CUESTIONARIO 1.- Qu mtodos analticos empleara para cuantificar las macromolculas fraccionadas? Considere el fundamento de cada uno de ellas.

1.-Para la determinacin de carbohidratos: Reaccin de molisch Este ensayo permite detectar la presencia de hidratos de carbono en una muestra; se basa en la accin hidrolizante y deshidratante que ejerce el cido sulfrico sobre estos compuestos. Como se sabe, los cidos concentrados originan una deshidratacin de los azcares para rendir furfurales, que son derivados aldehdicos del furano. Los furfurales se condensan con los fenoles para dar productos coloreados caractersticos, empleados frecuentemente en el anlisis colorimtrico.

REACCION DE BENEDICT Una de las reacciones ms comunes en la identificacin de carbohidratos es la reaccin de Benedict. Esta reaccin es especfica para azcares con grupo reductores libres (C=O). Todos los monosacridos poseen un grupo reductor libre. Los disacridos maltosa y lactosa tienen grupos reductores libres, pero la sacarosa no los posee, ya que se pierden los grupos reductores de sus componentes cuando sta es formada. Se basa en la capacidad del carbohidrato de reducir el Cu2+ en un medio alcalino. Este Cu1+ se oxida y precipita en forma de Cu2O, lo que proporciona la coloracin

positiva de la reaccin. La coloracin depender de la concentracin de xido de cobre y sta a su vez de la reduccin del cobre; va desde verde, amarillo, anaranjado o rojizo, dependiendo de la coloracin.

REACCION DE SELIWANOFF Los carbohidratos se clasifican como cetosas o aldosas. Vale decir, que las cetosas en el carbono 2 tienen una funcin cetona, que en presencia de un cido fuerte producen rpidamente derivados furfricos que reaccionan con un difenol llamado resorcina que est contenido en el reactivo de Seliwanoff. La sacarosa (un disacrido formado por glucosa y fructosa) y la inulina (un polisacrido de la fructosa) dan positiva la reaccin, ya que el HCl del reactivo provoca en caliente la hidrlisis del compuesto liberando fructosa (responsable de la reaccin positiva). REACCION DE BARFOED Este ensayo se emplea para diferenciar a los mono de los disacridos. Estos ltimos reaccionan ms lentamente con el acetato cprico, debido probablemente al tamao molecular, aunque tambin pueden estar implicados otros factores tales como una interaccin ms compleja con los dos anillos monosacridos.

REACCION DE FEHLING Este ensayo pone de manifiesto la presencia de azucares reductores (aldosas: glucosa, ribosa, eritrosa, etc.). Se trata de una reaccin redox en la que el grupo aldehdo (reductor) de los azcares es oxidado a grupo cido por el Cu2+ que se reduce a Cu+. Tanto los monosacridos como los disacridos reductores reaccionan con el Cu2+ dando un precipitado rojo de oxido cuproso. La reaccin tiene lugar en medio bsico por lo que es necesario introducir en la reaccin tartrato sdicopotsico para evitar la precipitacin del hidrxido cprico. La prueba de Fehling no es especfica; otras sustancias que dan reaccin positiva son los fenoles, aminofenoles, benzona, cido rico, catecol, cido frmico, hidrazobenceno, fenilhidrazina, pirogalol y resorcinol. PRUEBA DE TOLLENS El complejo diamina-plata(I) es un agente oxidante, reducindose a plata metlico, que en un vaso de reaccin limpio, forma un "espejo de plata". ste es usado para verificar la presencia de aldehdos, que son oxidados con cidos carboxlicos. Una vez que ha sido identificado un grupo carbonilo en la molcula orgnica usando 2,4-dinitrofenilhidrazina (tambin conocido como el reactivo de Brady o 2,4-DNPH), el reactivo de Tollens puede ser usado para discernir si el compuesto es una cetona o un aldehdo. Al agregar el aldehdo o la cetona al reactivo de Tollens, ponga el tubo de ensayo en un bao mara tibio. Si el reactivo es un aldehdo, el test de Tollens resulta en un espejo de plata. En otro caso, puede formarse o no un espejo amarillento. El reactivo de Tollens es tambin un test para alquinos con el enlace triple en la posicin 1. En este caso se forma un precipitado amarillo de carburo de plata.

