie de raportul dintre masa si sarcina lor (m/e) (in general emaxim = 3); c. inregistrarea abundentelor relative ale ionilor. Diversitatea mare a ionilor care se formeaza este cauzata de transformarile pe care la pot suferi moleculele organice in spectrometrul de masa. Acestea pot fi redate in modul cel mai general prin urmatoarea schema: 1. Ionizarea:

36

ABCDEF + e- ABCDEF]+ + 2eIon molecular 2. Fragmentarea: a. fragmentarea ionului molecular: ABCDEF]+ AB] + CDEF]+ ABC] + DEF]+ ABCD] + EF]+ b. scindarea in continuare a fragmentelor ionice: ABCD] AB] + + CD c. fragmentari insotite de transpozitii: ABCDEF]+ ABCF]+ + DE ABF]+ + CDE Ionii radicali formati pot suferi in continuare fragmentari conform schemei a.; d. coliziuni ioni-molecule neutre: ABCDEF]+ + ABCDEF ABCDEFABCDEF]+ ABCDEFA]+ + BCDEF] Probabilitatea formarii ionilor de coliziune este mica si in general previzibila; e. formarea ionilor cu sarcina multipla: ABCDEF + e- ABCDEF]n+ + (n+1) e- , n3 Probabilitatea aparitiei acestor ioni este foarte mica si specifica anumitor clase de compusi; f. formarea ionilor negativi ABCDEF + e- ABCDEF]- ABCD]- + DEF] Acesti ioni se formeaza numai in anumite conditii. S-au notat cu A, B, C, D, E si F diferiti atomi sau grupari de atomi din molecula, iar cu ]+ , ]+, ] ionii-radicali, ionii pozitivi si radicalii la care nu se poate preciza pe care atom sau grupare de atomi se gaseste sarcina sau caracterul de radical. Cand se cunoaste exact pozitia sarcinii, aceasta se noteaza simplu, in dreptul atomului care o poarta.
+

37

III.2.2. Aspecte tehnice si aparatura

Indiferent de principiile care stau la baza construciei lor, orice spectrometru de mas trebuie s permit obinerea, separarea n funcie de m/z i nregistrarea ionilor pozitivi (uneori i negativi) proveni din fragmentrile compuilor organici. Cum n marea majoritate a cazurilor z=e=1, separarea i nregistrarea ionilor se face n funcie de masele lor. n figura III.1 este prezentat schema bloc a unui spectrometru de mas.

Figura III.1. Principalele componente ale unui spectrometru de mas

Scopul sistemului de introducere a probelor este de a introduce cantitti mici de prob (de ordinul micromolilor sau mai mici) n spectrometrul de mas, unde componenii sunt convertii ntr-un amestec gazos de ioni. Adesea, aceste sisteme conin dispozitive speciale de volatilizare a probelor solide i lichide. Sursa de ionizare a spectrometrului de mas convertete componenii probelor n ioni, prin bombardarea cu ioni, electroni, atomi sau fotoni. O

38

alternativ la acest tip de ionizare este obinerea direct a ionilor probei, prin ionizare termic sau electric. n unele cazuri sursa de ioni i sistemul de introducere a probei se gsesc cuplate ntr-un singur component. n ambele situaii, la ieire, proba se gsete sub forma unui curent de ioni pozitivi sau negativi (cel mai adesea pozitivi), care apoi este decelat n analizorul de mas. Rolul analizorului de mas este analog cu rolul reelelor de difracie din spectrometrele optice, n fapt, dispersia realizndu-se n acest caz pe baza raportului m/z a ionilor probei. Ca i spectrometrele optice, spectrometrele de mas cuprind un detector (pentru ioni) care convertete radiaia ionic ntr-un semnal electric, care este procesat, stocat n memoria unui calculator i afiat sau nregistrat n diferite variante. O caracteristic important a spectrometrelor de mas, care nu este gsit n cazul spectrometrelor optice (doar n cazul spectrometrelor electronice), este existena unui sistem de vidare, care menine o presiune joas (ntre 10-4 i 10-8 torri), n toate componentele aparatului, mai puin n sistemul de procesare i redare a semnalului.
III.2.2.1. Sistemul de introducere a probelor

In functie de volatilitatea si stabilitatea termica a probei, precum si de tipul sursei de ionizare, aparatul este prevazut cu diverse sisteme de introducere. Cantitatea de proba necesara pentru trasarea spectrului variaza intre 10-6 si 2mg in functie de tipul si caracteristicele aparatului, sistemul de introducere a probelor, masa moleculara, tipul sursei de ionizare. Prin cuplarea cromatografiei de gaz cu spectrometria de masa, gazele si lichidele pot fi introduse in aparat fara a mai fi izolate.
III. 2.2.2. Surse de ionizare utilizate n sistemul GC-MS

39

Spectrele de mas date de speciile moleculare sunt n strns legtur cu metoda folosit pentru producerea gazului ionic. Iniial formarea gazului ionic se baza pe bombardarea componenilor gazoi cu un fascicol de ioni. n ciuda ctorva dezavantaje ale acestei metode ea este nc de o importana major, mai ales c toate spectrele de mas care se gsesc n literatura de specialitate au fost realizate prin aceast tehnic. n ultimii ani, au fost realizate mai multe tipuri noi de surse, care ofer cteva avantaje fa de sursa clasic, (fascicul de electroni). n tabelul III.2 sunt prezentate cteva din sursele noi folosite n spectrometria de mas. n mod curent, spectrometrele de mas sunt echipate cu accesorii care permit utilizarea mai multor tipuri de surse.
Tabelul III.2. Surse de ionizare utilzate n spectrometria de mas Numele sursei Abrevierea Tipul de surs faz gazoas EI Ionizare cu fascicol de electroni faz gazos CI Ionizare chimic faz gazoas FI Cmp de ionizare desorbie FD Cmp de desorbie desorbie FAB Bombardare cu atomi rapizi desorbie LD Desorbie laser desorbie PD Desorbie n plasm Desorbie termic Ionizarea electrohidrodinamic Ionizare tip termospray EHMS ES ESI desorbie desorbie

Agentul de ionizare electroni energici ionii reactivului electrozi cu potenial nalt electrozi cu potenial nal atomi energici raza laser energia nalt de fisiune a 252 Cf temperatura cmp electric nalt difuzia de sarcini pozitive n picturile de soluie a probei

Functie de tipul sursei, ionizarea moleculelor organice se poate realiza pe mai multe ci. Cele mai importante tehnici de ionizare, care pot fi utilizate n tandem cu separarea cromatografic, includ: - ionizarea electronic (EI); - ionizarea chimic (CI); - ionizarea prin pulverizare in cimp electrostatic (ESI); - tehnici de desorbtie: - ionizarea prin bombardarea cu atomi rapizi (FAB); - ionizare prin desorbtie laser (LD); - ionizare prin desorbtie laser in prezenta unei matrici (MALDI);

40

- ionizare prin desorbtie in cimp electrostatic (FD); - ionizare prin desorbtie in plasma (PD). Efectul diferitelor tehnici de ionizare asupra fragmentarii moleculelor organice este diferit dar complementar (ceea ce sugereaza utilizarea a cel putin doua tehnici de ionizare pentru aceiasi molecula), asa cum se poate observa din figura de mai jos:

Ionizarea electronica (Electron impact ionization, EI)

Metoda de ionizare prin impact cu un fascicol energetic de electroni a fost mult timp singura utilizata in spectrometria de masa si inca se foloseste cu succes, mai ales in cazul compusilor nepolari, cu mase moleculare relativ mici (pana la 1000), volatili si stabili termic.
Sursele cu impact electronic (Figura III.2), se bazaez pe nclzirea unui

filament (Wolfram sau Reniu) aflat ntr-o camer vidat, care genereaz un fascicol de electroni cu energii foarte apropiate.

41

Figura III.2. Schema de principiu a unei camere cu ionizare cu impact de electroni

Electronii odata generati sunt apoi accelerati spre anod, urmind traiectorii elicoidale (datorita miscarii in cimpul magnetic generat de un magnet permanent):

Moleculele de gaz intalnite in incinta de ionizare interactioneaza cu fascicolul de electroni, cu formare de ioni ce pot fi separati si detectati pe baza raportului m/z. Energia fascicolului de electroni poate fi reglata intre 5-100 eV. Energia electronilor este controlat prin intermediul unui potenial de accelerare stabilit ntre catod i surs. Daca energia fascicolului de electroni este de 5-15 eV, din molecula este smuls un electron, luand nastere ionul molecular M+. Potenialul la

42

care apare ionul M + (eventual ali ioni dac M + este instabil) se numete potenial de apariie si este diferit in functie de structura compusului organic.

M + e M + + 2e Electronii rmai se distribuie ct mai uniform posibil pentru ocuparea orbitalei rmas vacant, slbind n acelai timp diferite legturi ale ionului molecular. Pentru realizarea spectrului de mas, proba este bombardat cu un fascicol de electroni cu energia de 70 eV. n aceste condiii, timpul de via al ionului molecular variaz ntre 10-14-10-4 secunde, el scindndu-se foarte repede la nivelul celor mai slabe legturi, dnd natere la un numr mare de fragmentri. Cu cat energia fascicolului de electroni este mai mare, cu atat numarul fragmentelor este mai mare, astfel incat pentru reproductibilitatea spectrelor este necesar sa se mentina aceeasi intensitate a fascicolului de electroni. Modurile de fragmentare sunt adesea dictate de structura ionului molecular ( M + ). Deoarece muli compui organici au potenialele de ionizare de la 7 la 20 eV, energia transferat n urma coliziunii dintre electroni i moleculele neutre este suficient s determine att ionizarea ct i fragmentarea multipl. Majoritatea ionilor formai prin acest proces au o singur sarcin, dar pot apare i fragmente moleculare cu sarcini multiple i chiar ioni cu sarcini negative. n cele mai multe cazuri ionii negativi reprezint doar o fraciune foarte mic din numrul total de ioni formai. Temperatura din aria de ionizare asigur meninerea n stare de vapori a probei, la o presiune de cca 10-5 torri. La aceast presiune drumul mediu liber al ionilor este suficient de mare, pentru ca numrul de coliziuni dintre ionii moleculari i molecule s fie ct mai redus la ieirea acestora din surs. Ionii pozitivi sunt scoi din aria de ionizare prin respingere electrostatic, electrodul avnd un potenial pozitiv mic, care i direcioneaz direct spre fanta de intrare n analizor. Fascicolul de ioni rezultat, focalizat, colimat i accelerat sub forma unui fascicol de ioni cu energii egale (sau foarte apropiate), este trimis spre analizorul spectrometrului. n spectrometrele moderne sursa de ionizare i analizorul operez la presiuni diferite. n aceste instrumente presiunea sursei de ionizare este mai mare

43

dect cea a analizorului, pentru care cea mai optim valoare a presiuni este de cca 10-7 torri. Avantajele EI: - tehnica de lucru foarte bine bine pusa la punct si cunoscuta; - exista deja baze de date privind fragmentarea compusilor organici; - se poate cupla cu GC; - se preteaza si pentru compusii insolubili sau nepolari. Dezavantajele EI: - necesita compusi volatili si termic stabili; - uneori nu furnizeaza ionul molecular; - nu se poate cupla cu LC; - se preteaza compusilor cu mase moleculare mici (<1000). Bombardarea moleculelor neutre cu un fascicol de electroni cu energii nalte, conduce la formarea de ioni-radicali moleculari cu exces de energie. Ionul molecular furnizeaz informaii utile despre identitatea moleculei definit prin masa molecular. Din pcate, n condiiile ionizrii electronice aceti ioni pot fi n unele situaii instabili pentru a putea genera un spectru, chiar i atunci cnd sunt utilizate fascicole cu energii joase (15-20 eV). n aceste condiii este necesar utilizarea unei alte metode de ionizare, mai puin energic, cum ar fi ionizarea chimic, n vederea obinerii informaiilor privind masa molecular.
Ionizarea chimica (Chemical Ionization, CI)

Ionizarea chimic este probabil cea de-a doua procedur foarte des ntlnit, pentru producerea ionilor n spectrometria de mas. Principiul metodei consta in utilizarea unui gaz reactant (CH4, NH3, NO, izobutan, etc), care este ionizat sub energia unui fascicol de electroni, iar ionii astfel formati, reactioneaza in continuare cu moleculele probei de analizat. Pentru obinerea ionizrii chimice, este nesesar modificarea ariei fluxului de electroni, artat n figura III.2. Practic, n aria de ionizare trebuie s se obin o presiune de cca 1 torr pentru gazul reactiv, n timp ce n analizor trebuie s se

44

menin o presiune mult mai scazuta, de cca 10-5 torri i totodat trebuie modificat i diametrul fantei de intrare n analizor. Cu aceste modificri, gazul reactiv este introdus n interiorul regiunii de ionizare n aa fel nct acesta s fie ntr-o concentraie de 103-104 mai mare dect concentraia probei.

Deoarece concentraia gazului reactiv este aa de mare, fascicolul de electroni va reaciona n exclusivitate cu moleculele gazului reactiv. n condiiile de presiune corespunztoare sursei de ionizare chimic, este favorizat producerea electronilor termali, care pot fi captai de moleculele sau fragmentele ion moleculare, cu o afinitate mare pentru electroni, conducnd la apariia ionilor moleculari cu sarcin negativ. Numrul de ioni negativi n acest caz poate fi cu dou sau chiar trei ordine de mrime mai mare dect n ionizarea cu impact de electroni (EI), facnd practic posibil utilizarea spectrometriei de mas prin ionizare chimic negativ ca o tehnic analitic viabil. Deoarece muli compui care sunt predispui la formare de ioni negativi sunt biologic activi sau substane toxice, spectrometria de mas cu ionizarea chimic negativ este o tehnic foarte important n studiile biomedicale i de mediu.

45

Unul din cei mai utilizai reactivi chimici de ionizare este metanul, care interacioneaz cu un fascicol de electroni cu energii mari (70eV), conducnd la o
+ + serie de ioni de tipul: CH 4 , CH 3+ , CH 2 , C 2 H 3+ . Aceti ioni, interaionez mai

departe cu moleculele neutre de metan conform schemei de mai jos:


CH4 e CH4 -H CH3 -H CH2

+ CH 4 + CH 4 CH 5+ + CH 3

CH 3+ + CH 4 C 2 H 5+ + H 2
+ CH 2 + CH 4 C2 H 3+ + H 2 + H

C2 H 3+ + CH 4 C3 H 5+ + H 2
Introducerea unor cantiti mici de prob n interiorul sursei (CI), declaneaz reacia dintre ionii gazului reactiv i moleculele neutre ale probei. Cele mai importante reacii sunt: - transferul de proton de la ionul gazului la molecula
+ neutr a probei, rezultnd astfel ionul molecular de tip XH 2 : + XH + CH 5+ XH 2 + CH 4

- transfer de sarcina:

XH + Y+ XH+ + Y
- adiia electrofil a ionilor gazului la moleculele neutre ale probei:

XH + Y + XH Y

- transferul anionului hidrur ( H ) de la molecula neutr a probei la ionul gazului reactiv:


XH + C2 H 5+ X + + C2 H 6

Ionii probei rezultai prin acest tip de ionizare conduc la un numr mult mai mic de fragmentri dect n cazul EI. Astfel ionizarea chimic (CI) este mult mai utilizat pentru determinarea maselor moleculare dect EI. Apariia i reproductibilitatea spectrelor de mas obinute prin ionizare chimic depind de o serie de factori i anume: condiiile de ionizare, temperatura

46

(n principal), presiunea i puritatea gazului reactiv. n general spectrele obinute prin CI nu sunt la fel de reproductibile ca cele date de sursele EI. Sursele de ionizare la presiunea atmosferic difer de celelalte surse deoarece n acest caz ionizarea se realizeaz la presiune atmosferic, n condiiile n care se stabilete un echilibru ntre ioni i moleculele neutre. Ionii reactivi sunt generai prin bombardarea unui gaz inert (N2), cu electronii generai de o placu de
63

Ni. Rezultatul este formarea unei plasme ce

conine ioni i electroni formai din ionizarea gazului purttor i de la reaciile ionmoleculelor urmelor de impuriti ce pot exista n acest gaz ( ap, O2, moleculele de solvent intrate n surs). Ionizarea moleculelor probei se realizeaz fie prin reacia direct cu electronii din plasm fie prin reacia ion-moleculelor impuritilor. n aceste condiii se pot forma, att ioni negativi ct i ioni pozitivi, prin adiia sau substituia anionului hidrur, prin schimbarea sarcinilor, prin captur de electroni i prin formarea de aduci cu ioni tip cluster.

Avantaje:
- furnizeaza ionul molecular; - permit cuplare cu GC; - se preteaza compusilor insolubili.

Dezavantaje:
- necesita compusi volatili si termic stabili; - se preteaza compusilor cu mase moleculare mici (<1000); - nu furnizeaza fragmentari ale probei. Tehnicile de ionizare prezentate mai sus necesit mai nti o vaporizare a probelor, excluznd practic posibilitatea analizei compuilor nevolatili i cu instabiltate termic ridicat precum i a probelor ionice. Pentru aceste tipuri de probe este indicat folosirea altor tehnici de ionizare i anume: bombardarea cu atomi rapizi (FAB), termosprayul i electrosprayul.
Ionizare prin bombardare cu un fascicol de atomi rapizi (Fast Atomic Bombardment, FAB)

47

n cazul bombardrii cu atomi rapizi, proba este mai nti dizolvat ntr-un solvent vscos (matrice), i apoi este bombardat cu un fascicol de particule cu vitez mare. Cel mai adesea aceste particule sunt atomi ai gazelor rare, argon (Ar) sau xenon (Xe), cu o energie cuprins ntre 2-10 KeV (Figura III.3). Fascicolul de atomi neutri rapizi de gaz rar se obtine intr-un tun, prin schimb de sarcina intre un fascicol accelerat de ioni si gaz neionizat, ex.: Ar Ar+ + eAr+ + Ar0 Ar0 + Ar+ Ulterior s-a apelat la utilizarea unui fascicol primar de ioni de Cs+ in locul fascicolului neutru de gaz (se obtine prin evaporarea unei sari de Cs). Fascicolul primar (atomi de gaz rar, sau ioni Cs+) cade pe suprafata probei sub un unghi de 60-70, iar ionii produsi sunt apoi extrasi si focalizati in analizor. Proba de analizat este dizolvata in matricea respectiva si se depune pe un suport metalic (cupru sau inox). Rezultatul impactului este difuzia materialului n faz gazoas printr-un moment de transfer, n care o parte din proba desorbit poate trece att n ioni pozitivi dar i n ioni negativi. Aceti ioni sunt apoi extrai din aria de ionizare i direcionai spre analizorul spectrometrului. Spectrul de mas este datorat formrii unor ioni de tipul [M + H ] i
+

[M H ]

uneori fiind posibil i formarea i unor ioni tip cluster, aceste specii

rezultnd din implicarea ionilor pseudomoleculari combinai cu un numr variabil de molecule neionizate din matricea solventului sau cu moleculele neutre ale probei.

48

Figura III.3. Schema unei surse de ionizare cu atomi rapizi

n cele mai multe cazuri difuzia i ionizarea produc un numr mic de fragmente ionice, dar suficiente pentru a obine informaii cu privire la structura i la masa molecular a probei. Ca matrice se folosesc lichide cu vascozitate mare si volatilitate scazuta, cu o presiune de vapori mica si in care proba sa fie cat mai solubila: alcool meta-nitro benzilic (MNBA), glicerol, tioglicerol, dietanolamina, trietanolamina, etc.

Avantaje:
- furnizeaza ionul molecular; - se preteaza compusilor labili termic; - se preteaza la compusi cu mase moleculare mari (>10000).
Practic metoda permite analiza unor compusi ionici, compusi cu mase moleculare mari si polimeri. Metoda este convenabila si pentru compusii instabili termic sau cu volatilitate scazuta, compusii fiind investigati in solutie.

Dezavantaje:
- necesita compusi solubili in matrix;

49

- sensibilitate scazuta; - nu furnizeaza fragmentari ale probei; - operare dificila.


Ionizarea prin pulverizare in camp electrostatic (Electrospray ionization, ESI)

Este o metoda recenta de ionizare, iar descoperirea acestei tehnici a condus la obtinerea premiului Nobel in chimie in 2002 de catre John Bennett Fenn. Pentru acest tip de ionizare este necesar ca substanta de analizat sa fie dizolvata intr-un solvent polar si volatil, de exemplu MeOH, MeCN, etc. Desorbtia ionilor din solutie se realizeaza prin pulverizarea si formarea unor picaturi foarte fine sub actiunea unei surse de energie termica, aerodinamica, electrica, sau o combinatie a acestora. Gazul care inconjoara picaturile furnizeaza energia termica necesara evaporarii solventului. Metoda opereaza la presiune atmosferica si temperatura mediului ambient. ESI presupune crearea unui camp electric prin aplicarea unei diferente de potential la nivelul capilarei prin care se pulverizeaza lichidul, cu ajutorul unor electrozi situati in imediata vecinatate. Fluxul de lichid va capata astfel o forma conica la iesirea din capilara (con Taylor), din care se vor desprinde apoi picaturile. Initial, la potential scazut, prin pulverizare se obtin picaturi de dimensiuni relativ mari, care nu permit desorbtia ionilor. Crescand potentialul aplicat capilarei, are loc o pulverizare continuu, sub forma unui grup de picaturi foarte fine de ioni pozitivi sau negativi, desprinse din conul de lichid format la capatul capilarei.

50

Avantaje:
- furnizeaza ionul molecular; - poate fi cuplata cu HPLC; - se preteaza compusilor labili termic; - operare usoara; - se preteaza la compusi cu mase moleculare mari (>100000).

Dezavantaje:
- necesita compusi polari solubili in solventi polari (MeOH, acetona, acetonitril); - metoda este sensibila la saruri; - nu furnizeaza fragmentari ale probei.
Ionizare prin desorbtie laser (LD) Ionizare prin desorbtie laser in prezenta unei matrici (MALDI)

In aceasta metoda, atat desorbtia, cat si ionizarea au loc sub influenta unei radiatii laser, fie in absenta, fie in prezenta unei matrici. Se utilizeaza doar tehnica

51

in pulsuri, in astfel de procese fiind mai probabila detectia speciilor [M+ metal alcalin]+ decat a speciilor [M + H]+. Formarea de cationi are loc prin reactii in faza gazoasa intre ioni si molecule. Ionizarea si desorbtia au loc printr-o combinatie de procese de excitare in faza solida, a unor procese de excitare electronica individuala si a unor reactii fotochimice. Cresterea puterii radiatiei laser are ca efect absorbtia ulterioara de energie de catre ioni, ceea ce poate conduce la un proces de fragmentare controlat.

In cazul analizei unor biomolecule cu mase moleculare foarte mari prin tehnica MALDI, substanta este inglobata intr-o matrice care trebuie sa absoarba puternic la lungimea de unda a laserului aplicat (acid nicotinic, p-nitroanilina, etc).

Avantaje:
- furnizeaza ionul molecular; - se preteaza compusilor labili termic; - se preteaza la compusi cu mase moleculare mari (>100000); - operare usoara.

Dezavantaje:
- necesita o mare varietate de matrice; - nu furnizeaza fragmentari ale probei.
Ionizare prin desorbtie in camp electrostatic (FD)

52

Metoda blanda de ionizare si desorbtie a ionilor formati pe suprafata unui anod metalic. Proba de analizat este depusa initial pe suprafata filamentului, ionizata sub aceasta forma, iar ionii formati de desorb ulterior. Formarea ionilor poate avea loc prin: - interactiunea cu electronii sub influenta campului electric - aditie de protoni sau cationi - ionizare termica-necesita incalzirea filamentului
Ionizare prin desorbtie in plasma (PD)

Pricipial metoda consta in desorbtia ionilor din substanta de analizat depusa pe o folie de aluminiu sau poliester acoperit cu aluminiu, sub influenta fragmentelor de fisiune generate de o sursa 252Cf plasata in spatele foliei respective. Particulele sub actiunea carora are loc ionizarea si desorbtia ionilor au energii foarte mari, aprox 100 MeV, fata de energiile de ordinul keV in cazul tehnicii FAB. Metoda se poate utiliza pt analiza unor compusi cu mase moleculare mai mari decat in cazul metodelor FAB. Moleculele de proteine fixate pe nitroceluloza se desorb fara fragmentare sau cu un grad mai redus de fragmentare decat in absenta acesteea.

III.2.2.3. Tipuri de analizoare utilizate n sistemul GC/MS

Ionii rezultai n sursa de ionizare trebuie mai nti separai n funcie de raportul m/z nainte ca acetia s ajung la detector. Aceast selecie este realizat cu ajutorul unui analizor de mas. Se cunosc mai multe tipuri de analizoare de mas care sunt utilizate frecvent n tandemul GC/MS, dintre care cele mai importante sunt: analizorul magnetic cu o singur focalizare, analizorul cu dubl focalizare, analizor tip quadrupol i analizor ion trap.In tabel sunt prezentate principalele tipuri de spectrometre de masa care difera ca principiu constructiv si functional intre ele.

53 Analizor Sectorial magnetic Quadrupol Triplu quadrupol Trapa de ioni TOF Q-TOF FTICR Pret + +++ ++ ++ ++ + Gabarit + +++ +++ +++ ++ ++ + Rezolutie ++ + + + ++ ++ +++ Domeniu de analiza ++ + ++ ++ +++ +++ ++

In ultimul timp s-au dezvoltat metode de analiza care folosesc doua sau mai multe spectrometre de diferite tipuri, inseriate intre ele, fie doua principii constructive diferite, incorporate in acelasi analizor si care opereaza consecutiv asupra ionilor formati, astfel incat performantele realizate sa fie cat mai bune. Separarea ionilor funcie de raportul m/z se realizez prin aciunea unui cmp electric i/sau magnetic. Puterea de rezolvare a spectrometrelor este o msur a abilitii acestor analizoare s fac distincie ntre dou fragmente ionice cu valorile raporturilor m/z foarte apropiate(rezoluia- relaia III.1). Spectrometrele de mas utilizate n tandemul GC/MS, sunt de dou tipuri : cu rezoluii medii ( R: 500-2.000) i cu rezoluii nalte (R: 10.000-75.000).

R=

M M

(III.1)

unde este diferena ntre masele corespunztore celor dou picuri adiacente, i

M este masa nominal corespunztoare primului pic.


Asupra ionilor pozitivi formai se exercit o for proporional cu sarcina lor i cu diferena de potenial dintre electrozi. Conform acestei dependene, putem scrie pentru un ion oarecare cu masa m:
F = e V = m v2 2 (III.2)

Din aceast relaie putem observa c ionii diferii care rezult n urma fragmentrilor vor avea energii cinetice egale. Posibilitatea variaiei n limite largi a

54

potenialului dintre electrozi permite reglarea cu precizie ridicat a vitezelor de ieire a ionilor din camera de ionizare. Analizorul de mas cu o singur focalizare (Figura III.5), este aezat ntre polii unui cmp magnetic Cmpul magnetic de intensitate H, este orientat perpendicular pe direcia de deplasare a ionilor i acioneaz asupra acestor cu o fora magnetodinamic centripet Fcp: Fcp = H z v (III.3) deteminnd curbarea traiectorie acestora. Acestei fore i se opune fora centrifug Fcf: Fcf = m v2 r (III.4)

unde r este raza de curbur a arcului de cerc descris de traiectoria particulei. Parametrii acestei traiectorii pot fi dedui prin egalarea celor dou fore: H zv = m v2 r (III.5) v= H zr m (III.6)

innd cont de relaia III.2 se obine: H 2 z2 r2 z V = 2m (III.7)


r=

2m V H2 z

(III.10)

m H 2 r2 = z 2V

(III.11)

Din realia III.11 se poate oserva c pentru anumite valori ale lui H i V, vor ajunge la fanta de ieire numai ionii cu un anumit raport m/z. Ionii cu m/z mai mari vor parcuge traiectorii cu raze mai mari, iar cei cu m/z mai mici vor parcurge traiectorii cu raze mai mici dect raza de curbur a aparatului, ciocnindu-se de pereii lui, ceea ce va determina descrcarea acestora. Prin varierea lui H sau a lui V se poate obine tot spectrul de mas. De obicei se variaz poteialul de accelerare V, care este fcut s scad continuu, ceea ce conduce la traversarea analizorului de ctre ioni cu mase din ce n ce mai mari. n acest mod cmpul magnetic, prin focalizarea ionilor pozitivi cu aceeai energie cinetic i clasific i difereniaz n fascicule dup raportul m/z.

55

Figura III.5 Schema unui analizor magnetic cu un singur fascicol

n general rezoluia unui spectrometru cu o singur focalizare este dat de relaia :


R= r s+w

(III.12)

unde: r este raza de curbur a tubului analizor ; s i w sunt diametrele fantelor de intrare i ieire din tubul analizor. Practic puterea de rezoluie a acestor spectrometre este mai mic dect 10000. Pentru decelarea defectelor de mas mici, n cazul unor fragmente grele, aceast rezoluie este insuficient. Spectrometrele cu o nalt rezoluie sunt cele cu dubl focalizare (Figura III.6), n care fascicolul de ioni de la surs, este mai nti focalizat printr-un analizor electrostatic, care micoreaz practic dispersia energiilor ionilor i apoi acetia sunt

56

focalizai ntr-un analizor magnetic, care realizeaz separarea ionilor n funcie de raportul m/z. Pentru ca dou fragmente cu m/z identice s ias exact n acelai timp din analizor, acestea trebuie s aib energii cinetice, respectiv viteze strict egale, la intrarea n tub. Datorit producerii ionizrii la distane diferite de sistemul de accelerare, precum i a vitezelor de translaie diferite ale moleculelor nainte de ionizare, energiile lor cinetice difer ntre anumite limite. Din acest motiv ionii cu acelai m/z nu vor focaliza exact n acelai punct, iar picurile oinute se vor li, conducnd n cazul a doi ioni de mase M i M+M la suprapunerea mai mult sau mai puin avansat a lor, n funcie de valoarea raportului M/M. ncepnd de la o anumit valoare a acestui raport cele dou semnale se vor suprapune complet.

57

Figura III.6. Schema de principiu a unui spectrometru de mas cu dubl focalizare de tip NilerJohnson

Pentru decelarea acestor ioni, ar trebui ca nainte ca ionii s ajung la analizorul de mas, acetia s fie separai n fascicule cu energii cinetice diferite. Aceasta se realizeaz prin trecerea fascicolului de ioni, dup accelerare, printr-un cmp electrostatic produs de armturile curbe ale unui condensator (Figura III.6). Raza de curbur a fascicolului de ioni n cmpul electrostatic este: rc = 2 V U (III.13)

unde U este tensiunea dintre plcile condensatorului i V este potenialul de accelerare al ionilor. Se poate observa c n realia III.13 nu apare masa ionului, deci rezult c traiectoria unui ion , pentru un U dat, depinde numai de V i prin

58

urmare numai de energia eV a ionului respectiv. n acest mod cmpul electrostatic, denumit i analizor electrostatic, clasific ionii numai funcie de energia lor. Variind potenialul de accelerare, vor ajunge la fanta de intrare n analizorul magnetic numai ionii ce posed aceeai energie (prima focalizare). Analizorul magnetic va separa n continuare aceti ioni funcie de masa m/z (a doua focalizare). Spectrometrele cu dubl focalizarea au o rezoluie de cca 70.000. Un alt tip de spectrometru de mas foarte rspndit n tehnic GC/MS, este spectrometrul cu timp de zbor sau spectrometrul impuls (Figura III.7).

Figura III.7. Schema unui spectrometru cu timp de zbor

Prin iradierea intermitent i instantanee (~ 2s) a probei cu un fascicol de electroni, se formeaz pulsuri de ioni cu aceeai energie cinetic. Aceti ioni zboar printr-un tub rectiliniu vidat, de o anumit lungime (cca. 1m). Timpul de zbor din punctul de pornire pn la colector este dat de expresia: tz = s v (III.14)

unde: s este spaiul de zbor i v viteza.innd cont de relaia III.3 obinem:

59

tz = s

m 2 zV

(III.15)

Meninnd constante s i V pe tot parcursul efecturii spectrului, tz se poate scrie ca fiind:


tz = K m z

(III.16)

unde K = s

1 2V

Timpul de zbor fiind proporional cu m/z, vor ajunge primii la detector, ionii care au masa cea mai mic. Puterea de rezoluie a acestor aparate este de cca. 1500. Viteza mare de efectuare a spectrului genereaz condiii optime de cuplare cu cromatografele de gaze. n ultimul timp linia tehnologic de producere a aparatelor de tip GC/MS sa concentrat n utilizarea ca detectori pentru spectrometrul de mas, a unor sisteme mai compacte i mai exigente privind scanarea i decelarea fragmentelor ionice ale probei ionizate, i anume analizorul quadrupol i analizorul ion trap. Analizorul quadrupol (Figura III.8) funcioneaz ca un filtru de mas, avnd un principiu de funcionare complet diferit fa de analizoarele magnetice. Acest tip de analizor, are avantajul unui timp de scanare foarte mic (mai mic de 100 ms), ceea ce l face foarte util pentru tandemul GC/MS, permind scanarea timpilor reali ai picurilor cromatografice. Este similar cu monocromatoarele utilizate n spectrometria optic, deoarece permite transmiterea la detector numai a ionilor cu m/z foarte aproiate, n timp ce ceilali ioni sunt neutralizai i transportai n alt direcie, ca molecule neutre.

60

Figura III.8. Schema unui detector tip quadrupol.

Prin variaia curentului electric ce trece prin analizor este posibil transmiterea unui pachet de ioni cu m/z variabile, astfel putndu-se realiza spectrul de mas prin scanare. Analizorul este alctuit din patru electrozi cilindrici conectai i dispui paralel, ntr-o arie circular sau hiperbolic (cazul ideal), conectai la o surs de radio frecve (RF) i curent continuu (CC). Electrozii opui au aceei polaritate. Micarea ionilor n interiorul acestor electrozi poate fi descris cu ajutorul unei ecuaii difereniale de ordinul II (realaia III.17). d 2x 2 z (U + V0 cos t )x = 0 (III.17) 2 dt m r2 unde termenul V0 cos t caracterizeaz sursa de radiofrecven i U este curentul de la surs. Aceast ecuaie este un exemplu tipic de ecuaie tip Mathieu, pentru care forma general este:

61

d 2x (a x + 2 q cos 2 )x = 0 d 2

(III.18)

unde este o funcie de timp (t/z).Aceast ecuaie are urmtorele soluii: a = 8 zeU mr 2 2 (III.19)

q = 4 zeV mr 2 2 (III.20) cu precizarea c 2r reprezint spaiul dintre electrozilor. Parametrii a i q sunt folosii mai ales n partea de construcie, n aa fel nct s se stabileasc i s se definesc exact spaiul n care ionii au o traiectorie stabil. Relaia dintre cei doi parametrii i raportul m/z se poate vedea printr-o reprezentare grafic ntr-un sistem de coordonate a i q (Figura III.9). Masele din interiorul ariei haurate sunt transmise la detector iar masele din afara acestei regiuni sunt pierdute, fie prin cderea lor direct pe electrozii quadrupolului , fie trecnd printre acetia.

62 Figura III.9. Diagrama stabilitii pentru analizorul quadupol i ion trap

n interiorul acestei regiuni, valorile m/z cresc odat cu scderea lui a iar la a =0 (n acest caz opereaz doar sistemul de radio frecven) sunt transmise toate masele. Maximul diagramei (punctul X), este caracterizat prin ndeplinirea condiiei de rezoluie maxim, deoarecece n aceste condiii sunt transmise doar cteva mase. Dac s-ar lucra n condiiile date de acest maxim, ar trebui s se aleag practic ntre transmiterea tuturor ionilor i ntre o rezoluie nalt. n cazul analizorului quadrupol puterea de rezolvare este o simpl multiplicarea a masei (de obicei 2m), astfel c acest analizor este n esen un dispozitiv cu rezoluie medie. Linia de scanare (AB), reprezint intervalul n care variind U i V n aa fel nct raportul acestora s rmn constant, ionii ajuni n spaiul quadrupolului au o traiectorie stabilizat i direcionat spre detector. Analizoarele tip quadrupol, pot separa i mase peste 3000-4000 m/z. Aceste instrumente separ ionii ca diferene de mas printr-o unitate. Progresele n tehnologia ion trap au revoluionat tehnica i aparatura n sistemele integrale de tipul CG/MS. n mecanismul ion trap (Figura III.10) anionii i cationii n faz gazoas pot fi formai i meninui pentru un inteval de timp, cu ajutorul unui cmp electric i /sau magnetic. n ultimul timp au fost realizate mai multe tipuri de astfel de analizoare, dar dintre toate doar dou sunt curent utilizate n spectrometrele de mas. Dintre acestea ca detector n tehnica cuplat GC/MS se folosete analizorul ion trap simplu. Practic analizorul ion trap este un analizor quadrupol n dou dimensiuni. De altfel principiul de funcionare poate fi explicat tot cu ajutorul relaiei III.18, cu referire la parametrii a i q ce caracterizeaz diagrama de stabilitate (Figura III.9). Acest tip de analizor const din cte dou perechi de electrozi de forme diferite i roluri diferite (doi electozi circulari i doi electrozi end-cap). Ionii sunt formai n interiorul capcanei prin pulsuri electronice generate de un filament, i sunt

63

Figura III.10. Shema unui analizor ion trap

reinui n aceast regiune stabil (n lungul liniei a=0). Spectrul de mas este obinut prin generarea condiiei de instabilitate, prin creterea potenialului V, fiecrui ion, peste valoarea de stabilitate (q = 0,91- linia de scanare AC). Astfel, ionii sunt eliminai secvenial prin unul din electrozii end-cap direct spre detector. Aceasta este n contrast cu modul de operare al quadrupolului, unde ionii dup ce urmeaz traiectorii stabile sunt detectai. Prezena unui gaz purttor la o presiune de cca 10-3 torri, ajut la meninerea unei rezoluii adecvate (He, folosit drept faz mobil pentru cromatografia de gaze capilar este foarte bun n acest scop) n trap este posibil i producerea reaciilor de ionizare chimic3. Astfel, reactivul gazos de ionizare chimic este introdus la o presiune relativ joas i plasma format poata fi inut n trap pentru o perioad mai mare de timp.

