ASPECTOS TCNICOS DEL TRABAJO CON ENZIMAS

El xito del trabajo con enzimas depende del cuidado con que se eviten las condiciones en las cuales son inestables. Las purificaciones deben llevarse a cabo sin prdidas intiles de tiempo y lo ms conveniente, en general, es guardar las preparaciones en congeladora. Deben evitarse altas temperaturas y acidez o alcalinidad extremas. Durante el aislamiento y la purificacin conviene, en general, trabajar entre 0 y 4 oC y evitar pH mayor que 9 o menor que 5. Debe evitarse la formacin de espuma, ya que la misma es indicador de desnaturalizacin proteica. Los solventes orgnicos inactivan muchas enzimas a temperatura ambiente; de modo que los fraccionamientos con los mismos deben llevarse a cabo a baja temperatura y sta no debe elevarse hasta que el solvente se haya eliminado o diluido a concentraciones inocuas. Deben tomarse tambin varias precauciones en lo que se refiere a las condiciones de la reaccin: Elegir pH y temperatura en las zonas de mayor estabilidad de la enzima Llevar a cabo la reaccin a temperatura constante. Elegir un buffer adecuado para evitar cambios de pH Evitar la introduccin de trazas de otras enzimas (por ejemplo saliva). Elegir una cantidad de enzima adecuada para obtener variaciones apropiadas de la magnitud a medir.

http://www.calvo.qb.fcen.uba.ar/Trabajo%20con%20enzimas.htm

EXTRACCION DE ENZIMAS Las condiciones para extraer las enzimas y pasarlas a solucin son a menudo crticas y requieren el estudio de muchas variables. Es necesario destruir las clulas, eventualmente las estructuras subcelulares y disociar las enzimas de otras molculas. A veces es necesario pasarlas a solucin como complejo mucoproteico o nucleoproteico y disociarlo luego durante la purificacin. Aunque la dispersin de agregados moleculares puede frecuentemente lograrse mediante medios mecnicos, en muchos complejos enzimticos estn involucradas fuerzas especficas; de la naturaleza de las mismas depende el mtodo a emplear. En general, el primer paso consiste en la obtencin de un homogenato, que implica la destruccin de la clula y el pasaje de las enzimas a solucin o suspensin. Esto puede llevarse a cabo por:

1) Homogenizacin mecnica: Puede utilizarse un homogeneizador de vidrio, mortero, licuadora,

a veces con la ayuda de abrasivos como almina, arena o bolitas de vidrio y con un solvente adecuado, isotnico (sacarosa 0,25 M, NaCl 0,9%, KCl 0,15 M) o ligeramente hipertnico, en un buffer adecuado para controlar el pH.

2) Homogeneizacin snica: El choque de ondas snicas o ultrasnicas provoca cambios de

presin de miles de atmsferas, que rompen la pared celular. Se usa generalmente para bacterias y levaduras y, a veces, para determinados tejidos animales (bazo, rin, eritrocitos).

3) Desintegracin trmica: El congelamiento y descongelamiento rpidos y repetidos suelen

usarse para desintegrar bacterias y eritrocitos. Por congelacin se forman cristales de hielo intracelulares, destruyendo la estructura. Al descongelarse, las clulas se destruyen osmticamente debido a la presencia de agua pura y se libera su contenido.

4) Desintegracin qumica: Se utilizan agentes que atacan la pared celular, como el etanol, ter
de petrleo, isopentanol, etc.

5) Homogeneizacin por deshidratacin: Se basa en la precipitacin de protenas por solventes

orgnicos. En la preparacin del "polvo acetnico" se utiliza acetona en fro.

http://payala.mayo.uson.mx/Programa/Aislamiento%20y%20purificaci%C3%B3n.htm