DETERMINACIN CUANTITATIVA DE CARBOHIDRATOS Determinacin cuantitativa segn o o o o Mtodos clsicos (valoraciones, fundamentalmente) Mtodos instrumentales Cromatografa Electroforesis Mtodos pticos Procedimientos bioqumicos (o enzimticos).

Clasificacin de los procedimientos analticos segn analitos: Mono- i oligosacaridos Polisacaridos nutricionales Polisacaridos estructurales

CUANTIFICACIN DE MONO Y OLIGOSACARIDOS Determinacin de monosacaridos y oligosacaridos Mtodos qumicos (valoracin normalmente) Colorimtricos Cromatogrficos (TLC, GC y HPLC) Electroforticos Otros mtodos pticos (polarimetria, ndice de refraccin) Bioqumicos

A. MTODOS QUMICOS.- basados en las propiedades reductoras de los carbohidratos (principalmente aldosas). Volumetrias redox con diferentes tipos de reactivos valorantes oxidantes suaves (Cu2+, ferricianuro, I2,). Contenido global de carbohidratos. B. MTODOS CROMATOGRFICOS Finalidad de la aplicacin de los mtodos cromatogrficos: Fraccionar y aislar los carbohidratos individuales Identificacin y cuantificacin individualizada En muestras de matriz compleja Tipos de cromatografia aplicados Capa fina (y papel) Cromatografia lquida Cromatografia de gases

Cromatografia en capa fina y papel. las fases mviles ms utilizades pueden ser: Cromatografia sobre pape (celulosa _ polisacrido) 1. n-butanol/cido actico/agua (40:10:50) 2. Piridina/acetato de etilo/agua (20:40:40) 3. Piridina/acetato de etilo/cido actico/agua (35.7:35.7:7.1:21.5)

Cromatografia en capa fina (silica gel 60) 1. Isopropanol/acetato de etilo/agua (60:30:10 o 50:40:10) 2. n-butanol/etanol/agua/cido actico/piridina (6.6:66.2:19.9:0.7:6.6) 3. n-butanol/cido actico/agua (50:25:25) Sistemas de elucin con buena separacin de mono y oligosacaridos: lactosa, sacarosa, maltosa, oligosacaridos de la degradacin del almidn,... Tiempos necesarios para completar la separacin entre 18 horas y seis dias (en papel) Cuanto mayor es el peso molecular del carbohidrato en una serie homloga menor es el Rf: Rf trisac < Rf disac < Rf monosac Rf hexosas < Rf pentosas Rf aldosas < Rf cetosas Ejemplos de reveladores

Determinacin cuantitativa mediante : Densitometra directa de las manchas Escisin y disolucin de las manchas y aplicacin de otras tcnicas de medida (absorcin UV-Vis, fluorescencia, Infrarrojo,...) Incluso microvaloraciones Determinacin cuantitativa mediante : Densitometra directa de las manchas Escisin y disolucin de las manchas y aplicacin de otras tcnicas de medida (absorcin UV-Vis, fluorescencia, Infrarrojo,...) Incluso microvaloraciones C. MTODOS PTICOS REFRACTOMETRIA Muy habitual en el anlisis de carbohidratos para determinar el contenido en slidos disueltos (jarabes, siropes, ) Uso de tablas con concentraciones de sacarosa en funcin del ndice de refraccin (a 20 C) y correccin de temperatura Control y anlisis de rutina