64

III.2.2.4. Detectorii de ioni.

Cei mai utilizai detectori n spectrometrul de mas se bazeaz n general pe fenomenul de multiplicare electronic (Figura III.11).

Figura III.11. a) detector cu ir discret de diode b) detector cu diod continu

65

Acestea pot fi constituite fie dintr-un ir discret de diode, fie din diode continue. Ambele tipuri utilizeaz emisia de electroni secundari pentru amplificarea semnalului dat de ioni. O serie de diode pe baza unor alije de Be-Cu (n mod obinuit 12-20) sunt aranjate aa cum este prezentat n figura III.11. Fascicolul de ioni ajunge pe prima diod din aceast serie discret, i produce electroni secundari, care sunt accelerai ctre urmtoarea diod producndu-se astfel o cascad de electroni secundari,care sporesc cu mult semnalul ionic iniial. Diodele sunt meninute la un potenial pozitiv prin intermediul unei reele de rezistori. Curentul obinut este apoi convertit i trimis la un amplificator. Amplificatorul este de asemenea constituit dintr-un sistem de diode, fiecare dnd natere uneii emisii de electroni (multiplicatori electronici). Dup amplificare, curentul obinut este trimis la un sistem de procesare i conversie, urmnd ca apoi s se nregistreze spectrul propriu-zis. Vizualizarea spectrului rezultat se poate face fie prin intermediul unui nregistrator, fie cu ajutorul ecranului unui calculator.
IIII.2.2.5. Tipuri de interfee pentru sistemul GC/MS

Partea cea mai important pentru aceste categorii de sisteme este interfaa care realizeaz legtura dintre cele dou instrumente. Problemele care apar n interpunerea coloanei cromatografice la spectrometrul de mas sunt legate de diferenele de curgere ale gazelor purttoare din cele dou instrumente i de necesitatea obienrii unor informaii despre probe n afar interferenelor date de faza mobil n care aceasta este diluat. Sistem integral GC/MS este unul din cei mai favorizai n aceast privin, deoarece, de multe ori faza mobil (comun n multe cazuri) nu nflueneaz observarea spectrelor, i existena probei n faz gazoas, este compatibil cu varietatea tehnicilor de ionizare utilizate n spectrometria de mas. Prima incompatibilitate n acest caz este diferena de presiune la care lucreaz cele dou instrumente. Astfel, introducerea probei n coloana

66

cromatografic se face la presiunea atmosferic iar sursele de ionizare din spectrometru opereaz de regul n intervalul 2-10-5 torri, pentru ionizarea chimic i respectiv, electronic. De aceea interfaa trebuie s fie capabil s realizeze o scdere adecvat a presiunii ntre cele dou instrumente i de asemenea s sporeasc trecerea probei meninut n faz mobil n raport cu presiunea de operare a sursei de ionizare. Interfaa ar trebui s nu permit introducerea unui volum suplimentar de gaz purttor de la coloana cromatografic i n acelai timp s nu degradeze sau s modifice chimic constituienii probei. Spectrometrele de mas moderne cu sistem de vacuum diferenial, permit utilizarea unor coloane n care vitezele de curgere spre sursele de ioni variaz ntre 1-2 mL/min. Aceste viteze de curgere sunt compatibile cu cele corespunztore coloanelor tubulare deschise din cromatografia de gaze, dar sunt mai mici dect vitezele tipice ale coloanelor tip pachet. Au fost realizate mai multe tipuri de interfee care ndeplinesc destul de bine condiiile mai sus menionate. Utilizarea acestora n sistemul GC/MS depinde n mare msur de circumstanele experimentale. Coloanele care asigur debite de 1-2 mL /min, spre sursa de ioni sunt compatibile cu sistemele de vacuum ale spectrometrelor de mas moderne. Acestea sunt, de asemenea, debite optime pentru coloanele capilare deschise de tip tubular, de dimensiuni convenionale i de aceea cuplarea unor asemenea coloane la un spectrometru de mas prezint foarte puine probleme. Datorit flexibilitii, ineriei chimice i rezistenei crescute, coloanele din silice topit cu faz imobilizat, adeseori sunt cuplate direct la sursa de ioni prin intermediul unui dispozitiv foarte simplu de cuplare la vid i unui suport pentru susinerea coloanei. Acest dispozitiv permite ajustarea poziiei coloanei fa de sursa de ioni pentru obinerea unei ionizari eficiente. Proba este transferat cantitativ la sursa de ionizare, dar performaa coloanei capilare poate fi compromis de cderea de presiune, timpii de reinerea ai componenilor variind cu modificarea presiunii sursei. O alt modalitate de realizare a cuplrii ntre cele dou instrumente se bazeaz pe un reductor al debitului la intrarea n spectrometrul de mas i a unei

67

valve speciale care acioneaz ca un divizor de debite. Aceast interfa este mult mai viabil dect cea descris anterior deoarece poate opera cu o varietate de viteze de curgere, permind schimbarea coloanelor cu uurin i sunt prevzute cu o cale secundar de ndeprtare a unor volume mari de solveni sau reactivi corozivi din spectrometrul de mas. Dezavantajele acestor interfee sunt date de posibilitatea introducerii unui volum suplimentar de gaz purttor precum i de posibilitatea degradrii compuilor termic instabili, pe suprafeele metalice fierbini ale valvelor. De cele mai multe ori este preferabil utilizarea unor sisteme de cuplare de tip open split n locul interfeelor de tip valv. Interfaa de tip open split n esen const dintr-un tub cu volum suplimentar mic, interpus ntre coloana capilar sau reductorul capilar i spectrometrul de mas, formnd practic o fant de trecere ntre cele dou instrumente. n unele cazuri reductorul capilar pentru spectrometru, are un diametru foarte apropiat cu cel al diametrului interior al coloanei cromatografice astfel c este posibil cuplarea direct a celor dou capilare printr-o simpl etaneizare. Acest fapt face posibil o minimalizare a proceselor de adsorbie la interfa i nltur fenomenul de diluie realizat de eluentul coloanei n reductorul capilar al spectrometrului. Acest tip de cuplare permite meninerea unei viteze de curgere constant a gazului purttor de la coloan cromatografic, independent de viteza de curgere prin aceasta. n aceste condiii, cantitatea de prob care intr n spectrometru depinde de raportul dintre viteza de admisie n sursa de ionizare, (care este fixat n functie de capacitatea de admisie a capilarei cromatografice, de conductana sursei, de temperatur i de gazul purttor) i viteza de curgere n coloana cromatografic, a eluentului. ntreaga cantitate de prob este transferat n spectrometrul de mas doar dac viteza de curgere la ieirea din coloana cromatografic este egal cu viteza de curgere la intrarea n reductorul capilar al spectrometrului. Dac viteza de curgere din coloan este mai mare dect la intrarea n sursa de ionizare, o parte din prob este pierdut la interfa i nu mai ajunge n spectrometru. Dac viteza de curgere este mai mic, apare fenomenul de diluie prin creterea cantitii de gaz intrat in spectrometru, iar masa de prob ajuns la sursa de ionizare este mult mai redus.

68

Interfaa poate opera ca o fant conectat la un detector secundar. Un alt avantaj al interfeei de tip open split este dat de faptul c, ntotdeauna captul coloanei se afl la presiune atmosferic ceea ce face ca timpii de reinere s fie reprobuctibili. Aceste tipuri de interfee au o fiabilitate mare, permind utilizarea mai multor tipuri de coloane i diferite viteze de curgere. Coloanele pot fi uor schimbate fr a afecta parametrii de funcionare ai spectrometrelor de mas. Cantitatea de prob care rmne la interfa este constan indiferent de programul de temperatur folosit pentru separare, dac viteza de curgere a gazului purttor este foarte atent controlat prin intermediul unui flow controler, i dac interfaa este nclzit cu aceeai vitez ca i coloana cromatografic (interfa se gsete n termostatul cromatografului de gaze). Practic interfaa trebuie s aib un rol de separator molecular. Performaele separatorilor moleculari sunt date de eficiena (Y) i capacitatea de separare (N) a acestora. Eficiena este definit ca raportul dintre cantitatea de prob intrat n spectrometru i cea intrat n coloan (n procente), i reprezint capacitatea acestora de a permite trecerea probei n interiorul sursei de ionizare a spectrometrului. Factorul de separare (N) este definit ca raportul dintre concentraia probei n faza mobil la intrare n spectrometru, i concentraia probei n faza mobil la intrare n coloana de separare. Factorul de separare variaz n raport cu tipul de separator folosit, cu viteza de trecere a fazei mobile prin coloana cromatografic i depinde de eficiena sistemului de vacuum a sursei de ionizare i de masa molecular a probei. ntre cei doi factori ce caracterizeaz performaa unui separator molecular, exist relaia : N = (Y 100)(VGC VMS ) volumul gazului purttor la intrarea n spectrometru. Cei mai obinuii separatori moleculari utilizai n acest sistem integral sunt separatorul prin efuzie (Watson-Biemann), separatorul tip jet i separatori cu membrane(Figura III.12). (III. 21)

unde VGC este volumul fazei mobile care intr n coloana cromatografic i VMS

69

Figura III.12 Tipuri de interfee utilizate n sistemele integrale GC/MS. A) Separator prin efuzie; B) Separator tip jet; C) Separator membran.

Separatorul Watson-Biemann, const dintr-un tub de sticl sinterizat cu o porozitate ultrafin, introdus ntr-o incint vidat i termostatat. Tubul este prevzut cu capilare din sticl la ambele capete prin intermediul crora se realizeaz reducia debitului de gaz purttor. Presiunea din interiorul incintei este

70

de civa torri i debitul la care proba efuzeaz prin porii fritei este invers proporional cu masa molecular la 1/2 i proporional cu presiunea parial a fiecrui component din prob.Variind viteza de curgere a gazului purttor prin acest tub, se poate realiza o separare a probei din faza mobil, prob care ajunge apoi la spectrometrul de mas. Separarea n acest caz este influenat att de temperatur ct i de debit, optimizarea acestor parametri fcndu-se empiric. Separatorul tip jet este foarte mult utilizat n cazul separatorilor cu pachet de coloane. Efluentul de care vine de la cromatograf este obturat prin intermediul unui orificiu foarte fin, cnd practic el expandeaz n interiorul unei camere vidate nclzite. n timpul acestui proces de expandare, moleculele gazului purttor difuzeaz rapid, departe de centrul jetului supersonic, separndu-se de moleculele mai grele ale probei. Poziia i diametrul acestui orificiu, precum i spaiul relativ de expansiune al jetului sunt deosebit de importante pentru o separare corespunztoare. Normal acest separator este realizat ntr-o manier care permite obinerea un maxim de separare doar pentru debite apropiate ale gazului purttor, n ambele instrumente. Seperatorul cu membran siliconic funcioneaz pe principiul permeabilitii difereniate, dintre moleculele solutului organic i a gazului purttor. Cantitatea de prob transmis prin membran este direct proporional cu solubilitatea i difuzia solutului prin membran, cu aria membranei, cu presiunea de la suprafaa membranei i invers proporional cu grosimea membranei. Trecerea moleculelor organice prin memebran, poate fi cu dou ordine de mrime mai mare dect a moleculelor gazului purttor. Suprafaa membranei care vine n contact direct cu eluentul gaz cromatografic, este expus la o presiune ridicat. Pentru a nu periclita rezoluia coloanei cromatografice nainte de a ajunge la membran, eluentul este mai nti introdus ntr-o camer mic care vine n contact direct cu membrana. Rolul acestei caviti este de a minimaliza presiunea la suprafaa membranei. Suprafaa membranei, grosimea i timpul de contact sunt parametrii critici ai acestor membrane iar temperatura reprezint un parametru operaional deosebit de

71

important. O separare eficient se obine la o temperatur relativ joas a separatorului, nsoit totodat i de meninerea integritii coloanei de separare. Pn n prezent nu s-a gsit un separator ideal pentru toate situaiile. Aa cum se poate vedea i n tabelul III.3, la prima vedere separatoarele tip membran pot fi considerate ca fiind foarte utile. Acestea sunt caracterizate printr-un factor de separare destul de mare i totodat permit coloanelor s funcioneze separat de spectrometru de mas, astfel c ambele instrumente pot fi optimizate individual.
Tabelul III.3 Performanele separatorilor moleculari Proprieti specifice Efuzie (Waston-Bieman) Eficiena (%) 20-30 Factorul de separare 4-7 Viteza de curgere a gazului 10-30 purttor (mL/min) Temperatura. 350 (limita superioar 0C)

Jet 30-70 6-14 15-25 300

Membran 30-80 10-30 1-60 255

Din pcate, perfomanele acestor membrane sunt critic influenate de temperatur. Acestea au o temperatur optim de transmisie pentru fiecare compus organic prin seciunea lor. La o temperatur mai sczut dect temperatura optim poate apare condiia de distorsionare a picurilor cromatografice iar operarea la o temperatur relativ joas exclude practic analiza compuilor cu o volatilitate sczut. Separatoarele tip jet i prin efuzie, necesit un echipament auxiliar de vacuum i sunt eficiente doar pentru viteze de curgere apropiate pentru ambele instrumente.
IIII.2.2.6. Puterea de rezolutie a spectrometrelor de masa

Rezolutia in spectrometria de masa se refera la posibilitatea de a distinge ionii cu mase apropiate, respectiv un ion cu masa m, fata de unul cu masa m+m. Spectrometrele de masa cu rezolutii bune permit separarea semnalelor cu mase foarte apropiate.

72

Exista mai multe posibilitati de caracterizare a rezolutiei unui spectrometru de masa, cea mai des intalnita fiind ca raport m/m, unde m este masa ionului al carui semnal il consideram si m diferenta de masa, respectiv distanta fata de un semnal vecin de aceeasi intensitate cu care se intrepatrunde, astfel incat minimul curbei se situeaza la 10% din inaltimea celor doua semnale.

In figura de mai sus m = 900 si m = 0,208, ceea ce determina o rezolutie m/m = 4327. Rezolutia se mai poate exprima si in functie de un singur semnal, respectiv largimea acestuia la 5% sau 50% din intensitate, iar in cazul instrumentelor TOF si a celor cu trapa de ioni se ia in calcul largimea semnalului la jumatate din intensitatea maxima. In functie de rezolutie, spectrometrele pot fi: -cu rezolutie scazuta (m/m~ 200); - cu rezolutie medie (m/m= 500-5000); - cu rezolutie inalta (m/m >10000) permit determinarea masei moleculare exacte.

73

Pentru a separa doua molecule cu masele de 400 si 401, este nevoie de un aparat cu rezolutia de m/m = 400/1 = 400. Pentru a separa semnalele O2 (M = 31,9898) si S (M = 31,9721): m = 0,0177, deci necesita un aparat cu o rezolutie m/m = 31,9898/0,0177 = 1806. Pentru a separa semnalele C8H13N (M= 123,094799) si C7H11N2 (M= 123,092223): m = 0,002576, deci este necesar un aparat cu o rezolutie m/m = 123,094799/0,002576 = 47748.

III.3. Monitorizarea datelor n spectrometria de mas


Cele mai moderne spectrometre de mas cu sistem de introduce a probelor tip coloan cromatografic sunt prevzute cu calculatoare de mare putere sau microprocesoare. Acestea sunt alctuite din: sistemul de achiziie a datelor i instrumentul de control; procesorul de date care permite realizarea: substragerii automate a backgroundului, normalizarea parametrilor, formatarea, calibrarea, tiprirea i afiarea precum i identificarea spectrelor de mas cu ajutorul metodei de cutare n banca de date din memoria calculatorului. Componentele tipice ale unui spectrometru de mas /sistem de date sunt prezentate n figura III.3.1. Convertizorul digital analog (ADC) are rolul de a transforma semnalul primit de la amplificatorul spectrometrului ntr-un ir de semnale digitale discrete, compatibile cu procesorul calculatorului (conversia maselor i intensitilor). Aceste semnale sunt apoi sortate pentru editarea i vizualizarea rspunsului, prin intermediul unui monitor, n timpul achiziionrii datelor, asfel c procesele pe care le sufer proba pot fi uor urmrite chiar n timpul analizei. De asemenea rspunsul poate fi tiprit prin intermediul unei imprimante, n diferite variante (spectrul de mas, mass-cromatogram, tabel de date cu masele fragmentelor i intensitatea curentului ionic total).

74

Figura III.3.1. Diagrama bloc a unui sistem GC/MS

Un astfel de sistem integral GC/MS, ntr-o singur operaie poate genera cteva sute de spectre de mas, cu acces consecvent i rapid la placa de baz, n vederea nregistrrii spectrelor de mas pentru procesri secveniale. Multe din sistemele de date nu sunt doar simple uniti funcionale, pasive la informaiile achiziionate Aceste sisteme sunt prevzute i cu o unitate de control care opereaz n regim invers cu sistemul analog digital de conversie (DAC) fcnd practic posibil trecerea instruciunilor de la calculator la spectrometrul de mas. Viteza de scanare, intervalul de mas studiat, rezoluia, programul de temperatur pentru coloana cromatografic, modul de ionizare, viteza de curgere a gazului inert sunt doar civa din parametrii operaionali care pot fi selectai i optimizai prin intermediul keyboardului calculatorului.

III.4. Interpretarea spectrului de masa


Un spectru de masa este o interpretare grafica a ionilor detectati de spectrometrul de masa. Spectrul apare sub forma unui grafic in axele de coordonate

75

x,y, unde pe axa x este redat raportu masa/sarcina (m/z) iar pe axa y intensitatea generata de ion. Odata inregistrat, spectrul de masa se analizeaza dupa anumite reguli, furnizind informatii importante cu privire la structura substantei analizate. In prima instanta se determina abundentele relative ale semnalelor prin masurarea inaltimilor lor, se identifica ionul molecular (acolo unde exista), picul de baza si principalele fragmente. Picul de baza este semnalul cel mai intens si i se atribuie conventional valoarea 100%. El da indicatii asupra principalei reactii de fragmentare din molecula. Intensitatile celorlalte semnale se exprima in procente fata de picul de baza. De obicei, ultimul semnal important este ionul molecular (M), care ne da masa moleculara a substantei. Intotdeauna, dincolo de M, apar semnale si la M+1, M+2, si in unele cazuri si M+4, M+6, etc. Aceste semnale isi au originea in prezenta izotopilor mai grei in structura compusilor respectivi. Intensitatea acestor semnale se considera in raport cu intensitatea lui M, care de aceasta data se considera ca are valoarea 100. Nu se vor omite o serie de semnale mici sau mijlocii care sunt caracteristice unor fragmente deosebit de importante pentru interpretarea spectrului (fragmente cheie). Nu se omit de asemenea picurile furnizate de ionii metastabili si ionii dublu incarcati. Regla azotului: o molecula a carei masa moleculara este un numar par trebuie sa contina un numar par (sau nul) de atomi de azot; o masa moleculara impara dovedeste ca in molecula avem un numar impar de atomi de azot. In figura III.4.1. este prezentat spectrul de masa al acetofenonei, ca exemplu reprezentativ. Se observa ca ionul molecular apare in spectru la m/z 120, avind o intensitate mare (37%). Picul de baza (100%) apare la m/z 105 si se datoreste unei fragmentari alfa la nivelul gruparii functionale carbonil. Acelasi tip de fragmentare, dar in partea opusa a gruparii carbonil, explica si picul da la 77 (86%). Ionii cu intensitate mai mica de la m/z 51, 43 si 39 se datoresc fragmentarii nucleului aromatic.

76
O CH3 m/z 120 105 77 Int. 37 100 86

Figura III.4.1. Spectrul de masa al acetofenonei

Se observa ca ionul molecular apare in spectru la m/z 120, avind o intensitate mare (37%). Picul de baza (100%) apare la m/z 105 si se datoreste unei fragmentari alfa la nivelul gruparii functionale carbonil, cind se genereaza un ion benzoil. Acesta din urma elimina o molecula neutra ce CO si genereaza picul intens de la m/z 77 (86%). Acest din urma pic se poate explica si printr-o fragmentari alfa tot la nivelul gruparii carbonil, dar in partea opusa fragmentarii anterioare (care explica si explica si picul da la mz 43). Ionii cu intensitate mai mica de la m/z 51 si 39 se datoresc fragmentarii nucleului aromatic, figura III.4.2.
O CH3 m/z= 120 - CH3 m/z= 105 O + - CO m/z= 77

- H3C C O m/z= 43

Figura III.4.2. Schema reactiei de fragmentare a acetofenonei

77

Tipuri de ioni 1. Ioni metastabili

In functie de propria energie, un ion cu masa m1 format in camera de ionizare poate sa se comporte in urmatoarele moduri: a) ajunge la detector fara a suferi procese de fragmentare si este detectat ca ionradical cu masa m1; b) sufera un proces de fragmentare in interiorul camerei de ionizare, cu formarea unui ion m2, care va fi detectat ca atare; c) sufera procesul de fragmentare dar dupa accelerare si inainte de detectare. Astfel de ioni se numesc ioni metastabili, ca urmare a comportamentului lor din punct de vedere a stabilitatii, intermediar intre ionii de tip a) si b). Ionii metastabili determina aparitia in spectru a unor semnale metastabile, corespunzatoare unei mase m* data de expresia: m* = (m2)2/m1 unde: m1 masa ionului initial; m2 masa ionului nou format. Ionii metastabili dau de obicei semnale de mica intensitate si semnalu este largit, ceea ce-i face usor de recunoscut in spectru si dau informatii cu privire la modul de fragmentare a unui compus, fig. III.4.3.

Figura III.4.3. Semnalele datorate unor ioni metastabili (*) in spectru EI-MS.

78

Din valorile lui m*, tinand cont si de celelalte picuri existente in spectru, se pot determina valorile lui m1 si m2. Beynon a intocmit tabele cuprinzand toate perechile de m1 si m2 care corespund aceleeasi m*, pentru valori cuprinse intre 1 si 500.
2. Ioni cu sarcina multipla

Atunci cand energia furnizata de fascicolul de electroni este suficient de mare, compusii cu electroni sau p pot furniza ioni cu mai multe sarcini pozitive. M + e- Mn+ + (n+1) e- , n3 Cei mai importanti ioni sunt cei dublu incarcati, acestia putand fi recunoscuti astfel: - cei cu mase impare vor furniza semnale la mase fractionare; - cei cu mase pare vor furniza semnale datorate izotopului 13C la 0,5 unitati de masa mai sus decat valoarea masei lor (exista un raport bine stabilit si intre intensitatile celor doua semnale).
Picuri izotopice

Aceste semnale isi au originea in prezenta izotopilor mai grei in structura compusilor respectivi. Izotopii vor intra in componenta moleculelor in aceeasi proportie in care sunt raspanditi in natura. In tabelul de mai jos sunt prezentate abundentele relative ale elementelor ce intra in structura compusilor organici.

79

Elementele care contribuie semnificativ la aparitia semnalelor M+1 sunt izotopii


2

H,

13

C,

15

N si

33

S, iar pentru semnalele M+2 sunt izotopii

18

O,

34

S,

37

Cl si

81

Br.

Cum izotopii hidrogenului sunt in foarte mica proportie raspanditi in natura, se poate neglija influenta pe care o au asupra spectrelor de masa. In general pentru o molecula cu n atomi de carbon, abundentele relative ale semanlelor M+1 si M+2, pot fi calculate prin rezolvarea binomului (a+b)n, Unde: a abundenta izotopului 12C b abundenta izotopului 13C Facand calcule pentru n=3 si impartind prin 10000 pentru ca suma lor totala sa fie 100, obtinem: Ioni Intensitati relative Numarul atomilor de 13C Cu cit numarul de atomi de carbon (si de azot) din molecula este mai mare, cu atit abundenta maximului M+1 este mai mare, vezi tabelul de mai sus. 0 1 2 3 M 96,712 M+1 3,25 M+2 0,0364 M+3 0,136 x 10-3

80

Asa dupa cum am mai spus, elementele care contribuie semnificativ la aparitia semnalelor M+2 sunt izotopii
18

O,

34

S,

37

Cl si

81

Br. Un compus care

contine clor va contine un maxim M+2 cu o intensitate de aproximativ o treime din intensitatea ionului molecular M ( comform abundentei izotopilor 35Cl si 37Cl), iar o substanta cu brom un maxim M+2 cu o intensitate aproape egala cu intensitatea ionului molecular M (abundenta izotopilor 79Br si 81Br este aproape egala). In ceea ce priveste semnalele de la masele M+4, M+6, etc, acestea se datoreaza prezentei mai multor atomi de S, Cl sau Br si sunt prezentate in tabel in precente % fata de intensitatea ionului molecular. Halogen prezent Br Br2 Br3 Cl Cl2 Cl3 BrCl Br2Cl BrCl2 100 100 100 100 100 100 100 100 100 97,7 195,0 293,0 32,6 65,3 99,8 130 228 163 95,5 186,0 10,6 31,9 31,9 159 74,4 93,4 3,47 31,2 10,4 M% M+2 M+4 M+6

Tinind cont de datele de mai sus pentru picuri izotopice si utilizind tabelele lui Beynon pentru formule moleculare posibile, se poate determina formula moleculara probabila pentru un compus. Beynon a calculate valorile lui M+1 si M+2 pentru compusi continand in molecula C, O, H, N si cu mase mergand pana la 250. Calculele au fost facute atat pentru formule cu o anume semnificatie, cat si pentru formule care nu au o semnificatie rationala. In tabelul de mai jos sunt citeva exemple.

81

82

IV. REGULI GENERALE DE FRAGMENTARE IN SPECTROMETRIA DE MASA


IV. 1. Introducere IV.2. Reactii de fragmentare IV.2.1. Fragmentari simple IV.2.2. Fragmentari insotite de transpozitia unui atom de hidrogen IV.2.3. Fragmentari complexe IV.2.4. Fragmentari insotite de transpozitia a doi atomi de hidrogen IV.2.5. Fragmentari insotite de transpozitii de schelet IV.2.6. Ioni importanti rezultati in urma reactiilor de fragmentare

83

IV. REGULI GENERALE DE FRAGMENTARE IN SPECTROMETRIA DE MASA


IV. I. Introducere
Ionii moleculari se pot fragmenta in diferite moduri, viteza fragmentarii fiind in functie de structura acestora, si de taria legaturilor prezente, acestea nescindandu-se cu aceeasi usurinta. Fie E energia de ionizare si E +E energia de fragmentare: - daca E +E >> E , ionul molecular este stabil si furnizeaza un semnal important in spectrul de masa. - daca E +E ~ E, ionul molecular odata format se va scinda foarte repede, furnizand diferite fragmente. Prima alternativa o intalnim in cazul compusilor care se pot stabiliza prin delocalizarea sarcinii pozitive, iar cea de-a doua, in cazul compusilor la care sarcina pozitiva este greu de stabilizat. Numarul si abundentele diferitelor fragmente ionice ce apar in spectrul de masa depind de: - instabilitatile relative ale legaturilor din ionul molecular (taria relativa) - stabilitatile relative ale fragmentelor ionice ce se formeaza - stabilitatea unor fragmente neutre care se elimina din ioni - probabilitatea tranzitiilor care decurg printr-un proces ciclic de rearanjare, implicand deplasari de legaturi si transferuri de atomi de hidrogen - probabilitatea formarii ionilor de coliziune Exista o asemanare intre procesele care se produc in spectrometrul de masa si descompunerea termica a compusilor organici. Cateva reguli generale care permit sa se intrevada modul in care se vor fragmenta compusii organici au fost enuntate tinand cont de efectele inductive, electromere, de polarizabilitate cunoscute din chimia organica.

84

Se va nota cu

-deplasarea unui singur electron -deplasarea a doi electroni

1. Intensitatea relativa a semnalului furnizat de ionul molecular este maxima la compusii liniari si scade proportional cu cresterea gradului de ramificare, fragmentarile producandu-se mai usor si preferential la atomii de carbon cei mai substituiti. Aceasta este in concordanta cu seria stabilitatii carbocationilor: Cp < Cs < Ct; 2. Dintre mai multi substituenti legati de acelasi atom de carbon, se fragmenteaza preponderent cel cu masa mai mare; 3. Intr-o serie omoloaga, intensitatea relativa a semnalului ionului molecular scade odata cu cresterea masei moleculare. Probabilitatea de a avea loc o fragmentare creste odata cu cresterea numarului de legaturi; 4. Legaturile multiple, ciclurile aromatice, cele heteroaromatice, chiar si heteroatomii, stabilizeaza ionii moleculari, facand ca acestia sa aiba intensitati mai mari. Aceasta se explica prin aceea ca este mai usor de smuls un electron sau p, decat unul , iar sarcina se localizeaza mai puternic in prezenta electronilor sau p;
n> > n: H3C OH - e- eH3C OH

H3C CH2 CH3

- e-

H3C CH2 CH3

Figura 4.1. Exemplificari ale locului unde are loc initial ionizarea

5. Dublele legaturi, chiar si triplele legaturi favorizeaza fragmentari ce conduc la cationi de tip alilic stabilizati prin conjugare:

85

R1 H2C

CH2 CH CH2

CH2 CH CH2 cation "alilic"

H2C HC H2C + R1 H2C

6. Ciclurile benzenice si in general cele aromatice favorizeaza fragmentari care conduc la cationi de tip tropilic:
CH2 R -R CH2 CH2 cation "tropilic"

7. Combinatiile ce contin heteroatomi se fragmenteaza preferential in pozitia fata de legatura C=X, furnizand ioni stabilizati prin conjugare, de tip oniu, exemplu la cetone:
R1 H2C C O R R1 H2C + O C R fragment "oniu"

8. Reactiile de fragmentare sunt adesea insotite de eliminarea unor molecule neutre cu masa moleculara mica, cum ar fi oxid si dioxid de carbon, olefine, acetilena, H2O, NH3, SH2, HCN, mercaptani, CH2=O, alcooli. Aceste molecule sunt recunoscute in mod indirect prin prezenta fragmentelor ionice care se obtin din ionul molecular, avind valori caracteristice:

(M - 15) M (M - 17) (M - 18) (M - 28)

+ CH3 + NH3 + H2O + CO

IV.2. REACTII DE FRAGMENTARE

86

Marea diversitate a reactiilor de fragmentare a ionilor pozitivi, consecinta directa a diversitatii structurale si functionale a compusilor organici, creaza dificultati majore in clasificarea lor. Cea mai intalnita clasificare a reactiilor de fragmentare este urmatoarea: 1. fragmentari simple; 2. fragmentari insotite de transpozitia unui atom de hidrogen; 3. fragmentari complexe; 4. fragmentari insotite de transpozitia a doi atomi de hidrogen; 5. fragmentari insotite de transpozitii de schelet.

IV.2. 1. Fragmentari simple


In general, procesul fragmentarii simple implica ruperea unei legaturi, formandu-se ioni si radicali sau ioni si molecule neutre. In maniera cea mai generala, acest proces arata astfel: I+ I1+ + R I+ I2+ + Din categoria fragmentarilor simple fac parte mai multe tipuri de fragmentari: - fragmentarea alchilica; - fragmentarea legaturii carbon-heteroatom; - fragmentarea in fata de legatura carbon-heteroatom C-X sau C=Y (fragmentarea de tip oniu); - fragmentarea in fata de dubla legatura C=C (fragmentarea alilica); - fragmentarea in fata de un sistem aromatic. Fragmentarea tropilica.

1. Fragmentarea alchilica

Caracteristicile principale ale acestei fragmentari sunt:

87

- ionul molecular sau un fragment ionic se scindeaza furnizand carbocationi alchilici; - se intalneste la toti compusii organici care contin in molecula lor un numar de atomi de carbon 2; - schema reactiei de fragmentare este:
C C C C C C C C C C + C C

C C C C

C C

C C

- in cazul normal alcanilor: fragmentele alchilice de formula generala CnH2n+1+ vor furniza semnale la masele: 29 (etil), 43 (propil), 57 (butil), 71 (pentil), 85 (hexil),etc. (picuri despartite de 14 unitati); 100 43 71 50 85

ionul molecular scade in intensitate odata cu cresterea mase moleculare, dar este inca detectabil la C40; in fig. IV.4.2 este prezentat spectrul de masa al n-tetradecanului, M= 198.
57

29 99 10 20 30 40 (m ainlib) Tetradecane 0 50 60 70 80 113 127 141 155 169 198

90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210

Figura IV.4.2. Spectrul de masa al n-tetradecanului

88

Se observa ionul molecular (m/z= 198, intensitate 7%), fragmentele principale (57, 43, 71, 85, 29, 99) sunt picuri despartite de 14 Daltoni, iar picul de baza este un fragment n-butilic (m/z= 57, 100%); schema reactiei de fragmentare este prezentata in fig. IV.4.3.a.;
57 (PB) 141 85 43 155 113 57 (PB) 141 85 113 183 15 29 169 71 127 99 43 155 127

99

71

a.

b.

Figura IV.4.3. Schema reactiei de fragmentare al n-tetradecanului (a) si 7-metil-tridecanului (b)

- in cazul alcanilor ramificati: au tendinta de fragmentare la nivelul ramificatiei; o pierdere de masa de 15 unitati (M-15) indica un metil (CH3) ramificat; ionul molecular scade in intensitate odata cu cresterea ramificarii si poate sa nu apara in spectru; in fig. IV.4.4 este prezentat spectrul de masa al 2-metil-tridecanului, M= 198.
100 43 57

71 50 85 29 99 113 0 127 141 155 183 198

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 (m ainlib) Tridecane, 2-m ethyl-

89

Figura IV.4.4. Spectrul de masa al 2-metil-tridecanului

Ionul molecular abia se observa (m/z= 198, 1%), apare M-15 (m/z= 183, 3%), pozitia ramificatiei este indicata de fragmentele de la m/z 155 (17%) si 43 (98%) (intensitatea picurilor este mult mai mare ca la compusul neramificat); fragmentele principale (29, 57, 71, 85, 99) sunt picuri despartite de 14 Daltoni, iar picul de baza este un fragment butilic (m/z= 57, 100%); schema reactiei de fragmentare este prezentata in fig. IV.4.3.b.
2. Fragmentarea legaturii carbon-heteroatom

In cazul acestui tip de fragmentare, sunt posibile si cunoscute doua moduri uzuale de scindare:
a). R3C X R3C + X X= - halogen; - NR'2; - OR'; - SR'

b). R3C X

R3C

+ X

Din cauza si in masura electronegativitatii heteroatomilor, tipul de fragmentare a) este preponderent. Fragmentarea dupa schema a) mai este favorizata si de efectele +I ale resturilor R, precum si de apartenenta carbonului adiacent heteroatomului la un sistem capabil sa stabilizeze sarcina pozitiva (de exemplu sistemul aromatic). Exemple: 2-clorobutanul (spectrul de masa este prezentat in fig IV.4.5), si etilizobutiltioeterul.

