Compendio 2009

Compendio de Biologa Celular y Molecular # Ao 2009
C om p e n d i o d e B i ol o g a M ol e c u l ar & C el ul a r
Casco, V. H.; Izaguirre M. F. & Hmpola P.
Ao 2009
333333333 1

NDICEDETEMAS
PGINA
CAPTULOPRIMERO EL ORIGEN Y EVOLUCIN DE LAS CLULAS NIVELES DE ORGANIZACIN PRINCIPIOS

DEECOLOGA
CAPTULOSEGUNDO QUMICADELACLULA CAPTULOTERCERO LASUPERFICIECELULAR CAPTULOCUARTO ELCITOSOL,ELCITOESQUELETOYELMOVIMIENTOCELULAR CAPTULOQUINTO RETCULOENDOSPLASMTICO,APARATODEGOLGIYLISOSOMAS 91 75 50 24
CAPTULOSEXTO MITOCONDRIAS,CLOROPLASTOSYPEROXISOMAS CAPTULOSPTIMO ELNCLEOCELULAR CAPTULOOCTAVO LAORGANIZACINDELOSGENOMASCELULARES CAPTULONOVENO LAREPLICACINENEUCARIOTAS CAPTULODCIMO LATRANSCRIPCINENEUCARIOTAS 168 160 149 130 105

CAPTULOUNDCIMO
TRADUCCINYSNTESISDEPROTENAS CAPTULODUODCIMO ELCICLOCELULAR BIBLIOGRAFA
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232 255
CAPTULO PRIMERO:
El Origen y Evolucin de las Clulas
ELORIGENYLAEVOLUCINDELASCLULAS
Las clulas vivas pueden, de acuerdo a si poseen o no ncleo, dividirse en dos clases principales:clulasprocariotasoeucariotas. CARACTERSTICAS NCLEO Dimetrodelasclulastpicas Citoesqueleto OrganelasCitoplasmticas ContenidodeADN(paresdebases) Cromosomas Procariotas Ausente ~1m Ausente Ausentes 0,5X106a5X106 ADNcircular (uncromosoma) Eucariotas Presente 10100m Presente Presentes 1,5X107a5X109 ADNlinear (variosparesde cromosomas)
A pesar de las diferencias, las bases moleculares que gobiernan ambos tipos celulares soncomunes.
LasPrimerasClulas
Lavidahabraemergidohaceaproximadamente3,8x109deaos,unos7,5X108deaos despus de formarse la Tierra. Al momento de originarse la vida, se piensa que la atmsferacontenaprincipalmenteCO2yN2(muypocoonadadeO2).Tambinhabra contenidopequeascantidadesdeH2yH2S. En la dcada del 20 del siglo pasado se comenz a especular que con estos componentes, en presencia de luz solar y/o descargas elctricas podran formarse espontneamentemolculasorgnicas. La formacin espontnea de molculas orgnicas, fue demostrada experimentalmente porStanleyMillerenladcadadel50`. Lacondicincrticaquedebieroncumplirlasmolculasqueprecedieronypermitieronla organizacin prebitica fue la capacidad de replicarse a si mismas. Las molculas actualesconcapacidaddellevarinformacin yportantocandidatasacumplirconesa funcinson:loscidosnucleicosylasprotenas.

Deestosdosgruposdemolculassloloscidosnucleicos(ARN)poseenlacapacidadde
dirigirsupropiareplicacin. Un paso crtico en la comprensin de la evolucin molecularfue el descubrimiento de Altman & Cech, quienes fueron los primeros en determinar que el ARN es capaz de catalizarunaseriedereaccionesincluyendolapolimerizacindelosnucletidos. El ARN es nico en cuanto a su capacidad de servir como molde y para catalizar su propia replicacin. Estas caractersticas hicieron pensar que el ARN fue el sistema genticoinicial,pocadelaevolucinprebiticaquesehadadoenllamar:ELMUNDODEL ARN.LainteraccinordenadaentreARNyaminocidoshabrallevadoalaevolucindel cdigogentico. Posteriormente, el ADN habra reemplazado al ARN como material gentico. Las primeras clulas presumiblemente se habran originado por el encapsulamiento de algunas molculas de ARN autoreplicantes en una bicapa fosfolipdica. Como se ver msadelantelosfosfolpidossoncomponentebsicosdelasmembranasplasmticasde nuestrosdas. EVOLUCINDELMETABOLISMO Debido a que las clulas se habran originado en un mar de molculas orgnicas ellas habran sido capaces de obtener energa y alimentos del ambiente circundante. El problemaqueseplanteaesquestaesunasituacinlimitanteensmisma,porloque debi producirse una evolucin hacia mecanismos propios para generar energa y sintetizarlasmolculasnecesariasparasureplicacin. Lageneracinyutilizacincontroladadelaenergametablicaescentralparatodaslas actividadescelulares. Las principales vas del metabolismo energtico estn altamente conservadas en las clulas de nuestros das. Todas las clulas usan adenosina5 trifosfato como fuente energtica principal para realizar la sntesis de los constituyentes celulares y realizar otrasactividadesquerequierenenerga(porej.contraccinmuscular,etc.)

Los mecanismos usados por las clulas para la generacin de ATP se piensa que
evolucionaronentresetapas: Evolucindelagluclisis Fotosntesis Metabolismooxidativo
El desarrollo de estas vas metablicas, cambiaron la atmsfera terrestre, que inicialmenteeraanaerobia,yalteraronelcursodelaevolucinposterior. En la atmsfera anaerobia inicial de la Tierra las primeras reacciones energticas incluyeronladescomposicindelasmolculasorgnicasenausenciadeOxgeno.Estas reaccionessecreehabransidosimilaresalagluclisisdenuestrosdas: C6H12O6C3H6O3+2ATP Glucosac.LcticoEnerga Adems de usar ATP, todas las clulas del presente llevan adelante el proceso de gluclisis, esto reafirma el concepto que estas reacciones se habran originado muy tempranamenteenlaevolucin. El desarrollo de la fotosntesis se cree que fue el siguiente paso evolutivo mayor, este procesopermitealasclulasutilizarlaenergasolareindependizarsedelautilizacinde las molculas orgnicas preformadas. Las primeras bacterias fotosintticas, probablementeusaronH2SparaconvertirCO2enmolculasorgnicaspreformadasun patrnanutilizadoporalgunasbacteriasdelpresente. El uso de H2O como donante de electrones e hidrgeno para la conversin de CO2 en compuestosorgnicosevolucionposteriormenteyhabratenidounaimportanciaclave enelcambio dela atmsfera terrestre.ElusodeH2Oenlasreaccionesfotosintticas impliclaproduccindeO2libre LaliberacindeO2comoconsecuenciadelafotosntesishabracambiadolaatmsfera terrestre y se cree que llev a las clulas a evolucionar hacia el desarrollo del 7