 POLARIMETRIA Los carbohidratos son pticamente activos y producen una rotacin ptica de la luz polarizada que se puede medir o Polarmetro visual: mide el ngulo de rotacin sobre una escala circular. Luz monocromtica. o Sacarmetro: diseado para medir la rotacin ptica de muestra expresada en porcentaje de sacarosa. Luz blanca y filtro monocromador. o Espectropolarmetros fotoelctricos: alta precisin, utilizan clulas fotoelctricas para la medida final. Los carbohidratos son pticamente activos y producen una rotacin ptica de la luz polarizada que se puede medir

1 Medida del ngulo de rotacin de la muestra clarificada (D) 2 Hidrlisis parcial de la sacarosa a compuestos no quirales 3 Medida del ngulo de rotacin de la muestra hidrolizada (I) 4 Por diferencia (D-1.25I) se obtiene el % de sacarosa. D. MTODOS PTICOS. ESPECTROSCOPIA INFRARROJA Complicada de aplicar a carbohidratos sencillos: o Muy poco solubles en disolventes orgnicos se deberian disolver en agua problema con el material del soporte de las muestras (KBr, tambin muy soluble en agua) o Uso de pastillas de KBr (muestra slida!!). D. MTODOS BIOQUMICOS CLASIFICADOS EN DOS GRUPOS: MICROBIOLOGICOS.- Utilizan fermentos (levaduras) con diferente capacidad de fermentacin: tiles para diferenciar, por ejemplo, pentosas y hexosas ENZIMTICOS.- Rotura estereoselectiva de los oligosacridos para, a continuacin, determinar selectivamente los monosacridos formados. CUANTIFICACIN DE POLISACRIDOS Polisacridos nutrientes o nutricionales Almidn Dextrinas

Glucgeno Determinacin del almidn en alimentos diferentes mtodos pero siempre hay que empezar por una extraccin y dispersin del almidn en una solucin coloidal

Anlisis final por precipitacin y determinacin gravimtrica Mtodos enzimticos de determinacin de la glucosa despus de la hidrlisis selectiva del polisacrido (a-amilasa y amiloglucosidasa)

2.-PARA LA DETERMINACION DE PROTENAS LEY DE LAMBERT-BEER la ley explica que hay una relacin exponencial entre la transmisin de luz a travs de una sustancia y la concentracin de la sustancia, as como tambin entre la transmisin y la longitud del cuerpo que la luz atraviesa. Si conocemos Io y Is, la concentracin de la sustancia puede ser deducida a partir de la cantidad de luz transmitida. Considrese un rayo de energa radiante con una intensidad inicial Io que se hace pasar a travs de una celda de vidrio cuadrada contiendo una solucin homognea de una sustancia que absorbe luz de cierta longitud de onda. La intensidad de la energa radiante transmitida Is es menor a la intensidad inicial Io. debido precisamente a que la solucin fue capaz de absorber cierta cantidad de energa radiante. Espectrofotometra: cuantificacin de protenas totales por el mtodo de Biuret.- La luz puede ser clasificada de acuerdo a su longitud de onda. La luz con una longitud de onda corta, entre 200 nm y 400 nm se conoce como ultravioleta (UV), mientras que aquella que posee una longitud de onda ms larga, entre 700 nm y 900 nm se conoce como luz infrarroja cercana. La luz con longitudes de onda de entre los 400 nm a los 700 nm contempla el rango de luz de diferentes colores visible al ojo humano. Qu ocurre cuando una radiacin electromagntica atraviesa la materia? Si la radiacin tiene energa adecuada con la estructura de la materia, sta ltima podr absorberla. La medicin de la cantidad de luz absorbida puede ser usada para detectar, identificar molculas y medir su concentracin en solucin. Esta medicin se basa en la Ley de Beer y Lambert o simplemente Ley de Beer. la mayora de las sustancias a cuantificar en bioqumica no poseen color. Por lo tanto es necesario acoplar algn tipo de reaccin qumica que involucre la aparicin o desaparicin de un cromgeno con la sustancia a

cuantificar. Generalmente se escogen cromgenos cuyo coeficiente de absortividad molar sea alto ya que mayor ser la absorbancia a medir y por tanto la tcnica tendr mayor sensibilidad. Los mtodos principales para cuantificacion de protenas son: UV 280 Biuret Lowry Bradford