90

Cl

m/z=57, I=100%, PB Cl b C
57

Cl

m/z=35/37, I= sub 1%
100

41 50 63

Cl

29

39 0 15 18 36 40 49 50 60

65 77 70 80 90 100

10 20 30 (m ainlib) Butane, 2-chloro-

Figura IV.4.5. Spectrul de masa al 2-clorobutan

CH m/e= 57, I=18%

S C H + S

m/e= 61, I=40%

Comparativ cu derivatii clorurati, cei iodurati si tioeterii, datorita stabilizarii sarcinii pozitive de catre iod sau sulf se scindeaza mai abundent dupa schema b).
3. Fragmentarea in fata de legatura carbon-heteroatom C-X sau C=Y (fragmentarea de tip oniu)

91

In afara de scindarea legaturii C-X, compusii care contin heteroatomi se fragmenteaza usor in pozitia fata de aceasta legatura. Procesul decurge conform schemelor: R' R' C R'' R C R' Y -R' R C Y R C Y X -R'' R' C R'' X R'' R' C X

unde X= halogen, NH2, NHR, NR2, OH, OR, SH, SR Y= O, S, NH, NR Aceasta scindare fiind de obicei preponderenta, furnizeaza in majoritatea cazurilor picurile de baza. Ionii rezultati prin fragmentari in furnizeaza picuri la masele minime: CH2=NH2+ m/z = 30 CH2=OH+ m/z = 31 sau 31 + 14n CH2=SH+ m/z = 47 sau 47 + 14n CH2=X+ m/z = Mhalogen+ 14 sau Mhalogen + 14n Dintre radicalii alchil, cel mai mare se va scinda mai usor. De exemplu, fragmentarea in a alcoolului butilic secundar (spectrul de masa este prezentat in fig IV.4.6),:

92

H C HO a C b c H a b

OH

+ CH3CH2

m/z= 45 I=100% H C c OH + CH3

m/z=59 I=19% HO C m/z=73 I=1.2% + H

Abundentele mai mici ale ionilor proveniti din fragmentarile (b) si (c), se datoresc instabilitatii mari a radicalilor CH3 si H, ceea ce face ca stabilitatea ionilor sa fie in acest caz invers proportionala cu abundenta lor.
100 45

HO

50

27 18 10 15 20 (m ainlib) 2-Butanol 0 25 28

31 43 57 30 35 40 45 50 55

59 73 60 65 70 75 80

Figura IV.4.6. Spectrul de masa al 2-butanol

Prin inregistrarea spectrelor de masa la compusi cu structuri de tipul XCH2CH2-Z, X si Z fiind heteroatomi, s-a gasit urmatoarea ordine a stabilitatii: CH2=NH2+ > CH2=SH+ > CH2=OH+ > CH2=F+

93

De exemplu, pentru etanolamina (spectrul de masa este prezentat in fig IV.4.7), s-a obtinut:
H2N OH H2C NH2 + H2C OH m/z=30 I=100%
100 30

m/z=31 I=10%

NH 2 50 HO

15 0

18

28 27 29 31 26 30 34 38

42 42 46 50 54 58

61 62 66 70

10 14 18 22 (m ainlib) Monoethanolam ine

Figura IV.4.7. Spectrul de masa al etanolaminei

Prin inlocuirea atomilor de hidrogen cu diversi radicali, stabilitatile relative si deci, abundentele acestor ioni pot fi mult modificate. Sensul acestor modificari va depinde de efectele inductive si electromere ale radicalilor. De exemplu, in cazul 1hidroxi-2-amino-2-metilpropanului s-au obtinut urmatoarele abundente:

H2N

OH

NH2 + m/z=58 I=100%

H2C OH m/z=31 I=2%

Prin efectul lor +I, gruparile alchil maresc stabilitatea fragmentelor incarcate pozitiv in care se gasesc. Deoarece aceleasi grupari sunt raspunzatoare si de cresterea bazicitatii heteroatomilor de care sunt legate, s-au putut studia comparativ bazicitatile aminelor pure (in absenta influentei solventilor si a

94

factorilor sterici) prin intermediul abundentelor relative ale fragmentelor rezultate prin scindari in . S-a gasit ca abundentele ionilor cresc in ordinea: R2C=NH2+ < R2C=NHR+ < R2C=NR2+ Prin urmare si bazicitatea reala a aminelor creste in ordinea: amine primare < amine secundare < amine tertiare. Acolo unde se este cazul, exista o concurenta intre scindarile in si scindarea legaturii C-X, aceasta poate fi determinata din abundentele picurilor furnizate. De exemplu, daca consideram cazul 2-cloro-2-metilbutanului (spectrul de masa este prezentat in fig IV.4.8), se observa ca fragmentarea in este preponderenta (intensitate 100%):
a C Cl + m/z=91/93 I=71% Cl C Cl + m/z=77/79 I=100%
100 41 55 71 77

CH3

CH3CH2

Cl 50 29 39 36 50 53 60 63 70 80 90 79 91 15 0 93 100 110 120

10 20 30 40 (m ainlib) Butane, 2-chloro-2-m ethyl-

Figura IV.4.8. Spectrul de masa al 2cloro-2-metil-butan

Fragmentarile oniu ale compusilor de tip R(R)C=Y se intalnesc la aldehide, cetone, amide, esteri, cloruri acide, chinone, tioesteri, etc. In functie, in

95

primul rand, de stabilitatile fragmentelor care se formeaza, se fragmenteaza preponderent unul din cei doi radicali. De exemplu, fragmentarea oniu a esterului metilic al acidului n-butanoic si a aldehidei propionice decurg dupa schemele de mai jos (spectrele de masa sunt prezentate in fig IV.4.9 si IV.4.10).
a O OCH3 b CH3O + C O m/z=71 I=54%
100 43 74 O 71 50 41 59 27 15 0 29 50 39 55 57 60 69 70 80 90 102 100 110 87 O

H3CO C O m/z=59 I=23%

10 20 30 40 (m ainlib) Butanoic acid, m ethyl es ter

Figura IV.4.9. Spectrul de masa al esterului metilic al acidului n-butanoic

96

a O H b

CH3CH2

H C O m/z=29 I=100%

C O m/z=57 I=12%

100

29 28 58

27 50

26 15 0 18 22 25 26 30 30 34 37 39 38 42 46 50 54 57

59

10 14 18 (m ainlib) Propanal

58

62

66

70

Figura IV.4.10. Spectrul de masa al aldehidei propionice

Prin inlocuirea oxigenului aldehidic cu


+

18

O s-a stabilit ca semnalul de la m/z=29

este dat de fragmentul HCO si nu de CH3CH2+.


4. Fragmentarea in fata de dubla legatura C=C (fragmentarea alilica)

Prezenta unei duble legaturi in ionul molecular, favorizeaza scindarea legaturii simple din pozitia . Exemplu, cazul izopentenei (fig. IV.4.11), se observa ca picul de baza (m/z= 55, 100%) rezulta prin fragmentare in pozitia a unui radical metil:

97

55 (PB) 15
100 55

50 27 39 42 53 20 30 40 50 60 70 80 70

15 0 10 (m ainlib) 1-Butene, 3-m ethyl0

Figura IV.4.11. Spectrul de masa al izopentenei

Totusi nu se poate stabili pozitia dublei legaturi intr-un lant hidrocarbonat deschis, decat in anumite cazuri. Se constata ca oricare dintre legaturile C-C din molecula se poate scinda aproximativ cu aceeasi probabilitate. Fenomenul poate fi explicat daca se admite ca timpul necesar producerii scindarii este mai mare decat cel de migrare succesiva a unor ioni hidrura si atomi de hidrogen.
H H H H C C C C C C H H H H H H H H H C C C C C C H H H H H H H H H C C C C C C H H H H H

H H H H H H H H C C C C C C H C C C C C C H H H H H H H H H Intr-adevar substituirea hidrogenilor din pozitia alilica cu resturi alchil,

blocheaza migrarile amintite permitand localizarea dublei legaturi. Acelasi lucru este valabil si pentru olefinele cu carboni dublu legati complet substituiti.

98

H H2C C R3

R2 R1

C C

si

R3 R2 C C C C R1

R4

S-a gasit de exemplu ca ionul molecular de mai jos furnizeaza semnale foarte intense la masele 71 si 73.

HO CH3 H3C H3C C C CH3 HO CH3 H3C m/z= 71 H3C CH2

CH3 H3C m/z= 73 Evident formarea ionului cu masa 71 este facilitata si de structura oniu a lui.
5. Fragmentarea in fata de un sistem aromatic. Fragmentarea tropilica.

Ciclurile aromatice substituite cu cel putin un rest alchil sau care fac parte dintr-un sistem ciclic, favorizeaza fragmentarea legaturii C-C din pozitia fata de ciclul aromatic. Prin marcare cu
13

C si D s-a dovedit ca in locul ionului benzil se

formeaza de fapt ionul tropiliu (m/z= 91). Exemplu: fragmentarea tropilica a npropilbenzenului (din fig. IV.4.12 se observa ca ionul tropiliu este chiar pic de baza).
CH3 H CH2 CH2 CH3 m/z= 91 ion tropiliu + C2H5

H C H

99
100 91

50 120 65 60 70 78 80

10 20 30 (m ainlib) Benzene, propyl-

27

39 40

51 50

89 90 100

105 110 120 130

Figura IV.4.12. Spectrul de masa al n-propilbenzenului

Transpozitii similare se produc si la sistemele heteroaromatice cu 5 si 6 atomi in ciclu. Heterociclii cu 6 atomi cum ar fi alchil-piridinele conduc la ioni de azotropiliu, iar cu cei 5 atomi isi largesc ciclul, conform schemei de fragmentare de mai jos:
R CH2 X H R X

H R X +R

Exemplu: 1-butil-1H-pirol (spectrul de masa este prezentat in fig IV.4.13); se observa ca fragmentele de la 80 (76%) si 81 (100%, PB) se pot explica tocmai prin largirea de ciclu.

100

H N H N H C3H7 C3H7 N H m/z= 80 C3H7

N H
100 81

50 N 27 0 15 40 50 60 70 39 53 67 78 80 90 94 100 108 110

123

10 20 30 (m ainlib) 1H-Pyrrole, 1-butyl-

120

130

Figura IV.4.13. Spectrul de masa al 1-butil-1H-pirol

Indiferent de pozitia substituientului se obtine acelasi ion, tropiliu. Fragmentarile tropilice sunt adesea preponderente furnizand picurile de baza. Studiul intensitatii stabilizarii sarcinii pozitive de diferite fragmente rezultate in urma scindarilor alilice si tropice au condus la urmatoarele rezultate:

101

m/z= 91, 40%

m/z= 57, 100%

m/z= 13, 23%

m/z= 43, 100% O

m/z= 41, 23% m/z= 57, 100%

m/z= 91, 100% m/z= 41, 9%

m/z= 91, 10% m/z= 20, 100% NH 2 m/z= 91, 60% O m/z= 43, 100% m/z= 91, 100% OH m/z= 31, 10%

In consecinta, se poate aprecia ca ordinea descrescatoare a stabilizarii sarcinii pozitive de catre diferiti ioni furnizati la fragmentarile simple poate fi redata prin seria:
H2C NH2 > C C > C C C C OH C H > H2C C CH > 2 > C C OH > H3C C O H >

>

C CH C

> H2C OH > C CH2

IV.2.2. Fragmentari insotite de transpozitia unui atom de hidrogen


O serie de picuri care apar in spectrele de masa a unui numar mare de compusi organici, nu pot fi explicate decat admitand transpozitia unui atom de hidrogen. Ionii rezultati in urma transpozitiei unui hidrogen in cursul scindarii unei legaturi se numesc ioni de transpozitie. In modul cel mai general aceasta transpozitie poate fi redata prin ecuatiile:

102

I I2

scindare si transpozitie scindare si transpozitie

I1

unde molecula neutra -

I3 +

Posibilitatea producerii acestui proces este conditionata de urmatoarele aspecte: a. Stereochimia ionului: transpozitia se produce intre centre apropiate spatial, printr-o stare de tranzitie ciclica care implica trecerea unei bariere energetice mici; b. Molecula si ionul format sau ce putin unul dintre ei trebuie sa fie deosebit de stabil. In functie de rezultatul final sau de mecanism, aceste fragmentari se pot clasifica dupa cum urmeaza: - transpozitia unui proton insotita de eliminarea grupei functionale; - transpozitia unui proton insotita de retroaditie 1,4; - transpozitia Mc Lafferty; - transpozitia hidrogenului in lanturi ionice de tip oniu; - transpozitii ion-dipol.

1. Transpozitia unui proton insotita de eliminarea grupei functionale

Acest proces implica transpozitia unui hidrogen la grupa functionala in cursul fragmentarii acesteea:
C X n C H C C nC + HX

unde X= -OH, -OR, -NH2, -NHR, -NR2, -X, -SH, RCOO-, RCONH- si CN.

103

Abundenta

fragmentelor

ionice

rezultate

este

proportionala

cu

electronegativitatea gruparii functionala. Astfel, daca pentru X= F, Cl, OH, picurile de la masele M+-(X+1) sunt intense, pentru X= NH2, NHR, NR2, Br si I in multe cazuri lipsesc din spectru. Se observa ca aceste picuri au masele cu o unitate mai mica decat cele rezultate prin fragmentare simpla. Prin marcari cu deuteriu s-a stabilit ca eliminarile se produc din pozitiile 1,2, 1,3, 1,4, etc, preponderente fiind cele din 1,3 si 1,4. De exemplu scindarea apei din n-butanol (spectrul de masa este prezentat in fig IV.4.14) conduce la ionul-radical de
la m/z= 56, care este si pic de baza.

1,3 OH 1,4 m/z= 56

+ H2O

+ H2O m/z= 56
100 31 41 43 27 50 29 28 15 0 19 25 30 33 35 39 38 40 45 45 50 55 60 65 70 55 OH 56

73 75 80

10 15 20 (m ainlib) 1-Butanol

Figura IV.4.14. Spectrul de masa al n-butanol

2. Transpozitia unui proton insotita de retroaditie 1,4

Ionii moleculari sau de fragmentare ai olefinelor 1,2-cis-disubstituite si ai derivatilor aromatici orto-disubstituiti care contin cel putin un hidrogen pe unul din

104

substituienti, pot elimina o molecula neutra conform schemei: Y X Z H R Y + RXH Z

unde X, Y, Z pot fi C, N, O, S iar R = alchil, aril, acil. Aceasta fragmentare are urmatoarele caracteristici:

decurge printr-o stare de tranzitie ciclica intre sase atomi incluzand si hidrogenul; hidrogenul se transpune intotdeauna de pe atomul 1 pe atomul 5 in timpul fragmentarii acestuia; rezulta ioni-radicali cu structura di-sau polienica, mai mici cu o unitate de masa decat ionii rezultati prin fragmentare simpla; permite distingerea izomerilor orto de meta si para, precum si a celor cis de
trans in cazul olefinelor. Numai izomerii orto si cis pot da stari de tranzitie

ciclica care furnizeaza eliminarea. Astfel, daca consideram drept exemplu cazul esterilor metilici al acidului metil-benzoic, din analiza spctrelor de masa (fig. IV.4.15), se obsera ca intensitatea ionului de masa 118, care corespunde starii de tranzitie ciclica de sase atomi (schema de mai jos), este mare in cazul de esterului metilic al acidului o-metil benzoic (58%):
O O CH3 C O + i-C3H7OH

CH2 m/z= 118 (58%)

105
100 O O 50 57 29 0 41 65 77 105 192 119

91

136

20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 (m ainlib) Benzoic acid,2-m ethyl, (2-m ethylpropyl)es ter
100 91 137 O 50 56 51 65 77 119 O

41 29 0

105

149

192

20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 (m ainlib) Benzoic acid,3-m ethyl, (2-m ethylpropyl)es ter 100 O 91 O 50 65 137 119

39 29 0 51

56

69 77

105

20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 (m ainlib) Benzoic acid, 4-m ethyl-, 2-m ethylpropyl es ter

Figura IV.4.15. Spectele de masa ale esterilor metilici al acidului metil-benzoic(o, m, p)

106

Pentru izomerul meta intensitatea ionului de masa 118 este de 1.6% iar pentru izomerul para de 1%, deoarece acestia nu pot adopta starii de tranzitie ciclica de sase atomi. In cazul izomerilor cis-trans olefinici diferentele intre intensitatile ionilor proveniti din aceasta fragmentare sunt mai mici (dar intotdeauna sesizabili) datorita transformarii. Astfel, daca consideram drept exemplu cazul esterilor izopropilici al acidului 2-metil-2-butenoic, din analiza spctrelor de masa (fig. IV.4.16), se obsera ca intensitatea ionului de masa 82, care corespunde starii de tranzitie ciclica de sase atomi (schema de mai jos), este mai mare in cazul de Z(cis)-esterului izopropilic al acidului 2-metil-2-butenoic (16%) comparativ cu E(trans)- (13%):
H3C O O H3C C O + i-Pr-OH

CH3 Z (cis) 100 55

CH2 m/z= 82 (16%)


83 O

43 50 27 101 41 45 59 69 100 85 109 110 120

127 142

20 30 40 50 60 70 80 90 (m ainlib) 2-Butenoic acid, 2-m ethyl-, 1-m ethylethyl es ter, (Z)-

31

130

140

150

107
100 83 O

55 50 27 43 59 0 15 31 40 45 53 50 60 69 70 80 90 100 85 109 110 120 101

127 142 130 140 150

10 20 30 (m ainlib) Is opropyl tiglate

Figura IV.4.16. Spectrele de masa ale esterilor benzilici al acidului 2-metil-2-butenoic, Z (sus) si E(jos)

3. Transpozitia Mc Lafferty

Acest mod de fragmentare se intalneste la ionii-radicali si intr-o masura mai mica la ionii cu un numar par de electroni, care contin cel putin o legatura multipla sau un sistem analog si pot adopta stari ciclice de tranzitie incluzand 6 atomi. In modul cel mai general, transpozitia McLafferty poate fi redata prin schemele:
H A B H A B G H A B G K D F L -L H A B G G X E D A B + F G H E D H F X C C H G E D

A B + G K D

H K A B + D F G

108

unde A, B, D, E, F, G, K, L pot fi atomi sau grupe de atomi de diferite naturi, cu conditia ca molecula sa fie constituita rational. X poate fi O, N sau S. Caracteristicile principale ale acestei fragmentari sunt:

este necesara prezenta unui hidrogen pe atomul din pozitia 5; daca atomul din pozitia 5 este un carbon care poseda legaturi multiple transpozitia nu mai are loc; transpozitia si fragmentarea sunt strict sincrone, fapt dovedit prin lipsa efectului izotopic la compusii deuterati; sistemul trebuie sa permita o apropiere de cel putin 1,8 intre hidrogen si atomul pe care se transpune; usurinta cu care se transpune atomul de hidrogen creste in seria: H-C primar < H-C secundar < H-C tertiar se elimina intotdeauna o molecula neutra; daca in urma unei rearanjari McLafferty rezulta un fragment ionic cu o structura corespunzatoare, acesta poate suferi o noua transpozitie McLafferty;

Din cele aratate rezulta ca transpozitia McLafferty se intalneste la olefine, sisteme aromatice cu catene laterale, compusi continand cicluri de 3 atomi, aldehide, cetone, acizi, esteri, amide, nitrili, etc. Mecanismul acestei transpozitii a fost studiat pe compusii deuterati corespunzatori conform schemei:

109

R CH D2C

R O C _ R CH CD2 H H2C O C M D _ R' R CD CH2 H2C _ R CH CH2

H CH H2C

R' C H2 compus deuterat D CD

R'

C R' C H2 compus nedeuterat

R H2C

O C

O C M
'

R'

C H2 compus deuterat RCH H2C H O C

H _ R' R CH CH2 D2C

O C

C D2

R'

M''

compus deuterat

unde: R= alchil, aril R1= -H, -R, -OH, -OR, -NH2, -NHR, -NR2, etc M, MI, MII sunt masele celor 3 fragmentari ionice. Deoarece in toate cazurile s-a gasit ca M= MI-1= MII-2 rezulta ca transpozitia este starea specifica, hidrogenul migrand din pozitia fata de gruparea functionala. Fragmentarea McLafferty furnizeaza picuri la urmatoarele mase minime: pentru aldehide 44, cetone 58, acizi 60, amide 59, esteri 74, etc. Eventualii substituienti la atomii fragmentului ionic conduc la mase diferite de cele indicate, dar usor previzibile. Exemplu: cazul 2-hexanonei; din analiza spctrului de masa (fig. IV.4.17), se observa existenta unui pic semnificativ la masa minima 58, caracteristic pentru fragmentarea McLafferty a cetonelor.

110

H3C CH

O C CH3
43

H H2C

O C

H3C + CH3

H CH2

m/z= 58
100

O 50 58

29 15 10 20 (m ainlib) 2-Hexanone 0 30

41 39 40 50

55 60

71 70 80

85 90

100 100 110

Figura IV.4.17. Spectrul de masa al 2-hexanonei

Prin compararea abundentelor fragmentelor ionice de transpozitie McLafferty furnizate de azometine si esterii -aminoacizilor se remarca favorizarea acestui proces de catre ionii radicali.
RCH H2C H N CH3 C _ H R CH CH2 H H2C N C CH3 H

C H2

I= 20-35% RCH H CH3 N CH 3 C H CH3 N CH 3 C H H2C H I= 0.2 - 2%

H CH C H2

N CH

CH3 CH3 COOR' - COOR'

H2C

H2C

C H2

_ R CH CH 2

In general picurile furnizate de transpozitia McLafferty sunt intense, in unele cazuri fiind picuri de baza.

111

4. Transpozitia hidrogenului in lanturi ionice de tip oniu

O serie de fragmente ionice de tip oniu pot suferi fragmentari insotite de transpozitiile unor atomi de hidrogen. Schema generala a reactiei de fragmentare este:
R'' H R X CH R' H cale 1 H -R'' cale 1 cale 2 H

R X CH R'

cale 2

HX CH R' a

H + R-H

R X CH2 + R' - H b -(R - H)

-(R '- H) unde: X= O, S, NH, NR; R, R- resturi alchilice;

HX CH2

R un rest care se scindeaza usor sub forma de radical. Desi rezultatul final este acelasi, calea 1 este preponderenta (in spectru apar semnale furnizate de ionii de tip a). Fragmentarea dupa calea 2 devine importanta numai daca R=H, CH3 sau daca daca R>>R. Fragmentarile in continuare ale ionilor a si b conform schemei au loc numai daca R si R sunt resturi alchilice mai mari decat CH3. Existenta acestor fragmentari este dovedita de prezenta picurilor furnizate de fragmentele de masa minima: CH2=NH2+ m/z = 30 - in cazul aminelor secundare si tertiare; CH2=OH+ m/z = 31 -in cazul alcoolilor secundari, tertiari si a eterilor; CH2=SH+ m/z = 47 tioeterilor. (47 + 14n) in cazul tiolilor secundari, tertiari si a

112

Daca consideram ca si exemplu cazul fragmentarii butil-isopropil- aminei (schema de mai jos), din analiza spctrului de masa (fig. IV.4.18), se observa existenta unui pic semnificativ la masa minima 30 (6%), caracteristic pentru fragmentarea de tip oniu.
H N m/z= 100 (35%)

H N

- CH3

- CH4 H2N m/z= 58 (24%) H2N H N m/z= 85 (nu se observa in spectru) CH2 m/z= 30 (42%)
72 NH

m/z= 43 (13%)

100

28

50

30 44 32 39 70 80 90 58

100

115 100 110 120 130

20 30 40 50 60 (m ainlib) 1-Butanam ine, N-(1-m ethylethyl)-

Figura IV.4.18. Spectrul de masa al butil-izopropil- aminei

Se va observa ca aceleasi fragmente se obtin si in cazul fragmentarii simple in a alcoolilor, aminelor si tiolilor primari. Marcarea cu deuteriu a aratat ca in acest sens transpozitia hidrogenului este nespecifica.

113

6. Transpozitii ion-dipol

Fragmentarile care includ transpozitii specifice ale hidrogenilor de la centre ion-radicalice sau ionice la grupari dipolare se numesc transpozitii ion-dipol. Schematic ele se reprezinta dupa cum urmeaza:

XH Y C C CH2 n

XH -R C

Y C CH2 n

YH C C CH2 n

X - YH C C CH2 n

unde: X= OH, NH; Y= OH, OR, NH. Transpozitiile de acest tip se intalnesc la diamine, dialcooli, esteri metilici ai hidroxi- si cetoacizilor, etc. Daca consideram ca si exemplu cazul fragmentarii esterului metilic al acidului 3-hidroxibutanoic (schema de mai jos), din analiza spctrului de masa (fig. IV.4.19), se observa existenta unor picuri semnificative la 103 (19%) si 71 (32%), caracteristice pentru fragmentarile de tip ion-dipol.

H3C

CH OH

CH2

O - CH3

OCH 3 CH2

HC OH

CH2

C O

OCH 3

HC O

CH2

OCH 3

HO

m/z= 103 C O + CH3OH

HC O

m/z= 71

114
100 43

O 45 74 O 71 27 31 0 61 63 69 70 77 80 87 85 90 103 100 100 110

OH

50

117 120 130

20 30 40 50 60 (m ainlib) Butanoic acid, 3-hydroxy-, m ethyl es ter

Figura IV.4.19. Spectrul de masa al esterului metilic al acidului 3-hidroxibutanoic

Prin marcare cu deuteriu s-a stabilit ca aceste transpozitii sunt specifice in privinta hidrogenului care migreaza si nespecifice in raport cu numarul gruparilor CH2 care separa cele doua centre intre care are loc migrarea. Ca si exemplu consideram tor cazul unui hiroxi-ester:
O CH3(CH )m CH (CH )n C 2 2 OCH OD 3 O O CH (CH )n C 2 O-CH 3 D O DO CH (CH )n C 2 OCH 3

-CH3(CH2)m

-CH OD 3

O CH (CH )n C O 2

IV.2.3. Fragmentari complexe


Ionii-radicali proveniti de la compusii ciclici substituiti cu heteroatomi, de la cicluri nesaturate sau continand un nucleu aromatic, cat si de la unii heterocicli aromatici, pot suferi o dubla sau tripla scindare insotita in multe cazuri de transpozitia unui hidrogen.

115

Intrucat in spectru nu apar decat picuri furnizate de ionii de fragmentare finali, numai prin marcari cu deuteriu si 13C s-au putut deduce mecanismele acestor fragmentari. In multe cazuri mecanismele fragmentarii s-au dedus pe baza regulilor generale de fragmentare si a unor analogii. Exista doua tipuri de fragmentari caracteristice: - fragmentarile complexe ale ciclurilor alifatice substituite; - fragmentarea retro-Diels-Alder.

1. Fragmentarile complexe ale ciclurilor alifatice substituite

Schematic, fragmentarea compusilor care contin cicluri de atomi poate fi redata astfel: R X R X R X C1 R H + + CH3

C2

X H

R X +

unde: X= O, S, NH, NR Ambele cai de fragmentare sunt posibile deoarece pot fi justificate prin consideratii de ordin energetic, iar fragmentele ionice finale sunt aceleasi. Un model pe care s-a studiat fragmentarea complexa a fost N-etil-ciclohexil amina si derivatul ei 2,6-tetradeuterat. Asa dupa cum se observa din spectrul de masa al aminei nedeuterate (fig. IV.4.20), in urma unei reactii de fragmentare complexe (schema de mai jos) rezulta fragmentul de la m/z= 84 (care este si pic de baza) iar

116

in cazul aminei deuterate acelasi tip de fragment are masa mai mare cu o unitate (m/z= 85, pic de baza):
H3CH2C NH H3CH2C NH H3CH2C NH D2C m/z=84, I%=100
100 84

H3CH2C NH D m/z=85, I%=100

CD2

HN 50

41 44 0 55

71 98 70 80 90 100 112 110 120

127

30 40 50 60 (m ainlib) Cyclohexylam ine, N-ethyl-

130

140

Figura IV.4.20. Spectrul de masa al esterului etil-ciclohexil-aminei

Doua caracteristici ale acestei fragmentari sunt mai importante: - transpozitia hidrogenului este in toate cazurile specifica (din 6 in 2 sau invers); - intensitatea picurilor este in general foarte mare. In mod analog se fragmenteaza si compusi cu heteroatomul dublu legat:
X X H X + + CH3

Si compusii care contin un ciclu de 5 atomi heterosubstituit se fragmenteaza complex. Un exemplu studiat in amanuntime pentru stabilirea mecanismului de

117

fragmentare a acestor cicluri l-a constituit N-etil-ciclopentilamina (I, fig. IV.4.21) si cei trei derivati deuterati ai sai (II, III si IV): H3C H2C NH H3C D2C NH D3C H2C NH H3C H2C NH D2C
I
100

CD2
IV

II

III
84

HN 50 41 27 15 10 20 30 40 (m ainlib) Cyclopentanam ine, N-ethyl0 50 44 58 60 67 56

70

113 98 82 70 80 90 100 110 120

Figura IV.4.21. Spectrul de masa al esterului etil-ciclpentil-aminei

Schema generala a fragmentarii N-etil-ciclopentilaminei este urmatoarea:

118

+ H3C H2C NH H C1 + H3C H2C NH H3C H2C NH C2

+ H3CH2C NH +

CH3 H2C

I: m/z=84, 100%, PB m/z=29, 14% II: m/z=86, 100%, PB III: m/z=87, 100%, PB IV: m/z=85, 100%, PB CH3 - CH2=CH2 m/z=28, 13% + HN m/z=83, lipseste CH3 + HN + CH3

C3 + H3C H2C NH

I: m/z=70, 60% II: m/z=72 III: m/z=70 IV: m/z=72 + CH2 HN + I: m/z=56, 32% II: m/z=58 III: m/z=56 IV: m/z=58 + NH2 + I: m/z=56, 32% II: m/z=56 III: m/z=57 IV: m/z=57 CH3 H2C CH3

+ H2C HN

- CH2=CH2

C4

m/z=42, 16% I: m/z=71, 18% II: m/z=73 III: m/z=71 IV: m/z=73 + + NH2 NH2

I: m/z=85, 14% II: m/z=85 III: m/z=86 IV: m/z=89

Numarul de unitati de masa cu care se deplaseaza picurile de aproximativ aceeasi intensitate, din spectrele compusilor permite stabilirea ionilor cu schelet identic, dar cu continut diferit de deuteriu. Structurile si masele principalilor ioni pozitivi care rezulta prin fragmentarea complexa a unor compusi organici mai des intalniti sunt:

119

OH

OR

SH

SR

NH2

NHR

NR2

m/z: 57

57 si MR-1

73

73 si MR-1

56

56 si MR-1 56 si 2MR-1

55

unde MR este masa restului R. Datorita prezentei, intensitatii si prin urmare a importantei lor pentru stabiliri de structura, aceste fragmente au fost numite fragmente cheie.
2. Fragmentarea retro-Diels-Alder

Este data de compusii ciclici care contin o dubla legatura sau un ciclu aromatic in locul acesteia:

Acest mod de fragmentare a fost intens studiat deoarece este des intalnit in clasa terpenelor si alcaloizilor. Un exemplu tipic il constituie fragmentarea ciclohexenei (schema de mai jos):
H - CH3 m/z=67, I=100

_ H C CH 2 2 m/z=54, I= 68% + CH2 CH2 CH2 CH2 m/z=28, I= 2%

120

Spectrul de masa al ciclohexenei este prezentat in fig. IV.4.22.


100 67

54 50

39 41 27 14 29 30 40 50 60 65 70 74 80 90 82

10 20 (m ainlib) Cyclohexene

Figura IV.4.22. Spectrul de masa al esterului ciclohexenei

Daca in structura unor astfel de compusi sunt prezenti substituenti care pot conduce la modificarea intensitatilor acestor picuri, se poate ajunge pana la aparitia in spectru a unor picuri intense corespunzatoare fragmentelor etilenice. De exemplu, in cazul trans-2-octalinei si 9-metil- trans-2-octalinei rezulta: R + R R + m/z= M-54 Intensitatile relative ale celor doi ioni sunt: m/z 54 M-54 I% cand R=H 3,04% 1,9% I% cand R=CH3 1,18% 19,1% m/z=54 R R

121

IV.2.4. Fragmentari insotite de transpozitia a doi atomi de hidrogen


Prezenta in spectrul de masa a unor picuri cu doua unitati de masa mai mari decat cele prevazute prin fragmentarile simple previzibile in cazul compusilor respectivi, a condus la presupunerea confirmata ulterior prin studii sistematice, ca in timpul fragmentarii, doi atomi de hidrogen se transpun de la fragmentul neutru la cel ionic. Compusii la care se intalneste aceasta fragmentare sunt multi, dar pot fi impartiti in doua clase mai importante: - compusi mono- sau polifunctionali cu legaturi ; - compusi mono- sau polifunctionali cu duble legaturi.
1. Compusi mono- sau polifunctionali cu legaturi

Procesul de frag,mentare poate fi redat prin urmatoarea schema:


H C R''' H unde: X= O, S; Y= O, S, CH2 (in multe cazuri X = Y = O, S); R, R, R, R grupe alchil sau atomi de hidrogen. Se vor fragmenta in acest mod, prin urmare: alcoolii, tiolii, 1,2-tiolii, 1,2tiol-alcoolii, derivatii lor alchilati precum si unii epoxizi. Un exemplu ilustrativ il constituie fragmentarea 1,2-propandiolului (spectru de masa este redat in fig/ IV.4.23) prezentata mai jos: Y R X R' C R'' H H + Y C R'''

R X R' C R''

122

OH H3C CH H
100

H C H O
45

H O H2C

H CH3 + O CH

m/e=47; 1,2%

HO 50 OH 27 18 30 31 33 43 41 40 50 57 61 60 70 80 90

15 0

10 20 (m ainlib) Propylene Glycol

Figura IV.4.23. Spectrul de masa al 1,2-propandiol

Ionul format este tocmai etanolul protonat a carei formare si stabilitate in mediul acid este bine cunoscuta.
2. Compusi mono- sau polifunctionali cu duble legaturi

Marea majoritate a fragmentarilor de acest tip decurg conform urmatoarei scheme de fragmentare:

O R C O H

H C B R' A n R

OH + OH

R' C B A n

unde: R poate fi: alchil, aril, heteroaril (adesea R = OR1);

123

A poate fi: -CH2-, -CHR-, -S-, -O-; n= 1, 2, 3; (adesea A = -CH2-CH2-CH2-, CH2-O-CH2-, -CH2-CH2-O-) ; B poate fi: -CH2-, >CHR, O si S; R si R1 radicali hidrocarbonati cu diferite structuri. In multe cazuri, datorita concurentei altor procese de fragmentare, intensitatile picurilor furnizate de ionii de dubla transpozitie sunt mici sau foarte mici. Totusi, cand ionul rezultat are o structura care stabilizeaza puternic sarcina pozitiva, acesta poate furniza picul de baza sau un pic cu intensitate mare. Asa se intampla in cazul unor esteri ai acidului carbonic. Stabilitatea mai mare a ionilor de dubla transpozitie rezultati din carbonati in comparatie cu ionii analogi proveniti din esterii acizilor organici se datoreaza puternicei lor stabilizari prin rezonanta.
OH R OH R OH OH R OH OH

OH R OH

OH R OH

OH R OH

OH OH

IV.2.5. Fragmentari insotite de transpozitii de schelet


Aceste fragmentari sunt insotite de transpozitii ale unor grupari alchil, aril, alcoxi, etc. Ele conduc la modificari profunde ale structurii compusilor organici si la eliminarea concomitenta a unor radicali sau molecule neutre cum ar fi: CO2, CO, olefine, H2C=O, HCN, S, SH2, SO2, etc Acest mod de fragmentare se intalneste la foarte multe clase de compusi care contin legaturi duble, sisteme conjugate de legaturi duble sau cicluri mici si in marea majoritate a cazurilor hateroatomi. Daca consideram cazul ciclurilor mici, fragmentarea epoxizilor decurge dupa schema de mai jos; ca si exemplu se considera cazul fragmentarii 2,2-dimetil-

124

3-propil-oxiranului, care conduce la un fragment cu intensitate mare la m/z=85 (spectru de masa in fig. IV.4.24) :

O H

H R' R

O H C

H + C R R'

R R' R, R' - alchil, aril O

O H

O H C

m/z= 85, 86%

100 41

43

59 85 O

50 55 72 53 40 50 60 (m ainlib) Oxirane, 2,2-dim ethyl-3-propyl0 69 70 81 80 90 99 100 110 114 120

Figura IV.4.24. Spectrul de masa al 2,2-dimetil-3-propil-oxiranului

Studiul sistematic al fragmentarii 4-hidroxi-ciclohaxanonei si a unor eteri ai sai a pus in evidenta transpozitia unei grupari OH sau OR (schema de mai jos). Daca consideram ca si exemplu chiar cazul fragmentarii 4-hidroxi-ciclohaxanonei, aceasta va conduce la un fragment cu intensitate mare la m/z=60 (spectru de masa in fig. IV.4.25) :

125

OR

O OR + HO OR CH2

O R O

OH

O OH + HO OH CH2 m/z= 60, 78%

O H
100 29 27

H
55 57

OH 114

43 50 31 41 39 68 73 81 86 70 80 90 96 O

50 20 30 40 50 (m ainlib) Cyclohexanone, 4-hydroxy0 60

65

100

110

120

130

Figura IV.4.25. Spectrul de masa al 4-hidroxi-ciclohaxanonei

Esterii acidului carbonic, unii esteri ,-nesaturati (mai rar) elimina usor CO2 concomitent cu transpozitia restului legat de oxigenul grupei esterice (schema de mai jos). Daca consideram ca si exemplu cazul fragmentarii etil-2-metoxifenilcarbamatului, aceasta va conduce la un fragment la m/z=152 (spectru de masa in fig. IV.4.26) :

126

O R O O

O O O

OR

+ CO2

O O

+ CO2

m/z= 152
100 O 109 124

50

O O

29 41 0 52 65

77

95

152

196

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 (m ainlib) Carbonic acid, ethyl 2-m ethoxyphenyl es ter

Figura IV.4.26. Spectrul de masa al etil-2-metoxifenil-carbamatului

Monoxidul de carbon rezulta prin fragmentarea cetonelor alifatice, aromatice, chinonelor, fenolilor, eterilor fenolici, etc. Daca consideram ca si exemplu ilustrativ cazul 1-metil-antrachinonei (schema de mai jos), fragmentarile de acet tip (eliminari succesive de CO) vor conduce la fragmentele semnificative de la m/z=194 si 166 (spectru de masa in fig. IV.4.27) :

O -CO O m/z=222, 100%, PB

O -CO m/z=194, 24% m/z=166, 21%

127

100 O 165

222

50

39 0

50

63

82 89 97

O 115 126 139 150 177

194 207

30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 (m ainlib) 9,10-Anthracenedione, 1-m ethyl-

Figura IV.4.27. Spectrul de masa al 1-metil-antrachinonei

Eliminarea acidului cianhidric prin fragmentarea aminelor aromatice sau a unor amidine, a sulfului si a acidului sulfhidric prin fragmentarea sufurilor sau disulfurilor au loc de asemenea concomitent cu transpozitii de schelet.