metabolismooxidativo.
Alternativamente,elmetabolismooxidativopudoevolucionarantesquelafotosntesis, y con el incremento del O2 atmosfrico se dio una seleccin ventajosa sobre aquellos organismosqueerancapacesdeusarloensusreaccionesdeproduccindeenerga. Conpocasexcepcioneslasclulasdenuestrosdasusanlasreaccionesoxidativascomo suprincipalfuentedeenerga. PROCARIOTASDENUESTROSDAS Achaea (arquibacterias) Eubacteria (cianoficeasybacterias) La mayora de las bacterias son esfricas, en forma de bastn o espiraladas, con un dimetrode1a10m. ElcontenidodeADNoscilaentre0,5X106a 5X106paresdebases Los procariotas ms grandes y complejos serian las cianobacterias, bactrias de las que habra evolucionado la fotosntesis. La estructura de las clulas procariotas es ilustrada por Escherichia coli (E. coli) un habitante comn del tracto digestivo.

E.coliposeeformadebastnundimetrode1myunalongitudde2m.
Posee una pared celular compuesta de polisacridos y pptidos e interiormente se encuentralamembranaplasmtica Mientrasquelaparedcelularesporosa,lamembranaplasmticaeslaqueconfierela separacinfuncionalentreelinterioryelexterior. ElADNdeE.coliesunamolculacircular,sinseparacinconelcitoplasma.Elcitoplasma contieneaproximadamente30.000ribosomasqueleconfierensuaparienciagranular. CLULASEUCARIOTAS Todas las clulas eucariotas, como las procariotas estn rodeadas por una membrana plasmticaycontienenribosomas. Las clulas eucariotas contienen un ncleo, una variedad de organelas y un citoesqueleto. La organelamsprominente es elncleo,con un dimetro aproximado de5m Elncleocontienelainformacingenticadelasclulasorganizadasenformalinear ElncleoeselsitiodereplicacindelADNydelasntesisdeARN(transcripcin). LatraduccindelARNenprotenasseproduceenlosribosomas,enelcitoplasma Lasorganelascompartimentalizanelcitoplasmadelasclulas,enestoscompartimentos selocalizanlasdiferentesactividadesmetablicas. Lasclulaseucariotasgeneralmentesondemayortamaoquelasprocariotasconun volumencelularalmenos1.000vecesmayor.Lacompartimentalizacindelasclulas eucariotas constituye el mecanismo para conseguir la mayor eficiencia de estos tipos celulares. Las mitocondrias y los cloroplastos juegan un rol crtico en el metabolismo de energtico.Lasmitocondriasseencuentranencasitodaslasclulaseucariotas,sonlos sitios en los que produce el metabolismo oxidativo, responsables de la produccin de

ATPderivadodeladescomposicindelasmolculasorgnicas
Loscloroplastossonlossitiosenlosqueserealizalafotosntesisseencuentrantantoen lasplantascomoenlasalgasverdes. Los lisosomas y los peroxisomas constituyen compartimentos metablicos especializados en la digestin de macromolculas y de varias reacciones oxidativas respectivamente. Adicionalmente,lasclulasvegetalesposeenunagranvacuolaenlaqueserealizanuna granvariedaddefunciones,incluyendodigestindemacromolculas,yalmacenamiento deproductosdedesechoynutrientes Debidoaltamaoycomplejidaddelasclulaseucariotas,eltransportedelasprotenas a sus destinos correctos dentro de las clulas es una tarea formidable, dos organelas citoplasmticas: el retculo endoplasmtico y el aparato de Golgi se han consagrado especficamente al transporte y clasificacin de protenas destinadas a la secrecin, incorporacinalamembranaeincorporacinaloslisosomas.Elretculoendoplasmtico esunaextensareddemembranasintercelularesqueseextiendendesdelamembrana nuclearatravsdelcitoplasma El RE no slo interviene en el procesamiento y transporte de protenas, sino que tambinlohaceenlasntesisdelpidos Desde el RE, las protenas se transportan dentro de pequeas vesculas al aparato de Golgidondesonposteriormenteprocesadasyclasificadasasusdestinosdefinitivos Ademsdesufuncineneltransporte,elaparatodeGolgifuncionacomounlugarde sntesisdelpidosyenlasclulasvegetalesessitiodesntesisdealgunospolisacridos delaparedcelular Las clulas eucariotas poseen otro nivel de organizacin interna: el citoesqueleto, una red de filamentos proteicos que seextienden atravs del citoplasma.El citoesqueleto constituyeelandamiajedelasclulas,determinandolaformaylaorganizacingeneral delcitoplasma.Elcitoesqueletoeselresponsabledelosmovimientosdelasclulas(por 10

la contraccin del msculo cardaco) y del transporte y posicin de las organelas y ej.
otras estructuras incluyendo el movimiento de los cromosomas durante el proceso de divisincelular. Las clulas eucariotas habran evolucionado aproximadamente 2700 millones de aos atrs, 1.000 a 1.500 millones de aos despus que hicieron su aparicin las clulas procariotas. Los estudios del ADN de las arquibacterias (Archaea) y las eubacterias indicanqueconstituyendosgrupostandistanciadocomoloestnlasclulaseucariotas delasprocariotas Porloantesdicho,secreequedebiocurriruneventomuytempranoenlaevolucin,a partirdelcual se habraproducidoladivergenciadetreslneasevolutivasquehabran descendido de un ancestro comn originando: arquibacterias, eubacterias y clulas eucariotas. De gran inters es el hecho que algunos genes de las arquibacterias guardan mayores similitudes con las clulas eucariotas que con las eubacterias, indicando que stos grupos comparten un ancestro comn y estn ms relacionados entre si que con las eubacterias. Un paso crtico en la evolucin de las clulas eucariotas habra sido la adquisicin de organelassubcelularesdelimitadaspormembranalasquepermitieroneldesarrollode lacomplejidaddeestasclulas. Se cree que las organelas se adquirieron como resultado de una asociacin de tipo simbiticaentrelosancestrosdelasclulaseucariotasylasprocariotas. Esta hiptesis, denominada endosimbitica est soportada por los estudios de mitocondrias y cloroplastos, organelas que se cree evolucionaron de bacterias adaptadasalavidaenelinteriordegrandesclulasenunaasociacinsimbitica. Mitocondriasycloroplastosposeentamaossimilaresalasbacterias,sereproducenpor divisinbinaria,yunhechofundamental, ambasorganelasposeensu propioADNque codifica algunos, aunque no todos, sus componentes. El ADN de mitocondrias y cloroplastos se replica cada vez que la organela se divide, los genes que codifica este 11