METODO UV las protenas muestran un fuerte grado de absorcin a 280nm en uv, principalmente por los residuos de triptofano y la tirosina. ya que las concentraciones de estos aminocidos en las protenas es francamente constante se puede utilizar la absorbancia a 280nm para estimar la concentracin de protenas ventajas mtodo rpido y relativamente sensible (varias veces ms sensible que el mtodo de biuret) no existe interferencia del sulfato de amonio y otras sales buffer mtodo no destructivo utilizado en deteccin post-columna de las protenas desventajas los cidos nuclicos tambin absorben en la regin de 280nm el contenido de aminocidos aromticos difiere considerablemente en varias protenas. la solucin debe ser clara e incolora. la turbidez puede producir resultados errticos se requiere un sistema relativamente puro para utilizar este mtodo REACCIN DE BIURET El nombre de la reaccin procede del compuesto coloreado formado por la condensacin de dos molculas de rea con eliminacin de amonaco. Esta reaccin est dada por aquellas sustancias cuyas molculas contienen dos grupos carbamino (-CO.NH) unidos directamente o a travs de un solo tomo de carbono o nitrgeno. El reactivo de Biuret contiene Cu2SO4 en solucin acuosa alcalina (gracias a la presencia de NaOH o KOH). La reaccin se basa en la formacin de un complejo de coordinacin entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del nitrgeno que forma parte de los enlaces peptdicos. Esta ltima reaccin provoca un cambio de coloracin: violeta prpura o violeta rosado. Debe sealarse que el color depende de la naturaleza de las protenas; protenas y pptidos dan un color rosado; la gelatina da un color azul. metodo 1. 5 ml de reactivo de biuret se mezcla con 1ml de solucin protica (1-10 mg de protena/ml). 2. despus de reposo a temperatura ambiente durante 15 a 30 minutos, se lee la absorbancia a 540nm contra un blanco con slo reactivo.

3. se debe elaborar una curva estndar de concentracin vs absorbancia utilizando albmina de suero de bovino (bsa) para comparacin con la muestra bajo estudio ventajas: rpido (se puede completar en menos de 30 minutos) es el mtodo ms simple de anlisis de protenas no es frecuente encontrar derivaciones de color pocas substancias no proticas interfieren con la reaccin de biuret no detecta n2 de fuentes no proticas o no peptdicas desventajas: no es muy sensible comparado con el mtodo de lowry requiere de al menos 2 a 4 mg de protena por prueba las concentraciones altas de sales de amonio interfieren con la reaccin debe estandarizarse el color mediante cantidades de protena conocidas EL MTODO DE LOWRY El mtodo de Lowry (1951) es un mtodo colorimtrico de valoracin cuantitativa de las protenas. A la muestra se aade un reactivo que forma un complejo coloreado con las protenas, siendo la intensidad de color de la disolucin resultante proporcional a la concentracin de protenas, segn la ley de Lambert-Beer (ver apartado de fotometra). Este mtodo consta de dos etapas: 1) Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las protenas formando complejos con los tomos de nitrgeno de los enlaces peptdicos. Estos complejos Cu2+-protena tienen un color azul claro. Adems, provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la protena, exponindose los residuos de tirosina que van a participar en la segunda etapa de la reaccin. El Cu2+ se mantiene en solucin alcalina en forma de su complejo con tartrato. 2) La reduccin, tambin en medio bsico, del reactivo de Folin-Ciocalteau por los grupos fenlicos de los residuos de tirosina presentes en la mayora de las protenas, actuando el cobre como catalizador. El principal constituyente del reactivo de Folin-Ciocalteau es el cido fosfomolibdotngstico, de color amarillo, que al ser reducido por los grupos fenlicos da lugar a un complejo de color azul intenso.

