PRCTICAS BIOQUMICA Y MICROBIOLOGA INDUSTRIALES (Licenciatura de Bioqumica) Dr. Pedro F. Mateos Gonzlez Dr. Pedro M.

Coll Fresno

INTRODUCCION

De todos los productos de origen biolgico producidos a escala industrial, los antibiticos son probablemente los ms importantes tanto desde el punto de vista econmico como sanitario. Los antibiticos son compuestos orgnicos de bajo peso molecular producidas por ciertos microorganismos para eliminar o inhibir el crecimiento de otros microorganismos. Desde el punto de vista metablico, son productos del metabolismo secundario y por lo tanto, no necesarios para el crecimiento normal de los microorganismos productores. El hbitat natural de la mayora de los microorganismos productores de antibiticos es el suelo. Entre los productores ms importantes figuran hongos filamentosos (Aspergillus, Penicillium y Cephalosporium), bacterias Gram (+) formadoras de endosporas (Bacillus) y bacterias filamentosas (Streptomyces). La prctica que vamos a realizar consistir en el aislamiento microorganismos productores de antibiticos a partir de una fuente natural: el suelo. Intentaremos identificarlos, ensayaremos la actividad del antibitico que produzcan respecto a otro antibitico de referencia ya conocido y finalmente realizaremos el espectro de actividad del nuevo antibitico.

1 parte: AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS PRODUCTORES DE ANTIBIOTICOS

El objetivo inicial es aislar microorganismos a partir de una muestra de suelo mediante siembra en medio rico no selectivo (Agar nutritivo). Posteriormente se seleccionarn microorganismos productores de antibiticos por su capacidad de formar halos de inhibicin del crecimiento de un micoorganismo sensible

AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS

DIA 1 (viernes) -Preparar una suspensin de una muestra de origen natural (suelo) en agua estril: 10 g suelo + 90 ml agua estril -Agitar durante 1 hora para resuspender bien los microorganismos adheridos a las partculas del suelo. -Grupo A: Preparar diluciones seriadas de la suspensin anterior de 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 y 10-5. (0,5 ml de suspensin + 4,5 ml de agua estril). -Grupo B- Calentar la suspensin de suelo 10 min. a 80 C y posteriormente realizar diluciones seriadas1:4 (1/4, 1/16, 1/64, 1/256, 1/1.024) (1,5 ml de suspensin+4,5 ml de agua estril). -Sembrar 0,2 ml de cada dilucin en una placa de Agar Nutritivo con un asa de Digralski. -Incubar a 25 C durante 3 das, para favorecer el crecimiento de microorganismos mesfilos. DIA2 (lunes) -Observar los microorganismos que han crecido en las placas de Agar Nutritivo. -Elegir la placa en la que haya entre 30-300 colonias. Hacer un recuento de las colonias y expresar el resultado en ufc/g suelo.

SELECCION DE MICROORGANISMOS PRODUCTORES DE ANTIBIOTICOS

DIA2 (lunes) -Sembrar en placas test algunos de los microorganismos aislados con el fin de poder seleccionar los productores de antibitico. Utilizaremos como microorganismos sensibles Bacillus subtilis (Gram+) o Pseudomonas (Gram-). Preparacin de placas test: -Aadir a un tubo con 20 ml de Agar Nutritivo fundido y mantenido a 50C, 1 ml de una suspensin del microorganismo sensible. -Tapar el tubo con parafilm. Homogenizar por inversin una vez. -Verter sobre una placa Petri vaca y dejar solidificar. Siembra de las placas test -Identificar en las placas de Agar Nutritivo con colonias bien aisladas varios microorganismos morfolgicamente diferentes. -Sembrar estos microorganismo en estra sobre la superficie de las placas test utilizando palillos estriles (8-10 estras por placa). -Incubar las placas a 25 C durante 24 horas para permitir el crecimiento de los microorganismos aislados del suelo y la produccin de antibitico DIA3(martes) -Observar si se han producido halos de inhibicin del crecimiento del microorganismo sensible alrededor de algunas de las estras -Aislar el microorganismo productor.