ADNsetranscribendentrodelasorganelasysetraducentambinenlosribosomasdel
interior de mitocondrias y cloroplastos. As, mitocondrias y cloroplastos contienen su propiosistemagentico,queesdiferentedelgenomadelasclulas. Los ribosomas y los ARNs ribosomales de estas organelas, son mas parecidos al de las bacteriasquealdelasclulaseucariotas. Actualmente se acepta el origen endosimbionte de estas organelas, se cree que las mitocondrias habran evolucionado a partir de bacterias aerbicas y los cloroplastos a partirdebacteriasfotosintticascomolasactualescianobacterias. La adquisicin de bacterias aerbicas, pudo haber permitido que una clula anaerobia desarrollaseelmetabolismooxidativo. Laadquisicindeunabacteriafotosintticapudoproveerlaindependencianutricional, conseguidaapartirdelacapacidadderealizarfotosntesis. De esta forma, la endosimbiosis habra sido altamente beneficiosa para ambos partenersyhabrasidoseleccionadaporlanaturalezadurantelaevolucin Aparentemente, muchos de los genes de estas bacterias simbioticas se habran incorporado al genoma nuclear de la clula hospedadora y slo unos pocos componentesdemitocondriasycloroplastossonancodificadosporsuspropiosgenes. E L D ESARROLLODELOS O RGANISMOS M ULTICELULARES Muchos eucariotas son organismos unicelulares, que como las bacterias, consisten de clulassimplescapacesdeautoreplicarse.Loseucariotasmssimplessonlaslevaduras. Laslevadurassonmscomplejasquelasbacteriasperodetamaomenorymssimples que las clulas vegetales o animales. La levadura ms estudiada es: Sacharomyces cerevisiaeolevaduradecerveza.Poseeundimetrode6mycontiene12x106pares debasesdeADN. OtroseucariotasunicelularessonmscomplejosyposeentantosparesdebasesdeADN comoloshumanos(porejemplolaEuglena,posee3000.000.000deparesdebases) Las amebas por ejemplo, son otros organismos unicelulares muy complejos. Amoeba 12

proteousesunaclulaeucariticamuycompleja,suvolumenes100.000vecesmayor
queeldeE.coli,ysulongitudexcede1mm.Poseenunamovilidadmuyimportante. Los organismos multicelulares habran evolucionado hace aproximadamente 1.700 millones de aos. Algunas eucariotas unicelulares habran formado agregados multicelulares, que representan organismos de transicin evolutiva de organismos formadosporclulassimplesaorganismosmulticelulares.PorejemploelalgaVolvoxes una asociacin multicelular colonial que se cree constituye una forma similar a los antecesoresdelosvegetalesdenuestrosdas. Elincrementoenlaespecializacincelularhabrallevadoalosorganismosmulticelulares del presente. La especializacin celular y la divisin del trabajo habran llevado a la diversidaddetiposcelularesobservadaenplantas,hongosyanimalesdenuestrosdas, incluyendoalossereshumanos. Las plantas estn compuestas por pocos tipos celulares, en comparacin con los animales,perocadatipovegetalestespecializadopararealizarlatarearequeridaporel organismocompleto. Las clulas vegetales estn especializadas en 3 tipos de sistemas tisulares: tejido parenquimtico, (que posee dos tipos celulares especializados: colnquima y esclernquima),tejidodrmicoytejidovascular(xilemayfloema). Lasclulas animales,sonconsiderablementemas diversasquelasvegetales,elcuerpo humano,porejemplo,estformadopormsde200tiposcelularesdiferentes,losque seconsiderancomponen5tipostisularesdiferentes:
TejidoConectivo TejidoEpitelial TejidoSanguneo TejidoNervioso TejidoMuscular
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LOSNIVELESDEORGANIZACIN
PrinciosdeEcologaFuente:BiologadeCurtis&Barnes(SextaEdicin) Lostomos Todas las molculas orgnicas como los carbohidratos, lpidos, protenas y nucletidos contienen carbono, hidrgeno y oxgeno. Adems, las protenas contienen nitrgeno y azufre, y los nucletidos, as como algunos lpidos, contienen nitrgeno y fsforo. El agua, una molcula inorgnica, contiene hidrgeno y oxgeno. En la Tierra, existen unos 92 elementos. Los elementos son sustancias que no pueden serdesintegradasenotrassustanciaspormediosqumicosordinarios.Lapartculams pequeadeunelementoeseltomo. Desdehacelargotiempo,loscientficostratandeentendercmoesuntomo.Sehan propuestodiversosmodelosqueintentandilucidarculeslaestructuradeltomo. Lostomosdecadaelementodiferentetienenensusncleosunnmerocaracterstico de partculas cargadas positivamente, llamadas protones. Por ejemplo, un tomo de hidrgeno,elmslivianodeloselementos,tieneunprotnensuncleo;elnmerode protonesenelncleodeuntomocualquierarecibeelnombredenmeroatmico.Por lotanto,elnmeroatmicodelhidrgenoes1yeldelcarbonoes6. Fuera del ncleo de un tomo hay partculas cargadas negativamente, los electrones, que son atrados porlacarga positiva de los protones. El nmero de electronesen un tomo iguala al nmero de protones en su ncleo. Los electrones determinan las propiedades qumicas de los tomos y las reacciones qumicas implican cambios en el nmeroyelestadoenergticodeestoselectrones. Los tomos tambin contienen neutrones, que son partculas sin carga de aproximadamenteelmismopesoquelosprotones.Estostambinseencuentranenel ncleodeltomo,dondeparecentenerunefectoestabilizador.Elpesoatmicodeun 14