128

V. APLICATII IN MEDICINA JUDICIARA


V.1. Probe care se utilizeaza in medicina judiciara. Generalitati Modalitatea transportat Tipurile de impuritati, produsi de degradare, produsi secundari sau solventi care sunt prezenti in probele de drog/toxic Modalitatea in care proba drogul/toxicul se prezinta: in forma pura, amestec cu alte droguri, cu excipienti, cu adaos de produsi denaturati sau falsificati V.2. Probe biologice V.2.1. Introducere Metabolizarea drogurilor/toxicelor Administrare, transport, absortie, distributie si excretie V.2.2. Fluide biologice Singe, plasma, ser. Urina. Saliva V.2.3. Tesuturi si fluide postmortem Ficat, creier, bila, umoarea vitroasa, continut stomacal V.2.4. Probe neconventionale V.3. Pregatirea probelor V.3.1. Extractia si cromatografia in strat subtire V.3.1.1. Extracia V.3.1.2. Cromatografia in strat subtire V.3.2. Pretratamentul si prepararea probelor V.3.3. Derivatizarea chimica in medicina judiciara V.3.3.1. Reactii chimice utilizate in procesul de derivatizare in care drogul/toxicul este conditionat si

129

V.3.3.2. Metode practice de derivatizare V.4. Droguri din opiu si derivati

V.4.1. Introducere V.4.2. Metabolizarea opiaceelor V.4.3. Analiza prin GC-MS in cazul opiaceelor
V.5. Canabioide, Spice/Weed/ierburi a. canabioide naturale: canabis, hasis, marijuana, derivati b. canabioide de sinteza din Spice/Weed/ierburi

V.5.1. Introducere V.5.2. Metabolizarea canabioidelor V.5.3. Analiza prin GC-MS in cazul canabioidelor
V.6. Amfetamine si derivati aminici

V.6.1. Introducere V.6.2. Metabolizarea amfetaminelor V.6.3. Analiza prin GC-MS in cazul amfetaminelor
V.7. Cocaina si derivati

V.7.1. Introducere V.7.2. Metabolizarea cocainelor V.7.3. Analiza prin GC-MS in cazul cocainelor
V.8. LSD si derivati

V.8.1. Introducere V.8.2. Metabolizarea LSD si derivati V.8.3. Analiza prin GC-MS in cazul LSD si derivati

130

V. APLICATII IN MEDICINA JUDICIARA


In toxicologia medico-legala, separarea, identificarea si dovedirea structurii diverselor substante, a capatat o importanta hotaritoare atit in cazul drogurilor ilegale cit si in cazul otravurilor (introduse accidental sau cu scopuri criminale). Evolutia permanent ascendenta a prformantelor instrumentelor folosite in chimia analitica pe parcursul ultimilor ani, a avut o influenta determinanta asupra dezvoltarii tehnicilor de laborator din medicina judiciara. Asa dupa cum s-a mai spus, printre metode instrumentale cele mai utilizate de catre specialistii in medicina judiciara, se numara gaz cromatografia cuplata cu spectrometria de masa (GC-MS). In cele ce urmeaza, pe linga tratarea notiunilor de baza folosite in medicina judiciara in domeniul GC-MS, un accent deosebit se va pune judiciara pe informatiile in domeniu din ultimii 10 ani. Sunt vizate atit metodele de detectare si de analiza a drogurilor cit si a metabolitilor lor in diversele fluide biologice si tesuturi. In prezent pe linga GC-MS, o raspindire destul de larga incepe sa aiba LCMS si GC-MS-MS.

V.1. Probe care se utilizeaza in medicina judiciara. Generalitati


Marea diversitate a probelor utilizate in medicina judiciara (probe biologice, de apa, de sol, etc), rigurozitate impusa de practica judiciara, impune o anumita conduita in prelevarea si pregatirea probelor ce urmeaza a fi analizate. Indiferent ca sunt prezentate ca dovezi in procese, in anchete criminalistice, in depistarea cazurilor de dopaj la sportivi, in accidente de munca, etc., probele trebuie sa indeplineasca anumite standarde si rigori, fara de care nu pot avea valoare judiciara.

131

Pregatirea probelor pentru analiza in medicina judiciara impune prelevarea adecvata a probelor, conversia analititilor din probele de studiat in forma necesara analizei, efectuarea cel putin a unei masuratori analitice ( dar de obicei sunt efectuate doua) si in final analiza, corelarea si interpretarea datelor obtinute. Procesul de pregatire este complicat si de faptul ca probele utilizate sunt mai intodeauna amestecuri complexe si din acest motiv este necesara o cunoastere aprofundata a caracteristicelor lor principale, care sa permita alegerea metodei de analiza cea mai potrivita si pe cale de consecinta si o interpretare corecta a datelor obtinute. Orice greseala in procesul de prelevare si manipularea a probelor poate duce la compromiterea lor. Consumul de droguri a fost si este una dintre provocarile majore ale societatii moderne, atit din punct de vedere social si juridic cit si din punct de vedere al sistemului de sanatate. Costurile globale legate de de abuzul de droguri (costurile cu sanatatea si sociale, costurile legate de criminalitate), au fost estimate a fi de sute de miliarde de euro anual! Si sunt in continua crestere. In cazul drogurilor si toxicelor, ca reguli general valabile pentru toate laboratoarele de criminalistica, trebuie sa se aiba in vedere urmatoarele aspecte: 1. Modalitatea in care drogul/toxicul este conditionat si transportat; 2. Tipurile de impuritati, produsi de degradare, produsi secundari sau solventi care sunt prezenti in probele de drog/toxic; 3. Modalitatea in care proba drogul/toxicul se prezinta: in forma pura, cu excipienti, cu adaos de produsi denaturati sau falsificati.
Modalitatea in care drogul/toxicul este conditionat si transportat

Practica criminologica a demonstrat ca drogul/toxicul poate fi conditionat si transportat in cele mai variate moduri, aceste modalitati fiind limitate doar de imaginatia infractorilor. Asa spre exemplu: extasy ca si tablete, capsule, pudra, mici bolovani; metamfetamina se poate prezenta ca si cristale transparente (Gheata); heroina ca si solutie injectabila, pulbere; clorhidratul de cocaina ca si

132

fulgi, cristale mari, pulbere fina, caramizi; LSD-ul ca si solutie injectabila sau impregnat in hirtie cu porozitate mare (hirtie de filtru); etc.
Tipurile de impuritati, produsi de degradare, produsi secundari sau solventi care sunt prezenti in probele de drog/toxic

O problema importanta ridicata in consumul de droguri ete calitatea lor, deoarece multe droguri contin impuritati. Aceste impuritati pot fi produsi de degradare, produsi secundari sau produsi initiali de sinteza (in cazul drogurilor sintetice), solventi. Identificarea impuritatilor este importanta din punct de vedere al efectelor toxice asupra organismului uman, unele dintre aceste impuritati producind boli grave sau chiar moartea. Asa spre exemplu, in procesul de sinteza a unui analgezic-narcotic (opioid) numit 1-metil-4-fenil-propionilpiperidina (MPPP) apare ca produs secundar (impuritate) 1-metil-4-fenil-1,2,5,6-tetrahydropiridina (MPTP) care este un toxic grav pentru organism, producind simptome ca si in boala Parkinson si moarte. H3C N H3C N

O O MPPP Analgezic-narcotic MPTP Produce moarte

Determinarea provenientei impuritatii nu este intodeauna usor de facut. Asa spre exemplu, in cazul heroinei exista inca diferente de opinii cu privire la provenienta monoacetilmorfinei (MAM). In general este admis ca 6-MAM este produsul de hidroliza al heroinei (produs de degradare) iar 3-MAM este un produs secundar de sinteza care rezulta prin acilarea incompleta a morfinei. Cu toate

133

acestea, s-a demonstrat ca 6-MAM poate fi sintetizat iar 3-MAM poate fi obtinut si prin hidroliza heroinei. Identificarea impuritatilor este importanta si din punct de vedere al investigatiilor criminalistice, deoarece poate furniza informatii importante cu privire la: provenienta probei: sintetica sau naturala; modalitatea de sinteza a drogului; zona din care provine, circulatia drogului.

Daca consideram cazul cocainei, existenta unor impuritati in probe furnizeaza informatii pretioase dupa cum urmeaza: prezenta cis- sau trans- cinamoil-cocainei indica o proba ilicita extrasa din surse naturale; prezenta acidului cinamic indica o proba licita extrasa din surse naturale; prezenta ecgoninei, si/sau metilecgoninei, si/sau benzoilecgoninei, si/sau acidului benzoic, si/sau ecgonidinei, si/sau metilecgonidinei, etilecgonidinei, si/sau metilpseudoecgoninei indica o proba licita extrasa din surse naturale si/sau produsi de degradare; prezenta (+) cocainei, si/sau pseudococainei, si/sau alococainei, si/sau pseudoalococainei indica ca proba de cocaina este de natura sintetica. Zona din care provine drogul, poate fi si ea dedusa din compozitia si cantitatea impuritatilor. Exemplu, compozitia (procentual, %) probelor de heroina (heroina si impuritatile prezente) functie de zona geografica de unde provine este prezentata in tabelul 1.

Tabelul 1. Compozitia hrionei functie de aria geografica de provenienta

Compus Heroina 6-Monoacetil -morfina Acetilcodeina Asia SE 81 2,7 6,2 India 75 4,4 3,0

Tara, compozitie % Pakistan Turcia 51 72 2,2 4,6 4,9 3,7

Iran 72 1,8 5,4

Nigeria 87 4,9 2,2

134

Cit priveste prezenta solventilor in probele de analizat, acestia exista atit in probele licite cit si ilicite, dar in cantitati mai mari in acestea din urma. Cei mai utilizati solventi in izolarea si/sau prepararea drogurilor sunt acetona, eterul si mai rar etanolul, si se gasesc in probele de analizat in proportii variabile, dar mici (sub 1%). S-a constata si o tendinta de a inlocui eterul cu metil etil cetona.
Modalitatea in care proba drogul/toxicul se prezinta: in forma pura, amestec cu alte droguri, cu excipienti, cu adaos de produsi denaturati sau falsificati

Din dorinta de a obtine efecte narcotice mai puternice sau alte tipuri de efecte, adesea drogurile se combina fie intre ele fie cu alte substante. De asemenea in practica criminologica trebuie sa se tina cont si de existenta produsilor de denaturare din probe si de posibilitatea ca anumite anumite droguri sa fie falsificate prin inlocuire cu alti produsi. Amestecul de droguri si respectiv droguri-medicamente, este frecvent intilnit, si are in vedere complementaritatea efectelor halucinogene (sau de alta natura) a substantelor amestectecate. Printre cele mai frecvente combinatii amintim: - heroina penciclidina (PCP) (Sunshine); heroina cocaina (Speedball); heroina - fentermin (Bam);

135

H N

"Sunshine"

"Speedball"

Penciclidina (PCP) Anestezic narcotic + H3 C N O O + O O O O H H H O H O + NH 2

"Bam"

Cocaina Narcotic

Heroina Analgezic narcotic

Fentermine Antiobezitate; efecte secundare: euforic, halucinogen

- morfina tripelenamina (Blue Velvet); pentazocina tripelenamina (Ts and Blues); cocaina metamfetamina (Hits or Loads);
H3C N Morfina H H Analgezic narcotic HO O H H OH + N N Tripelenamina Antihistaminic; efecte secundare: sedativ HO Pentazocina Analgezic nacotic "T's and Blues" N N "Blu Velvet"

136

- exatasy LSD ("candy flipping"); extasy PCP ("elephant flipping"); "candy flipping" O C N N HN LSD CH3 + O H N "elephant flipping" H N

+ O MDMA Penciclidina (PCP) (3,4-Methylenedioxymethamphetamine) Anestezic narcotic (componenta principala a Extasy)

- marijuana (canabis) metaqualona; marijuana penciclidina; droguri alcool; droguri deprimante ale sistemului nervos. O OH + O Tetrahidrocanabinol (componenta principala a Marijuana) N Metaqualone Hipnotic Sedativ efect secundar: halucilogen N

Amestecul de droguri cu excipienti sau cu produsi care denatureaza probele este de asemenea un caz de interes in in medicina judiciara. Ca si excicpienti se folosesc diversi componenti (in diverse forme de agregare) cum ar fi: diluanti, lubricanti, lianti, coloranti, dezintegranti si odorizanti. Iata citeva exemple de excipienti mai des intilniti: zaharuri (glucoza, lactoza, sucroza, fructoza, etc.), caolinul (sulfat de bariu), talc, amidon, celuloza, vitamina C, sulfat de calciu, carbonat de calciu, bicarbonat de sodiu, etc. De exemplu in cocaina de calitate inferioara (crack cocaine) se gaseste o cantitate importanta de bicarbonat de sodiu.

137

Produsi care denatureaza probele sunt destul de utilizati pe piata ilicita a drogurilor pentru a pacali consumatorii. Exemple: in heroina se adauga chinina care da gustul amar al probelor de heroina (pe care de obicei consumatorii il asociaza cu probele autentice); in cocaina contrafacuta se adauga acid benzoic care da miros specific asociat cu probele autentice.

V.2. Probe biologice


V.2.1. Introducere

In mod obisnuit probele biologice utilizate in medicina judiciara sunt fluide biologice si tesuturi. O caracteristica esentiala a probelor biologice o constituie faptul ca ele au o compozitie extrem de complexa iar concentratia drogurilor/toxicelor este extrem de mica. Mai mult de atit, o parte din aceste droguri/toxice sunt metabolizate (partial sau total) ceea ce duce la aparitia in fluidele biologice a unor metaboliti. Exista situatii in care drogul/toxicul se combina cu alte substante prezente in probele biologice facind si mai complicata situatia. Din aceste motive atunci cind un specialist in medicina judiciara analizeaza o proba biologica, trebuie sa aiba in vedere totalitatea acestor aspecte altfel proba devine inutilizabila in medicina judiciara. Cle mai comune fluide biologice sunt singele, plasma sau serul, urina si in ultima perioada saliva. Tesuturile si fluide postmortem (toate tipurile) sunt utilizate atunci cind este posibil iar analiza lor este adeseori dificila. Probele neconventionale, in special par, unghii si oase, au inceput si ele sa cistige teren in medicina judiciara. Alegerea tipului de proba pentru analiza judiciara trebuie facuta cu atentie si nu trebuie subestimata. In tabelul 2 prezentam un exemplu pentru alegerea tipului de proba.

138

Tabelul 2. Probe biologice: alegerea tipului de proba

Tip de proba Bila Continut gastric Creier Ficat Grasimi Muschi Oase Plamini Rinichi Singe Urina Umoare vitroasa

Tipul de drog/toxic Narcotice Drog/toxic ingerat oral Deprimante ale SNC; etanol Toate tipurile Solubile in grasimi; insecticide Toate Intoxicatii cronice cu metale Inahalanti Metale grele Toate Toate Toate

Metabolizarea drogurilor/toxicelor

Odata patruns intr-un sistem biologic, drogul/toxicul sufera procese de metabolizare si degradare (reactii chimice si enzimatice). Acest proces de metabolizare are loc la nivelul anumitor organe si sisteme ale organismului si poate fi considerat ca un proces de autoapara re al organismului, prin care drogurile/toxicele sunt transformate in substante mai putin toxice, cu structura mai simpla (unii autori il considera ca un proce de detoxifiere). In prezent, pentru cvasimajoritatea drogurilor uzulale, caile lor de metabolizare si degradare precum si structura produsilor de metabolizare, sunt cunoscute. Metabolizarea drogurilor este impartita in doua etape: faza metabolica I sau faza reactiilor metabolice, cuprinde reactiile de hidroliza, oxidare si reducere; faza metabolica II sau faza reactiilor de conjugare, care cuprinde procesele de conjugare ale substantelor cu diversi compusi din organism cum ar fi aminoacizi (glutation, glutamina, etc) si acidul glucuronic.

139

HOOC HO HO

O OH

HO Acid glucuronic
(toti substituientii sunt in ecuatorial)

HOOC N H O HS Glutation (GSH)

O H N

NH2 COOH

De obicei in faza I se produc grupari fuctionale care dau reactii de conjugare in faza II. Aceste biotransformari se pot opri la grupari functionale si conjugati ai drogului/toxicului si/sau pot fi mult mai profunde, conducind la produsi cu structura mult mai simpla. Exemplu: metabolizarea benzilpiperazinei (BZP; drog analog morfinomimetic), fig. V.2.1. Astfel, hidroxilarea sau dubla hidroxilare a BZP conduce la metabolitii 1, 2 si 6. Acesti metaboliti sub actiunea enzimei pirocatehin-

O-metil-transferaza (COMT) sufera un proces de metilare conducind la 4-hidroxi3-methoxi-BZP, 7. Toti produsii de hidroxilare ai BZP (1, 2 si 7), sunt transformati in O- glucuronoconjugati 8. Acest proces este realizat sub actiunea coenzimei UDP- acid glucuronic (acid uridin 5-fosfo--D-glucuronic) si este catalizat de enzima UDP-glucuroniltransferaza. Oxidarea BZP conduce initial la aldehida benzoica (8), care este oxidata mai departe la acid benzoic, 10. Acidul benzoic poate rezulta si prin dezaminarea oxidativa a aminelor 4 si 5 (cind initial se formeaza benzaldehida). Acesti produsi de metabolizare se elimina prin urina si se pot determina prin GC-MS. Spectrele de masa ale BZP, piperazinei, benzilaminei si acidului benzoic sunt prezentate in fig. V.2.2-5, sunt usor de recunoscut si interpretat, existind in toate bazele de date.

140

HOOC HO HO HO HO HO HO HOOC O O O P O P O O O O O OH

N O O

HO 8 O- Glucuronoconjugati ai 1, 2, 7
UDP

N N O

UDP-glucuroniltransferaza UDP - acid glucuronic

UDP - acid glucuronic

NH N NH N
enzima COMT

NH

OH N NH

HO OH
6

O OH
7

HO
2

NH
3

HN

NH NH2

BZP

H N

NH2

COOH

10 Figura V.2.1. Schema reactiei de metabolizare a BZP

141
100 91 134

50 56 28 42 65 71 77 60 70 80 90 85 104 120

NH 146

176

10 20 30 40 50 (m ainlib) 1-Benzylpiperazine

15

51

100 110 120 130 140 150 160 170 180 190

Figura V.2.2. Spectrul de masa al BZP


100 44

50

29 56

HN NH 86 42

15 10 20 (m ainlib) Piperazine 0 30 40 50 60 70 80

83 90 100

Figura V.2.3. Spectrul de masa al piperazinei


100 106

H2N 50 79 30 39 20 30 (m ainlib) Benzylam ine 0 40 51 50 60 65 70 74 80 77 91 89 90 100 104 110 120

Figura V.2.4. Spectrul de masa al benzilaminei

142

100 77 HO O

105

122

51 50

27 20 30 (m ainlib) Benzoic Acid 0

39 45 40 50 60

65 70

74

94 80 90 100 110 120 130

Figura V.2.5. Spectrul de masa al acidului benzoic

In tabelele 3 si 4 prezentam principalele biotransformari corespunzatoare fazelor metabolice I si II.


Tabelul 3. Probe biologice: biotransformari corespunzatoare fazei I

Tip de ractie Oxidare ArH -CH3 -CH2-R -C-O(S)-R - CH2-NH2 - CHR-NH2 -NH-R R-C(=S)-R R-S-R Reducere -CH(R)=O -NO2 R-S-S-R Ar-N=N-R Hidroliza -COOR -CONR2

Transformare Hidroxilare Idem Iden O(S)- Desalchilare Desaminare Idem N-Desalchilare Desulfurare Sulfoxidare Reducere aldehide Reducere nitroderivati Reducere sulfuri Reducere azoderivati Hidroliza esteri

Produs care rezulta Ar-OH -COOH -CH(OH)-R C-O(S)-H -CHO -COR -NH2 R-C(=O)-R R-S(=O)-R -CH2-OH(R) -NH2 R-SH R-NH2 -COOH + HO-R -COOH + HNR2

143

Hidroliza amide

Tabelul 4. Probe biologice: biotransformari corespunzatoare fazei II

Gruparea functionala -O(S)H

Reactia conjugata Glucuronoconjugare Glicozidoconjugare Sulfoconjugare Metilare Acetilare

Agentul de conjugare Acid glucuronic Glucoza Sulfate S-Adenozilmetionina; acid tetrahidrofolic-5metilat Acetil coenzima A Acid glucuronic Glucoza Glicina; Glutamina; Ornitina; Taurina Acid glucuronic Sulfate S-Adenozilmetionina; acid tetrahidrofolic-5metilat Acetil coenzima A Glutation

-COOH

Glucuronoconjugare Glicozidoconjugare Aminoacidconjugare Glucuronoconjugare Sulfoconjugare Metilare Acetilare

-NH2

ArX

Glutationconjugare

Administrare, transport, absortie, distributie si excretie

Orice substanta (drog/toxic/medicament, etc) poate patrunde intr-un organism viu pe diverse cai, cele mai importante fiind orala (ingestie), parenterala (intravenos, intramuscular, subcutan, etc), respiratorie, contact cu pielea sau mucoasele. Odata introdus in organism aceste substante sufera fenomentul de absortie, transport, distributie, metabolizare, eliminare. Procesul de absortie a unei substante incepe practic din momentul in care substanta a fost introdusa in tesutul viu, si depinde de tipul substantei (hidrosolubila, liposolubila, marime, pH, etc), modul de administrare, mecanismul de absortie si de locul unde este absorbita majoritar substanta, dupa cum urmeaza:

144

- ingetia orala coduce la o absortie majoritar la nivelul stomacului si intestinului, prin mecanism de difuzie; - inhalarea coduce la o absortie majoritar la nivelul plaminilor, prin mecanism de difuzie si/sau filtrare; - administarea parenterala coduce la absortia cea mai eficienta, administarea intravenoasa introduce direct substanta in circulatie iar administrarea intramusculara si subcutanata presupune difuzia substantei prin muschi sau

tesuturi urmata de intrarea ulterioara in circuitul sanguin; - administarea la nivelul tegumentelor si mucoaselor, coduce la absortia prin difuzie a substantei. Din aceste motive in medicina toxicologica este necesar a se tine cont de aceste aspecte atunci cind se recolteaza probe pentru analize. Este unanim acceptat astazi ca majoritatea substantelor pot fi detectate din probe de singe, dar in functie si de perioada de timp care a trecut de la administrarea substantei. Odata ajunse in singe substantele sunt distribuite spre diverse tesuturi. Procesul de distributie dpinde din nou de tipul substantei, de tipul tesutului, etc. In tabelul 5 este prezentat un exemplu privitor la distributia (procentual) a cocainei si amfetaminei in diverse organe (valori medii).
Tabelul 5. Probe biologice: distributia cocainei si amfetaminei in singe, diverse organe si urina

Drog Amfetamina Cocaina

pKa drog 9,9 8,6

Singe 9 5

Creier 3 7

Ficat 30 5

Rinichi 17 15

Urina 35 50

Practic, majoritatea substantelor ajung prin singe in ficat, unde fie sunt metabolizate fie sunt excretate ca atare inapoi in singe sau in bila, de unde sunt eliminat prin materii fecale si urina. In principiu, substantele hidrosolubile se elimina in bila si apoi in fecale, pe cind cele liposolubile sunt retrimise in singe si se elimina prin urina.

145

V.2.2. Fluide biologice

Fluidele biologice sunt practic cele mai utilizate probe specialistii in domeniu.

in medicina

judiciara si de aceea buna lor cunoastere este o sarcina obligatorie pentru toti Analiza acestor probe depinde de mai multi factori, dar in general este admis ca cu cit o proba este mai fluida cu atit este mai usor analizata. In tabelul 6 este presentata ordinea descrescatoare a scaderii fluiditatii probelor biologice. Se observa ca cel mai usor de anlizat va fi lichidul cefalorahidian (LCR) si cel mai greu sunt oasele. Singele se afla undeva in a doua jumatate, si de aceea ait cit se poate este de evitat.
Tabelul 6. Fluide biologice: ordinea descrescatoare a scaderii fluiditatii

Lichide

LCR Lacrimi Sudoare Saliva Urina Bila Plasma/ser Singe Materii fecale Inima/ficat/rinichi Plamini/muschi Oase
Singe, plasma, ser

Amestec

Singele este un fluid cu o compozitie extrem de complexa, fiind, datorita utilitatii si accesibitatii lui, cel mai utilizat tip de proba in medicina judiciara moderna. Principalii constitenti ai singelui, eritrocitele (singele rosu) si fluidul clar (plasma sau serul), pot fi separati cu usurinta prin centrifugare. In practica

146

toxicologica este preferata utilizarea plasmei, desi sunt cazuri in care este necesara utilizarea ambelor componente majore ale singelui. Chiar in cazul utilizarii plasmei, deoarece ea contine un amestec complex de proteine si adeseori substantele se leaga de proteine, analiza directa a plasmei nu va da continutul total in substanta. Din acest motiv, adesea proteinele plasmatice se denatureaza inainte de a fi extrase cu un solvent organic.
Urina

Spre deosebire de singe/plasma, urina are un continut mult mai mic de proteine ceea ce o face mult mai usor de analizat (in prealabil se face extractie din urina cu un solvent organic). Desi mult mai usor de analizat, folosirea probelor urinare ridica o serie de probleme, deoarece interpretarea rezultatelor este complicata de mai multi factori cum ar fi: cantitatea de urina, pH-ul acesteia, si timpul care a trecut de la administrarea substantei. Cu toate acestea folosirea probelor de urina este larg folosita in special in cazul tetarilor de medicamente si la determinarea dopingului la sportivi.
Saliva

Folosirea probelor de saliva prezinta avantaje si dezavntaje comparativ cu probele clasice de singe si urina. Probele de saliva se utilizeaza fara a fi nevoie de extractie, pot fi determinate atit substantele cit si metabolitii lor, colectarea lor este mai putin invaziva, degradarea probelor decurge mai greu.
V.2.3. Tesuturi postmortem

Alegerea unui tesut postmortem pentru analiza depinde de tipul de drog/toxic/medicament cautat. Asa spre exemplu, in cazul in care se suspecteaza o moarte datorita unei supradoze de morfinomimetice este recomandata folosirea ca si proba de analizat a bilei, in cazul otravirilor cu cianuri si solventi se prefera probele de creier iar pentru otraviri cu metale grele se prefera probe din rinichi.

147

Cele mai utilizate tesuturi postmortem pentru analize sunt recoltate din ficat, creier, bila, umoarea vitroasa, singe, continut stomacal precum si muschii si rinichii (mai putin utilizati).
Ficatul si bila

Ficatul este unul din organele preferate in analiza forensica, in special in cazul drogurilor. Fiind un organ vascularizat puternic, concentratia drogurilor este in general egala cu cea din plasma. Unele droguri pot fi gasite ca atare sau sub forma de metaboliti in bila, cazul opiaceelor.
Creierul

In cazul otravirilor cu cianuri si solventi creierul este organul preferat pentru analize. De asemenea, creierul fiind relativ rezistent la putrefactie, este organul preferat in analiza de droguri atunci cind analiza se face la citeva zile dupa moartea persoanei.
Umoarea vitroasa

Ca si in cazul creierului, umoara vitroasa este rezistenta la putrefactie si in consecinta probele sunt mai usor de analizat. Trebuie sa se tina cont ca umoarea vitroasa este slab acida si in consecinta substantele usor bazice se vor gasi in concentratii marite.
Continut stomacal

Continutul stomacal da informatii atit asupra tipului de substanta ingerata cit si asupra modului de adminstrare. Preznta de urme sau lipsa unui drog/toxic/medicament indica ca ruta de administrare este alta decit cea orala. Folosirea probelor de tesuturi postmortem este limitata de o serie de dificultati datorate procesului de putrefactie a celulei. Cele mai importante dificultati sunt: 1. Datorita procesului de putrefactie se produc compusi care pot interfera cu substanta (drog/toxic/medicament) de analizat; 2. Exista substante care se descompun in urma procesului de putrefactie; 3. Pretratamentul probelor postmotem poate presupune proceduri mai dure care face ca substanta de analizat sa nu reziste;

148

4. Substantele si metaolitii pot suferi procese de redistributie in tesuturile postmortem, ceea ce ingreuneaza interpretarea datelor obtinute. Substantele rezultate in urma procesului de putrefactie pot avea caracter bazic (amine biogene in special), acid (acizi organici inferiori) sau neutru. De exemplu, din categoria substantelor avind caracter bazic rezultate in urma procesului de putrefactie, unul dintre compusii reprezntativi este feniletilamina, care pot interfera cu substante din clasa amfetaminelor dind reactii fals pozitive.

NH2 Amfetamina

NH2 -Feniletilamina

V.2.4. Probe neconventionale

Sub denumirea de probe neconventionale sunt cunoscute acele probe care sunt utilizate mai rar in medicina judiciara. Aici intra o serie de probe cum ar fi parul, unghiile, oase, o serie de fluide biologice cum ar fi probe de transpiratie, saliva, lichid seminal. Desi extrem de utile, informatiile furnizate din analiza acestor probe pierd mult din valoare datorita faptului ca inca nu exista o standardizare unanim acceptata a metodelor lor de analiza. Dintre aceste tipuri de proba, parul este de departe proba judiciara cea mai utilizata.
Parul

Astazi, GC / MS-ul este deja metoda preferata de analiza a probelor de par, tinzind sa devina una de rutina. Exlicatiia utilizarii pe scara din ce in ce mai larga a firelor de par ca probe in medicina judiciara, consta in avantajele pe care le prezinta: practic toate tipurile de drog/toxic se acumuleaza in par si pot fi detectate ca atare (nu ca metaboliti sau produsi de degradare), perioada de remanenta a

149

drogului in par este mare (saptamini sau chiar luni), probele de par sunt se recolteaza si se pastreaza usor, etc. In Tabelul 7 sunt prezentate sintetic avntajele si dezavantajele utilizarii probelor de urina si par.
Tabelul 7. Avntajele si dezavantajele utilizarii probelor de urina si par

Drog Compus majoritar Perioada de detectie Grad de invazivitate Pastrare probe Risc de alterare a probei

Urina Toate (cu exceptia unor steroizi) Metaboliti 2-5 zile Ridicat 20 oC Mare

Par Toate (cu exceptia hormonilor) Drogul parinte Saptamini, luni Mic Temperatura camerei Mic

Cu toate avantaje incontenstabile pe care le prezinta utilizarea parului in medicina judiciara, utilizarea lui este inca limitata datorita unor neajunsuri: nu se cunosc cu exactitate procesele biochimice de absortie si metabolizare a drogurilor in par; influenta contaminantilor externi. In prezent este admis ca drogurile/toxicele pot intraS in par pe doua cai: incorporarea in procesul de crestere (din singe) si adsorbtie din mediul extern (secretiile din transpiratie si seebum, expunerea la aerosoli, fum, etc); procedurile de colectare pentru analiza firului de par nu au fost standardizate. In majoritatea studiilor publicate, probele sunt obtinute din puncte aleatorii de pe scalp, cel mai adesea din zona de la partea din spate a capului, numit vertex posterior .

150

V.3. Pregatirea probelor


Pregatirea probelor reprezinta o etapa de important cruciala in analiza GC/MS. Pregatirea probelor este o operatiune complexa care necesita din partea specialistului care efetueaza aceasta operatiune cunostinte avansate de separatologie, si in special o temeinica stapinire a operatiilor/metodelor de baza privind izolarea si purificarea compusilor organici. Doua dintre aceste metode sunt indispensabile pentru specialistii in medicina judiciara: extractia si cromatografia.

V.3.1. Extractia si cromatografia in strat subtire


Pregatirea probelor pentru analizele medicolegale GC-MS (si nu numai) presupune cunoasterea notiunilor fundamentale privitoare la extractie si cromatografie, ca metode de baza pentru izolarea si purificarea compusilor.
V.3.1.1. Extracia

Extracia este una din operaiile de baz ale practicii chimiei organice fiind una din principalele metode de separare i purificare a substanelor organice. Extracia este operaia prin care unul sau mai muli componeni ai unei faze (lichide sau solide) sunt transferai ntr-o alt faz (lichid), nemiscibil sau parial miscibil, adus n contact cu prima. n funcie de starea de agregare a produsului din care se face extracia, se deosebete: 1. extracia solid lichid (elutriere); 2. extracia lichid lichid; 3. extracia gaz lichid.

151

Repartiia unei substane dizolvate n doua faze este dat de legea de distribuie a lui Nernst ce const n raportul concentraiilor la echilibru a substanei n cele dou faze lichide (A i B) nemiscibile ce este constant la o temperatur dat.

CA = K , unde K coeficient de repartiie. CB


ns, legea lui Nernst nu este valabil la concentraii mari ci numai la concentraii mici (comportare ideal) n care substana dizolvat n ambele faze formeaz asocieri identice. Extracia unei substane se realizeaz cu succes atunci cnd substana de separat este mult mai solubil ntr-una din faze dect n cealalt, adic K difer mult de valoarea 1. Astfel atunci cnd K<100 o singur extracie nu mai poate fi eficient i trebuie repetat de mai multe ori cu o soluie proaspt. n cazul n care avem de-a face cu dou substane ai cror coeficieni de repartiie (K1 i K2) sunt net diferii, atunci separarea se realizeaz printr-o extracie simpl.
K1 K2

Atunci cnd 100 substanele se pot separa mulumitor dintr-o singur extracie, iar cnd 100 se apeleaz la un procedeu multiplicativ. Deoarece, schimbul de substan se realizeaz numai la interfaa de separaie a celor dou faze, pentru a mri viteza de repartiie este necesar o agitare energic i o interfa ct mai mare. Din pcate, n majoritatea cazurilor (n special n cazul substanelor solide) echilibrul de repartiie nu poate fi atins n totalitate.
Extracia solid lichid

Extracia solid-lichid urmrete separarea unei substane organice ntr-un anumit solvent n care componentul este solubil. Un solvent bun pentru extracie

152

trebuie s ndeplineasc urmtoarele condiii: s solubilizeze cu uurin substana de extras; s fie selectiv; s nu reacioneze cu substana de separat; s asigure o ndeprtare facil dup extracie; s fie ieftin i disponibil comercial. Se cunosc diverse procedee de extracie a solidelor cu solveni. Extracia din substane solide cu ajutorul solvenilor se realizeaz cu ajutorul mai multor tipuri de operaii:
Macerarea i digerarea Macerarea este cel mai simplu procedeu de extracie ce const n

amestecarea fazei solide cu solventul urmat de filtrarea soluiei obinute. Acest procedeu necesit o dispersare ct mai accentuat a substanei solide prin adugare repetat de solvent i agitare continu.
Digerarea este de fapt macerarea la cald.

Ambele operaii pot fi realizate cu uurin deoarece nu necesit aparatur complicat, avnd nevoie doar de un pahar Berzelius n care se face extracia i plnie Bchner i flacon Erlenmeyer de vid pentru realizarea filtrrii. Cele dou procedee sunt des folosite n extracia substanelor organice din plante sau organele animale.
Procedeul Soxhlet
3

Pe scar larg se aplic extracia continu n aparatur special (extractoare Soxhlet) n care, de obicei, solventul proaspt este furnizat prin fierberea extractului. Extractorul Soxhlet se compune dintr-un balon (1), un corp de extracie (2) i un refrigerent ascendent (3), legate ntre ele. Materialul solid, mrunit n prealabil pentru ca solventul

Extractor Soxhlet

153

s vin n contact cu o suprafa ct mai mare, se aeaz n spaiul de extracie, fie introdus ntr-un cartu special de hrtie de filtru, fie vrsat direct n spaiul de extracie prevzut cu un fund de sticl poroas. Faza extractoare (solventul) din balonul de fierbere distil printr-un tub lateral, prevzut eventual cu o izolaie termica, iar vaporii condensai n refrigerentul de reflux picur peste materialul din cartu. Cnd spaiul de extracie se umple pn la nlimea stratului de preaplin, soluia cu extract trece prin sifonare n balonul de fierbere i procesul se repet. Uneori sunt suficiente cteva ore pentru extracia complet, ns la substanele care trec mai greu n soluie sunt necesare chiar cteva zile. La unele aparate Soxhlet, de construcie imperfect, se ntmpl ca, dup umplerea tubului de preaplin, soluia cu extract s nu se scurg dintr-o dat, ci numai n picturi, n ritmul n care picur dizolvantul din refrigerentul de reflux. Acelai defect apare i atunci cnd cartuul de extracie este greu permeabil, sau dac este lipit de gura sifonului. Acest defect nrutete extracia. El se poate nltura suflnd n refrigerent. Principalii factori care influeneaz o extracie solid lichid sunt: solubilitatea solidului n solvent; viteza de transfer a solidului n faz lichid.