2 parte: IDENTIFICACION DEL MICROORGANISMO PRODUCTOR DE ANTIBIOTICO DIA3(martes) El objetivo es identificar al menos un microorganismo productor. Para ello en primer lugar realizaremos la tincin de Gram y tincin de endosporas. La tincin de Gram nos permitir asignar el microorganismo productor al grupo de bacterias Gram+ o Gram- as como determinar su morfologa (coco, bacilo).
Protocolo de la tincin de Gram: 1. Extensin-poner una gota de agua en el portaobjetos y extender en ella la muestra con el asa de siembra. 2. Fijacin- pasar el portaobjetos varias veces por encima de la llama hasta que se seque. 3. Aadir cristal violeta (1-2 minutos) 4. Escurrir el exceso de cristal violeta (NO lavar con agua). 5. Aadir lugol, esperar 1 minuto y tirar el exceso (NO lavar con agua). 6. Decolorar con etanol o una mezcla de etanol:acetona (20 segundos) 7. Lavar con agua. 8. Aadir el colorante de contraste safranina (1 minuto) 9. Lavar con agua, secar y observar con objetivos de 40 Protocolo de tincin de endosporas 1. Extensin-poner una gota de agua en el portaobjetos y extender en ella la muestra con el asa de siembra. 2. Fijacin- pasar el portaobjetos varias veces por encima de la llama hasta que se seque. 3. Colocar un papel de filtro sobre la muestra y sujetarlo con una pinza. Empapar el papel con verde malaquita y calentar con el mechero hasta que emita vapores. Cuando deje de emitir vapores, aadir ms colorante. Hacer durante 5 minutos. 4. Retirar el papel y lavar con agua. 5. Safranina durante 1 minuto. 6. Lavar con agua 7. Secar 8. Lavar con agua, secar y observar con objetivos de 40 y 100 (usar aceite de inmersin slo con el de 100 ). y 100 (usar aceite de inmersin slo con el de 100 ).

DIA3(martes) En el caso de que hayamos aislado un microorganismo Gram +, formador de endosporas, podemos identificarlo utilizando el Kit de determinacin de Bacillus IDENT-BACILLUS -Resuspender una muestra del microorganismo productor en 1 ml de agua estril. -Inocular con 50 l de una suspensin del microorganismo productor los test de cultivo (IDENTBACILLUS) para la identificacin de especies de Bacillus. -Incubar a 30 C durante 2 das. DIA 5 (jueves) Revelar el kit de determinacin de Bacillus e intentar determinar la especie con ayuda de un programa informtico

Informacin suministrada por el proveedor de MICROKIT-IDENT BACILLUS Kit especialmente diseado para la identificacin de las especies de Bacillus segn el Manual de Bergey a partir de colonias. MICROKIT /IBERICA,S/L/Apartado de correos 44-28210 Valdemorillo (Madrid) Aislar la bacteria en el medio apropiado, por ejemplo DTA (tubos TPL092). Incubar 12-72 horas a 30 50C, segn se trate de especies mesfilas o termfilas. Realizar una dilucin en agua estril (FPL111) y agitar hasta obtener un McFarland 0,5-1 (KMT555). Aadir a cada tubo 0,5l e incubar a 30 55C de 3-14 das. PRUEBAS Controles positivos: deben estar turbios si la reaccin es positiva Control positivo A, para comprobar que el microorganismo crece a la temperatura elegida; Control positivo B, para comprobar que el microorganismo crece en el medio de los azcares, por lo que si no crece aqu no debe interpretarse como negativa la ausencia de viraje en las producciones de cidos. Catalasa:Aadir reactivo catalasa (reciente) (KMT299) a las 48h Positivo burbujas Crecimiento anaerobio: Positivo crecen hasta el fondo Voges Proskauer (test de acetona): Antes de revelar con los reactivos VP (SRH083) ajustar el pH a 7,4+-0,1 Positivo rosa Positivo amarillo Positivo halo transparente Positivo azul Positivo azul verdoso Positivo rojo Crecimiento a distintos pH (5,7 y 6,8) : Positivo turbio Crecimiento a distintas concentraciones de ClNa (2%, 5%, 7%) : Positivo turbio Crecimiento a 50 C: Positivo turbio Ordenar los datos y utilizar el programa del diskette para la identificacin. Negativo incoloro Negativo verde o azul Negativo ausencia de halo Negativo amarillo Negativo amarillo dorado Negativo incoloro Produccin de cidos a partir de azcares (xilosa, arabinosa, manitol y glucosa): Hidrlisis de casena:Sembrar en estra recta en el medio del pico Medio con citrato y medio con propionato: Sembrar en zig-zag Fenilalanina desaminasa: Sembrar en zig-zag y revelar a las 48h con cloruro frrico (SGC001) Nitratos: Revelar a las 48h con los reactivos del test de nitratos (SMN001) Negativo crecen slo en superficie Negativo ausencia de burbujas