elementoesaproximadamenteigualalasumadelnmerodeprotonesyelnmerode
neutronesdelncleodesustomos. El peso atmico del carbono es, por convencin, igual a 12, mientras que el del hidrgeno,quenocontieneneutrones,esligeramentemayorque1.Loselectronesson tanlivianos,encomparacinconlosprotonesyneutrones,quesupesohabitualmente noseconsidera.Cuandonospesamos,sloaproximadamente30gramosdelpesototal estintegradoporelectrones. LasMolculas Las molculas forman las clulas. Pueden ser orgnicas que contienen carbono o inorgnicas, como el H2O o el O2. Una sola clula bacteriana contiene aproximadamente cinco mil clases diferentes de molculas y una clula vegetal o animal tiene aproximadamenteeldoble.Estasmilesdemolculas,sinembargo, estn compuestas de relativamente pocos elementos (CHNOPS). De modo similar, relativamente pocos tipos de molculas desempean los principales papeles en los sistemasvivos. Enlosorganismosseencuentrancuatrotiposdiferentesdemolculasorgnicasengran cantidad. Estos cuatro tipos son los carbohidratos (compuestos de azcares), lpidos (molculas no polares, muchas de las cuales contienen cidos grasos), protenas (compuestas de aminocidos) y nucletidos (molculas complejas que desempean papeles centrales en los intercambios energticos y que tambin pueden combinarse paraformarmolculasmuygrandes,conocidascomocidosnucleicos). Sehadichoqueslosenecesitasercapazdereconoceraproximadamente30molculas paratenerunconocimientoquepermitatrabajarconlabioqumicadelasclulas.Dos de esas molculas son los azcares glucosa y ribosa; otra, un lpido; otras veinte, los aminocidosbiolgicamenteimportantes;ycincolasbasesnitrogenadas,molculasque contienennitrgenoysonconstituyentesclavesdelosnucletidos. LasMacromolculas 15
Las macromolculas son molculas constituidas por varias molculas que pueden ser o no similares entre s. Los polisacridos,porejemplo,estnconstituidospormonosacridos unidos en cadenas largas. Algunos de ellos son formas de almacenamiento del azcar,mientras que otroscomolacelulosa
sonunimportantematerialestructuraldelasplantas. Los lpidos son molculas orgnicas hidrofbicas que, al igual que los carbohidratos, desempean papeles importantes en el almacenamiento de energa y como componentes estructurales. Los compuestos de este grupo incluyen las grasas y los aceites,losfosfolpidos,losglucolpidos,lasceras,yelcolesterolyotrosesteroides.Las grasas son los principales lpidos almacenadores de energa. Los fosfolpidos son los principalescomponentesestructuralesdelasmembranascelulares. Las protenas son molculas muy grandes compuestas de cadenas largas de aminocidos,conocidascomocadenaspolipeptdicas.Enlasprotenas,losaminocidos seorganizanenpolipptidosylascadenaspolipeptdicasseordenanenunnuevonivel de organizacin: la estructura terciaria o cuaternaria de la molcula de protena completa.Solamenteenesteniveldeorganizacinemergenlaspropiedadescomplejas delasprotenasysloentonceslamolculapuedeasumirsufuncin. Losnucletidossonmolculascomplejasformadasporungrupofosfato,unazcarde cinco carbonos y una base nitrogenada. Son los bloques estructurales de los cidos desoxirribonucleico (DNA) y ribonucleico (RNA), que transmiten y traducen la informacingentica. LosComplejosdeMacromolculas Los complejos macromoleculares forman, dentro de las clulas, estructurascomplejas,comolasmembranasylasorganelasenlas clulaseucariotas.
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Las tcnicas microscpicas modernas han confirmado que las clulas eucariticas
contienen,enverdad,unamultituddeestructuras.Noson,porsupuesto,rganoscomo los que se encuentran en los organismos multicelulares, pero en cierta forma son comparables: estn especializados en forma y funcindemaneraquesoncapaces de desempear actividades
particulares requeridas por la economa celular. As como los rganos de los animales
multicelulares trabajan juntos en sistemas de rganos, las organelas delasclulasestncomprometidas

Modelo de la membrana plasmtica de una clula animal. En el esquema se indican los distintos componentes de las membranas biolgicas: carbohidratos, colesterol, protenas integrales y perifricas.
en varias funciones cooperativas e interdependientes. Si bien los procariotas no tienen organelas rodeadas por
membranas, s tienen estructuras macromoleculares complejas que constituyen la membrana celular, los ribosomas y otras estructuras. Todoslosseresvivosdelasabanaydetodoslos biomas de la Tierra estn formados por estas estructurasmacromolecularescomplejas.
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Losvirussoncomplejosmacromoleculares.Noesposibleubicaralosvirusenalgunode
losreinosdeorganismosvivosya que estn estn formados por una regin central de cido nucleico, DNA o RNA, rodeado por una cubierta protenica o cpside y, en algunos casos, por una envoltura se lipoproteica. reproducen
Adems,
solamente dentro de las clulas vivas, apoderndose de las enzimas y la maquinaria
biosintticadesushospedadores.Sinestamaquinaria,serantaninertescomocualquier otramacromolcula,osea,sinvidasegnlamayoradeloscriterios. FotomicrografaelectrnicaydiagramadeunbacterifagoTpar,mostrandosusmuchos componentes estructurales diferentes. El ADN del virus codifica todas las protenas necesarias. La cabeza de la cpside, las estructuras ms importantes de la cola y las fibrasdelacolaseensamblanporseparado.DespusdequeelADNhasidoinsertado enlacabezadelacpside,elensambledelacolapreformadaseuneaella.Laadicinde lasfibrasdelacolacompletalapartculaviral. LasClulas Las clulas son las unidades estructurales y funcionales de todo servivo.Todos los organismosestnconformadosporclulas. El cuerpodetodoorganismomulticelularcomplejoestconstituido por una variedad de clulas diferentes especializadas. Aunque estas clulas se asemejan en gran medida a los organismos unicelularesensusrequisitos,difierendestosenqueactanenconjuntoyenforma coordinada y se diferencian y funcionan como parte de un todo organizado. Los organismos unicelulares de la sabana, por ejemplo, estn representados, entre otros, por los parsitos de los sistemas digestivos de los vertebrados y por los organismos 18

descomponedores.
Estosorganismosunicelularespuedenserprocariotasoeucariotas. En las plantas hay clulas que presentan algunas diferencias con las clulas de los animales. LosTejidos Lostejidosestnformadosporclulasindividualesquetrabajanenformacooperativa. En un animal, como cualquiera de los que viven en la sabana, por ejemplo, los diferentes tejidos que constituyen Una porcin del tejido sanguneo, en la que se observan particularmente glbulosrojos. nerviosoyelmuscular. Tipos de tejido conectivo Tipo de tejido Conectivo laxo Localizacin Debajo de epitelios que revisten las cavidades internas. Relacionado con epitelios de las glndulas y los vasos sanguneos. Caractersticas Fibras delgadas poco ordenadas, sustancia fundamental abundante. Fibroblastos y adipocitos abundantes Permite la migracin de clulas en trnsito. En l ocurren reacciones inflamatorias de la respuesta immune. Permite la difusin de oxgeno y de nutrientes. Las fibras de colgeno no tienen una orientacin definida. y se encuentran en elevada proporcin. Sustancia fundamental y fibroblastos escasos. Provee resistencia a desgarros. Fibras de colgeno formando haces en un patrn definido que le otorga alta resistencia al esfuerzo. 19 Propiamente dicho el organismo son el tejido epitelial, el
conectivo, el
Conectivo denso En la capa inferior irregular (dermis) de la piel.
Conectivo denso En los ligamentos, regular tendones y aponeurosis.