Solubilitatea solidului n solvent poate fi influenat din exterior prin alegerea unor solveni adecvai. Viteza de transfer a solidului n faza lichid depinde de mai multe fenomene i mrimi fizice, ca de exemplu mrimea granulelor solidului, sistemul cristalin, viteza de ptrundere a solventului n solid, difuzia substanei solide n lichid, etc. Extraciile uzuale de laborator vizeaz influenarea, n sens favorabil, a trecerii solidului n solvent, de exemplu prin mrirea suprafeei solide, prin extracie continu cu solvent proaspt, prin agitare viguroas. Ridicarea temperaturii mrete att solubilitatea compusului (fenomen termodinamic), ct i viteza sa de transfer n faza lichid (fenomen cinetic). Extracia alcaloizilor din frunze, a substanelor aromate din semine, a esenelor de parfum din flori, a zahrului din trestia de zahr se constituie drept

154

exemple de extracii solid lichid, utilizate n industria chimic organic pentru separarea i izolarea substanelor din amestecuri naturale. Solvenii utilizai n mod frecvent sunt: CH2Cl2, CHCl3, CS2, CH3COCH3, alcooli, apa.
Extracia lichid lichid

Extracia lichid-lichid operaia este cea mai des aplicat, n laborator i industrie, n scopul separrii i concentrrii unor componeni din faza iniial, unde acetia se aflau alturi de impuriti. Aceast operaie are la
baz diferena de solubilitate a componentului extras n unul sau mai muli solveni nemiscibili sau parial miscibili ntre ei.

Faza care conine iniial componenii interesai se numete faz de


extras, iar faza cu care aceasta se aduce n contact poart numele de faz extractoare sau solvent. La terminarea extraciei, faza care a preluat

componenii se numete extract iar faza rmas rafinat. Alegerea unui solvent bun pentru extracie, nu se face ntmpltor, impunndu-se urmtoarele condiii: s solubilizeze foarte bine substana de extras; s fie, pe ct posibil, nemiscibil cu solventul din care substana trebuie extras; s extrag ct mai puine impuriti; s fie uor de eliminat dup terminarea extraciei; s nu reacioneze cu substana ce trebuie extras; s fie accesibil i la un pre de cost ct mai redus.
Echilibre de repartiie. Coeficient de repartiie

Se consider un compus de extras A ce este solubil n doi solveni nemiscibili sau parial miscibili ntre ei. ntr-o prim etap peste soluia iniial a
compusului A se adaug cel de-al doilea solvent curat i astfel moleculele

155

compusului de extras A vor strbate suprafaa de separaie, trecnd n cel de-al doilea solvent. Pe msur ce concentraia de A n cel de-al doilea solvent crete, ncepe i procesul invers de trecere a moleculelor de A napoi n primul solvent. Dup un timp viteza celor dou procese este egal, compoziia n cele dou faze rmnnd constant, i astfel se stabilete un echilibru dinamic de repartiie atunci cnd compusul de extras A se gsete distribuit n anumite proporii n ambii solveni. Prescurtrile uzuale, cele mai des ntlnite, sunt urmtoarele: R rafinat; S extract; CR Concentraia componentului A n stratul R; CS Concentraia componentului A n stratul S; Coeficientul de repartiie K reprezint raportul dintre concentraia CS a componentului A n stratul S i concentraia CR a componentului A n stratul R.
K= CS CR

n condiiile n care considerm AS i AR ca fiind cantitile absolute de


component A dizolvate n cei doi solveni, iar VS i VR volumele solvenilor respectivi, atunci concentraiile CS i CR se pot exprima astfel:
CS = AS A i respectiv CR = R VR VS

i n aceste condiii coeficientul de repartiie K va lua urmtoarea form:


AS V A V K= S = S R AR AR VS VR

Deoarece coeficientul de repartiie K nu indic mrimea cantitilor de component A distribuite n cei doi solveni, ntruct acestea depind i de volumele de solvent, prin rearanjarea relaiei de mai sus se obine:
AS V = K S = G , unde G este cifra de repartiie. AR VR

156

n calcule, cantitile absolute AS i AR sunt nlocuite cu cantitile relative p i q, cu remarca c p+q = 1:


p= AS A 1 G = ; q= R = Atotal G + 1 Atotal G + 1

Extracia lichid-lichid n laborator

Pentru o extracie ct mai eficient se recomand se recomand efectuarea mai multor extracii succesive cu poriuni mici din cantitatea total de solvent de extracie. n laboratoare extraciile se efectueaz prin agitarea soluiei cu solventul de extracie n plnii de separare, care datorit formei specifice ofer o suprafa de separaie mare se fac prin agitarea soluiei cu solventul de extracie. Este recomandat ca umplerea cu lichid a plniei de separare s nu se fac mai mult de din volumul su. Pentru o extracie eficient este necesar asigurarea unui contact optim ntre cele dou faze este necesar agitarea intens a plniei timp de 3-5 minute, dup care aceasta se las n repaus pn la separarea complet a celor dou faze. n cazul apariiei de emulsii nu mai este recomandat agitarea, ci n acest caz este suficient efectuarea unor micri circulare n plan orizontal. Din timp n timp este necesar efectuarea aerisirii, prin inversarea poziiei plniei i deschiderea temporar a robinetului. Aceast operaie este absolut necesar mai ales n cazul solvenilor extrem de volatili (eter etilic, eter de petrol etc.). Dup separarea complet a celor dou faze, se scoate dopul de la partea superioar a plniei i faza inferioar este separat cu grij ntr-un flacon
Stativ Pahar Berzelius Palnie de separare
robinet corpul plniei dop rodat

157

Erlenmeyer sau Berzelius. Chiar dac numai una din faze prezint interes, dup terminarea separrii vor fi pstrate ambele faze pn cnd avem dovezi certe c substana vizat se gsete acolo unde trebuie. Faza apoas poate fi uor deosebit de faza organic nemiscibil pe baza densitilor celor dou faze (faza cu densitatea cea mai mare va constitui faza inferioar), sau i mai simplu prin efectuarea unui simplu test de laborator, prin adugarea ctorva mililitri de ap ntr-o eprubet i colectarea ctorva picturi din faza inferioar, astfel faza apoas va forma o soluie omogen , iar faza organic un sistem bifazic. Atunci cnd limita de separaie dintre cele dou faze se apropie de robinet, se reduce mult viteza de separaie. La final, pentru a se evita o eventual impurificare, faza superioar se toarn prin gura plniei ntr-un alt flacon, faza organic se usuc utiliznd un agent de deshidratare convenabil (Na2SO4 anh., CaCl2 anh., MgSO4 anh. etc.), iar ulterior se ndeprteaz solventul prin distilare.
V.3.1.2. Cromatografia in strat subtire - metode cromatografice

Cromatografia este o metod de separare i purificare a substanelor organice, introdus relativ recent n practica de laborator. Denumirea de cromatografie a fost dat de botanistul rus vet i n limba rus nseamn culoare. vet a aplicat aceast metod la separarea coloranilor vegetali (clorofile, carotinoide) printr-o coloan cu carbonat de calciu. Cromatografia se bazeaz pe repartiia diferit a moleculelor ntre o faz staionar i o faz mobil. n funcie de afinitatea fa de faza staionar i cea mobil, diferitele specii moleculare ale unui amestec sunt antrenate cu viteze diferite, prin deplasarea fazei mobile, realizndu-se astfel separarea lor. n funcie de natura solid, lichid sau gazoas a acestor faze, au fost dezvoltate mai multe tehnici cromatografice. Dintre acestea cele mai utilizate de chimistul organician sunt:

158

1. Cromatografia n strat subire (Thin layer chromatography, TLC); 2. Cromatografia solid-lichid pe coloan (Liquid column chromatography, LC); 3. Cromatografia gaz-lichid (Gas liquid chromatography, GLC sau GC); 4. Cromatografia lichid de nalt performan (High performance liquid
chromatography, HPLC)
1. Cromatografia n strat subire

Primele ncercri n acest domeniu dateaz din anul 1938 i aparin lui Izmailov i Schraiber, iar prima carte a fost publicat n 1962 de ctre Stahl. Dei intrat relativ trziu n practica de laborator, cromatografia n strat subire s-a dezvoltat foarte rapid. Astfel ntr-un timp foarte scurt ea s-a impus ca o extrem de util att n cercetare ct i n producie. Ca principiu i ca tehnic, cromatografia n strat subire se aseamn foarte mult cu cromatografia pe coloan. n acest caz, faza staionar este un adsorbant (silicagel, alumin) dispus pe un suport plan din sticl sau metal, iar faza mobil circul de obicei prin capilaritate. Cromatografia n strat subire este o metod util, utilitatea acesteia rezid din urmtoarele avantaje: Permite separri pentru cantiti foarte mici de substan (0,01 g); Este o metod accesibil i uor de realizat; Se efectueaz ntr-un timp scurt; Permite separarea substanelor instabile; Permite analiza simultan a mai multor probe; Permite analiza stadiului unei reacii chimice; Direct pe placa cromatografic se pot efectua reacii chimice, cum ar fi: oxidri, reduceri, deshidratri, etc.
Tehnica general a cromatografiei n stat subire

159

Aceast tehnic a fost pus la punct de Stahl i const n obinerea unui strat de adsorbant (silicagel, oxid de aluminiu) de aproximativ 250 m grosime pe o plac de aluminiu sau sticl de dimensiuni variabile. Numrul adsorbanilor folosii ca faz staionar este relativ redus. Adsorbanii se pot clasifica n adsorbani anorganici i adsorbani organici. Dintre acetia, adsorbanii anorganici sunt cel mai des folosii deoarece sunt adsorbani puternici comparativ cu adsorbanii organici ce sunt n general adsorbani slabi. Adsorbantul trebuie s aib o suprafa specific mare, respectiv o granulaie fin, (sub 100 m) i numr mare de pori pe diametru mic.
Pregtirea plcuelor

ntr-un flacon Erlenmeyer de 200 ml se introduc 25 g silicagel G (cu gips) peste care se adaug o soluie format din 50 ml ap i 0,5 g amidon. Se agit flaconul 1-2 minute i apoi coninutul se toarn pe o plac din sticl de mrime 20/20 cm i se omogenizeaz ct mai bine prin micri de translaie (balansare), iar la sfrit se poate da i cu o baghet din sticl pentru o omogenizare mai bun. Se las placa s se usuce 24 ore la temperatura camerei i apoi se usuc timp de 30 minute n etuv la temperatura de 105 - 110C. Se las apoi la rcit i se utilizeaz ct mai repede.
Modul de lucru:

Pentru realizarea cromatografiei n strat subire trebuiesc parcurse urmtoarele etape: a) Se traseaz cu creionul linia de start pe care ulterior va fi aplicat substana. Linia de start se traseaz la aproximativ 1 cm de captul inferior al plcuei cromatografice. b) Se taie placua cromatografic n funcie de numrul de probe ce urmeaz a fi aplicate.

160

c) Se taie cu foarfecele colurile colurile plcuei la un unghi de aproximativ 45o, pentru ca migrarea solventului sa fie uniform n linie dreapt. d) Amestecul de substan de analizat se dizolva ntr-un solvent ct mai nepolar i uor volatil. Folosirea solvenilor volatili prezint un dublu avantaj: pe de o parte evit efectele nedorite de difuzie i pe de alt parte permite creterea concentraiei substanei n punctul de aplicare, datorit evaporrii rapide a solventului. e) Aplicarea substanei pe plcua cromatografic se realizeaz cu ajutorul tuburilor capilare pentru a se realiza concentrarea substanei pe o suprafa minim. n toate cazurile, indiferent de solventul folosit, este necesar ndeprtarea complet a dizolvantului nainte de nceperea eluiei.
Elueni folosii

Deoarece viteza de migrare a unei substane pe un adsorbant ct i rezoluia separrii depind de eluentul sau amestecul de elueni folosii, acesta trebuie s ndeplineasc mai multe condiii: S permit oinerea valorilor Rf ale componentelor de separat ntre 0,05 i 0,9; S separe complet toate componentele din amestec; S nu produc transformri chimice ale substanelor de separat; Nu trebuie s reacioneze cu reactivii de identificare. In tabelul 8 sunt prezentate citeva amestecuri eluotrope mai des utilizate in cromatografie.
Tabelul 8. Amestecuri uzuale de solveni pentru cromatografie

Hexan Hexan clorur de metilen =5:2 Benzen Benzen cloroform = 1:1

Cloroform metanol = 95:5 Cloroform aceton = 7:3 Benzen acetat de etil = 1:1 Acetat de butil metanol = 99:1

161

Cloroform Ciclohexan acetat de etil = 8:2 Cloroform aceton = 95:5 Benzen aceton = 9:1 Ciclohexan acetat de etil = 1:1 Ciclohexan ester pentru testri = 8:2 Benzen aceton = 8:2 Cloroform metanol = 9:1 Cloroform aceton = 4:6 Benzen acetat de etil = 1:1 Cloroform eter = 6:4 Acetat de butil
Developarea

Benzen eter = 1:9 Eter metanol = 99:1 Eter Eter dimetil formamida = 99:1 Acetat de etil Acetat de etil metanol = 99:1 Benzen aceton = 1:1 Cloroform metanol = 9:1 Dioxan Aceton Metanol Dioxan ap = 9:1

Dup ce a fost pregtit plcua cromatografic, aceasta se introduce n cuva cromatografic (de forma paralelipipedic sau cilindric). Plcua cromatografic se imerseaz n cuva cu eluent cu captul la care s-au aplicat probele, iar cuva se acoper pentru a asigura n interiorul cuvei o atmosfer saturat n vapori de eluent. Este recomandat ca stratul adsorbant s fie imersat ct mai puin posibil (3-4 mm, astfel nct eluentul s nu depesc linia de start). Oprirea developrii se realizeaz atunci cnd frontul solventului ajunge la aproximativ 1 cm de marginea superioar a plcua cromatografice. Se scoate placua cromatografic din cuv i se marcheaz cu un creion frontul solventului (linia pna la care a urcat solventul pe plcu). Plcua cromatografic se usuc dup developare n curent de aer liber sau n curent de aer cald (feon), n funcie de volatilitatea eluentului.
Identificarea compuilor dup developare

162

Cel mai simplu caz este cel al compuilor colorai, care se observ direct pe cromatogram, ns se ntlnesc situaii n care compuii, pentru a putea fi vizualizai, trebuie expui radiaiei ultraviolete (UV). Exist i compui care trebuiesc scoi n eviden prin reacii de culoare specifice gruprilor funcionale. n aceast situaie pe cromatogram se aplic reactivii de culoare, fie prin pulverizare, fie prin imersia plcuei cromatografice n soluia acestora. Dup uscare se observ diferite spoturi, corespunztoare componentelor din amestecul de analizat.
Determinarea valorilor Rf

Poziia unui spot pe plcua cromatografic se exprim printr-o mrime ce caracterizeaz substana, i o difereniaz de celelalte, mrime numit factor de vitez (Rf) i care se definete ca raportul dintre distana parcurs de spotul substanei i distana parcurs de developant (vezi Figura V.3.1.). Rf=XS/XD 0 Rf 1 Unde: XS reprezint distana parcurs de la zona de start pn la punctul unde ea se gsete n momentul opririi developrii. XD reprezint distana parcurs de la zona de start, de frontul developantului n acelai interval de timp.
Linia developantului Rf 1= Xs 1 / X D Rf 2=Xs 2/X D

XD Xs1 Xs2

Linia de start

Figura V.3.1. Separarea izomerilor geometrici prin cromatografie n strat subire

2. Cromatografia solid-lichid

163

Mecanismul de separare a substanelor

Se bazeaz pe repartiia diferit a componenilor unui amestec ntre o faz staionar (solid adsorbant sau lichid depus pe suprafaa unui adsorbant) i o faz mobil (lichid, eluent). Faza mobil strbate faza staionar, iar astfel componenii amestecului de separat vor fi repartizai diferit n funcie de viteza lor de migrare. Cu ct componentul este mai puin adsorbit pe faza staionar cu att viteza de migrare este mai apropiat de cea a fazei mobile, iar cu ct componentul va fi mai puternic adsorbit pe suprafaa fazei staionare cu att moleculele sale vor sta un timp mai ndelungat imobile. Afinitatea diferit a componentelor dintr-un amestec fa de faza staionar difer n funcie de capacitatea de adsorbie a fazei solide. Substana solid care adsoarbe se numete adsorbant. Astfel, se deosebesc adsorbani polari i nepolari: adsorbani nepolari: crbune activ, anumite rini organice (de exemplu wofatit EW); adsorbani polari: oxid de fier (Fe2O3), oxid de aluminiu (Al2O3), silicagel, hidrai de carbon (amidon, zahr, celuloz). Dintre aceti adsorbani o importan deosebit o au cei polari. Adsorbanii polari au afinitate mare fa de componentele polare din amestec, acestea fiind puternic adsorbite pe suportul solid, iar componentele nepolare sunt antrenate foarte uor de faza mobil. Pe lng polaritate, adsorbabilitatea substanelor organice depinde i de mrimea moleculelor i polarizabilitatea lor. Astfel se pot ordona substanele organice n ordinea cresctoare a afinitii lor fa de adsorbanii polari: derivai halogenai ai hidrocarburilor < eteri < amine teriare, nitroderivai < esteri < cetone, aldehide < amine primare < amide acide < alcooli < acizi carboxilici. Aceleai consideraii sunt valabile i pentru solveni adic o substan organic se adsoarbe mai puternic dintr-un solvent nepolar dect dintr-unul polar.

164

Astfel substana adsorbit va fi dezlocuit de moleculele de solvent, dac acestea au afinitate mai mare fa de adsorbant dect de substan. Pentru o selecie cat mai uoar au fost stabilite serii eluotrope, corespunztor cu creterea polaritii (Tabelul 9).
Tabelul 9. Seria eluotrop

1) eter de petrol 2) hexan, ciclohexan 3) sulfur de carbon 4) tetraclorur de carbon 5) dicloretilen 6) toluen 7) benzen 8) clorur de metilen 9) cloroform 10) eter etilic

11) tetrahidrofuran 12) acetat de etil 13) aceton 14) metiletilceton 15) n-butanol 16) etanol 17) metanol 18) ap 19) acid acetic glacial 20) piridin

Condiia principal impus solvenilor este anhidritatea complet, deoarece urmele de ap reduc semnificativ calitile de adsorbie ale fazei staionare.

V.3.2. Pretratamentul si prepararea probelor


Conversia analititilor din probele de studiat in forma necesara analizei este cunoscuta in literatura de specialitate ca si operatiunea de pretratament. Este o opreratiune dificila si laborioasa in special datorita faptului ca drogul/toxicul se gaseste aproape intodeauna impreuna in amestec cu alte substante, in asa zise matrici. In cazul compusilor de sinteza drogul/toxicul se gaseste combinat cu diversi excipienti si/sau substante falsificate, iar pentru compusii naturali din plante

165

cu alte substante din planta. In plus, in plante cantitatea de drog/toxic este foarte mica, in cele mai multe cazuri sub 1% din masa plantei. In cazul probelor biologice (singe, urina, etc) drogul/toxicul se gaseste fie sub forma conjugata (ex. glucuronoconjugat) fie ca metabolit, si doar foarte rar ca atare. In plus, ca si la plante, cantiatea de drog/toxic din probe biologice este - este mica. Din aceste motive, in cazul probelor biologice, de obicei, sunt necesari mai multi pasi in pregatirea probelor: se realizeaza intii scindarea substantei din conjugat. Aceasta se realizeaza prin hidroliza acida (metoda este rapida), enzimatica (metoda este lenta) si foarte rar bazica (posibila doar ca conjugatii de tip esteric); urmeaza apoi izolarea. Aceasta se face fie prin extractie, fie cromatografic, fie, foarte rar, prin cristalizare. Date pe larg despre aceste aspecte au fost prezentate anterior la V.3.1. ; in unele cazuri este necesara o etapa suplimentara denumita derivatizare. Mai precis atunci cind compusii sunt polari (compusi contin grupari carboxilice, hidroxilice, tiolice, amino primare si secundare, etc.) sau au o grupa puternic electronegativa (ex. CF3; halogen, etc), derivatizarea se impune cu necesitate. Principalele procedee de derivatizare sunt : a. Pentru droguri/toxice avind caracter bazic: acetilarea, trifluoroacetilarea, pentafluoropropionilarea, heptafluorobutirilarea, trimetilsililarea; b. Pentru droguri/toxice avind caracter acid: metilare, pentafluoropropionilarea, trimetilsililarea, tert-butildimetilsililare. Asupra derivatizarii vom reveni pe larg in capitolul urmator. Referitor la extractia drogurilor/toxicelor din probe, mai trebuie precizat ca uneori este necesara modificarea pH-ului probei astfel incit sa se realizeze trecerea drogului in faza organica. pH-ul necesar se poate calcula cu ajutorul ecuatiei Henderson-Hasselbach: pH = pKa + log ( [A-]/[HA] ) unde: pH- este pH-ul solutiei analizate;

166

pKa- este pKa-ul drogului/toxicului; A- - este forma bazica (ionizata) a drogului/toxicului; HA este forma acida (neionizata) a drogului/toxicului. Cunoscind pKa-ul drogului/toxicului si valoarea pe care o dorim pentru concentratia drogului/toxicului in forma neionizata (HA), se poate calcula cu usurinta pH-ul optim pentru trecerea in faza organica. Prezentam mai jos (Tabele 10, 11) citeva sisteme extractive mai des utilizate pentru droguri si pentru si pentru extractii din materii prime vegetale (plante).
Tabelul 10. Sisteme extractive pentru droguri, in mediu acid sau bazic

Drogul extras Morfina; hydromorfona; pentazocina; cocaina

Sistem extractiv folosit NH4OH-saturat/cloroform

Amfetamina; metamfetamina; 3,4-metilen- NH4OH-saturat/hexan dimetoxiamfetamina; meperidida; efedrida Herona; cocaina; pentazocina; meperidina; HCl-saturat/cloroform penciclidina Cocaina NH4OH-saturat/eter de petrol

Tabelul 11. Sisteme extractive pentru izolarea drogurilor din materii prime vegetale

Material din plante Canabis

Drog Solventul si procedeul de extractie Canabioide Cloroform (temperatura camerei); Eter petrol (temperatura camerei); Etanol (Soxhelet) Cocaina Morfina Cloroform/eter de petrol/metanol (temperatura camerei) (2:1:1)

Frunze coca Opiu

Metanol (reflux); Sonicare in prezenta acid acetic 5%, apoi extractie cu cloroform/metanol (3:1) la pH 8,5

V.3.3. Derivatizarea chimica in medicina judiciara

167

Derivatizarea se defineste ca fiind procesul de conversie a unui analit dintr-o proba de studiat in o forma diferita a sa, care poate fi analizata prin diverse metode fizico-chimice. Ideal, in medicina judiciara, analitii din probe trebuie testati in forma lor originala intrucit aceasta permite identificarea calitativa si cantitativa fara nici un dubiu. Din nefericire, in multe cazuri, acest lucru nu este posibil si este necesar procesul de derivatizare chimica; ea este folosita pe scara larga in medicina judiciara, deoarece exista compusi (in special cei cu polaritate mare) ce nu pot fi analizati prin GC-MS in starea lor originala. Derivatizarea poseda o serie de avantaje si dezavantaje, de care trebuie sa se tina cont. Dintre dezavantaje citam: presupune o reactie suplimentara care poate introduce impuritati sau transformari secundare, costuri suplimentare in bani si timp. Insa, avantajele derivatizarii substantelor sunt incontestabile: imbunatatirea unora din proprietatile fizice; imbunatatirea proprietatilor cromatografice, in special a capacitatii de separare; imbunatatirea capacitatii de detectie prin spectrometrie de masa.

V.3.3.1. Reactii chimice utilizate in procesul de derivatizare

In principiu atunci cind se efectueaza o derivatizare se are in vedere ca reactia chimica utilizata sa fie cit mai simpla, rapida, sa nu dea produsi secundari, sa decurga cu randamente mari in produsul final si sa nu necesite purificari costisitoare ale acestuia. Cele mai utilizate reactii chimice utilizate in procesul de derivatizare sunt alchilarea, acilarea si sililarea.
1. Sililarea

Sililarea este cel mai utilizat procedeu de derivatizare. Cei mai utilizati reactanti de derivatizare sunt:

168

a. Trimetilclorosilan (TMSC)

TMCS este folosit ca agent de derivatizare pentru compusi de tipul R-H, unde R este un radical organic. Reactia de derivatizare poate fi reprezentata shematic astfel:
CH3 H3C Si Cl + CH3 TMCS R H R TMS Produs de derivatizare + HCl

Reactia este mai rar utilizata in prezent, fiind destul de nespecifica. Se observa ca in acest caz ca si produs secundar se obtine acidul clorhiric, care se poate elimina usor prin adaugarea unei baze slabe (trietilamina sau piridina, de obicei).

b. N-O-Bis(trimetilsilil) acetamida (BSA)


BSA este folosit ca agent de derivatizare pentru compusi de tipul R-Y-H, unde: Y este un heteroatom (altul decit carbon) iar R este un radical organic. Reactia de derivatizare poate fi reprezentata shematic astfel:
N H3C C O TMS BSA TMS + R Y H TMS HN R Y TMS + H3C C O Produs de TMS-acetamida derivatizare

CH3 TMS= Si CH3 CH3

Produsul de derivatizare rezultat este stabil, iar conditiile de reactie sunt blinde. Se observa ca in acest caz ca si produs secundar se obtine TMS-acetamida, care poate fi indepartata usor din mediul de reactie.

c. N-O-Bis(trimetilsilil) trifluoroacetamida (BSTFA)


BSTFA este folosit ca agent de derivatizare tot pentru compusi de tipul R-Y-H, avid avantajul ca reactioneaza mai rapid si practic cantitativ. Reactia de derivatizare poate fi reprezentata shematic astfel:

169

N F3C C

TMS + R Y H

O TMS BSTFA

TMS HN R Y TMS + F3C C O Produs de TMS-trifluoroacetamida derivatizare

Se observa ca in acest caz ca si produs secundar se obtine TMS-trifluoroacetamida, care poate fi indepartata usor din mediul de reactie.

d. N-Metiltrimetilsilil trifluoroacetamida (MSTFA)


MSTFA este folosit ca agent de derivatizare tot pentru compusi de tipul R-Y-H, putind fi utilizat inclusiv pentru compusii mai volatili. Reactia de derivatizare poate fi reprezentata shematic astfel:
O F3C C N MSTFA TMS CH3 + R Y H CH3 HN R Y TMS + F3C C O Produs de Metil-trifluoroacetamida derivatizare

Se observa ca in acest caz ca si produs secundar se obtine metil-trifluoroacetamida, care este voatila si poate fi indepartata usor din mediul de reactie.

e. Trimetilsililimidazol (TMSI)
TMSI este folosit ca agent de derivatizare tot pentru compusi de tipul R-Y-H, in special pentru cei cu hidroxil, inclusiv impiedecat steric (nar nu pentru amino). Reactia de derivatizare poate fi reprezentata shematic astfel: TMS N N + R Y H R Y TMS + Produs de derivatizare HN N

TMSI

Imidazol

Se observa ca in acest caz ca si produs secundar se obtine imidazolul, care este netoxic si se poate indepartata usor din mediul de reactie.

170

f. Trimetilsilildietilamina (TMS-DEA)
TMS-DEA este folosit ca agent de derivatizare tot pentru amine si acizi carboxilici. Reactia de derivatizare poate fi reprezentata shematic astfel:

TMS N

R Y H

R Y TMS + Produs de derivatizare

HN DEA

TMS-DEA

g. N-Metil-N-(tert-butildimetilsilil) trifluoroacetamida (MTBSTFA)


MTBSTFA este folosit ca agent de derivatizare tot pentru compusi de tipul R-Y-H, avind avantajul ca produsul de derivatizare este extrem de stabil la hidroliza. Reactia de derivatizare poate fi reprezentata shematic astfel:
CH3 F3C C Si N CH3 CH3 MTBSTFA O + R Y H CH3 R Y Si CH3 Produs de derivatizare CH3 HN + F3C C O Metil-trifluoroacetamida

h. Hexametildisilazanul (HMDS)
HMD este folosit ca agent de derivatizare pentru compusi de tipul R-Y-H. Reactia de derivatizare poate fi reprezentata shematic astfel:
TMS NH TMS HMDS + R Y H R Y TMS + TMS NH2 Produs de derivatizare

Este mai rar utilizat.

2. Alchilarea
Alchilarea este un alt procedeu de derivatizare, dar cu utilizarea mai limitata, in special pentru gruparile hidroxil. Cei mai utilizati reactanti de derivatizare sunt:

171

a. Dimetilacetalul dimetilformamidei (DMF-dialkyla)


Diacetalul dimetilformamidei este folosit ca agent de derivatizare pentru compusi de tipul R-Y-H, in special pentru compusii carboxilici, dar fi pentru fenoli, amine, aminoacizi. Reactia de derivatizare poate fi reprezentata shematic astfel:
H3C H3C O CH2 CH3 n R Y H H3C N CHO + HO CH2 CH3 R Y CH2 CH3 + n n H3C DMF Produs de derivatizare

N CH

O CH2 CH3 n n= 1,2,3 DMF-dialkyla

In functie de masa moleculara (controlata prin valoarea lui n) se controleaza timpii de retentie in GC.

b. BF3 metanol (sau n-butanol)


Amestecul BF3 metanol sau BF3 n-butanol este folosit ca agent de derivatizare pentru compusii carboxilici. Reactia de derivatizare poate fi reprezentata shematic astfel: O R O BF3 + R' C OH R' C H R= Me; n-Bu O O R Produs de derivatizare

c. Hidroxid de tetrabutilamoniu (TBH) si hidroxid de trimetilanilinium


(TMAH) Ambele substante sunt folosite cu precadere ca agenti de derivatizare pentru compusi carboxilici. Reactia de derivatizare poate fi reprezentata shematic astfel:

172

C4H9

C4H9 N C4H9 C4H9

O OH + R' C OH R' C

O O Produs de derivatizare

TBH

CH3 N CH3 OH CH3

O + R' C OH R' C

O O CH3 Produs de derivatizare

TMAH

3. Acilarea
Acilarea este un procedeu de derivatizare cu specificitate mai mare, in special pentru gruparile hidroxil si amino. Cei mai utilizati reactanti de derivatizare sunt:

a. Anhidrida acetica (Ac-Anh)


Anhidrida acetica este folosita ca agent de derivatizare pentru compusi de tipul RY-H, in special pentru pentru alcooli, fenoli si amine. Reactia de derivatizare poate fi reprezentata shematic astfel: O H3C C H3C C O Ac-Anh O + R Y H O C CH3 R Y Produs de derivatizare + H3C C OH O

b. N-Metil-N-bis(trifluoroacetamida (MBTFA)
MBTFA este folosita ca agent de derivatizare pentru compusi de tipul R-Y-H, in special pentru pentru alcooli, fenoli, tioli si amine. Reactia de derivatizare poate fi reprezentata shematic astfel:

173

O F3C C F3C C O MBTFA N CH3 + R Y H

O R Y C CF3 + F3C C

O N CH3 H Metil-trifluoroacetamida

Produs de derivatizare

Produsul de derivatizare rezultat este stabil, iar conditiile de reactie sunt blinde. Reactia mai posda avantajul ca reactia decurge rapid cu aminele (primare si secundare) si mai greu pentru, alcooli, fenoli, tioli. Se observa ca in acest caz ca si produs secundar se obtine metil-trifluoroacetamida, care este voatila si poate fi indepartata usor din mediul de reactie.
c. Heptafluorobutirilimidazol (HFBI)

HFBI este folosita ca agent de derivatizare pentru compusi de tipul R-Y-H, in special pentru pentru alcooli, fenoli si amine. Reactia de derivatizare poate fi reprezentata shematic astfel:
O F3C F2C F2C C N HFBI N O + R Y H R Y C C3F7 + HN N

Produs de derivatizare

Imidazol

Produsul de derivatizare rezultat este stabil, iar conditiile de reactie sunt blinde. Ca si produs secundar se obtine imidazolul, care este netoxic si se poate indepartata usor din mediul de reactie.
d. Anhidride fluorurate (TFA; PFPA; HFBA)

Anhidridele

fluorurate

[anhidrina

trifluoroacetica

(TFA),

anhidrida sunt

pentafluoropropionica (PFPA) si anhidrida heptafluorobutirica (HFBA)] derivatizare poate fi reprezentata shematic astfel:

folosite ca agenti de derivatizare in special pentru compusi hidroxilici. Reactia de

174

O F3C C F3C C O TFA F3C F2C C F3C F2C C O PFPA F3C F2C F2C C F3C F2C F2C C O HFBA O + R OH O + R OH

O R O C CF3 + F3C C

O OH Acid trifluoroacetic

Produs de derivatizare O R O C C2F5

O OH Acid pentafluoropropionic O OH Acid heptafluorobutiric + C3F7 C + C2F5 C

O O + R OH

Produs de derivatizare O C C3F7 R O Produs de derivatizare

Se observa ca in acest caz ca si produs secundar se obtin acizi organici fluorurati, care se pot neutraliza (si elimina) prin adaugarea unei baze slabe (trietilamina sau piridina).
e. Clorura de pentabluorobenzoil (PFBCl)

PFBCl este folosit ca agent de derivatizare pentru compusi de tipul R-Y-H, in special pentru pentru alcooli, fenoli si amine. Reactia de derivatizare poate fi reprezentata shematic astfel:
F F F F PFBCl F COCl + R Y H F F F CO Y R F F Produs de derivatizare + HCl

PFBCl este foarte reactiv. V.3.3.2. Metode practice de derivatizare Practic, in acest moment, exista metode de derivatizare bine puse la punct

175

pentru toate clasele de compusi de interes din medicina judiciara si toxicologie. In cele ce urmeaza vom prezenta sintetic citeva metode de lucru experimentale de derivatizare pentru principalele tipuri de functiuni.
1. Functiunea amino, primara (-NH2) si secundara ( -NH-R)

Pentru functiunea amino sunt utilizate mai multe proceduri de derivatizare: derivatizare prin procedee de sililare: TMS, TBDMS; derivatizare prin procedee de acilare: TFA, Ac-Anh; drivatizare prin procedeul metilare: DMF-dimetha.

a. Derivatizare prin procedeul TMS

Si in acest caz, hidrogenul gruparii functionale amino dintr-un compus organic este inlocuit cu o grupare trimetilsilil, si in consecinta in spectrul GC-MS se va inregistrea o crestere de masa cu 72 unitati pentru fiecare grupare amino. Ca agenti de sililare se pot folosi MSTFA, BSTFA, BSA.
CH3 H3C Si CH3
MSTFA BSTFA BSA

NH2 sau NH R

CH3 Si CH3 Y= H, R CH3 Produs de derivatizare

Y N

Procedeu experimental:

Intr-un recipient potrivit, se adauga cu o micropipeta 50 L MSTFA (sau: BSTFA, BSA) peste o cantitate de 1-5 mg proba de analizat. Se adauga apoi 50

L solvent (acetonitril, piridina, THF, DMF). Se inchide cu un capac etans


recipientul si apoi se agita bine vasul, pentru a realiza o omogenizare cit mai buna a amestecului. Se incalzeste apoi vasul continind proba de analizat timp de 5 minute la 600C, pe baie de apa sau ulei. Se raceste apoi proba si se injecteaza 1-2 L din proba in GC-MS.