Reaccin entre la protena y lo reactivos ventajas muy sensible menos afectado por la turbidez de la muestra ms especfico que la mayora de los otros mtodos relativamente simple se puede completar en 1 a 1.5 horas desventajas el color vara con diferentes protenas (ms que el mtodo de biuret) el color no es estrictamente proporcional a la concentracin de protenas la sacarosa, lpidos, buffers fosfato, monosacridos y hexoaminas interfieren con la reaccin las altas concentraciones de azcares reductores, sulfato de amonio y compuestos con sulfidrilo interfieren con la reaccion. MTODO DE BRADFORD el azl brillante g-250 coomassie se adhiere a la protena, el colorante se torna de rojizo a azulado ye l mximo de absorcin del colorante cambia de 465 a 595nm. el cambio en la absorbancia a 595nm es proporcional a la concentracin de protena en la muestra. ventajas mtodo rpido (la reaccin se puede completar en 2 minutos) reproducible sensible (mucho ms que el mtodo de lowry) no existe interferencia de cationes como k+, na+, y mg+ desventajas el complejo protena-colorante formado puede unirse a las celdas de cuarzo el color vara con diferentes tipos de protenas. la protena estndar debe seleccionarse con mucho cuidado interferencia con detergentes. 3.-PARA CUANTIFICAR DNA Y RNA CUANTIFICACIN DE ARN POR ABSORCION ESPECTRAL La concentracin de ARN es ledo por la medicin de la absorbancia de una muestra en el A260 en un espectrofotmetro. La muestra de ARN se coloca en una cubeta de cuarzo para leer la densidad ptica (DO). Usted tendr que utilizar para determinar la concentracin de su ARN. Los cientficos han determinado un coeficiente de absorbancia a utilizar para determinar la concentracin de ARN en su preparacin de la muestra. Un ARN con la concentracin de 40 ug / ml tiene una densidad ptica de 1 en A260. PARA LA CUANTIFICACIN DE RNA POR PCR A TIEMPO REAL Permite cuantificar, la cantidad de ADN o ARN amplificado en cada momento mediante el marcaje con fluorocromos y detectar la fluorescencia emitida cuando se genera el fragmento especfico durante la amplificacin. Existen diversos formatos de deteccin: Uso de molculas fluorescentes que se intercalan en el ADN de cadena doble. Ej. SYBR-GREEN:

Doble sonda marcada o sondas de hibridacin (sondas "LightCycler"). En este caso se emplean dos sondas marcadas con molculas fluorescentes en posicin 5' (sonda A) y 3'(sonda B) y que hibridan en regiones adyacentes del DNA diana. Cuando se produce la hibridacin, la primera sonda emite fluorescencia que excita al colorante de la segunda sonda, produciendo una seal detectable

Cebadores fluorescentes ("Molecular Beacons"). En estos tipos, la molcula fluorescente y la molcula que absorbe la fluorescencia se mantienen prximas mediante la formacin de una horquilla de hibridacin. Esta horquilla se abre durante la amplificacin, aumentando la emisin de fluorescencia. Sondas Taqman. Diseadas por Applied Biosystems, hacen uso de la actividad 5' exonucleasa de la Taq (Thermus aquaticus) DNA polimerasa. Estas sondas tienen un marcador fluorescente en el extremo 5' y una molcula que absorbe ("quencher") la fluorescencia emitida por el marcador en el otro extremo. La sonda hibrida con el fragmento especfico (si est presente) y, a medida que se sintetiza la hebra complementaria al fragmento, la sonda se va degradando por la accin exonucleasa, liberando el marcador que ahora s emite fluorescencia.