Especializado
Adiposo (blanco Por debajo de la piel Contiene adipocitos (almacenadores de lpidos) en y pardo) (hipodermis) formando ntima relacin con un rico lecho vascular. una capa aislante. Almacenamiento de energa, aislacin y proteccin de rganos vitales. seo (compacto En huesos, resistente y esponjoso) y muy liviano (el esqueleto humano constituye slo aproximadamente el l8% de nuestro peso). Matriz extracelular mineralizada (fosfato de calcio en forma de cristales de hidroxiapatita). Almacena calcio y fosfato que se pueden movilizar desde la matriz sea y pasar a la sangre cuando se necesitan, regulando la homeostasis de los niveles de calcio. Sustancia fundamental con protenas (colgeno y otras) y proteoglucanos. El colgeno y los componentes de la sustancia fundamental tambin estn mineralizados. Clulas (condrocitos) secretan una matriz extracelular muy especializada, slida y firme, pero elstica con fibras de colgeno que la refuerzan y sustancia fundamental. Los condrocitos (solos o en pequeos grupos) se encuentran en pequeas cavidades de la matriz (lagunas). Generalmente es avascular y no inervado. Acta como soporte de pesos en las articulaciones. Es clave para el crecimiento de los huesos. Algunos cartlagos son elsticos.
Cartilaginoso
Restringido a las articulaciones, anillos traqueales y estructuras de sostn del odo externo y la punta de la nariz (excepto en los animales de esqueleto cartilaginoso), tambin en los discos que actan como amortiguadores entre las vrtebras. En el feto forma los primeros huesos.
Hemopoytico
En la mdula sea Formacin de glbulos rojos, granulocitos, monocitos y roja dentro de los plaquetas. espacios de los huesos largos: en los huesos jvenes en la cavidad medular y en los espacios del hueso esponjoso. En timo, ganglios linfticos, mdula sea, amgdalas y bazo. Dentro del corazn y los vasos sanguneos del sistema circulatorio. Formacin de linfocitos y clulas de sostn de los rganos linfoides que forman redes laxas. Los linfocitos reaccionan en presencia de sustancias antignicas. Matriz extracelular lquida con presencia de glbulos rojos, glbulos blancos y plaquetas. Transporte de nutrimentos, oxgeno, deshechos y otras sustancias.
Linfoide
Sanguneo
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Losrganos
Losrganosestnformadosportejidosquecooperanyactanen coordinacin.Elestmagoesunrganoqueconstituyeelsistema digestivo de cualquiera de los vertebrados de la sabana, por ejemplo. La estructura del rgano ms grande del cuerpo de un vertebradoeslapiel. Enlasplantas,lashojas,lostallosylasracessonejemplosderganosqueconstituyen elcuerpocompletodelorganismo. LosSistemasderganos Los sistemas de rganos estn constituidos por rganos que trabajan en forma conjunta e integrada. En la mayora de los animales, esta integracin y control la realizan el sistema nervioso y el endocrino. En los
animalesdelasabana,por ejemplo, cualquier como otro en animal
incluido el ser humano, los sistemas de rganos son el digestivo, respiratorio, excretor, circulatorio, inmune y reproductor. Los sistemas de rganos permiten que el organismo multicelular tome y elimine sustancias desde y hacia el medio. En el curso de la evolucin, aquellos organismos multicelulares que presentaban estas estructuras se vieronbeneficiadosypudieronconquistarnuevosambientes. Un sistema de rganos, el sistema circulatorio de las aves y los mamferos. Est 21

constituidoporelcoraznylosvasossanguneos.
LosIndividuos Existenindividuosunicelularescomolosprotistasyprocariotasy multicelulares. Algunos organismos se encuentran en un nivel intermedio entre una colonia de clulas y un organismo multicelular autntico; tal es el caso de las esponjas. Otros organismosalcanzanelniveldetejidos,comoloscnidarios,yotros se ubican en el nivel de rganos, como las plantas vasculares. Muchos animales pertenecen al nivel de sistemas de rganos, entre ellos las jirafas y las acacias que habitanenlasabanaafricana. Los individuos como las jirafas o las acacias, por ejemplo, pueden ser estudiados de diversas maneras. O bien como unidades constituyentes de las poblaciones en los estudiosecolgicosobiencomounaunidadestructuralyfisiolgica. Otros individuos que componen la sabana y muchos otros ecosistemas, pero que no podemosver,sonlosorganismosunicelularescomolasbacteriasdescomponedoras. LasPoblaciones La poblacin es una unidad primaria de estudio ecolgico; es un grupo de organismos de la misma especie, interfrtiles, que conviven en el mismo lugar y al mismo tiempo. Entre las nuevas propiedades que aparecen en el nivel de organizacin de poblacin estn los patrones de crecimiento y mortalidad de la poblacin,laestructuraetaria,ladensidadyladistribucinespacial. Entodapoblacinhayotrasdospropiedadesinterrelacionadas:sudensidadysupatrn dedistribucinespacial.Ladensidadeselnmerodeindividuosporunidaddereaode volumen,mientrasqueelpatrndedistribucinespacialdescribelaubicacinespacial de los organismos. Una compleja gama de factores ambientales, tanto biticos como abiticos,desempeanunpapelenlaregulacindeltamaodelapoblacin.
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LasComunidades
Lacomunidadesunconjuntodeorganismosdistintosquehabitan unambientecomnyqueseencuentraneninteraccinrecproca. Esainteraccinregulaelnmerodeindividuosdecadapoblacin yelnmero ytipodeespecies existentesenlacomunidad yson lasfuerzasprincipalesdelaseleccinnatural. Se reconocen tres tipos principales de interaccin especfica en las comunidades: la competencia,lapredacinylasimbiosis. Cuantomssemejantesseanlosorganismosencuantoasusrequisitosyestilosdevida, ms probable es que la competencia entre ellos sea intensa. Como resultado de la competencia,laaptitudtotaldelosindividuosqueinteractanpuedeversereducida. La simbiosis es una asociacin ntima y a largo plazo entre organismos de especies diferentes. La evidencia actual indica que las comunidades son dinmicas, y cambian continuamenteamedidaquecambianlascondiciones. LosEcosistemas El ecosistema, la unidad de organizacin biolgica, est constituido por todos los organismos que componen esa unidad componente bitico y el ambiente en el que viven componente abitico. Estos componentesinteractandediversasmaneras. Enelecosistemadelasabanaafricana,porejemplo,sepuedenencontrarlostresniveles trficos habitualmente presentes en los ecosistemas: los productores, en este caso, acacias y gramneas; los consumidores primarios, jirafas, y los consumidores secundarios,leones;ylosdescomponedoresquedegradanlamateriaorgnicahastasus componentesprimariosinorgnicos. La fuente ltima de energa que ingresa en un ecosistema es el Sol. Los productores convierten una pequea proporcin aproximadamente 1 a 3% de energa solar en 23