176

b. Derivatizare prin procedeul TBDMS

In acest caz hidrogenul gruparii functionale dintr-un compus organic este inlocuit cu o grupare tertbutil-dimetilsilil, si in consecinta in spectrul GC-MS se va inregistrea o crestere de masa cu 114 unitati pentru fiecare amino. Ca agent de sililare se poate folosi TBDMS. CH3 CH3 H3C C Si CH3 CH3 TBDMS + NH2 sau NH R CH3 CH3 C CH3 Si Y= H, R CH3 CH3 Produs de derivatizare Y N

Procedeu experimental:

Intr-un recipient potrivit, se adauga cu o micropipeta 50 L solvent (acetonitril, piridina, THF, DMF) peste o cantitate de 1-5 mg proba de analizat. Se adauga apoi 50 L TBDMS. Se inchide cu un capac etans recipientul si apoi se agita bine vasul, pentru a realiza o omogenizare cit mai buna a amestecului. Se incalzeste apoi vasul continind proba de analizat timp de 15 minute la 600C, pe baie de apa sau ulei. Se raceste apoi proba si se injecteaza 1-2 L din proba in GC-MS.
c. Derivatizare prin procedee de acilare: TFA, Ac-Anh

In acest caz hidrogenul gruparii functionale dintrun compus organic este inlocuit fie cu o grupare trifluoroacetil (si in consecinta in spectrul GC-MS se va inregistrea o crestere de masa cu 96 unitati pentru fiecare grupare amino) fie cu o grupare acetil (si in consecinta in spectrul GC-MS se va inregistrea o crestere de masa cu 42 unitati pentru fiecare grupare amino). Ca agenti de acilare se pot folosi fie anhidrida trifluuoroacetica (TFA) fie anhidrida acetica (Ac-Anh).

177

O F3C C F3C C O TFA NH2 O + sau NH R

O C CF3 R N Y Y= H, R Produs de derivatizare O C CH3 R N Y Y= H, R Produs de derivatizare

O H3C C O + H3C C O Ac-Anh

NH2 sau NH R

c.1. Derivatizare prin procedee de acilare cu Ac-Anh

Intr-un recipient potrivit, se adauga cu o micropipeta 40 L solvent (cel mai adesea piridina) peste o cantitate de 1-5 mg proba de analizat. Se adauga apoi 60 L AcAnh. Se inchide cu un capac etans recipientul si apoi se agita bine vasul, pentru a realiza o omogenizare cit mai buna a amestecului. Se incalzeste apoi vasul continind proba de analizat timp de 30 minute la 600C, pe baie de apa sau ulei. Se evapora la sec trecind un curent de azot peste solutie. Se dizolva rezidiu in 25 L solvent (piridina sau acetonitril). Se raceste apoi proba si se injecteaza 1-2 L din proba in GC-MS.
c.2. Derivatizare prin procedee de acilare cu TFA

Intr-un recipient potrivit, se adauga cu o micropipeta 200-500 L solutie toluenica 0,05 M de trietilamina peste o cantitate de 1-5 mg proba de analizat. Se adauga apoi 50 L TFA. Se inchide cu un capac etans recipientul si apoi se agita bine vasul, pentru a realiza o omogenizare cit mai buna a amestecului. Se incalzeste apoi vasul continind proba de analizat timp de 5 minute la 450C, pe baie de apa sau ulei. Se raceste si apoi se adauga 400-1000 L solutie apoasa 5% de bicarbonat de

178

sodiu. Se agita bine pina cind stratul superior devine clar si apoi se centrifugheaza. Se injecteaza 1-2 L din stratul superior al probei in GC-MS.
d. Procedeul cu dimetil acetalul N,N-dimetilformamidei (DMF-dimetha).

Intr-un recipient potrivit, peste o cantitate de maxim 0,1 mg proba de analizat se adauga cu o micropipeta 50 L dimetil acetal al N,N-dimetilformamidei si 50 L acetonitril. Se inchide cu un capac etans recipientul si apoi se agita bine vasul, pentru a realiza o omogenizare cit mai buna a amestecului. Se incalzeste apoi vasul continind proba de analizat timp de 30 minute la 600C, pe baie de apa sau ulei. Se injecteaza 1-2 L din proba in GC-MS .
2. Functiunea hidroxil, -OH

In acest caz sunt preferate 3 proceduri de derivatizare: derivatizare prin procedeul TMS derivatizare prin procedeul TBDMS derivatizare prin procedeul acetil

a. Derivatizare prin procedeul TMS

In acest caz hidrogenul gruparii functionale dintr-un compus organic este inlocuit cu o grupare trimetilsilil, si in consecinta in spectrul GC-MS se va inregistrea o crestere de masa cu 72 unitati pentru fiecare hidroxil. Ca agenti de sililare se pot folosi MSTFA sau BSTFA. CH3 H3C Si CH3 MSTFA sau BSTFA + O H CH3 H3C Si O CH3 Produs de derivatizare

Procedeu experimental:

Intr-un recipient potrivit, se adauga cu o micropipeta 100 L MSTFA (sau BSTFA) peste o cantitate de 1-5 mg proba de analizat. Se adauga apoi 50 L de

179

solvent (in functie de proba de analizat, cel mai adesa piridina sau acetonitril). Se inchide cu un capac etans recipientul si apoi se agita bine vasul, pentru a realiza o omogenizare cit mai buna a amestecului. Se incalzeste apoi vasul continind proba de analizat timp de 5 minute la 600C, pe baie de apa sau ulei. Se raceste apoi proba si se injecteaza 1-2 L din proba in GC-MS.
b. Derivatizare prin procedeul TBDMS

In acest caz hidrogenul gruparii functionale dintr-un compus organic este inlocuit cu o grupare tertbutil-dimetilsilil, si in consecinta in spectrul GC-MS se va inregistrea o crestere de masa cu 114 unitati pentru fiecare hidroxil. Ca agent de sililare se poate folosi MTBSTFA. CH3 CH3 H3C C Si CH3 CH3
MTBSTFA

O H

CH3 CH3 H3C C Si O CH3 CH3 Produs de derivatizare

Procedeu experimental:

Intr-un recipient potrivit, se adauga cu o micropipeta 100 L solvent (in functie de proba de analizat, cel mai adesa acetonitril) peste o cantitate de 1-5 mg proba de analizat. Se adauga apoi 100 L de MTBSTFA. Se inchide cu un capac etans recipientul si apoi se agita bine vasul, pentru a realiza o omogenizare cit mai buna a amestecului. Se incalzeste apoi vasul continind proba de analizat timp de 15 minute la 600C, pe baie de apa sau ulei. Se raceste apoi proba si se injecteaza 1-2

L din proba in GC-MS.


c. Derivatizare prin procedeul acetil

In acest caz hidrogenul gruparii functionale dintr-un compus organic este inlocuit cu o grupare acetil, si in consecinta in spectrul GC-MS se va inregistrea o

180

crestere de masa cu 42 unitati pentru fiecare hidroxil. Ca agent de acetilare se poate folosi anhidrida acetica.
O H3C C O + H3C C O Ac-Anh O H O C CH3 O Produs de derivatizare

Procedeu experimental:

Intr-un recipient potrivit, se adauga cu o micropipeta 40 L solvent (in functie de proba de analizat, cel mai adesa piridina) peste o cantitate de 1-5 mg proba de analizat. Se adauga apoi 60 L de Ac-Anh. Se inchide cu un capac etans recipientul si apoi se agita bine vasul, pentru a realiza o omogenizare cit mai buna a amestecului. Se incalzeste apoi vasul continind proba de analizat timp de 30 minute la 600C, pe baie de apa sau ulei. Se raceste apoi proba si se injecteaza 1-2 L din proba in GC-MS.
3. Functiunea carboxil, -COOH

Ca si in cazul hidroxilului, pentru functiunea carboxil sunt preferate 3 proceduri de derivatizare: derivatizare prin procedee de sililare: TMS, TBDMS; derivatizare prin procedeul de metilare: DMF-dimetha, Me-OH.

a. Derivatizare prin procedeul TMS

Si in acest caz, hidrogenul gruparii functionale carboxil dintr-un compus organic este inlocuit cu o grupare trimetilsilil, si in consecinta in spectrul GC-MS se va inregistrea o crestere de masa cu 72 unitati pentru fiecare carboxil. Ca agenti de sililare se pot folosi MSTFA, BSTFA, BSA. Pentru acizi cu mase moleculare mici se poate folosi si TMS-DEA.

181

CH3 H3C Si CH3


MSTFA BSTFA TMS-DEA BSA

O C O H

O C O

CH3 Si CH3 CH3

Produs de derivatizare

Procedeu experimental:

Intr-un recipient potrivit, se adauga cu o micropipeta 200 L MSTFA (sau: BSTFA, BSA) peste o cantitate de 1-5 mg proba de analizat. Se inchide cu un capac etans recipientul si apoi se agita bine vasul, pentru a realiza o omogenizare cit mai buna a amestecului. Se incalzeste apoi vasul continind proba de analizat timp de 15 minute la 600C, pe baie de apa sau ulei. Se raceste apoi proba si se injecteaza 1-2 L din proba in GC-MS.
b. Derivatizare prin procedeul TBDMS

In acest caz hidrogenul gruparii functionale dintr-un compus organic este inlocuit cu o grupare tertbutil-dimetilsilil, si in consecinta in spectrul GC-MS se va inregistrea o crestere de masa cu 114 unitati pentru fiecare carboxil. Ca agent de sililare se poate folosi TBDMS. CH3 CH3 H3C C Si CH3 CH3
TBDMS

O + C O H C

CH3 CH3 C CH3 Si O CH3 CH3 Produs de derivatizare

Procedeu experimental:

Intr-un recipient potrivit, se adauga cu o micropipeta 50 L TBDMS peste o cantitate de 1-5 mg proba de analizat. Se adauga apoi solvent, daca este necesar (acetonitril, piridina, THF, DMF). Se inchide cu un capac etans recipientul si apoi

182

se agita bine vasul, pentru a realiza o omogenizare cit mai buna a amestecului. Pentru acizii cu masa moleculara mare, se incalzeste apoi vasul continind proba de analizat timp de 5-20 minute la 600C, pe baie de apa sau ulei. Pentru acizii cu masa moleculara mica, se lasa la temperatura camerei vasul continind proba de analizat timp de cca 30 minute. Se raceste apoi proba si se injecteaza 1-2 L din proba in GC-MS.
c. Derivatizare prin procedeul metilare

In acest caz hidrogenul gruparii functionale dintrun compus organic este inlocuit cu o grupare metil, si in consecinta in spectrul GC-MS se va inregistrea o crestere de masa cu 14 unitati pentru fiecare carboxil. Ca agent de metilare se poate folosi metanolul (MeOH) sau dimetil acetalul N,N-dimetilformamidei (DMFdimetha).
O H3C OH MeOH + C O H H+ O O CH3 Produs de derivatizare O O CH3 Produs de derivatizare C C

H3C H3C

OCH3 N CH OCH3 + C

O O H

DMF-dimetha

Procedee experimentale 1. Procedeul cu metanol anhidru si acid sulfuric concentrat

Intr-un recipient potrivit, peste o cantitate de 1-5 mg proba de analizat se adauga cu o micropipeta 250 L MeOH si 50 L H2SO4 concentrat (ca si catalizator al reactiei de esterificare). Se inchide cu un capac etans recipientul si apoi se agita bine vasul, pentru a realiza o omogenizare cit mai buna a amestecului. Se incalzeste

183

apoi vasul continind proba de analizat timp de 45 minute la 600C, pe baie de apa sau ulei. Se adauga apoi 500 L cloroform sau clorura de metilen si se agita timp de 2 min. Se injecteaza 1-2 L din proba in GC-MS (din patura inferioara organica ce contine proba). Acest procedeu permite identificarea urmelor de acid. Ca si produs secundar se obtine dimetilsulfatul (DMS), usor de identificat dupa fragmente in MS.
15 (36%) CH3 O 31 (67%) O S O H3C DMS
100 O 31 50 15 45 48 10 20 30 40 50 (m ainlib) Sulfuric acid, dim ethyl ester 0 68 60 70 66 79 81 80 90 100 110 120 125 130 140 29 O O S O 95

O 95 (10%, BP)

Figura V.3.2. Spectrul de masa al dimetilsulfatului

2. Procedeul cu metanol anhidru si acid clorhidric concentrat


Intr-un recipient potrivit, peste o cantitate de 1-5 mg proba de analizat se adauga cu o micropipeta 250 L solutie metanolica 3N de HCl (MeOH anh. si HCl conc.). Se

184

inchide cu un capac etans recipientul si apoi se agita bine vasul, pentru a realiza o omogenizare cit mai buna a amestecului. Se incalzeste apoi vasul continind proba de analizat timp de 20 minute la 600C, pe baie de apa sau ulei. Se injecteaza 1-2 L din proba in GC-MS .

3. Procedeul cu metanol anhidru si BF3


Intr-un recipient potrivit, peste o cantitate de 1-5 mg proba de analizat se adauga cu o micropipeta 250 L solutie metanolica (5-10%) de BF3 (MeOH anh. si HCl conc.). Se inchide cu un capac etans recipientul si apoi se agita bine vasul, pentru a realiza o omogenizare cit mai buna a amestecului. Se incalzeste apoi vasul continind proba de analizat timp de 20 minute la 600C, pe baie de apa sau ulei. Se raceste pe baie de apa cu gheata si apoi se adauga 2 mL apa distilata. Se transvazeaza amestecul intr-o pilnie de separare, se adauga 2 mL clorura de metilen si se agita timp de 5 min. Se separa patura organica (inferioara) si apoi in patura apoasa se adauga din nou 2 mL clorura de metilen, se agita timp de 5 min. Si apoi se separa din nou patura organica. Extractele reunite de clorura de metilen se usuca pe sulfat de sodiu anhidru. Se filtraza si apoi solutia de clorura de metilen se concentreaza prin evaporare pina la 100 L, fie trecind un curent de azot fie se evapora normal. Se injecteaza 1-2 L din proba in GC-MS (din patura inferioara organica ce contine proba).

4. Procedeul cu dimetil acetalul N,N-dimetilformamidei (DMF-dimetha).


Intr-un recipient potrivit, peste o cantitate de 1-5 mg proba de analizat se adauga cu o micropipeta 100 L dimetil acetal al N,N-dimetilformamidei. In cazul in care proba nu se dizolva bine, se poate adauga 100 L solvent (cloroform, clorura de metilen, piridina, THF sau DMF). Se inchide cu un capac etans recipientul si apoi se agita bine vasul, pentru a realiza o omogenizare cit mai buna a amestecului. Se incalzeste apoi vasul continind proba de analizat timp de 15 minute la 600C, pe baie de apa sau ulei. Se injecteaza 1-2 L din proba in GC-MS .

185

V.4. Droguri din opiu si derivati

V.4.1. Introducere Opioid (greac i - asemntor opiului) este un termen care defineste o grupa de substante chimice heterogene naturale si sintetice inrudite cu morfina.
H3C CH3 N HO O OH Morfina
1 2

N
9 15 14 8

H H H OH

HO

O 5 H

Morfina, structura spatiala

Opioidele sunt substante cu actiune deprimanta asupra sistemului nervos central (SNC) iar spectrul lor de actiune al este foarte complex si diferit, cel mai important rol al lor fiind actiunea intens analgezica. In acelasi timp opidele au o serie de efecte secundare nedorite, de departe efectul secundar cel mai nedorit fiind efectul de dependenta. Dintre celelalte efecte secundare citam: deprimarea respiratiei (hipoventilatie pulmonara, hipoxie), scaderea peristaltismului intestinal, efecte hipnotice, anxiolitice, halucinogene si euforie. Ultimele doua efecte secundare constitue efectele narcotice, nedorite ale opioidelor. Acest ansamblu de actiuni face ca opioidele sa fie incadrate in clasa de substante analgezice narcotice. Compusii din clasa opioidelor pot fi clasificati dupa mai multe criterii. Tinind cont de provenienta lor, opioidele se impart in mai multe grupe:

186

1. tebaina; 2. 3. 4.

alcaloizi naturali din opiu - care cuprinde morfina, codeina si derivati semisintetici de morfina; derivati sintetici de morfina; antagonisti ai morfinei - substante folosite ca antidot pentru droguri.

Produsii naturali ai clasei sunt reprezentati de alcaloizi din opiu. Opiul este constituit din latexul uscat obtinut din fructele necoapte de mac (Papaver

somniferum). In opiu se gasesc circa 25 de alcaloizi (alaturi de alti compusi), intre


care si alcaloizii cu nucleu fenantrenic, cel mai important dintre acestia, pentru proprietatile analgezice narcotice, fiind morfina. Opiul se obtine numai pe cale manuala. Recoltarea are loc la circa 12 zile de la caderea petalelor florilor, atunci cand capsulele ajung la dimensiunea maxima; ea se face prin intermediul scarificarii (capsulele de mac sunt incizate cu nite lame speciale numai pan la jumtatea capsulei), operatie desfasurata numai pe timp frumos. Datorita inciziilor, latexul din capsulele de mac, alb la inceput se brunifica si se coaguleaza. Astfel coagulat, se racleaza cu ajutorul unui razuitor din lemn sau din metal. Latexul rezultat se usuca la soare cu atenie pana cand capata consistenta unei paste foarte dense si este brunifiact complet. Este strans in bucati de dimensiuni variabile si presat in forme variabile. Latexul astfel obtinut constituie asa numitul opiu baza si contine circa 1012% alcaloizi, 1015 % apa, acizi organici, rezine etc. Prin inclzirea opiului baza la temperaturi scazute se obtine o solutie de culoare maronie care supusa filtrarii (pentru indepartarea reziduurilor vegetale) si apoi evaporarii, conduce la formarea unei pudre care reprezinta forma opiului de fumat, cu un continut mult mai mare de morfina fata de latex. Alcaloizii morfinici sunt compusi organici naturali cu schelet fenantrenic care provin formal din morfina, cei mai importanti fiind morfina, codeina si tebaina:

187
CH3 N HO O Morfina OH H3CO O Codeina OH CH3 N H3CO O Tebaina OCH3 CH3 N

Pentru specialistii in medicina judiciara o importanta deosebita o are clasificarea opioidelor dupa structura chimica, tinind cont de numarul de cicluri care se pastreaza din alcaloidul baza, morfina: - derivati pentaciclici (seria morfinei); - derivati tetraciclici (seria morfinanului); - derivati triciclici (seria benzomorfanului); - derivati monociclici (seria piperidinei). [mai exista o clasa admisa, derivati hexaciclici (seria buprenorfinei), dar care nu prezinta importanta pentru practica judiciara intriucit acesti compusi nu sunt utilizati ca si droguri] Desi derivatii monociclici piperidinici aparent nu au nimic in comun cu morfina, ei sunt derivati opioidici de sinteza care provin formal prin distrugerea legaturilor dintre ciclurile initiale din morfina:
N A O E O B D O C C Seria morfinanului, derivati tetraciclici A B D R1 N A R3 D B R2 Seria benzomorfanului, derivati triciclici

Seria morfinei, derivati pentaciclici

N A R D Seria piperidinei, derivati monociclici

188

Antagonisti narcotici Antagonistii narcotici reprezinta o grupa de morfinomimetice care au proprietatea de a inversa majoritatea actiunilor farmacologice de natura narcotica a drogurilor. Antagonistii narcotici sunt larg utilizati in curele de dezintoxicare a toxicomanilor avind avantajul ca nu produc dependenta si nici sindrom de abstinenta. Principalele medicamente antagonist narcotice sunt Nalorfina,

Naltrexona, Levalorfanul, Butorfanol si Xorfanolul.

N HO O OH Nalorfina Naltrexona HO HO O O

N HO

Levalorfan

HO HO Butorfanol

N HO

N CH3

Xorfanol CH2

V. 4.2. Metabolizarea opioidelor Asa dupa cum s-a aratat anterior, intr-un sistem biologic orice drog sufera procese de metabolizare si degradare. Acest proces de metabolizare are loc in doua etape conducind la produsi cu structura mai simpla pe care organismul viu ii elimina fie ca atare (in cantitate mica) fie ii transforma in produsi de conjugare(in cantitate mare): faza metabolica I sau faza reactiilor metabolice, cuprinde reactiile de hidroliza, oxidare si reducere; faza metabolica II sau faza reactiilor de conjugare, care cuprinde procesele de conjugare ale substantelor cu diversi compusi din organism cum ar fi

189

aminoacizi (glutation, glutamina, etc) si acidul glucuronic. In practica toxicologica, prin procesul de preparare si pretratament al probelor, se realiza nu numai izolarea drogului si a produsilor de metabolizare si clivajul produsilor de conjugare in metaboliti. Din aceste motive cunoasterea produsilor de metabolizare a drogurilor este de importanta cruciala pentru specialistii in medicina judiciara. 1. Metabolizarea derivatilor pentaciclici (seria morfinei) In aceasta grupa intra morfina si analogii ei pentaciclici. Cele mai cunoscute droguri din aceasta clasa sunt Morfina si Heroina, a caror schema de metabolizare este prezentata mai jos:
CH3 N H3CCOO O Heroina OOCCH3 HO O CH3 N OOCCH3 6-Monoacetil-Morfina (6-MAM) Hidroliza partiala Hidroliza partiala CH3 N

Hidroliza NH Demetilare HO O Normorfina OH HO O Morfina OH

Demetilare Hidroliza CH3 partiala N H3CO O OOCCH3 Acetilcodeina H3CO O Codeina OH CH3 Demetilare N H3CO O Norcodeina OH

NH

190

In organismul viu heroina este rapid metabolizat la 6-MAM. Datorit timpului relativ scurt de detectare a 6-MAM, de obicei in probe se detecteaza morfina si codeina, respectiv produsii lor de N-demetilare (normorfina si norcodeina). Acetilcodeina este un produs secundar rezultat la fabricarea ilicita a heroinei, si poate fi el gasit in probele biologice. Acesti compusi au fost identificati prin spectrometrie de masa. 2. Metabolizarea derivatilor tetraciclici (seria morfinan) Cele mai cunoscute droguri din aceasta clasa sunt Levorfanolul si

Dextrometorfanul , a caror schema de metabolizare este prezentata mai jos:


Demetilare N HO Levorfanol (N-Metil-3-hidroximorfinan) Hidroliza N H3CO Dextrometorfan (N-Metil-3-metoximorfinan) HO Norlevorfanol (3-Hidroximorfinan) Demetilare si hidroliza NH

Acesti compusi au fost identificati prin spectrometrie de masa.

3. Metabolizarea derivatilor triciclici (seria benzomorfan) Cele mai cunoscute droguri din aceasta clasa sunt Pentazocina si Fenazocina. Schema si produsii de metabolizare a pentazocinei este prezentata mai jos:

191
OH Oxidare N HO Pentazocina HO Cis-hidroxipentazocina N + HO Trans-hidroxipentazocina HOOC N HO Trans-carboxipentazocina OH

Acesti compusi au fost identificati prin spectrometrie de masa. 4. Metabolizarea derivatilor monociclici (seria piperidinei) Cele mai cunoscute droguri din aceasta clasa sunt Petidina (Meperidine,

Demerol), -Prodine, Profadol si Fentanil. Schema si produsii de metabolizare a


petidinei este prezentata mai jos:
HO N N-Demetilare N-Oxidare O O N-Hidroxinorpetidina H 3C N para-Hidroxilare O O HO p-Hidroxi-petidina Petidina O-Hidroliza O-Hidroliza O Norpetidina H 3C N N-Oxidare O Petidin-N-oxid H N N-Demetilare O O O H 3C N O

192
Norpetidina Petidina O-Hidroliza H3C N O-Hidroliza H N N-Demetilare OH O Acid norpetidinic

OH O Acid petidinic

Acesti compusi au fost identificati prin spectrometrie de masa. V. 4.3. Analiza prin GC-MS in cazul opiaceelor Atit drogurile in sine cit si produsi de metabolizare ai opiaceelor se pot determina prin GC-MS. Din acest motiv cunoasterea modului de fragmentare, identificarea fiecarui fragment si in final identificarea structurii acestor metaboliti, constituie dovezi solide in medicina judiciara si trebuiesc cunoscute de catre specialistii in domeniu. Spectrele de masa ale opiaceelor se regasesc, liber (fara a fi necesar plata), in mai toate bazele de date. Ceea ce nu exista in aceste baze de date, sunt reactiile de fragmentare si corelatiile intre ele, pe care noi le vom prezenta in continuare in acest curs, si care permit identificarea su relativa usurinta a spectrelor de masa. 1. Seria morfinei In aceasta grupa intra morfina si analogii ei pentaciclici. Prezentam in continuare spectrele de masa (GC-MS, Electron Impact) ale principalelor droguri si produsi de metabolizare din aceasta clasa: Morfina, Heroina, 6-Monoacetil-

Morfina (6-MAM), Codeina, Acetilcodeina(6-MAC):

193
100 HO 285

O 50 42 17 0 31 HO 59 70 65 70 124 81 94 90 115 110 131 130 150 170 N

162 174 197 190

215 228 242 256 210 230 250 268

10 30 50 (m ainlib) Morphine

270

290

Figura 1. Spectrul de masa al morfinei

100 O

327

369 O O 50 43 N 70 81 15 10 40 70 (m ainlib) Diacetylm orphine 0 124 146 162 115 130 160 190 220 250 204 284 280 310 340 370 O O 268 310

94 100

Figura 2. Spectrul de masa al heroinei


100 N 43 50 HO 59 70 65 0 O 81 94 105 O 146 124 162 174 O 215 204 197 226 252 270 284 290 310 330 268 327

152

30 50 70 90 110 130 150 170 190 210 230 250 (m ainlib) Morphinan-3,6--diol, 7,8-didehydro-4,5--epoxy-17-m ethyl-, 6-acetate

Figura 3. Spectrul de masa al 6-MAM

194
100 O O OH 50 42 31 0 59 70 81 94 65 60 80 100 N 124 115 120 146 140 160 175 188 214 162 229 242 240 256 260 282 280 300 299

20 40 (m ainlib) Codeine

180

200

220

Figura 4. Spectrul de masa al codeinei


100 O 43 O O 50 59 81 31 0 70 65 94 103 N 124 115 162 188 204 240 298 282 O 229 341

266

20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 (m ainlib) Morphinan-6-ol, 7,8-didehydro-4,5-epoxy-3-m ethoxy-17-m ethyl-, acetate (es ter), (5,6)-

340

Figura 5. Spectrul de masa al acetilcodeinei

Asa dupa cum se observa de mai sus, toti acesti compusi poseda spectre de masa asemanatoare, dar cu anumite particularitati. Din spectrul heroinei se observa ca ionul molecular este foarte intens [M+ (77%), m/z= 369)iar in urma unei fragmentari de tip la nivelul grupei functionale esterice (insotita de transferul unui proton) rezulta 6-MAM (care este pic de baza, 100%, m/z= 327), iar din acesta din urma, tot printr-o fragmentare de tip la nivelul grupei functionale esterice (insotita de transferul unui proton), rezulta morfina (M+, m/z = 285), Fig. 6:

195
CH3 N H2C H O C O O Heroina CH3 N

- H2C

O O C CH3 m/z= 369 (M+, 77%)

C O HO m/z= 42 (28%)

- H2C
O

CH3 N

O O C CH 6-Monoacetil-Morfina 3 (6-MAM) m/z= 327 (BP, 100%)

C O m/z= 42 (28%)

HO O Morfina OH m/z= 285 (4%)

Figura 6. Schema reactiei de fragmentare a heroinei la morfina

Din spectrul 6-MAM, se observa ca observa ca ionul molecular este foarte intens fiind chiar pic de baza (M+= BP, 100%), si tot printr-o fragmentare de tip la nivelul grupei functionale esterice(insotita de transferul unui proton), rezulta morfina, Fig. 7:
CH3 N HO O 6-Monoacetil-Morfina O (6-MAM) m/z= 327 (M+=BP=100%) O C C O m/z= 42 (40%) CH2 H CH3 N

- H2C

HO O Morfina OH m/z= 285 (4%)

Figura 7. Schema reactiei de fragmentare a 6-MAM la morfina

Din spectrul 6-MAC, se observa ca observa ca ionul molecular este de asemenea foarte intens fiind pic de baza (M+= BP, 100%), si tot printr-o fragmentare de tip la nivelul grupei functionale esterice (insotita de transferul unui proton), rezulta codeina ( m/z = 299, 4%). Fragmentarea de tip la nivelul grupei functionale esterice a codeinei conduce la un radical al morfinei (m/z= 284, 6%), Fig. 7.

196
CH3 N O O HO CH2 H 6-Monoacetil-Codeina (6-MAC) m/z= 341 (M+=BP=100%) Codeina m/z= 299 (4%)

H3C O O O

CH3 N

C O O m/z= 42 (40%) O C

- H2C

H3C

CH3 N

- CH3

O OH Morfina (radical) m/z= 284 (6%)

Figura 7. Schema reactiei de fragmentare a 6-MAC la morfina

In continuare, principalele reactii de fragmentare sunt sunt comune, iar pentru simplificare, le vom prezenta doar la morfina. Principalele reactii de fragmentare sunt fragmentarile complexe de tip si la nivelul grupei functionale aminice tertiare, insotite de transferul unuia sau mai multor protoni si electroni. Astfel, picurile de la m/z= 215 (22%) si m/z= 70 (17%) sunt picuri datorate fragmentarilor complexe de tip si la nivelul grupei functionale aminice tertiare, insotite de transferul a 2 protoni si a mai multor electroni; picurile de la m/z= 204 (3%) si m/z= 81 (15%) sunt picuri datorate fragmentarilor complexe de tip si la nivelul grupei functionale aminice tertiare, insotite de transferul a 3 protoni si a mai multor electroni, Fig. 8.

197
CH3 N HO H H O

CH2 CH3 + H C N 2 CH

H2C OH m/z= 70 (17%) m/z= 215 (M-70, 22%) Fragmentarile CH3 N HO Morfina O m/z= 285 H H N H OH CH3 HO O OH m/z= 204 (M-81, 3%) CH3 + HC C N CH H2C m/z= 81 (15%)

Fragmentarile

Figura 8. Fragmentari complexe de tip si la nivelul grupei functionale aminice tertiare, in cazul morfinei

Fragmentele de la m/z= 226 (8%) si m/z= 59 (17%) si respectiv m/z= 228 (10%) si m/z= 57 (8%) sunt explicate tot prin fragmentarile complexe de tip si la nivelul grupei functionale aminice tertiare, insotite de transferul a 2 protoni si a mai multor electroni (Fig. 9).

198
H CH2 N H HO O OH m/z= 228 (10%) + CH2 N CH2 H3C m/z= 57 (8%)

Fragmentarile CH3 N HO O OH H N H CH3 HO

CH3 HN O m/z= 226 (8%) OH + CH2 H3C m/z= 59 (17%)

Fragmentarile

Figura 9. Fragmentari complexe de tip si la nivelul grupei functionale aminice tertiare, insotite de transferul a 2 protoni si a mai multor electroni in cazul morfinei

Fragmentele de la m/z= 216 (9%), 162 (25%), 124 (19%), 70 (17%) si 42 (25%), sunt explicate printr-o succesiune de reactii de fragmentare: fragmentarile complexe de tip si la nivelul grupei functionale aminice (insotite de transferul unora sau mai multor protoni si electroni), fragmentare retro Diels-Alder, transpozitii de schelet, Fig. 10.

199
CH3 N HO O OH Morfina CH3 N HO HO O OH O m/z= 70 (17%) OH CH3 CH3 N HO O H OH O CH2 HO m/z= 216 (9%) CH3 N + HO N HO m/z= 124 (19%) CH3 CH3 + HO N O OH CH3 HO O HC OH CH3 CH3 CH2 CH3 N HO O OH CH3 H CH3 N HO O HO CH2 CH3 N Fragmentare retro Diels Alder CH3 N

CH2

HO

H2+ H2C N CH2 C m/z= 42 (25%) CH2

O m/z= 162 (25%)

O m/z= 174

OH OH m/z= 124 (19%) m/z= 162 (25%) Figura 10. Fragmentari complexe la morfina

Fragmentul de la m/z= 268 (12%) se datoreste fragmentarii de tip la nivelul grupei functionale fenolice, Fig. 11.
CH3 N HO O OH - HO m/z= 17 + O OH m/z= 268 (12%) CH3 N

200 Figura 11. Schema reactiei de fragmentare la nivelul grupei functionale fenolice din morfina

Caracteristici comune si deosebiri in spectre


ionii moleculari sunt fie foarte intensi fie, cel mai adesea, picuri de baza. Ei sunt urmati de picuri M+1 (intense) si precedati de M-1 (mai putin intense); principala reactie de fragmentare este fragmentarea de tip si la nivelul grupei functionale aminice tertiare; spectrele contin picuri specifice la m/z= 42, 59, 70, 81 (si cele aferente de la M-42, M-59, M-70, M-81), caracteristice fragmentari de tip si la nivelul grupei functionale aminice tertiare; pentru codeina si 6-MAC apar 2 picuri specifice la m/z= 282 si m/z= 229
CH3 N O O m/z= 299 CH2 O O m/z= 229 OH + H2C OH CH3 N CH - HO m/z= 17 O O m/z= 282 + CH3 N

H2C m/z= 70

Figura 12. Schema reactiei de fragmentare la nivelul grupei functionale alcoolice si fragmentarile complexe de tip si la nivelul grupei functionale aminice tertiare, insotite de transferul a 2 protoni si a mai multor electroni in cazul codeinei si 6-MAC

care se datoresc fragmentarii de tip la nivelul grupei functionale alcoolice si respectiv fragmentarii de tip si la nivelul grupei functionale aminice tertiare, Fig. 12.

201

2. Seria morfinanului In aceasta grupa intra analogii tetraciclici de morfina. Prezentam in continuare spectrele de masa (GC-MS, Electron Impact) ale principalelor droguri din aceasta clasa: Levorfanolul si Dextrometorfanul:
100 271 59 O

50 N 31 0

150 214 171 42 70 91 90 115 128 110 130 150 170 185 190 210 228 242 256 230 250 270

10 30 50 70 (m ainlib) Dextrom ethorphan

Figura 13. Spectrul de masa al dextrometorfanului


100 OH 150 257

50 59 N 128

157

200

189 171 140 160 180 200 214 228 242 240 260

30 42 0

82 91

115

20 40 60 80 100 (m ainlib) Morphinan-3-ol, 17-m ethyl-

120

220

Figura 14. Spectrul de masa al levorfanolului

Asa dupa cum se observa de mai sus, si acesti compusi poseda spectre de masa asemanatoare, prezentind asemanari cit deosebiri atit intre ele cit si comparativ cu seria morfinei. Principalele reactii de fragmentare sunt tot fragmentarile complexe de tip si la nivelul grupei functionale aminice tertiare, insotite de transferul unuia sau mai

202

multor protoni si electroni. Astfel, in spectrele de masa ale dextrometorfanului (fragmentarile vor fi exemplificate in cazul dextrometorfanului, pentru levorfanol fiind similare) fragmentele de la m/z= 212 (15%) si m/z= 59 (90%) si respectiv m/z= 214 (37%) si m/z= 57 (3%) sunt explicate tot prin fragmentarile complexe de tip si la nivelul grupei functionale aminice tertiare, insotite de transferul a 2 protoni si a mai multor electroni, Fig. 15.
H CH2 N H O m/z= 214 (37%) Fragmentarile CH3 N O m/z= 271 (M+=BP, 100%) H N H CH3 H3C + CH2 N CH2 H3C m/z= 57 (3%)

H3C O m/z= 212 (15%)

CH3 HN + CH2 H3C m/z= 59 (90%)

Fragmentarile

Figura 15. Fragmentari complexe de tip si la nivelul grupei functionale aminice tertiare, insotite de transferul a 2 protoni si a mai multor electroni in cazul dextrometorfanului

Fragmentele de la m/z= 171 (19%), 150 (51%), 42 (10%) si 31 (11%), sunt explicate printr-o succesiune de reactii de fragmentare: fragmentarile complexe de tip si la nivelul grupei functionale aminice (insotite de transferul unora sau mai multor protoni si electroni), Fig. 16.

203
CH3 N O O CH2 O CH3 N

CH2 H

CH3 N

CH3 N + CH2

O m/z= 150 (51%) m/z= 121 (4%)

CH2 O m/z= 216 (3%) CH2 + H2C

CH3 N H2C N CH2 m/z= 42 (10%) CH -HC CH H2C m/z= 70 (2%)

+ H2C OH m/z= 31 (11%) m/z= 171 (19%)

Figura 16. Fragmentari complexe in cazul dextrometorfanului

Fragmentul de la m/z= 256 (8%) se datoreste fragmentarii de tip la nivelul grupei functionale metoxi, Fig. 17.
CH3 N H3C O CH3 N O m/z= 256 (8%)

- CH3 m/z= 15

Figura 17. Schema reactiei de fragmentare la nivelul grupei functionale metoxi in cazul dextrometorfanului

Caracteristici comune si deosebiri in spectre

204

ionii moleculari sunt fie foarte intensi fie, cel mai adesea, picuri de baza. Ei sunt urmati de picuri intense M+1 (intense) si precedati de M-1 (intense); principala reactie de fragmentare este fragmentarea de tip si la nivelul grupei functionale aminice tertiare; spectrele contin picuri specifice la m/z= 42, 59 (si cele aferente de la M-42, M-59), caracteristice fragmentari de tip si la nivelul grupei functionale aminice tertiare;

spre deosebire de seria morfinei picurile de la m/z= 59 si m/z= 150 sunt foarte intense.