DETERMINACION DE LA CONCENTRACIN DE ADN POR VISUALIZACIN. El mtodo indirecto ms recomendable para la determinacin de la concentracin de ADN en una muestra es mediante la visualizacin de un gel de electroforesis en el cual se colocan muestras con concentraciones conocidas. El procedimiento requiere la preparacin de una cmara de electroforesis (se recomienda la cmara mediana para 22 o 40 muestras), colocando cada una de las muestras que se desea evaluar en pozos individuales y dejando al menos 10 pozos libres. Posteriormente se inicia la electroforesis con 6 v/cm y diez minutos antes de que concluya la corrida, se detiene la fuente de poder, se destapa la cmara de electroforesis, sembrando las muestras de concentraciones conocidas. Finalmente se cierra la cmara de electroforesis, se enciende nuevamente la fuente de poder, dejando que corra durante 10 minutos, se visualiza el producto con U.V. y se toma una fotografia. En este mtodo la estimacin se realiza contrastando intensidades de luz entre las muestras, lo cual se realiza visualmente o con el auxilio de algn programa computacional que contraste intensidades de color.

3.-Se puede utilizar otro metodo para el fraccionamiento de las macromolculas? Indique cuales? Y haga la compracion con el utilizado en el practica. Cromatografa de penetrabilidad. El componente bsico es una columna empaquetada con una matriz en gel especial, que son partculas de un polmero orgnico de estructura tridimensional, que originan una red de poros hidroflicos equilibrados con un tampn acuoso. La tcnica consiste en que las molculas de gran tamao no penetran por los poros del polmero, por lo que migran mucho ms rpidamente que las de menor tamao que s son capaces de penetrar por los poros de la matriz. Al principio del desarrollo de la tcnica, se realizaba a bajas presiones por lo que el rango de aplicaciones estaba restringido debido a los elevados tiempos de separacin y su poca resolucin. En la actualidad se han desarrollado matrices de slica estables a elevadas presiones que se utilizan columnas de alta presin, para la separacin de biomolculas en funcin de su forma y tamao.

Cromatografa de intercambio inico. Es el mtodo ms utilizado para la separacin de cidos nucleicos. El mecanismo bsico es el intercambio reversible de los iones en solucin con los grupos funcionales unidos covalentemente a una fase estacionaria insoluble llamada resina. Por ejemplo, un cido nucleico con carga negativa a pH 7,0 se unir a un intercambiador inico con grupos cargados positivamente, pero eluir de la columna al cambiar el pH del tampn (tampn de elucin) ya que los iones del tampn de elucin interaccionan con los grupos cargados del cido nucleico o del intercambiador inico, respectivamente; primero eluirn de la columna las molculas cargadas positivamente que no se unen a la fase estacionaria y posteriormente, al aadir el tampn de elucin, eluirn las molculas con poca carga negativa neta y luego las de mayor carga negativa neta.