energa qumica. Los consumidores primarios (herbvoros) comen a los productores
primarios. Un carnvoro que come a un herbvoro es un consumidor secundario, y as sucesivamente. En promedio, aproximadamente el 10% de la energa transferida en cadaniveltrficoesalmacenadaentejidocorporal;del90%restante,parteseusaenel metabolismodelorganismoypartenoseasimila.Estaenerganoasimiladaesutilizada porlosdetritvorosy,finalmente,porlosdescomponedores. LosBiomas Las comunidades vegetales y su vida animal asociada que constituyen un bioma son discontinuas, pero una comunidad puede asemejarse mucho a otra que se encuentre en el lado opuesto del planeta. Sometidas a fuerzas evolutivas semejantes, lasformasdevidaresultantestambinseasemejan.Unbiomaes una clase o una categora, no un lugar. Cuando hablamos del bioma de la sabana, por ejemplo, no estamos hablando de una zona geogrfica
determinada, sino de todas las sabanas del planeta. Como ocurre con la mayora de las abstracciones, detalles se omiten Por
importantes.
ejemplo,loslmitesnosontandefinidoscomolosmuestranlosmapas,nitampocoes fcil clasificar con criterios semejantes a todas las reas del mundo. Sin embargo, el concepto de bioma enfatiza una verdad importante: donde el clima es el mismo, los organismostambinsonmuysimilares,aunquenoestngenticamenterelacionadosy se encuentren muy distantes por su historia evolutiva. Los organismos de un mismo bioma, pero de reas geogrficamente separadas, proporcionan muchos ejemplos de evolucinconvergente. Biomas del mundo. La informacin de estos mapas y las referencias que los 24

acompaanfueronsuministradasporA.W.Kchler,delaUniversidaddeKansas,EEUU,
una de las principales autoridades en el tema de la distribucin de biomas. Dada la cobertura global de los mapas, la escala es relativamente pequea y el contenido es general.Losdistintosbiomasnosiempresonuniformesytodosincluyenconsiderables variaciones de vegetacin. Los lmites entre los biomas pueden ser marcados, pero frecuentementesondifusosyestnformadosporzonasanchasdetransicinentreun tipodevegetacinyotra. Lassabanassonpraderastropicalesconmanchonesderbolesdispersos.Latransicin del bosque abierto con un suelo tapizado de gramneas a la sabana es gradual y est determinadaporladuracin yseveridaddelaestacinsecay, frecuentemente,porel fuegoyporelpastoreoyramoneodelosanimales. En la sabana, la competencia crtica es por el agua, en la cual las gramneas resultan favorecidas.Estasplantassonmuyaptasparaprosperarensuelosfinos,arenosos,con lluviasestacionalesyaquesusracesformanunadensaredcapazdeextraerlamxima cantidaddeaguaduranteelperododelluvias.Durantelasestacionessecas,laspartes areasdelasmatasmueren,perolasracesprofundassoncapacesdesobrevivirhasta muchos meses de sequa. El equilibrio entre las plantas leosas y las gramneas es delicado.Sidisminuyenlaslluvias,losrbolesmueren.Siaumentanlaslluvias,aumenta la cantidad de rboles, sombrean a las gramneas, y stas, a su vez, tienden a desaparecer. Si hay un pastoreo excesivo de gramneas (lo que habitualmente ocurre cuandoseintroduceganadoparapropsitospecuarios),quedaunexcedentedeaguaen el suelo que incrementa el nmero de plantas leosas y la pradera habitualmente desaparece. Las sabanas mejor conocidas son las de frica, habitadas por el grupo de grandes herbvorosmsabundanteydiversodelmundo,queincluyealasgacelas,elimpala,el antlopealceoelan,elbfalo,lajirafa,lacebrayel.Otroejemploeslaanchabanda transicional que rodea a la regin de las pampas, donde la estepa graminosa se va poblando de bosquecillos y de ejemplares aislados de Prosopis y otras leguminosas leosasconformadeparasol.Elpaisajevegetalrecuerdaalasabanaafricanaperolos herbvoros,mucho menos abundantes, son medianos o pequeos: crvidos, guanacos, 25

andes,diversosarmadillos,vizcachas;entreloscarnvoros:zorros,zorrinos,pumasy
diversasavescarroeras. LaBiosfera La biosfera es la parte de la Tierra en la que habitan los organismos vivos. Es una pelcula delgada sobre la superficie del planeta,deirregulargrosor ydensidad.La biosfera est afectada porlaposicinymovimientosdelaTierraenrelacinconelSoly por los movimientos del aire y del agua sobre la superficie de la Tierra.Estosfactoresprovocangrandesdiferenciasdetemperaturayprecipitacionesde unlugaraotroydeunaestacinaotra.Tambinhaydiferenciasenlassuperficiesdelos continentes, tanto en composicin como en altitud. Estas diferencias se reflejan en diferenciasenlostiposvegetalesyanimalesqueseencuentranenlasdistintaspartesde labiosfera. Labiosferaseextiendeaproximadamenteentre8y10kmporencimadelniveldelmary unos pocos metros por debajo del nivel del suelo, hasta donde pueden penetrar las racesyencontrarselosmicroorganismos. Segn la llamada hiptesis Gaia, la vida se puede interpretar como un nico sistema autorreguladoquemantienelatemperatura,lacomposicindelasuperficiedelaTierra ydelaatmsferaatravsdemecanismosderetroalimentacin.Laaparicindelavida permiti el desarrollo y la evolucin de condiciones adecuadas para s misma sobre la Tierra.Esunfenmenoautomantenibleaescalaplanetaria,esdecir,tantoeneltiempo comoenelespacio.Unavezestablecidafirmementeenunplaneta,seextiendeportoda su superficie y solamente desaparecer cuando el planeta sufra un cambio csmico trascendentalocuandoseacabelafuenteoriginaldeenerga.
*El origen de la vida