3. Seria benzomorfanului In aceasta grupa intra analogii triciclici de morfina. Prezentam in continuare spectrele de masa (GC-MS, Electron Impact) ale principalelor droguri din aceasta clasa: Pentazocina si Fenazocina.
100 45 N 50 70 217

110 OH 159 146 174 188 160 180

202 270 230 242 256 260 280 300 285

55 0

82 91 100

115 120

131

40 60 80 (m ainlib) Pentazocine

140

200

220

240

Figura 18. Spectrul de masa al pentazocinei

205
100 230

50

44 0

58 69

91 105 100 120

158 173 131 145 187 140 160 180 200 220

OH 320 240 260 280 300 320

40 60 80 (m ainlib) Phenazocine

Figura 19. Spectrul de masa al fenazocinei

Asa dupa cum se observa de mai sus, acesti compusi poseda spectre de masa mai degraba diferite, prezentind totusi ceva asemanari intre ele si asemanari mult mai putin evidente comparativ cu seria morfinei si morfinanului. Aceste aspecte sunt datorate in primul rind modului diferit de fragmentare: in timp ce in seria morfinei si morfinanului principalele reactii de fragmentare sunt tot fragmentarile complexe de tip si la nivelul grupei functionale aminice tertiare, in seria benzomorfanului principalele reactii de fragmentare sunt diferite: in cazul pentazocinei principala reactie de fragmentare este o fragmentare de tip ipso la nivelul grupei functionale aminice tertiare insotita de transferul unui proton si de migrarea mai multor electroni, si care justifica fragmentele de la m/z= 217 (BP, 100%) si m/z= 68 (9%), Fig. 20; in cazul fenazocinei principala reactie de fragmentare fie o fragmentare de tip la nivelul grupei functionale aminice tertiare, care corespunde in acest caz cu o fragmentare tropilica, si care justifica fragmentele de la m/z= 230 (BP, 100%) si m/z= 91 (5%), Fig. 21.

206
H

N HO Pentazocina m/z= 285 (M+, 19%) HO m/z= 172 (21%) HO

NH + m/z= 68 (9%)

m/z= 217 (BP, 100%)

H2N CH2 H3C m/z= 45 (74%)

N HO Pentazocina H HO

CH2 + H2C

CH3 N CH +

m/z= 56 (11%) H2C m/z= 159 (23%) m/z= 70 (44%) +

N HO Pentazocina - CH3 HO

m/z= 270 (24%)

Figura 20. Schema reactiei de fragmentare in cazul pentazocinei

Fragmentele de la m/z= 172 (22%), 159 (23%), 70 (44%), 56 (11%) si 45 (74%), sunt explicate printr-o succesiune de reactii de fragmentare: fragmentarile complexe de tip si la nivelul grupei functionale aminice (insotite de transferul unora sau mai multor protoni si electroni), Fig. 20. Fragmentul de la m/z= 270 (22%), se explica printr-o fragmentare a metilului din fata de dubla legatura.

207

N HO Pentazocina m/z= 321 (M+, 1%) + H2O m/z= 173 (6%) HO

CH2 N +

m/z= 91 (5%)
m/z= 230 (BP, 100%)

HN + H3C

CH2 + H2C N CH2 m/z= 42 (6%) CH2 CH3 + H2C N CH

CH2 m/z= 58 (12%)

N HO H HO H2 C HO m/z= 158 (5%)

H2C

Figura 21. Schema reactiei de fragmentare in cazul fenazocinei

Fragmentele de la m/z= 173 (6%), 158 (5%), 58 (12%) si 42 (6%), sunt explicate printr-o succesiune de reactii de fragmentare: fragmentarile complexe de tip si la nivelul grupei functionale aminice (insotite de transferul unora sau mai multor protoni si electroni), Fig. 21.

4. Seria piperidinei In aceasta grupa intra analogii monociclici analogi morfinei. Prezentam in continuare spectrele de masa (GC-MS, Electron Impact) ale principalelor droguri din aceasta clasa: Petidina (Meperidine, Demerol), -Prodine, Profadol si

Fentanil.

208
71

100

O O 50 42 29 0 57 91 77 N 103 115 131 158 170 190 202 190 210 172 218 232 230 250 247

10 30 50 70 90 110 130 150 (m ainlib) 4-Piperidinecarboxylic acid, 1-m ethyl-4-phenyl-, ethyl ester

Figura 22. Spectrul de masa al petidinei

100

172

O 50 84 129 144 158 80 100 120 140 160 180 204 200 220 240 260 187 N 261 O

20 40 60 (m ainlib) Alphaprodin

29

42

57

77

91

105

Figura 23. Spectrul de masa al alfa-prodinei

209
100 57

OH

50

42 65 77 91 107 133 147 177 219

40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 (m ainlib) Phenol, m -(1-m ethyl-3-propyl-3-pyrrolidinyl)-

Figura 24. Spectrul de masa al profadolului

100

245

N 50 O N

146

189 29 42 57 77 105 91 132 158 10 30 50 (m ainlib) Fentanyl 0 70 90 202

110 130 150 170 190 210 230 250 270 290 310 330 350

Figura 25. Spectrul de masa al fentanilului

Asa dupa cum se observa de mai sus, acesti compusi poseda spectre de masa mai degraba diferite, prezentind totusi ceva asemanari intre ele si asemanari mult mai putin evidente comparativ cu primele 3 serii anterioare de morfinomimetice (care tin de fragmentarile scheletului amini). Din acest motiv fiecare spectru va fi interpretat semarat. Datele furnizate de spectrul de masa al petidinei permit elaborarea unei scheme a reactiilor de fragmentare ca cea din Fig. 26, si pot fi interpretate dupa cum urmeaza:

210

- ionul molecular M+ apare la m/z= 247 cu o intensitate mare, de 50%, caracteristic pentru esteri; - picul de baza (BP), apare la m/z= 71 (100%) si se datoreaza unei fragmentari fata gruparea functionala esterica; aceiasi fragmentare explica si picul de la m/z= 174 (19%); fragmentarea ulterioara a ultimului fragment (fragmentarile complexe de tip si la nivelul grupei functionale aminice insotite de transferul a 2 protoni si unora sau mai multor electroni) genereaza fragmentele de la m/z= 57 (29%) [ din care ulterior se genereaza m/z= 42 (25%)] si m/z= 117 (2%); fragmentul de la m/z= 117 sufera ulterior o fragmentare tropilica generind cationul tropiliu de la m/z= 91 (19%) sau o fragmentare fata de dubla legatura care genereaza cationul fenil la m/z= 77 (10%); tot prin fragmentarea lui m/z= 117 (fragmentare la nivelul dublei legaturi) se genereaza si fragmentul m/z= 103 (24%);
H3C N CH2 N + O O Petidina m/z= 247 (M+, 50%) H m/z= 174 (19%) - CH3 + m/z= 103 (24%) + m/z= 77 (10%) m/z= 91 (19%) + m/z= 117 (2%) H CH2 N CH2 - CH3 H2C N CH2 m/z= 42 (25%) H H O O m/z= 71 (BP, 100%) H

H3C m/z= 57 (29%)

Figura 26. Schema reactiei de fragmentare pentru petidina

211
H3C N H3C N - CH3 O O Petidina - C2H5 m/z= 29 (9%) O O m/z= 218 (29%) - CO2 m/z= 174 (19%) O H3C N

CH2 - H2C O

O m/z= 202 (4%) H3C N

m/z= 232 (10%) H3C N

- CO

Figura 26. Schema reactiei de fragmentare pentru petidina (continuare)

- picul de la m/z= 218 (29%) si cel ulterior de la m/z= 174 (19%) se datoresc unor fragmentari fata gruparea functionala esterica; fragmentarea metilului (din gruparea etil esterica) genereaza fragmentul de la m/z= 232 (10%) din care ulterior se genereaza m/z= 202 (2%) (tot fragmentari fata gruparea functionala esterica) iar in final se genereaza m/z= 174 (19%). Datele furnizate de spectrul de masa al alfa-prodinei permit elaborarea unei scheme a reactiilor de fragmentare ca cea din Fig. 27, si pot fi interpretate dupa cum urmeaza: - ionul molecular M+ apare la m/z= 261 cu o intensitate mica, de 11%; - picul de baza (BP), apare la m/z= 172 (100%) si se datoreaza unor fragmentari complexe in pozitia fata gruparea functionala esterica insotite de transferul a 2 protoni si unora sau mai multor electroni; fragmentarea ulterioara a ultimului fragment (fragmentarile complexe de tip ipso la nivelul grupei functionale aminice insotite de transferul unora sau mai multor electroni si protoni)

212

genereaza fragmentul de la m/z= 144 (17%); ulterior, printr-o fragmentare alchilica a gruparii etil, din m/z= 144 se genereaza fragmentul m/z= 117 (2%); fragmentul de la m/z= 117 sufera ulterior o fragmentare tropilica generind cationul tropiliu de la m/z= 91 (13%) sau o fragmentare fata de dubla legatura care genereaza cationul fenil la m/z= 77 (14%); tot prin fragmentarea lui m/z= 117 (fragmentare la nivelul dublei legaturi) se genereaza si fragmentul m/z= 105 (13%).
H3C N H3C N H + O O H H - CH4 m/z= 188 (14%) O O m/z= 71 (BP, 100%) H3C N

Alfa-prodina m/z= 261 (M+, 15%) N +

- HC NH
m/z= 28

m/z= 144 (17%) m/z= 77 (14%)


m/z= 172 (BP, 100%)

m/z= 84 (37%)

H CH2 N + CH2 - CH3 H2C N CH2 m/z= 42 (8%)

m/z= 105 (13%) + m/z= 77 (14%)

m/z= 117 (2%)

H3C m/z= 57 (14%)

+ m/z= 91 (13%)

Figura 27. Schema reactiei de fragmentare pentru alfa-prodina

213

Datele furnizate de spectrul de masa al profadolului permit elaborarea unei scheme a reactiilor de fragmentare ca cea din Fig. 28, si pot fi interpretate dupa cum urmeaza: - ionul molecular M+ apare la m/z= 219 cu o intensitate foarte mica, de 3%, caracteristic pentru fenoli; - picul de baza (BP), apare la m/z= 57 (100%) si se datoreaza unor fragmentari complexe de tip si la nivelul grupei functionale aminice tertiare insotite de transferul unui proton si unora sau mai multor electroni; aceiasi fragmentare explica si picul de la m/z= 162;
H N CH2 HO Profadol m/z= 219 (M+, 3%) H N H HO m/z= 219 (M+, 3%) HO + HO m/z= 162 N CH2 H2C N CH2 m/z= 42 (8%)

H3C m/z= 57 (BP, 100%)

H CH2 CH2 + H H2C N CH2 m/z= 42 (8%)

m/z= 177 (7%) CH2 -

HO m/z= 107 (2%) m/z= 91 (2%)

m/z= 77 (2%)

Figura 28. Schema reactiei de fragmentare pentru profadol

214

fragmentarile complexe de tip ipso si fata de grupa functionala aminica insotite de transferul unora sau mai multor electroni si protoni) genereaza fragmentele de la m/z= 177 (7%) si m/z= 42 (6%); ulterior, printr-o fragmentare complexa a fragmentului de la m/z= 177 se genereaza fragmentul m/z= 107 (2%), din care ulterior printr-o fragmentare tropilica se genereaza cationul tropiliu de la m/z= 91 (2%) si ulterior se genereaza cationul fenil la m/z= 77 (2%). Datele furnizate de spectrul de masa al fentanilului permit elaborarea unei scheme a reactiilor de fragmentare ca cea din Fig. 29, si pot fi interpretate dupa cum urmeaza: - ionul molecular M+ (m/z= 336) lipseste; - picul de baza (BP), apare la m/z= 245 (100%) si se datoreaza unor fragmentari tropilice (care explica si prezenta cationului tropiliu de la m/z= 91 (17%) si cationul fenil la m/z= 77 (20%); - fragmentarile complexe de tip si la nivelul grupei functionale aminice insotite de transferul a 2 protoni si unora sau mai multor electroni in fragmentul m/z= 245, genereaza fragmentele de la m/z= 189 (38%) si m/z= 57 (23%) [din care ulterior se genereaza m/z= 42 (28%)]; - fragmentarea de tip la nivelul grupei functionale cetonice insotite migrarea dublei legaturi in fragmentul m/z= 189, genereaza fragmentele de la m/z= 132 (16%) si m/z= 57 (23%) [din care ulterior se genereaza m/z= 29 (26%)];

215

N N

CH2 H

m/z= 77 (20%)

H N O O Fentanil m/z= 336 (M+, 1%) N

+ m/z= 91 (17%)

m/z= 245 (BP, 100%)

CH2 N O m/z= 189 (38%) + N CH2 H3C m/z= 57 (23%) - CH3 H2C N CH2 m/z= 42 (28%)

N + m/z= 132 (16%)

+ HC O m/z= 29 (26%)

m/z= 57 (23%)

Figura 29. Schema reactiei de fragmentare pentru fentanil

216

V. 5. Canabioide, Spice/Weed/ierburi a. canabioide naturale: canabis, hasis, marijuana, derivati b. canabioide de sinteza din Spice/Weed/ierburi
V.5.1. Introducere Conform Natiunilor Unite, canabisul este drogul cu cea mai larga utilizare in lume. In anul 2004, ONU a estimat ca aproximativ 4% din populatia adulta a lumii (162 milioane de persoane) consuma canabis, iar aproximativ 0,6% (22,5 milioane) il foloseau zilnic, fiind dependenti. Daca la aceste date adaugam si datele recente (din perioada 2008-2011) referitoare la canabioidele de sinteza (sau asazisele Spice/Weed/ierburi), numarul consumatorilor de canabioide se dubleaza sau chiar tripleaza.
Canabisul, cunoscut si sub numele de marijuana (uneori scris

"marihuana"), se refera la orice tip de preparate din planta de canabis (cinepa) destinate utilizarii ca drog psihoactiv. Practic canabisul/marijuana este un amestec din frunze, tulpini i inflorescente fin maruntite ale plantei mature de sex feminin canabis, care prezinta aspect de tutun verzui. Ca si drog, canabisul prezinta diverse alte denumiri: Grass sau Herb (Iarba), Buddha sau Bud, Mary Jane, Weed, Pot, Schwag.
Hasisul este rasina secretata de glandele situate la nivelul frunzelor de

cinepa. Hasisul se comercializeaza sub forma de "bulgari" solizi (Fig. 30) sau placi presate avind diverse nuante de culoare: rosie, maron, verde sau negru (in functie de tara de origine, puritate). Fumat sau mestecat este mai activ decit canabisul.
Figura 30. Bulgare hasis

217

Planta canabisul face parte din genul Cannabis, familia Cannabaceae si include trei specii, C. sativa, C. indica si C. Ruderalis, Fig. 31. Aceste plante sunt dioice (fiecare individ este fie masculin fie feminin) si este o planta anuala. C.

Sativa si C. indica cresc, in general, inalte (unele soiuri de ajunge la 4 m), iar
plantele femele dau o productie de flori bogate in THC (1% la 29%). C. ruderalis este foarte scurt, produce doar urme de THC.

Figura 31. Familia Cannabaceae: C. Sativa


(inclusiv color), C. indica si C. Ruderalis

Planta de canabis contine mai mult de 400 de compusi chimici diferiti, din care cel putin 70 sunt canabinoide. Componenta chimica psihoactiva majora din canabis si hasis este 9-tetrahidrocanabinol (abreviat ca THC), iar dintre celelalte

218

canabioide le amintim pe cele mai importante: canabidiol (CDB), canabinol (CBN) i tetrahidrocanabivarin (THCV), Fig. 32.
11 CH3 10 OH 1 2 HO Canabidiol (CDB) CH3 OH O Canabinol (CBN) CH3 OH CH3 OH

8 7

6 O 3 4 5 9-Tetrahidrocanabinol (THC)

O Tetrahidrocanabivarin (THCV) Figura 32. Structura principalelor canabioide naturale

Canabioidele de sinteza sau Spice/Weed/ierburi sunt droguri psihoactive

de sinteza care se inglobeaza in amestecuri de plante, motiv pentru care se mai denumesc si Spice/Weed/ierburi. Componentele chimice psihoactive cele mai intilnite apartin la 6 clase de substante: naftoilindoli, naftilmetilindoli, fenilacetilindoli, naftoilpiroli, naftilmetilindene si ciclohexilfenoli, Fig. 33.
R4 O O R3 N R1 R2 N R1 R2 R3 R3 N R1 R2

Fenilacetilindoli

Naftoilindoli

Naftilmetilindoli

219

O R3 N R1 R2 R1 Naftilmetilindene R2

OH R3 OH R2 Ciclohexilfenoli

R1

Naftoilpiroli

Figura 33. Structura principalelor clase de canabioide de sinteza, spice/ierburi

Componentele Spice/ierburi sunt:

chimice

psihoactive

majore

de

tip

canabioid

din

ciclohexilfenolul

CP-47,497-C8

(cis-3-[2-hidroxi-4-(1,1-

dimetilheptil)fenil]-ciclohexan-1-ol) si aminoalkilindoli de tip JWH (JWH-018, JWH-073 si JWH-250). Subliniem ca in Spice/ierburile comercializate se gasesc si alte substante psihoactive [diversi alcaloizi, opioide de sinteza, etc.], dar nu vor fi tratate aici.
OH H H O

OH

N Ciclohexilfenol (CP-47) JWH-018 H3CO O

N JWH-073

N JWH-250

Figura 34. Structura principalelor canabioide de sinteza, spice/ierburi

Spice/ierburile comercializate pe piata se gasesc sub diverse denumiri cum ar fi: Space Diamond, Space Gold, Space Rubin, Spice Arctic Synergy,

220

Spice Diamond, Spice Egypt, Spice Gold, Spice Gold Spirit, Spice Silver, Spice Tropical Synergy, 2Spicy, Algerian Blend, Bombay Blue, Botanic Fire, Bull Titan, Chill Out, Chill Out Second Edition, CHILL OUT, Chill X, Chill X Second Edition, Clover, Cultured Weed Ahia, Dream, Encense Gorilla, Escelle, Experience Cahoots, Experience Chill, Experience Ignite, Experience Vortex, Ex-ses Platinum, Flash, Forest Humus, Genie, Highdis Almdrohner, Ikarus, Jamaican Gold, Joker, Kiffer Feuerkrauter, King B, Krypton, Mojo, Nirwana (angels dust), Nirwana (angels kiss), Relax, Scope sex on the beach, Scope vanilla, Scope wildberry, Sencation, Sencation Blackberry, Sencation Vanilla, Sence, Sence Second Edition, Silent Black, Silent Red, Skunk, Sky High, Smok, Smok Second Edition, Smoke, Smoke XXX, Spirit, Sun Coast Herbal Teas D, Sun Coast Herbal Teas H, Sun Coast Herbal Teas S, Sun Coast Herbal Teas SH, Tagetes Lucida 10x extract, Yucatan Fire, ZoHaiMX, ZoHai RX, ZoHai SX, Wild Dagga,etc. Canabioidele, atit cele naturale cit si cele de sinteza, se consuma sub cele mai diverse forme: fumat, mincare, bauturi. Canabisul, hasisul, Spice/ierburile, se fumeaza in forma pura sau in amestec cu tutun. Odata inhalate cu fumul de tigara, substantele active sunt absorbite de organism prin capilarele pulmonare. Efectul se instaleaza rapid dup circa 10-20 de minute dupa inceperea fumatului. Praful de canabis (Kief, Fig. 32) se produce din frunzele si florile plantei este bogat in canabioide, si se consuma fie prin prizare directa fub forma de pudra, fie se produc produse de confetarie (prajituri, frusecuri, etc.) cind se maninca (Fig. 33), sau se poate bea in amestec cu alcool (cind de obicei se potenteaza reciproc; un amestec de alcool etilic si canabis este cunoscut sub numele de Green Dragon), sau cu ciaiuri. In cazul consumului sub forma de ceai sau produse de confetarie, efectele psihotice se instaleaz mai tirziu (dup 1 - 2 ore).

221

Figura 31. Canabis praf (Kief) Figura 32. Prajituri continind canabis

V. 5.2. Metabolizarea canabioidelor In functie de modul de introducere in organism, metabolizarea initiala a canabinoidele este diferita. Daca sunt administrate prin fumat, atunci procesul de metabolizare incepe chiar in plamini si apoi se continua in singe. Daca sunt administrate oral, atunci canabioidele sunt metabolizate mai intii la nivelul tractului gastro-intestinal si apoi se continua in ficat, singe. O caracteristica imporatanta a cnabinoidelelor este aceea ca ele persista pentru perioade de timp extrem de lungi in organism, ceea ce usureaza detectia lor. Chiar si dupa o singur administrare de THC, niveluri detectabile de THC pot fi gasite in organism (urina) pentru saptamani sau mai mult (in functie de cantitatea administrata si de sensibilitatea metodei de evaluare). In singe, THC sete detectabil numai pentru 2-3 ore, iar THC-COOH pentru maxim 6 ore. a. Cazul canabioidelor naturale: canabis, hasis, marijuana, derivati Literatura de specialitate descrie mai mult de 30 metabolii ai THC si peste 20 in cazul canabinolului si canabidiolului (identificati prin spectrometrie de masa).

222

Multi dintre acesti metaboliti sunt la rindul lor substante psihoactive. Dintre acesti metaboliti, 9-carboxi-9-tetrahidrocanabinolul (THC-COOH) este principalul produs de metabolizare, si este totodata de citeva ori mai activ ca drog comparativ cu THC. Principalele doua cai de metabolizare a THC sunt redate schematic in Fig. 33. Calea I, este calea majora de metabolizare, si consta in mai multe etape
CH3 OH 11-Hidroxilare I O CH2 OH OH O
9

II 8-Hidroxilare

-Tetrahidrocanabinol
(THC) HO

CH3 OH

O 11-Hidroxi- -tetrahidrocanabinol (11-OH-THC)

8Hidroxi9-THC
+ CH3 HO OH

oxidare

COOH OH

8Hidroxi9-THC

O Acid 11-nor-9-carboxi9-tetrahidrocanabinol (THC-COOH) COO-Glu Glucuronoconjugare OH

O Acid 11-nor-9-carboxi9-tetrahidrocanabinol glucuronat (THC-COO-Glu)

Figura 33. Schema reactiei de metabolizare a THC

223

succesive: mai intii are loc un proces de hidroxilare enzimatica (11-hidroxilare) a THC, cu formarea 11-hidroxi-9-tetrahidrocanabinolul (11-OH-THC). Acesta din urma sufera un proces de oxidare la nivelul hidroxilului alcoolic, cu formarea principalului compus de metabolizare a THC, acidul 11-nor-9-carboxi-9tetrahidrocanabinol (THC-COOH). THC-COOH poate suferi ulterior un proces de glucuronoconjugare formind acidul glucuronat, tetrahidrocanabinol glucuronat (THC-COO-Glu). Calea II, este calea secundara de metabolizare, si consta intr-un proces de hidroxilare enzimatica a THC, dar de data aceasta o 8-hidroxilare, cu formarea unui amestec de 8--hidroxi-9-tetrahidrocanabinolul (8--OH-THC) si 8--hidroxi-9tetrahidrocanabinolul (8--OH-THC). Acesti produsi de metabolizare sunt eliminati in cea mai mare parte din organism prin urina, in special sub forma de THC-COOH si THC-COO-Glu. b. Cazul canabioidelor de sinteza din Spice/Weed/ierburi Principalele cai de metabolizare ale canabioidelor de sinteza constau in reactii enzimatice de hidroxilare, oxidare, carboxilare, deshidratare si N-dealkilare, care conduc la circa 10-25 metaboliti (identificati prin spectrometrie de masa). Asa spre exemplu, in cazul JWH-018 (M=m/z=234), literatura de specialitate descrie existenta a 17 metaboliti, rezultati in urma unei scheme de metabolizare cum este cea redata schematic in Fig. 34. Principalele reactii de metabolizare sunt: monohidroxilarea la nivelul nucleului indolic, naftalenic sau a lantului Nalkilic, care conduc la metabolitii M1 (M=m/z= 358). continuare 3 cai posibile de metabolizare: - calea I, consta in doua hidroxilari succesive ale lui M1 care conduc la metabolitii din M2 (M=m/z= 374) si respectiv M3 (M=m/z= 390). Prin deshidratare si dehidrogenare ulterioara a lui M3 se obtine metabolitul M6 (M=m/z= 372); M1 sufera in acidul 11-nor-9-carboxi-9-

224

- calea II, consta initial intr-o deshidratare si dehidrogenare a lui M1, care conduce la metabolitul M4 (M=m/z=340). Prin doua hidroxilari succesive din M4 se obtin metabolitii M5 (M=m/z=356) si respectiv M6 (M=m/z=372);
monohidroxilare OH O desalkilare O

N JWH-018 M=m/z= 342

N M11 H M=m/z= 272 monohidroxilare OH

N M1 M=m/z= 358 II deshidratare si dehidrogenare O

I monohidroxilare (OH)2

O III

O desalkilare OH N

M12 N M=m/z= 288 H

M4

M=m/z= 340 monohidroxilare

M2 M=m/z= 374 monohidroxilare

O (OH)3 N H

O OH N M5 M=m/z= 356 monohidroxilare O OH

M12 M=m/z= 288 N M3 M=m/z= 390 deshidratare si dehidrogenare

OH N M6 M=m/z= 372 Figura 34. Schema reactiei de metabolizare a JWH-018

225

- calea III, consta in desalkilarea lui M1, care conduce la M12 (M=m/z= 288);
JWH-018 M=m/z= 342 O

carboxilare

N oxidare O O O

COOH

M13 M=m/z= 372

OH OH O

N hidroliza

O O

OH desalkilare O OH

N H

HO

OH

N H M10 M=m/z= 306

M10' M=m/z= 306

HO

OH

desalkilare

OH

M7 M7' M=m/z= 376 M=m/z= 376 OH monohidroxilare OH OH O O

N M8 M=m/z= 392 (OH)2 O OH

N monohidroxilare (OH)2 O

HO

OH M8' M=m/z= 392

OH

N M9 M=m/z= 408

HO

OH M9' M=m/z= 408

Figura 34. Schema reactiei de metabolizare a JWH-018 (continuare)

226

oxidarea unuia din nucleele benzenice din scheletul naftalenic a lui JWH018, urmata de hidroliza epoxidului intermediar, conduce la metabolitii dioli M7 (si M7) (M=m/z= 376). Desalkilarea metabolitii dioli M7 conduce metabolitii dioli desalkilati M10 (si M10)( M=m/z= 306), pe cind monohidroxilarea lui M7 conduce la metabolitii trioli M8 (si M8)( M=m/z= 392). Monohidroxilarea lui M8 vor conduce la metabolitii tetraoli M9 (si M9) (M=m/z= 408);

carboxilarea lui JWH-018 va conduce la metabolitul carboxilat M13 (M=m/z= 372). V.5.3. Analiza prin GC-MS in cazul canabioidelor Atit drogurile in sine cit si produsi de metabolizare ai canabioidelor se pot

determina prin GC-MS. a. Cazul canabioidelor naturale: canabis, hasis, marijuana, derivati Prezentam in continuare spectrele de masa (GC-MS, Electron Impact) si reactiile de fragmentare mai importante ale principalelor droguri si produsilor de metabolizare din clasa canabioidelor naturale: 9-tetrahidrocanabinol (THC), canabidiol (CDB), canabinol (CBN), tetrahidrocanabivarin (THCV), 11-hidroxi9-tetrahidrocanabinolul (11-OH-THC) si acidul 11-nor-9-carboxi-9tetrahidrocanabinol (THC-COOH). Asa dupa cum se observa, acesti compusi poseda spectre de masa cu asemanari si deosebiri si din acest motiv se vor trata separat. Asa spre exemplu, principalala reactie de fragmentare in cazul THC este o reactie de fragmentare de tip a unui metil fata de oxigenul piranic, care justifica framentul principal de la m/z= 299 (THC: M-15, 70%), Fig. 40. Ionul molecular este si pic de baza.

227
100 314

299 OH 231 50 41 271 O 55 67 81 91 80 107 121 120 147 140 160 180 193 200 217 220 240 260 280 300 320 243 258

29 0

20 40 60 (m ainlib) Dronabinol

100

Figura 35. Spectrul de masa al -9-Tetrahidrocanabinol (THC)


299 OH

100

OH 50

O 43 0 55 67 81 91 115 128 147 165 193 200 217 231 220 240 257 260 280 300 312

330

40 60 80 100 120 140 160 180 (m ainlib) 11-Hydroxy-.DELTA.9-tetrahydrocannabinol

320

340

Figura 36. Spectrul de masa al 11-Hidroxi--9-tetrahidrocanabinol (11-OH-THC)


41

100

OH

50 O 91 95 115 189 128 130 141 150 165 170 190 215 229 210 230 250 270 290 203 243 271 286

55 67

81

30 50 70 90 110 (m ainlib) 9-Tetrahydrocannabivarin

Figura 37. Spectrul de masa al Tetrahidrocanabivarin (THCV)

228
100 295

OH 50

O 41 0 55 100 128 120 140 152 165 178 160 180 195 209 200 223 220

238 251 240 260 280

310

40 60 80 (m ainlib) Cannabinol

300

320

Figura 38. Spectrul de masa al Canabinol (CBN)


231

100

OH 50 HO 83 108 121 174 193 207 187 220 246 258 271 240 260 280 299 314 300 320

41 0

55 67

147 159

40 60 80 100 120 140 160 180 200 (m ainlib) Res orcinol, 2-p-m entha-1,8-dien-3-yl-5-pentyl-, (-)-(E)-

Figura 39. Spectrul de masa al Canabidiol (CBD)

In cazul THF, celelalte reactii de fragmentare importante sunt prezentate in Fig. 40: transpozitie McLafferty (m/z= 246 si 68) urmate de eliminarea unui metil, cind se obtine fragmentul de la m/z= 321 (53%); fragmentarea retro Diels-Alder, cind se obtine fragmentul de la m/z= 271 (37%) si m/z= 43 (32%); fragmentarea catenei pentilice, cind se obtine fragmentul de la m/z= 258 (18%); eliminarea unui metil din acest din urma fragment, sau fragmentarea catenei pentilice a fragmentului principal de la m/z= 299, vor conduce la acelasi fragment, cel de la m/z= 243 (19%);

229
CH3 OH m/z= 68 McLafferty CH3 OH - C4H8 m/z= 56 CH3 OH

O m/z= 246 (2%) - CH3 m/z= 15 OH

O THC m/z= 314 (M+, 100%, BP) - CH3 m/z= 15

O m/z= 258 (18%) - CH3 m/z= 15 CH3

CH3 OH - C4H8 m/z= 56

OH

O m/z= 231 (53%) O m/z= 299 (70%) CH3 OH retro Diels-Alder - C3H7 m/z= 43 (32%) O THC m/z= 314 (100%, BP)

O m/z= 243 (19%)

CH3 OH

O m/z= 271 (37%) CH3 - C4H8 m/z= 56

CH3 OH

m/z= 68 O

O O m/z= 147 (13%)

Figura 40. Schema reactiei de fragmentare al THC

- fragmentarea McLafferty urmata de fragmentarea catenei pentilice a fragmentului de la m/z= 271, conduce fragmentul de la m/z= 147 (13%);

230

Fragmentarea metabolitilor THC, 11-OH-THC si THC-COOH, decurge de o maniera asemanatoare, Fig. 41. Principalala reactie de fragmentare este o reactie de fragmentare de tip fata de gruparea functionala hidroxilica (1-OH-THC: M-31, 100% BP) si respectiv carboxilica (THC-COOH: M-44,100%, BP), iar in continuare reactiile de fragmentare decurg similar ca in cazul THC.
CH2 OH OH COOH OH

O 11-OH-THC m/z= 330 (M+, 16%) - H2C OH m/z= 31 (16%) OH

O THC-COOH m/z= 344 (M+, 12%) - H+ - CO2 m/z= 44

O m/z= 299 (100, BP%)

Figura 41. Schema principalei reactii de fragmentare ale canabioidelor 1-OH-THC si THCCOOH

In cazul THCV, reactiile de fragmentare importante sunt prezentate in Fig. 42: principalala reactie de fragmentare in cazul THCV este o reactie de fragmentare retro Diels-Alder, care justifica picul de baza de la m/z= 41 (100%, BP) si picul de la m/z= 244 (5%). Fragmentul din urma sufera o transpozitie McLafferty urmata de eliminarea unui etil, cind se obtine fragmentul de la m/z= 147 (13%); reactia de fragmentare de tip a unui metil fata de oxigenul piranic, justifica picul de la m/z= 271 (38%). Fragmentarea catenei propilice, fragmentarea catenei propilice a conduce la fragmentul de la m/z= 258 (2%), iar prin eliminarea unui metil din acest din urma fragment, sau

231

fragmentului de la m/z= 271, vor conduce la acelasi fragment, cel de la m/z= 243 (33%); transpozitia McLafferty (m/z= 218 si 68) a THCV urmata de eliminarea unui metil, conduce la fragmentul de la m/z= 203 (36%).
CH3 O McLafferty CH3 O m/z= 244 (5%) retro Diels-Alder CH3 OH - C2H5 m/z= 29 OH McLafferty O THCV m/z= 286 (M+, 25%) - CH3 m/z= 15 CH3 OH - C2H5 m/z= 29 OH O m/z= 203 (36%) CH3 O m/z= 218 (2%) - CH3 m/z= 15 OH CH3 OH + H2C m/z= 41 (100, BP%)

O m/z= 147 (13%)

m/z= 68 - C2H5 m/z= 29

CH3

OH

O m/z= 258 (2%) - CH3 m/z= 15

m/z= 68

O m/z= 271 (38%)

m/z= 243 (33%)

Figura 42. Schema reactiei de fragmentare al THCV

In cazul CBN, reactiile de fragmentare importante sunt prezentate in Fig. 43. Principalala reactie de fragmentare in cazul CBN este o reactie de fragmentare de tip a unui metil fata de oxigenul piranic, care justifica picul de baza de la m/z= 295 (100%, BP). Fragmentarea ulterioara a catenei pentilice va conduce la fragmentul de la m/z= 238 (20%); acelasi fragment se obtine si prin fragmentarea

232

initiala a catenei pentilice din CBN (care justifica fragmentul de la m/z= 253 (9%)) urmata de fragmentare de tip a unui metil fata de oxigenul piranic.
CH3 CH3 OH - C4H9 m/z= 57 OH CH2 O m/z= 238 (20%)

O m/z= 295 (100%, BP) - CH3 m/z= 15

- CH3 m/z= 15 CH3 OH - C4H9 m/z= 57 OH

CH3

O CBN m/z= 310 (M+, 21%)

O m/z= 253 (9%)

Figura 43. Schema reactiei de fragmentare al CBN

In cazul CBD, reactiile de fragmentare importante sunt prezentate in Fig. 44. Principalala reactie de fragmentare in cazul CBN este o transpozitie McLafferty urmata de eliminarea unui metil, care justifica atit obtinerea picului de baza de la m/z= 231 (BP, 100%) cit si a fragmentului de la m/z= 246 (11%). O alta linie de fragmentare consta in o fragmentare initiala de tip retro Diels-Alder (care justifica fragmentele de la m/z= 271 (4%) si m/z= 43 (6%)) urmata de o transpozitie McLafferty si o fragmentarea catenei pentilice, cind se obtin fragmentele de la m/z= 147 (4%), 56, 68.

233
CH3 CH3 OH m/z= 68 McLafferty H OH - CH3 m/z= 15 OH

O m/z= 246 (11%)

O m/z= 231 (100%, BP)

HO CBD m/z= 314 (M+, 4%) CH3 OH H O H m/z= 314 (M+, 4%)

CH3 retro Diels-Alder - C3H7 m/z= 43 (6%) OH

CH3 - C4H8 m/z= 68 m/z= 56 O

O m/z= 271 (4%)

m/z= 147 (4%)

Figura 44. Schema reactiei de fragmentare al CBD

b. Cazul canabioidelor de sinteza din Spice/Weed/ierburi Prezentam in continuare spectrele de masa (GC-MS, Electron Impact) si reactiile de fragmentare mai importante ale principalelor droguri din clasa canabioidelor de sinteza: CP-47, JWH-018, JWH-073, JWH-250. In cazul CP-47 ionul molecular este intens (26%) si apare si picul M-18, caracteristic pentru compusii hidroxilici, Fig. 45. Picul de baza apare la m/z= 233 (BP, 100%), si este justificat prin trei reactii de fragmentare posibile (Fig. 46): - o reactie de fragmentare la nivelul gruparii hidroxil din inelul ciclohexanolic (insotita de eliminarea unei molecule de apa), care genereaza fragmentul de la m/z= 314 (26%). Acest fragment sufera ulterior o fragmentare la nivelul legaturii simple dintre cele doua cicluri, generind picul de baza de la m/z= 233 si fragmentul ciclohexenilic de la m/z= 81 (14%). Fragmentarea complexa de tip retro Diels Alder a fragmentului de la m/z= 314, genereaza picul importat de la m/z= 260 (7%), din care ulterior printr-o reactie de fragmentare a catenei laterale

234

alkilice, se genereaza fragmentul de la m/z= 161 (12%) si radicalul alkilic hepltil (m/z= 99); - o a doua reactie de fragmentare este cea a catenei laterale alkilice, cind pe linga fragmentul de la m/z= 233 se obtine si radicalul alkilic hepltil (m/z= 99). Fragmentarea complexa a BP insotita de eliminarea unei molecule de apa genereaza fragmentul de intensitate mare m/z= 215 (98%); - o a treia reactie de fragmentare este la nivelul legaturii simple dintre cele doua cicluri, cind pe linga fragmentul de la m/z= 233 se obtine si radicalul ciclohexanolic de la m/z= 99. Prin eliminarea unei molecule de apa din fragmentul ciclohexanolic se genereaza fragmentul de la m/z= 81 (14%). O reactie de fragmentare complexa tot la nivelul catenei laterale alkilice, genereaza fragmentul de la m/z= 260 (7%) si radicalul alkilic pentilic (m/z= 71). Fragmentarea legaturii simple dintre cele doua cicluri din fragmentul de la m/z= 260, genereaza un alt pic importat, cel de la m/z= 161 (12%).