Cromatografa de adsorcin. Se basa en la adsorcin y desorcin de los cidos nucleicos en presencia de sales caotrpicas. Bajo condiciones nativas, los cidos nucleicos estn recubiertos de una capa hidratante de molculas de agua que mantienen la solubilidad del DNA en soluciones acuosas. Con la adicin de iones caotrpicos a los cidos nucleicos, se destruye esta ordenada estructura de molculas de agua de la capa hidratante, por lo que las sales caotrpicas crean un entorno hidrofbico alrededor del DNA. Bajo estas condiciones hidrofbicas, los cidos nucleicos se unen perfectamente a la membrana de slica de las columnas, mientras que las protenas, los metabolitos y otros contaminantes no se unen y, por lo tanto, son eliminados de la muestra durante los pasos de lavado. Posteriormente, los cidos nucleicos se eluyen de la membrana de slica mediante tampones de elucin con baja concentracin de sales (ligeramente alcalinos) o simplemente agua, ya que permiten recuperar la capa hidratante de los cidos nucleicos, liberndolos as de la membrana. Con esta tecnologa, no se produce ningn efecto sobre las molculas de los cidos nucleicos ya que la unin intramolecular de los mismos no es de naturaleza hidrofbica. Con este rpido proceso de purificacin mediante la tecnologa de la adsorcin-desorcin sobre membranas de slica, se obtiene cidos nucleicos altamente purificados y listos para usar en procesos posteriores como PCR, RTPCR, QPCR, secuenciacin, blotting, clonaje, etc. Ultrafiltracin. En esta tecnologa, la muestra se carga directamente sobre la membrana de ultrafiltracin y mediante vaco o centrifugacin, se eliminan todos los contaminantes mientras que la muestra con los cidos nucleicos permanecen retenidos en la superficie de la membrana. Despus de un paso de lavado opcional, se recuperan los cidos nucleicos aadiendo agua o un tampn adecuado. Bolas magnticas. Con esta tecnologa, los cidos nucleicos se unen selectivamente a bolas paramagnticas en presencia de sales caotrpicas mientras que el resto de los contaminantes son eliminados de la muestra. Los cidos nucleicos purificados se eluyen de la solucin con las bolas paramagnticas bajo condiciones de baja salinidad y estn listos para ser usados en posteriores aplicaciones. La electroforesis Es una tcnica analtica de separacin de fundamento cintico basada en el movimiento o migracin de las macromolculas disueltas en un determinado medio (solucin tampn de electroforesis), a travs de una matriz o soporte reticulado como resultado de la accin de un campo elctrico. El comportamiento de la molcula viene dado por su movilidad electrofortica y sta por la carga, tamao y forma de la misma. Cuanto mayor es la relacin carga/tamao ms rpido migra un in en el seno del campo elctrico. Esta tcnica tiene como ventaja su capacidad de separar macromolculas de inters en la industria biotecnolgica y qumica. Ha sido un mtodo muy til para la separacin de protenas (enzimas, hormonas) y cidos nucleicos (DNA y RNA) con gran resolucin.

En un sistema electrofortico pueden originarse distintos fenmenos que afectan la separacin de las sustancias: Electroforesis Convencional La electroforesis convencional ha sido utilizada durante muchos aos para separar especies complejas de elevado peso molecular de inters biolgico y bioqumico. Las separaciones se llevan a cabo sobre una capa delgada y plana o placa de un gel semislido y poroso que contiene un tampn acuoso en el interior de sus poros. Esta ser la sustancia encargada de ofrecer resistencia al movimiento de las molculas, controlando as su migracin uniforme. Mediante esta tcnica se pueden separar varias muestras simultneamente. Dichas muestras se depositan sobre el gel, se aplica un potencial de corriente continua a travs del mismo durante un tiempo fijo. Cuando las separaciones se han completado se interrumpe el paso de corriente y las especies separadas se tien para visualizarse. La electroforesis en gel es muy utilizada en la deteccin, control de pureza, caracterizacin, cuantificacin (por comparacin con controles) as como preparacin y purificacin (por extraccin de bandas desde el gel) de molculas y fragmentos de DNA. HOMOGENIZACION Se trata de romper las clulas con la ayuda de un mbolo rotatorio que se ajusta perfectamente a las gruesas paredes de un tubo de cristal especial, el homogenizador. Clulas anexas: primero se deben romper conexiones con otras clulas. Clulas no anexas: pueden separarse teniendo en cuenta forma, densidad o caractersticas que puedan marcarse. Existen dispositivos de homogenizacin en los que est calibrada la separacin entre el mbolo y la pared de cristal para producir homogenizados con un tamao de partcula determinado. Consiste en el procesamiento del tejido y posteriormente de las clulas con el fin de obtener una mezcla fluida en la cual estn todos los componentes celulares, para lo cual podemos recurrir a diversos mtodos fsicos. Homogenizador de Esferas

Fragmentacin celular por accin del choque de las esferas de vidrio con las clulas.

Tamao de esferas: 0.1 mm: Bacterias, esporas. 0.5 mm: Levaduras, micelio, microalgas, clulas animales no anexas, clulas tripsinizadas. 1.0, 2.5 mm: Cerebro, msculo, piel, hojas.