3 parte: ESTIMACION DE LA PRODUCCION DE ANTIBIOTICO

El objetivo es cuantificar la cantidad de antibitico que el microorganismo productor libera al medio de cultivo. Para ello cultivaremos el microorganismo en medio lquido y analizaremos la presencia de antibitico en el sobrenadante de cultivo. DIA 3 (martes) -Inocular 15 ml de Caldo Nutritivo con el microorganismo productor de antibitico. -Incubar a 30 C durante 24 horas en agitacin. El microorganismo producir antibitico que secretar al medio. DIA 4 (mircoles) Preparacin de placas test. -Aadir 1 ml de una suspensin de microorganismo sensible a un tubo con Medio Agar Antibitico fundido y mantenido a 50C. Mezclar bien. Dejar solidificar. -Hacer 4 pocillos en el agar utilizando como taladro una pipeta Pasteur. - A partir del cultivo lquido de 24 horas del microorganismo productor, tomar una alcuota de 1 ml. - Centrifugar a 14.000 rpm durante 1 min y recoger el sobrenadante. -Ensayar la eficacia relativa del antibitico empleando diferentes concentraciones de Pen G (80 g/ml, 40 g/ml, 20 g/ml ) como patrones de referencia. Para ello colocamos en los pocillos 40ml de soluciones patrn o sobrenadante de cultivo. -Incubar las placas a 30 C durante 24 horas. DIA 5 (jueves) -Medir los halos de inhibicin de los controles -Representar los resultados del antibiograma:log10 de la concentracin de antibitico frente al tamao del halo (en milmetros).

4 parte: ESPECTRO DE ACTIVIDAD

El objetivo es determinar qu microorganismos son sensibles al antibitico. DIA 3 (martes) -Sembrar una parte de una placa de Agar Nutritivo con el microorganismo productor de antibitico para obtener crecimiento confluente. -Incubar hasta el da siguiente a 30 C para que crezca y produzca antibitico, el cual difundir en el agar. DIA 4 (mircoles) -Sembrar perpendicularmente al area de crecimiento del microorganismo productor varios microorganismos con el fin de obtener el espectro de actividad. Utilizar suspensiones (DO600nm = 0,1) de estos microorganismos y sembrar slo un loop de cada con asa de siembra. Micrococcus luteus (Gram +) Bacillus subtilis (Gram +) Escherichia coli (Gram -) Pseudomonas (Gram -) Serratia marcescens (Gram -) Yarrowia lipolytica (Levadura) DIA 5 (jueves) - Observar si hay inhibicin del crecimiento en algunos de los microorganismos.

APENDICE Composicin de los medios de cultivo empleados Agar nutritivo (pH 7,4) Extracto de carne Extracto de levadura Peptona ClNa Agar 1,0 g/l 2,0 g/l 5,0 g/l 5,0 g/l 20 g/l Medio antibitico (pH 6,5) Peptona Triptona Extracto de levadura Extracto de carne Glucosa Agar 6,0 g/l 4,0 g/l 3,0 g/l 1,5 g/l 1,0 g/l 15 g/l