Fuente:RevistaCienciaHoy.Vol. 3 - N 17 Marzo/Abril 1992
Marcelo Hermes-Lima
Intistuto de Qumica, Universidad de San Pablo, Brasil
En algn momento del pasado remoto, en algn ambiente acutico de la Tierra primitiva,lamateriainanimadacobrvida.Traslashuellasquelespermitanexplicar esteacontecimiento,cientficosdetodoelmundosepreguntanculhabrsidoel"
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polmeroprimordial"quegeneralosseresvivos.
Habr sido un antepasado de las protenas? Lo sera de los cidos ribonucleicos (ARN)o,talvez,deloscidosdesoxirribonucleicos(ADN)? Lasinvestigacionesmsrecientesdescartanestastresposibilidadesyapuntanhacia otracompletamentenueva.
La cuestin del origen de la vida ha constituido desde hace mucho tiempo un desafo para la imaginacin,peropuestoquenodisponemosdeuna"mquinadeltiempo"comolautilizadaporel personajedelanoveladeH.G.Wells,losintentosdereconstruirlagnesisdelavidaenelambiente delaTierraprimitivatienenmuchodetemerario.Estoesassobretodoporquenoexistenfsilesde losprimerosseresvivos quecolonizaronnuestroplaneta.Losmicrofsilesmsantiguostienentres mil seiscientos millones de aos (3,6 eones). Sin embargo, los cientficos han obtenido pruebas geolgicasindirectassegnlascualeslacapacidaddefijaranhdridocarbnico,queesexpresindela existencia de seres vivos capaces de realizar fotosntesis (es decir, de aprovechar la energa de la radiacin solar para formar los compuestos necesarios para su supervivencia), apareci hace 3,8 eones. La formacin de la Tierra tuvo lugar hace 4,6 eones, pero su superficie se habra tornado menos inhspitaparalaacumulacindecompuestosorgnicoshaceentre4,2y4eones.Demaneratalque lavida,ensuformamsprimitiva,podrahabernecesitadoparasurgirinclusomenosde0,4eones, untiempomuybreveentrminosdelcalendariogeolgico.Eneseexiguoespaciodetiempo,quenos lleva hasta los 3,8 eones antes mencionados, habra tenido lugar una serie encadenada de eventos bioqumicoscapacesdeconducirhastalageneracindeaquellosprimerosorganismosconcapacidad fotosinttica. Laprimerahiptesisconsistenteacercadelosprocesosqumicosquehabrandadoorigenalavida fuelaformuladaporelbioqumicorusoAlexanderI.Oparin.Latraduccinalinglsdesulibrosobreel tema apareci en 1938 con el ttulo de The Origin of Life y caus gran impacto. En esta obra se revisabanyampliabanhiptesisqueOparinoriginalmentehabapublicadoenunarevistarusapoco conocida, la Proiskhjozdenic Zhizny. Este cientfico propona que, despus de la formacin de la atmsferaprimitivadelaTierra,sehabaproducidounaseriedeeventosqumicosqueaumentaronla complejidaddelasmolculasexistentes,determinandoquemolculasprimitivassetransformaranen estructurascoloidalesllamadas"coacervados"delosquehabrasurgidounanuevaorganizacindela materia:lavida.(Loscoloidessonsuspensionesdepartculascuyodimetropuedevariardesdeuna milsimahastadiezmillonsimasdemilmetro.Laasociacindeestaspartculasentresyconparte del solvente forma minsculas gotas llamadas coacervados.) Segn Oparin, este largo proceso de generacinespontneadelavidapodra(ydebera)serreproducidoenellaboratorio. Esta hiptesis chocaba, sin embargo, con un obstculo difcil de superar. En efecto, si bien era probable que se hubieran formado estructuras coloidales anlogas a los coacervados, las cuales podranhaberestadoconstituidasporlaasociacindemacromolculas,talvezdeestructuraproteica y con capacidad de acelerar determinadas reacciones qumicas sin sufrir por ello cambios permanentes(capacidadcataltica),resultabamuydifcildeexplicarcmohabrandesarrolladoesas estructuras un cdigo gentico. Por ello, la hiptesis de los coacervados fue paulatinamente abandonada, aunque la filosofa de Oparin sobre la evolucin qumica todava sirve de base para todoslosestudiossobreelorigendelavida.
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Elpolmeroprimordial En 1951, una nueva hiptesis sobre el origen de la vida fue propuesta, con escaso eco en la comunidadcientfica,porelfsicoinglsJohnBernal.Segnestateora,unaentidadmolecularpodra definirse como viva si poseyera dos propiedades: capacidad de acumular informacin gentica y capacidad de producir copias de su propia estructura. El metabolismo de este primer ser vivo el "polmero primordial" consistira nicamente en esa capacidad de generar, autocatalticamente, copiasdesmismo.(Unpolmero,esunamolculaformadaporlaunindemuchasmolculasms pequeas, llamadas monmeros). Los errores producidos durante la autoduplicacin podran dar lugaravariedadesconmayorresistenciaaladestruccinoconmayorcapacidaddereproduccinyla seleccinnaturalanivelmolecularfavoreceraaestasvariedadesporsucapacidaddeadaptarse mejoralambiente.Asi,lahiptesisdeBernalpredecalaaparicindevidaenformade"polmeros autorreplicables",quehabransurgidoantesdelaaparicindemicroorganismosseparadosdelmedio externoporunamembrana.Culespodranserestospolmeros?Loscandidatosnaturaleseranlas protenas (cadenas de molculas pequeas, los aminocidos, ordenados en una secuencia determinada) o los cidos nucleicos, el ARN y el ADN (vase "ADN, una molcula maravillosa" en CienciaHoy,vol.2,n8,pgs.2635ylafigura1). Sinembargo,esdifcilasignarleacualquieradeelloslafuncindepolmeroprimordial.Lasprotenas actancomoexcelentescatalizadores,perosonincapacesdeacumularinformacingentica,yaque una protena no puede guardar la informacin necesaria para la sntesis de otra. Por su parte los cidos nucleicos (ARN y ADN) almacenan informacin gentica, pero necesitan para duplicarse de enzimas, vale decir de protenas con actividad cataltica. Entonces, cul de estos polmeros habra surgidoprimeroenelplaneta,loscidosnucleicosolasprotenas?Hastaelcomienzodeladcadadel '80esteproblema(deltipo"elhuevoylagallina")noparecatenersolucin.Enlosltimosaos,sin embargo, una serie de evidencias parecieron indicar que el polmero primordial autorreplicable po Debe sealarse que el grupo del biofsico Sidney Fox, de Florida, EE.UU., cree an ahora que las protenas(ociertasestructurasparecidasaellasalasquellaman"polmerosproteinoides")podran haber sido los polmeros primordiales. Sin embargo, este grupo ha intentado en vano probar su hiptesis estudiando, desde mediados de la dcada del '50, los mecanismos de polimerizacin de aminocidos a altas temperaturas en medios similares al ambiente volcnico de la Tierra primitiva. Fox ha observado que, en estas condiciones, mezclas que contienen igual nmero de molculas de cadaunodemsde15aminocidosdiferentesgeneranunagrancantidaddepolmerosproteinoides enlosqueseobservaelpredominiodealgunostiposdeaminocidossobreelresto,ndicedequela polimerizacin no se produce totalmente al azar. Estos experimentos, si bien fueron importantes porquelosproteinoidesasobtenidostenancapacidadcataltica,hansidoinsuficienteshastaahora: apesardequelapolimerizacintrmicanoocurretotalmentealazar,elprincipiodeordenqueesto implica es insuficiente para conferir a los proteinoides mecanismos eficientes de acumulacin y transmisindelainformacingentica.Porlotanto,yaquenopuedenreproducirseeficazmente,las protenas no tienen ninguna posibilidad de constituirse en los polmeros primordiales.dra ser un cidonucleico,msespecficamenteuncidoribonucleico(ARN)ynounaprotena.