Figura 45. Spectrul de masa al CP-47

235
OH

OH H OH - H 2O

OH retro Diels-Alder

CP-47 m/z= 332 (M +, 26%) OH

m/z= 314 (26%)

m/z= 260 (7%) -

+ m/z= 81 (14%) m/z= 233 (100, BP%) OH OH OH H OH H +

OH

m/z= 161 (12%)

CP-47 m/z= 332 (M +, 26%) OH H + m/z= 99 - H 2O m/z= 233 (100, BP%) OH

CH 2 C m/z= 233 (100, BP%) H OH 2 OH m/z= 233 - H 2O OH 2 C

m/z= 99

m/z= 81 (14%) m/z= 215 (98%) OH OH H m/z= 260 (7%) OH + m/z= 99 m/z= 161 (12%) OH OH OH +

m/z= 71

Figura 46. Schema reactiei de fragmentare al CP-47

236

Spectrele de masa ale canabioidelor de sinteza JWH-018, JWH-073, JWH250, sunt prezentate in figurile 47-49. Fragmentarea canabioidelor de tip JWH are loc asemanator, si o vom exemplifica pentru JWH-018, Fig. 50.

Figura 47. Spectrul de masa al Canabidiol JWH-018

Figura 48. Spectrul de masa al JWH-073

237

Figura 49. Spectrul de masa al JWH-250


O + N m/z= 270 (21%) N N m/z= 284 (56%)

O +

O N + O JW H-018 m/z= 341 (M +=BP, 100%)

m/z= 186(2%)

m/z= 155 (19%) - CO

N O m/z= 214 (50%) H N O m/z= 144 (21%)

m/z= 127 (28%)

m/z= 127 (28%)

Figura 50. Schema reactiei de fragmentare al JWH-018

238

In cazul JWH-018 ionul molecular este si pic de baza, aparind la m/z= 241 (BP, 100%). Fragmentarile complexe de tip si la nivelul grupei functionale aminice tertiare, constituie principalele reactii de fragmentare si explica fragmentele de la m/z= 284 (56%) si de la m/z= 270 (21%). O alta reactie de fragmentare importanta o constituie fragmentarea de tip la nivelul grupei functionale carbonilice, care explica fragmentele de la m/z= 214 (50%), m/z= 155 (19%) si m/z= 127 (28%). Acest din urma fragment se poate obtine si din fragmentarea de tip la nivelul grupei carbonilice a fragmentului de la m/z= 155. In urma unei fragmentari complexe a catenei alkilice insotita de eliminarea unei molecule de metan, a doi protoni (si migrarea de protoni si electroni), rezulta fragmentul de la m/z= 324 (48%), asa dupa cum este figurat in schema de mai jos:

N - CH4; - 2H+ O JWH-018

m/z= 324 (48%)

239

V.6. Amfetamine si derivati aminici


V.6.1. Introducere Amfetamina este cunoscuta inca din anul 1887, cind ed a fost sintetizata pentru prima oara de catre savantul roman Lazar Edeleanu [L Edeleanu, Ber., 20 (1887), 616]. Amfetaminele, denumite si ca Speed sau Uppers printre consumatori, sunt droguri cu larga raspindire pe piata ilicita, fiind substante
OH HO NH2 Amfetamina Efedrina NH HO Adrenalina NH OH

simpatomimetice cu structura asemanatoare adrenalinei si efedrinei, Fig.51.

Figura 51. Structura amfetaminei si analogi

Efectele euforice ale amfetaminelor se manifesta la consumatori printr-o senzatie de energie sporita, de bine, persoanele respective se simt mai inteligente, mai increzatore, mai rezistente. Din acest motiv amfetaminele produc in prima instanta o crestere a capacitatii de munca fizica si intelectuala, inlaturarea somnolentei pentru perioade lungi de timp, reducere a oboselii, cresterea increderii in sine. Pe linga amfetaminele propriuzise in aceasta clasa mai intra si o serie de derivati aminici inruditi, inclusiv triptamine, structura principalelor amfetamine fiind prezentata in Fig. 52.

240
OH NH R NH R AMP (Amfetamina, R= H) MAMP (Metamfetamina, R= CH3) O O MDMA (3,4-Methylenedioxymethamphetamine) (componenta principala a Extasy) H N R N R DMT (N,N-Dimetil-tripamina, R= CH3) DET (N,N-Dietil-tripamina, R= C2H5) H N N R X= OH, OCH3 X-substituit-DMT R X NH2

4-Metoxi-amfetamina, X= CH3-ONorefedrina, R= H Efedrina, R= CH3 4-Metiltio-amfetamina, X= CH3-SH N O H N R

O MDA, R= H MDEA, R= C2H5 H3CO H3CO OCH3 Mescalina NH2

Figura 52. Structura principalelor amfetamine

Amfetaminele se consuma sub cele mai diverse forme: administrare parenterala, mincare, bauturi. V. 6.2. Metabolizarea amfetaminelor In functie de structura lor, substituite sau nesubstituite la nucleul fenilic, amfetaminele se metabolizeaza in organism sub influenta unor enzime specifice, iar produsii de metabolizare sunt eliminati in final sub forma de glucuronoconjugati sau sulfatati prin urina (majoritar) si fecale. Asfel, MDMA, MDEA, MDA (amfetamine substituite la nucleul fenilic) sunt metabolizate prin procese de N-dealkilare, N-demetilare si O-metilare, sub actiunea enzimelor citocrom 3A4 si P450 2D6 precum si a enzimei catecol-Ometiltreansferaza, conducind la metabolitii din Fig. 53. Metabolitii dihidroxilati HHA, HHMA si HHEA sunt eliminati in final sub forma de conjugati sulfatati , pe

241

cind cei monohidroxilati HMA, HMMA si HMEA sunt eliminati in final sub forma de glucuronoconjugati sau sulfatati.
O H N R

N-Dealkilare
O MDMA, R= CH3 MDEA, R= C2H5 O O NH2

O-Demetilare

HO Sulfatare HO H R N

H N R

O-Demetilare
HO HO NH2

O-Metilare
OCH3 OH

Sulfatare

N-Dealkilare O-Metilare
H3CO HO NH2

Glucuronare

O Sulfat O

Glucuronare

H3CO Glucuronati O

Figura 53. Schema reactiei de metabolizare pentru amfetamine substituite la nucleu

Cit priveste metabolizarea AMP si MAMP (amfetamine nesubstituite la nucleul fenilic), in acest caz acestea sunt metabolizate prin procese de N-dealkilare,

para-hidroxilare, N-acilare, reducere si oxidare, iar metabolitii rezultati sunt


eliminati in final sub forma de glucuronoconjugati sau sulfatati, si chiar sub forma de acid hipuric.

242
H N H N

N-Dealkilare
MAMP NH2 para-hidroxilare AMP Oxidare NH

para-hidroxilare
HO NH2 O

HO

Sulfatare Glucuronare

Glucuronat (Sulfat)

Oxidare O Oxidare COOH Oxidare O N H CH2 COOH Reducere

Glucuronare
OH O Glucuronat

N-Acilare

Acid hipuric

Figura 54. Schema reactiei de metabolizare pentru amfetamine nesubstituite la nucleu

V.6.3. Analiza prin GC-MS in cazul amfetaminelor Prezentam in continuare spectrele de masa (GC-MS, Electron Impact) si reactiile de fragmentare mai importante ale principalelor droguri din clasa amfetaminelor: amfetamine tipice: AMP, MAMP, MDMA, MDEA; amfetamine din clasa triptaminelor: DMT, 7-Metoxy-DMT.

243

Asa dupa cum se observa, acesti compusi poseda spectre de masa asemanatoare, doar derivatii triptaminici prezentind citeva particularitati specifice azaheterociclurilor. Din aceste motive, reactiile de fragmentare vor fi prezentate doe la MDMA (Fig. 61) si DMT (Fig. 62).

100

44 NH 2

50

42 0

51 56

65 70

91 77 80 90 103 100 110 120 120 130 140

20 30 40 50 60 (m ainlib) Benzeneethanam ine, -m ethyl-

Figura 55. Spectrul de masa al AMP

100

58

NH 50

10 20 30 40 50 60 70 (m ainlib) Benzeneethanam ine, N,-dim ethyl-

15

30

42

51

65

91 77 80 90 100 115 110 120 134 130 140 150 160

Figura 56. Spectrul de masa al MAMP

244
100 58

O 50 O

NH

30 0

42 51

63

77

89

105

135

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 (m ainlib) N-Methyl-3,4-m ethylenedioxyam phetam ine

Figura 57. Spectrul de masa al MDMA (componenta de baza a Extasy)


72

100

50 44 77

O NH O

51 0

105

135

40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 (m ainlib) 3,4-Methylenedioxy-N-ethylam phetam ine

Figura 58. Spectrul de masa al EDMA


58 N

100

50

NH 0 30 42 51 63 70 77 80 89 103 115 130 143 188

10 20 30 40 50 60 (m ainlib) N,N-Dim ethyltryptam ine

90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200

Figura 59. Spectrul de masa al DMT

245

100

160

50 O 42 0

NH

204 145

51 58

77

89

102

117

130

188

40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 (m ainlib) Tryptam ine, 7-m ethoxy-N,N-dim ethyl-

Figura 60. Spectrul de masa al 7-Metoxi-DMT

Caracteristici comune si deosebiri in spectre


in cazul amfetaminelor tipice ionii moleculari fie lipsesc fie au o intensitate foarte mica caracteristic pentru aminele primare si secundare. In cazul triptaminelor ionii moleculari au o intensitate mica caracteristic pentru aminele tertiare [m/z= 188 (M+, 5%) pentru DMT]; principala reactie de fragmentare este fragmentarea de tip la nivelul grupei functionale aminice, care justifica existanta picurilor de baza. In cazul MDMA rezulta fragmentul de la m/z= 58 (100%, BP) si fragmentul de la m/z= 135 (8%), iar in cazul DMT rezulta fragmentul de la m/z= 58 (100%, BP) si fragmentul de la m/z= 130 (6%). Prin fragmentarea ulterioara a fragmentului de la m/z= 58, se obtin picurile specifice pentru amine de la m/z= 30, si m/z= 42; in cazul MDMA fragmentul de la m/z= 135 sufera o serie de fragmentari complexe succesive care conduc la picurile de la m/z= 105 (2%), 89 (2%) si 77 (7%); in cazul DMT fragmentul de la m/z= 130 sufera o serie de fragmentari complexe succesive care conduc la picurile de la m/z= 89 (2%) si 77 (4%).

246
H N CH2 H

O O MDMA

H O

CH2 +

CH2 HN CH2 H3C m/z= 58 (BP, 100%)

O m/z= 135 (8%) - CH2=O m/z= 30 (5%) CH2

CH2 - HO HO m/z= 89 (2%)

CH2 N CH2 m/z= 42 (3%) +

CH2 H2N m/z= 30 (5%)

m/z= 105 (2%)

Figura 61. Schema reactiei pentru fragmentare a MDMA


H N N DMT + m/z= 188 (M , 2%) - CH3 H N + CH2 HN CH2 H3C CH2 N CH2 m/z= 42 (5%) +

CH2 H2N m/z= 30 (2%)

m/z= 130 (6%)

m/z= 58 (BP, 100%)

Figura 62. Schema reactiei d fragmentare a DMT

247

V.7. Cocaina si derivati


V.7.1. Introducere Cocaina este alcaloidul principal din frunzele de Erythroxylon coca, arbust originar din America de Sud (Muntii Anzi), zonele subtropicala si tropicala (Bolivia, Columbia si Peru). Indigenii din America de Sud mesteca frunzele de coca de mii de ani, pentru inlaturarea senzatiei de oboseala si foame si pentru a inlatura efctele neplacute cauzate de altitudine (greata, ameteli). Planta era considerata un dar al zeilor si era folosita in timpul ritualurilor religioase si a inmormantarilor. "O potiune din frunzele de coca" a fost inclusa in reteta originala a lui John Styth Pemberton din 1886 pentru bautura Coca-Cola. Papa Leon al XII-lea, Sigmund Freud, Jules Verne si Thomas Edison aprobau in anul 1888 folosirea cocainei in bautura de Coca-Cola, sustinind ca este "bautura care inlatura obosela". (Intre timp Coca- Cola a inlocuit continutul de cocaina cu cofeina). Izolarea alcaloidului cocaina a fost facuta in 1855 de catre chimistul german Friederich Gaedcke. Obtinerea cocainei din frunzele de coca este un proces relativ simplu, de extractie. Din 150 kg de frunzese poate obtine 1 kg pasta de coca. Din punct de veder chimic, cocaina este o metil-benzoil-ecgonina, cocaina naturala fiind izomerul levogir (izomerul 2a, 3e-Z). Principale cocaine si produsi de metabolizare sunt prezentate in Fig. 63.

248
Me N O C OCH 3 H O

levo- Cocaina H - izomerul 2a,3e-Z


Me N H COOCH3 O H O C6H5 O Alococaina - izomerul 2a,3a-E H Me N COOH OH Ecgonina H OH Me N

COOCH3 H H C6H5 O

Me N

H COOCH3 H O C6H5

Pseudococaina - izomerul 2e,3e-E Me N COOH H Me N

O Pseudoalococaina - izomerul 2e,3a-Z COOH H H Me N H COOH H OH Pseudoaloecgonina - endo - izomerul 2e,3a-Z

- endo - izomerul 2a,3e-Z

H Aloecgonina OH Pseudoecgonina - exo - exo - izomerul 2a,3a-E - izomerul 2e,3e-E Figura 63. Structura principalelor cocaine

Cocainele se consuma sub cele mai diverse forme: administrare parenterala, fumat, prizare nazala, bauturi. V. 6.2. Metabolizarea cocainelor Metabolizarea cocainei are loc la nivelul ficatului si este catalizata de mai multe enzime; in cazul in care cocaina este ingerata concomitent alcoolul metabolizarea este mai intensa. Produsii de metabolism ai cocainei sunt mai lipofili (cu afinitate mai mare fata de sistemul nervos central) si mai toxici, ceea ce explica cresterea mortalitatii in cazul consumului concomitent de cocaina si alcool.

249

Metabolitul urinar major este benzoil-ecgonina (BE). Testul initial pentru a depista un consumator de cocaina urmareste detectarea acesteia in urina. Daca este testat parul sau saliva se cauta cocaina insasi. Procesul de metabolizare nu se opreste insa la BE, ci este mult mai complex, cuprinzind procese de hidroliza,

para- si meta-hidroxilare, dealkilare, iar metabolitii rezultati sunt eliminati in final


sub forma de glucuronoconjugati sau sulfatati, Fig. 64. Alaturi de BE, ceilalati metaboliti importanti sunt: para-hidroxi-benzoil-ecgonina (p-OH-BE), metahidroxi-benzoil-ecgonina (m-OH-BE), benzoil-norecgonina (NBE), esterul metilic al ecgoninei (EME) si ecgonia (EG).
Me N O C OCH 3 H Hidroliza Me N O C OCH 3 H O Cocaina H O Hidroliza OH Hidroliza Me N COOH H OH H Ecgonina (EG) O C OH H O H Benzoil-ecgonina (BE) meta-hidroxilare Me N O C OH H O H O Me N O C OH H O H O OH H O

H Esterul metilic al ecgoninei (EME) Me N

para-hidroxilare

N-Dealkilare HN O C OH H O O

meta-HidroxiBenzoil-norecgonina (NBE) para-HidroxiOH benzoil-ecgonina (m-OHBE) benzoil-ecgonina (p-OHBE)

Figura 64. Schema reactiei de metabolizare pentru cocaina

250

Atunci cint cocaina este fumata, principalul metabolit devine esterul metilic al anhidroecgoninei [(AEME), un produs de piroliza al cocainei] iar atunci cind este ingerata cu alcool principalul metabolit devine cocaetilenul [(COET), un produs de transesterificare al cocainei], Fig 65.
Me N O C OCH 3 H O Cocaina H O Piroliza (fumatul de cocaina) Esterul metilic al anhidroecgoninei (AEME) Me N Transesterificare (consum de cocaina cu alcool) O C OC H 2 5 H O H O Me N O C OCH 3

Me N

O C OCH 3 H O

Cocaina

Cocaetilen (COET)

Figura 65. AEME si COET

V.6.3. Analiza prin GC-MS in cazul cocainelor Prezentam in continuare spectrele de masa (GC-MS, Electron Impact) si reactiile de fragmentare mai importante ale cocainei si principalilor produsi de metabolizare din clasa cocainelor: cocaina, benzoil-ecgonina (BE), esterul metilic al ecgoninei (EME), esterul metilic al anhidroecgoninei (AEME), cocaetilen (COET) si ecgonia (EG). Asa dupa cum se observa, acesti compusi poseda spectre de masa ale stereoizomerilor cocainei (l-cocaina, pseudococaina, alococaina si pseudoalococaina) sunt, asa dupa cum era de asteptat, asemanatoare. De asemenea se observa asemanari evidente si cu metabolitii, motiv pentru care in continuare vor fi prezentate doar reactiile de fragmentare in cazul cocainei, Fig. 75.

251
100 82 N 182 H 50 94 42 51 0 15 27 50 68 70 90 110 105 303 122 130 152 166 150 170 198 190 210 230 250 272 270 290 310 H O O O O

10 30 (m ainlib) Cocaine

Figura 66. Spectrul de masa al l-cocainei

100

82 O O

182

50 77 42 0 51 59 67 100

H 96 105 152 122 120 138 140 166 160 180 200 220 198 O

303 272 240 260 280 300

40 60 80 (m ainlib) Ps eudococaine

Figura 67. Spectrul de masa al pseudococainei

100

82

O 182 50 O

42 55 0 67

96 77 105 122 100 120 140 152 166 160 180 O 198 200 220 240 260 272 280 O 303 300

40 60 80 (m ainlib) Allococaine

Figura 68. Spectrul de masa al allococainei

252
100 82

182 50 42 51 0 68

O 77 96

105 122 120 140 152 160 180 198 200 220 240

O 303 272 260 280 300

40 60 80 100 (m ainlib) Allops eudococaine

Figura 69. Spectrul de masa al pseudoallococainei

100

124 OH O 82 N

50

77 94 44 57 67 138 184 160 180 200 220 100 120 140 105 168

O 289 240 260 280 300

40 60 80 (m ainlib) Benzoylecgonine

Figura 70. Spectrul de masa al benzoil-ecgoninei (BE)

100

82 96 N

50 42 55 0 68 112 122 90 HO O 199 O 140 155 168 182

40 50 60 70 80 (m ainlib) Ecgonine m ethyl es ter

100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210

Figura 71. Spectrul de masa al esterului metilic al ecgoninei (EME)

253
100 O N 152

50

181 122 106 100 110 120 (m ainlib) Ecgonidine, m ethyl es ter 0 130 134 140 150 160 138 166 170 180 190

Figura 72. Spectrul de masa al esterului metilic al anhidroecgoninei (AEME)


196 O 82 N O O 50 94 105 212 166 272 317 O

100

122 0 67

50 70 90 110 130 150 170 190 210 230 250 270 290 310 330 (m ainlib) 8-Azabicyclo[3.2.1]octane-2-carboxylic acid, 3-(benzoyloxy)-8-m ethyl-, ethyl es ter, [1R-(exo,exo)]-

Figura 73. Spectrul de masa al cocaetilen (COET)


82 42 96 N 57 50 124 15 0 18 40 50 60 70 80 90 27 68 86 112 108 HO O 141 156 OH 168 185

100

10 20 30 (m ainlib) Ecgonine

100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200

Figura 74. Spectrul de masa al ecgoninei

254
H3C

O O O CH3 H3C N O O H H2C fragment X O O CH3 H3C N H3C N + CH m/z= 42 (24%)

Cocaina O m/z= 303 (M+, 18%)

H3C N

O O CH3 + HO

m/z= 82 (BP, 100%) + O H3C O O H3C O m/z= 220 O H3C O + HO O m/z= 122 (12%)

H2C m/z= 182 (72%) O H3C N + O

O m/z= 122 (12%) CH3 m/z= 77 (32%) H3C N O +

H2C m/z= 82 (BP, 100%)

CH3 m/z= 98 (16%)

CH2

H3C

O O O O O CH3 m/z= 272 (11%) O H3C N

O O CH3 + O

m/z= 105 (30%) Figura 75. Schema reactiei de fragmentare a cocainei

m/z= 198 (13%) O

Principalele reactii de fragmentare sunt fragmentarile complexe de tip si la nivelul grupei functionale aminice tertiare, insotite de transferul unuia sau mai multor protoni si electroni. Astfel, picul de baza de la m/z= 82 (100%, BP) se poate

255

explica printr-o suita de reactii de fragmentari complexe, care incepe cu o fragmentare de tip la nivelul grupei functionale aminice tertiare, urmate de o noua fragmentare de tip la nivelul grupei functionale aminice tertiare din fragmentul format initial (notat X), fragmentari insotite de transferul de protoni si electroni; fragmentarilor complexe de tip si a fragmentului corespunzator picului de baza de la m/z= 82 conduce la un alt pic important, cel de la m/z= 42 (24%); tot prin reactii de fragmentare complexa a fragmentului X se explica si picurile semnificative de la la m/z= 182 (72%), m/z= 122 (12%), 77 (32%). Fragmentele de la m/z= 272 (11%), 193 (13%) si 105 (30%), sunt explicate prin reactiile de fragmentare la nivelul gruparilor functionale esterice.

256

V.8. LSD si derivati


V.8.1. Introducere LSD sau dietilamida acidului lisergic, este un drog de sinteza derivat de la acidul lisergic. Derivatii acidului lisergic reprezinta o clasa vasta de produsi naturali (alcaloizii) sau derivati de sinteza si/sau semisinteza avind atit proprietati curative cit si toxice. Alcaloizii ergotici formeaza o clasa foarte importanta de compusi, si se numr printre putinii alcaloizi care nu sunt produsi de plante. Alcaloizii continind egolina au fost descoperiti in specii de fungi apartinind diferitelor grupe de Phycomycetes - Ascomycetes. Principala sursa de alcaloizi derivati de la acidul lisergic, este ergotul sclerotul unor ciuperci parazite din genul Claviceps. Ergotul sau cornul secarei (Secale cornutum) este sclerotul (miceliul) uscat al unei ciuperci parazite Claviceps purpurea Tulasne din grupa Ascomycetes Pyrenomycetales, care creste pe diferite graminee, dar mai ales pe secara. Din cauza efectului constrictor asupra muschilor uterului (efectul ocitocic) ergotul era un leac al farmaciei vechi, fiind utilizat pentru usurarea nasterilor. Din punct de veder chimic, LSD face parte din categoria compusilor indolici cu structura 9-ergolenica, Fig. 76. Derivatii LSD-ului au o structura asemanatoare, prezentind diversi alti substituienti pe scheletul 9 (sau 8)- ergolenic.
O N C 9 10 R5 8H 7 N6 CH3 5H 4 3 9 10 8 R4

7 N6 R3 5H 4

HN 2 1 LSD

3 N R1 1 2 R2 R1 - R5 - H, radicali organici Derivati de LSD

Figura 76. Structura LSD

257

Ca si drog, LSD-ul este un compus psihedelic produs prin semisinteza, care se poate incadra in familia mare a triptaminelor. Este sintetizat din acidul lisergic, care la rindul sau se obtine din ergotul de secara. Se administreaza parenteral sau prin alimentatie. V. 8.2. Metabolizarea LSD Metabolizarea LSD are loc la nivelul ficatului si este catalizata enzimatic. Produsul principal de metabolizare este dietilamida acidului 2-oxo-3-hidroxyi lisergic (2-O-3-OH-LSD). Acest metabolit se elimina prin urina si concentratia sa urinara este de circa 15-45 de ori mai mare comparativ cu a LSD.
O C N N O C N N CH3 metabolizare HN OH O 2-O-3-OH-LSD

CH3

HN LSD

Figura 76. Schema reactiei de metabolizare pentru LSD

V.6.3. Analiza prin GC-MS in cazul cocainelor Ca si drog, LSD-ul este principalul reprezentant al clasei, si de aceea prezentam in continuare spectrele de masa (GC-MS, Electron Impact) si reactiile de fragmentare mai importante doar pentru LSD. Se observa ca ionul molecular este si pic de baza aparind la m/z= 323 (M+= BP, 100%), si este urmat de un pic M+1 cu intensitate mare (m/z= 324 (19%)). Principala reactie de fragmentare in cazul LSD este o fragmentare de tip la nivelul grupei functionale amidice, insotite de eliminarea a doi hidrogeni si de transferul a mai multor electroni, care justifica picul intens de la m/z= 221 (74%) si

258

picul de la m/z= 100 (5%). O serie de reactii de fragmentare complexa a fragmentului de la m/z= 221 justifica existenta picurilor de la m/z= 207 (40%) si m/z= 167 (13%). Fragmentarea de tip fata ce gruparea CO din fragmentulde la m/z= 100, explica picul semnificativ de la m/z= 72 (55%).
100 O N N 72 44 0 58 76 89 100 128 154 167 196 265 280 295 235 249 180 200 220 240 260 280 300 320 207 323

221

HN 50

181

40 60 80 100 120 140 (m ainlib) D-Lys ergic acid N,N-diethylam ide

160

Figura 77. Spectrul de masa al LSD

100

268

N O NH 192 154 OH 111 44 0 55 83 167 127 139 180 207

224

50

239 250

40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 (m ainlib) Lys ergic acid

Figura 78. Spectrul de masa al acidului lisergic

259

N H O C N H N H CH3 HN m/z= 221 (74%) m/z= 72 (55%) N CH3 + O - CO C N + H2

m/z= 100 (5%)

HN LSD m/z= 333 (M+= BP, 100%)

NH + HN m/z= 207 (40%) HN m/z= 167 (13%)

CH2 C NH

O C N retro Diels-Alder N CH3

O C N + CH2 N CH3 m/z= 43 (6%) HN m/z= 280 (7%)

HN

+ O

C N

+ H2

H HN m/z= 100 (5%) m/z= 181 (39%) - C2H2

- HCN HN m/z= 154 (14%) m/z= 128 (12%)

Figura 78. Schema reactiei de fragmentare a LSD

260

O alta reactie de fragmentare importanta a LSD, este reactia de fragmentare complexa retro Diels-Alder, urmate de fragmentarea de tip la nivelul dublei legaturi, care explica picurile semnificative de la m/z= 280 (7%), m/z= 181 (39%), 154 (14%), m/z= 128 (12%), m/z= 100 (5%), 43 (6%).

261

BIBLIOGRAFIE

Referinte bibliografice Web 1. UNODC, World Drug Report 2007. Website: http://www.unodc.org/pdf/research/wdr07/WDR_2007.pdf 2. World Drug Report 2007, United Nations, Office of Drugs and Crime, 2007. Website: http://www.unodc.org/unodc/index.html 3. Drugs of Abuse, Regional Laboratory for Toxicology. Website: http://www.toxlab.co.uk/dasguide.htm#OPIATES 4. Drugs of Abuse, Regional Laboratory for Toxicology. Website: http://www.toxlab.co.uk/dasguide.htm#CANNABIS. 5. Understanding the Spice phenomenon. European Monitoring Centre for Drugs and Drug Addiction, Lisbon, 2009. Website: http://www.emcdda.europa.eu/html.cfm/index90917EN.html 6. C. Steup, Untersuchung des Handelsproduktes Spice. Note from THC Pharm GmbH. Website: http://usualredant.de/drogen/download/analyse-thc-pharmspice-jwh-018.pdf 7. Synthetic cannabinoids and Spice. European Monitoring Centre for Drugs and Drug Addiction, Lisbon, 2009. Website: http://www.emcdda.europa.eu/html.cfm/index90414EN.html

Idex alphabetic carti si manuale de referinta Drummer, O.H. The Forensic Pharmacology of Drugs of Abuse, Oxford University Press, New York, 2001. Giddings, J.C.. Unified Separation Science. New York: Wiley, 1991

262

Grob, R.L.; Barry, E.F. Modern Practice of Gas Chromatography, Wiley, Hoboken, 2004 Gross, J.H. Mass Spectrometry - A Textbook, Springer, Heidelberg, 2004 Harvey, D. Modern Analyiticalt Chemistry, McGraow Hill, London, 2000 Hbshmann, H.J. Handbook of GC/MS: Fundamentals and Applications, 2nd ed.,Wiley-VCH, Weinheim 2009 Kitson, F.G.; Larsen, B.S.; McEwan, C.N. Gas Chromatography an Mass Spectrometry A prasctica Guide, Academic Press, San Diego, 1996 Liu, R.; Gadzala, D.E. Handbook of Drug Analysis, CRC PRESS, Washinton, DC, 1997. Mangalagiu, I. Alcaloizi morfinici si analogy de sinteza, Ed. Dossoftei, Iasi, 2000. Maurer, H.H.; Pfleger, K.; Weber, A.A. Mass Spectral and GC Data of Drugs, Poisons, Pesticides, Pollutants and their Metabolites, Wiley-VCH, Weinheim, 2007. McLafferty, F.W.; Turecek, F. Interpretation of Mass Spectra, 4-thy Ed., University Science Books, Sausalito, California, 1993 Mc Master, M.C. GC/MS: a Practical User,s Guide, Wiley, Hoboken, 2008 Rood, D. A Practical Guide to the Care, Maintenance, and Troubleshooting fo Capillary Gas Chromatograpy Systems, 2nd Edition, Heidelberg, 1995 Settle, F, Handbook in Instrumental Techniques for Analytical Chemistry- Section II, Prentice Hall, New Jersey, 1997 Spiehler, V. Clarkes Analysis of Drugs and Poisons in Pharmaceuticals, in: Body Fluids and Postmortem Material, Pharmaceutical Press, London, 2004. Yinon, J. Advances in Forensic Applications of Mass Spectrometry, CRC PRESS, New York, 2004. Idex alphabetic lucrari stiintifice Auwartera, V.; Dresen, S.; Weinmann, W.; Muller, M.; Putz, M.; Ferreiro, N. Mass. Spectrom. 44 (2009) 832.

263

Beyer, J.; Peters, F.T.; Maurer, H.H. Ther. Drug Monit. 27 (2005) 151. Bijlsma, L.; Sancho, J.V.; Pitarch, E.; Ibnez, M.; Hernndez, F. Journal of Chromatography A 1216 (2009) 3078. Broussard, L.A.; Presley, L.C.; Pittman, T.; Clouette, R.; Wimbish, G.H. Clinical Chemistry 43 (1997) 1029. Capilla-Gonzalez, V.; Hernandez-Rabaza, V. Pharmaceuticals 4 (2011) 915. Cardona, P.S.; Chaturvedi, A.K.; Soper, J.W.; Canfield, D.V. Forensic Science International 157 (2006) 46. Chen, B.H.; Taylor, E.H.; Papas, A.A. J. Anal. Toxicol. 14 (1990) 12. Cognard, E.; Bouchonnet, S.; Staub, C. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 41 (2006) 925. Dresen, S.; Ferreiro, N.; Putz, M.; Westphal, F.; Zimmermannb, R.; Auwartera, V. J. Mass. Spectrom. 45 (2010) 1186. Dowling, G.; Regan, L.; Tierney, J.; Nangle, M. Journal of Chromatography A 1217 (2010) 6857. Edeleanu, L. Ber., 20 (1887), 616. Felinger, A,; Guiochon, G. Trends in Analytical Chemistry 14 (1995) 6. Giovanni, N.; Rossia, S.S. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications, 658 (1994) 69. Huestis, M.A.; Darwin, W.; Shimomura, E. & all. Anal Toxicol. 31 (2007) 462. Jufer, R.A.; Wstadik, A; Walsh, S.L.; Levine, B.S.; Cone, E.J. J. Anal. Toxicol. 24 (2000) 467. Kankaanpaa, A.; Gunnar, T.; Ariniemi, K.; Lillsunde, P.; Mykkanen, S.; Seppala, S. Journal of Chromatography B 810 (2004) 57. Khanna, N., Varshney, I.C., Banerjee, S., Singh, B.B. Analyst 108 (1983) 415. Kintz, P.; Mangin, M. Forensic Science International 73 (1995) 93. Klette, K.L.; Anderson, C.J.; Poch, G.K.; Nimrod, A.C.; ElSohly, M.A. J.Anal. Toxicol. 24 (2000) 550. Kraemer, T.; Maurer,H.H. Journal of Chromatography B 713 (1998) 163. Lee, M.S.; Kerns, E.H. Mass Spectrom. Rev. 18 (1999) 187. Maurer, H.H. Anal. Bioanal. Chem. 388 (2007) 1315. Maurer, H.H.; Tenberken, O.; Kratzsch, C.; Weber, A.A.; Peters, F.T. J. Chromatogr. A 1058 (2004) 169.

264

Meadway, C.; George, S.; Braithwaite, R. Forensic Science International 127 (2002) 136. Meng,P.; Wang, Y. Forensic Science International 197 (2010) 80. Micaya, A.I., Zaikin, V.G. Mass Spectrom. Rev. 9 (1990) 115. Musshoff, F.; Daldrupb, T. Forensic Science International 88 (1997) 133. Nourse, B.D.; Cooks, R.G. Anal. Chem. Acta, 228 (1990) 1. Ohta, H.; Suzuki, S.; Ogasawara, K. J. Anal. Toxicol. 23 (1999) 280. ONeal, C.; Poklis, A. J. Anal. Toxicol. 21 (1997) 427. Overton, E.B.; Carney, K.R. Trends in Analytical Chemistry 13 (1994) 252. Paul, B.D.; Lalani, S.; Bosy, T.; Jacobs, A.J.; Huestis, M.A. Biomed. Chromatogr. 19 (2005) 677. Peters, F.T.; Schaefer, S.; Staack, R.F.; Kraemer, T.; Maurer, H.H. J. Mass Spectrom. 38 (2003) 659. Postigo, C.; Lopez de Alda, M.J.; Barcelo, D. Trends in Analytical Chemistry 27 (2008) 1053. Pubill, D.; Garcia-Rats, S.; Camarasa, J.; Escubedo, E. Pharmaceuticals 4 (2011) 822. Ramirez Fernandeza, M.M.; De Boecka, G.; Woodb, M.; Lopez-Rivadullac, M.; Samyna, N. Journal of Chromatography B 875 (2008) 465. Scheidweiler, K.B.; Huestis, M.A. Journal of Chromatography B 835 (2006) 90. Sobolevsky, T.; Prasolov, I. Rodchenkov, G. Forensic Science International 200 (2010) 141. Staacka, R.F.; Fritschib, G.; Maurera, H.H. Journal of Chromatography B 773 (2002) 35. Teske, J.; Putzbachb, K.; Engewaldb, W.; Mullera, R.K. Chromatography B 772 (2002) 299. Tracqui, A.; Kintz, P.; Mangin, P. J. Forensic Sci. 40 (1995) 254. Journal of

Usmanova, D.; Khasanova, U.; Pantsireva, A.; Bocxlaerb, J. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 53 (2010) 1058. Zayed, M.A.; Hawash, M.F.; Fahmey, M.A. Spectrochimica Acta A 64 (2006) 363. Zbancioc, Ghe.; Moldoveanu, C.; Gradinaru, R.; Drochioiu, G.; Olteanu, G.; Mangalagiu I.I. International Journal of Criminal Investigation 1 (2011) 17. Zhang, Q.; Ma, P.; Cole, R.B.; Wang, G.D. Anal. Bioanal. Chem. 386 (2006) 1345. Zhang, Z.; Yan, B.; Liu, K.; Bo, T. ; Liao, Y.; Liu, H. Rapid Commun. Mass Spectrom. 22 (2008) 2851.

265

Wan Raihana, W.A.; Gan, S.H.; Tan, S.C. Journal of Chromatography B 879 (2011) 8. Wasels, R.; Belleville, F. Journal of Chromatography A 674 (1994) 225. Weinmann, W.; Wiedemann, A.; Eppinger, B.; Renz, M.; Svoboda, M. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 10 (1999) 1028. Wintermeyer, A.; Mller, I.; Thevis, M.; Jbner, M.; Beike, J.; Rothschild, M.A.; Bender, K. Anal. Bioanal. Chem. 398 (2010) 2141.