La cantidad de esferas debe ser al menos el 50% del volumen total de la biomasalquido.

Homogenizador de mbolo y tubo Potter, Potter-Elvehjem, Dunce, Ten Broeck. Separacin mbolo-pared del tubo calibrada segn tamao de partcula deseado. Los tejidos deben ser previamente picados y se suspenden en un volumen exceso de medio (4-10 veces). Fraccionamiento de tejidos animales. Preferido en preparacin de organelos subcelulares de tejidos frgiles como cerebro e hgado. (Accin suave). Permite un mejor control de la temperatura generada por la friccin. No es eficiente en la fragmentacin de microorganismos Blenders (Licuadora) Homogenizacin por uso de cuchillas. Proceso magnificado por uso de solventes orgnicos y/o detergentes. Cuchillas rotan a 6.000 50.000 rpm en un contenedor. Las muestras se pueden reducir hasta partculas de 4 micrones (anlisis de citometra de flujo). Procesamiento de tejidos animales y vegetales. No adecuado para fraccionamiento de microorganismos. Homogenizados de plantas pueden sufrir oxidacin enzimtica. Homogenizador Rotor/Stator Molinos de coloides H. Willems. Homogenizacin rpida (10-60 seg.) y completa. Mecanismo de turbulencia ligera. Proteccin de organelos: menor velocidad y tiempo de exposicin. Uso: tejidos animales y vegetales. Genera calor a niveles insignificantes. Formacin de espuma y aerosoles SONICACION Consiste en la aplicacin de ultrasonidos a una suspensin celular. La intensa agitacin producida destruye las membranas celulares. Dependiendo de la frecuencia, intensidad y energa aplicada se pueden destruir asimismo las estructuras subcelulares e incluso solubilizar complejos proteicos. Se suele aplicar en frio para evitar el sobrecalentamiento de las muestras que podra provocar la desnaturalizacin de las protenas. Se transmite una corriente elctrica a un sistema mecnico que la convertir en vibraciones de alta intensidad generndose ondas de ultrasonido que generan millones de burbujas microscpicas, las cuales se expanden y colapsan contra las clulas causando la ruptura de su membrana. Este fenmeno llamado cavitacin puede incrementarse adicionando al medio finsimas esferas de vidrio.

Ultrasonificacin Generacin de intensas ondas snicas en medio lquido. Se transmite una corriente elctrica a un sistema mecnico que la convierte en vibraciones de alta intensidad generndo ondas ultrasnicas que forman millones de microburbujas que se expanden y colapsan contra las clulas: CAVITACIN. Choque de ondas rompe membranas y an enlaces covalentes. Mayor accin por adicin de esferas de vidrio. El Sonicador tiene dos forma de operar, por Pulsos: Las Vibraciones de ultrasonido pueden transmitirse en una solucin en un rango de 0,1 a 0,9 pulsos por segundo, permitiendo una adecuada sonicacin sin generacin importante de calor y Continuo: Puede ser usado de forma contnua por hasta 15 minutos. Con este sistema se puede lograr la ruptura de levaduras entre 3 y 10 minutos o de E.Coli con 40 segundos. Presneta los siguientes inconvenientes: alta generacin de calor de las muestras que se mantienen en congelamiento, los tejidos duros (piel o tendn) se deben macerar previamente; se pueden generar radicales libres, el dao por oxidacin de radicales libres puede minimizarse adicionando cisteina, ditiotrteitol o algn otro componente -SH en el medio. Por Radicales Libres: Lesin en membrana celular, aberraciones, cromosmicas menores y cambios de tipo Fisiolgicas. Uso en Transferencia de DNA plasmdico en Protoplasmos y clulas intactas; con expresin temporal de un gen testigo. Flexible: Protoplasmos, Clulas en Suspencin y en fragmentos de tejido con la misma sencillez. En conclusin la diferencia esta en el cuadro. .