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Fig.1. Esquema de la estructura qumica del ARN. El hexaedro, que representa al azcar ribosa, contiene oxgeno en el vrticequeocupalaposicinsuperioren el dibujo. Cada uno de los otros vrtices contiene un tomo de carbono que no est representado. Los carbonos que constituyenlaribosasenumerande1a5 siguiendo la direccin de las agujas del relojapartirdelvrticequeseencuentra aladerechadeloxgenoyterminandoen elcarbonoqueseunealvrticeubicado a la izquierda del oxgeno. La ribosa se une a una base (stas pueden ser las basespirimidnicasuraciloycitosinaolas purnicas adenina y guanina) formando un ribonuclesido. ste une el fosfato al carbono que ocupa la posicin 5 en la ribosaparaformarunribonucletido.Los ribonucletidos se asocian entre si (se polimerizan)porqueelfosfatodeunode ellos se une al carbono que ocupa la posicin 3 en la ribosa de otro ribonucletido.LosdistintosARNdifieren entresporelnmeroderibonucletidos quelosformanyporelorden(secuencia) desusbases.EnelADNlaribosaresulta reemplazada por desoxirribosa y la base pirimidnicauraciloportimina).
EnloqueserefierealADN,losproblemassondiferentes.ComoelARN,elADNtambinrequierede proteinasparaautoduplicarse,demodoqueenelambienteprimitivodelaTierra,loshipotticosADN primordialesnopodranhaberservidodemoldeparasercopiadossinelauxiliodeenzimas.Adems, losdesoxirribonucletidos(lasunidadesquealunirseentresconstituyenelADN)sonproducidospor losseresvivosactualesapartirdelosribonucletidos(lasunidadesquealunirseentresconstituyen elARN),loqueindicaqueelADNdebehaberaparecidomuchomsrecientementequeelARNenel cursodelahistoriaevolutivadelaTierra.Porotraparte,elADNes msresistente queelARNala descomposicin por hidrlisis (en el caso del ADN la hidrlisis es la separacin de los desoxirribonucletidos que lo constituyen por incorporacin de agua) y esto hara ms difcil el reciclaje de monmeros (desoxirribonucletidos) a partir de los polmeros descartados por la seleccinnatural.Loshechosenunciadossugierenqueresultapocoprobablequehayaocurridouna colonizacindelambienteacuticoprimordialdelaTierraatravsdemolculasautorreplicablesde ADN. Una vez que se hubo excluido a las protenas y al ADN, se pas a explorar la posibilidad de que el polmeroprimordialfueraelARN.Lostrabajosqueiniciaronenlosaos'70losgruposlideradospor loscientficosestadounidensesThomasCechySidneyAltman,quienesfueronlaureadosporellocon elPremioNobelen1989,ampliaronlasfronterasdelaqumicadelARNymodificaronprofundamente los conocimientos cientficos acerca del origen de la vida. Cech y sus colegas verificaron, en la UniversidaddeColorado,quedeterminadassecuenciasdelARNdeciertasbacteriaserancapacesde
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acelerar la velocidad de algunas reacciones. En otras palabras, descubrieron que el ARN poda comportarsecomounaenzima.CechllegabautizarasuARNconelnombrede"ribozima",esdecir unaenzimaconstituidaporcidoribonucleico. En 1981, Cech public en la revista Cell la demostracin de que determinada secuencia de ribonucletidosde unaformadeARNribosomalllamado26Spodaserseparada,en elprotozoario Tetrahymenatermophila,delrestodelamolcula.Estetipodeprocesoesconocidoporloscientficos comosplicingdelARN.LosautoresutilizaronARNribosomalpurificadoyobservaronqueelsplicing ocurra tanto en presencia de un extracto del ncleo del protozoario, que contiene las enzimas responsables de la catlisis del splicing, como en ausencia de ese extracto y por lo tanto de estas enzimas(vaselarevistaCell,volumen27,1981,pgs.487499). ElmundodelosARN RecientementeelequipodeJ.DoudnayJ.Szostakobservqueentrelasreaccionescatalizadasporel ARNfigurabasupropiaduplicacin.DemodoqueelARNseracapazdecopiarseasmismoutilizando slo componentes pertenecientes a su propia estructura. Como un polmero con capacidad de reproduccin puede ser ubicado en el lmite entre los organismos vivos y la materia inanimada, muchosinvestigadoresllegaronapensarquelavidaenlaTierrasehabainiciadoapartirdeARNode estructurasmuysemejantesal. Porsuparte,elequipodeSidneyAltmanrealizotrodescubrimientoimportanteenlaUniversidadde Yale. Comprob que una enzima de la bacteria Escherichia coli, la ARNasa P, que participa en el procesamiento del ARN, est constituida por dos componentes: uno proteico y otro formado por ARN.ElgrupodeAltmanverificqueamboscomponentesdebanestarpresentesparaquelaARNasa P expresara su actividad cataltica. Este descubrimiento fue publicado en 1978 en la revista Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. Desde entonces la ARNasa P fue conocida por los cientficos como una "enzima fsil" porque, como los organismos primordiales, asociacapacidadcatalticaconcapacidaddetrasmitirinformacingentica. Asuvez,enelInstitutoSalkdeSanDiego,California,elgrupodelbioqumicoLeslieOrgelcomprob que determinados tipos de ARN (los polirribonucletidos, constituidos por una sucesin de ribonucletidosidnticos)soncapacesdeservirdemoldeparalaoligomerizacin(sntesisdecadenas cortas constituidas por ribonucletidos) en ausencia de enzimas de ribonucletidos activados. Por ejemplo, estos investigadores demostraron que el polirribonucletido policitosina puede servir de moldeparalapolimerizacindelariboguanosinaactivada. UnargumentoadicionalafavordelARNesquetodosloscomponentesqueparticipandelasntesis qumica del ARN ya han sido obtenidos en el laboratorio en condiciones que simulan el ambiente primitivo de la Tierra, mientras que a pesar de los esfuerzos realizados, no ha sido an posible sintetizarenlasmismascondicionesaladesoxirribosa,elazcarcomponenteestructuraldelADN. Frente a estos hallazgos pareca haberse resuelto el problema de "el huevo o la gallina" que perturbabaaloscientficos.SilosARNpresentaranlaadecuadaactividadcataltica,oseasipudieran funcionar como enzimas, ellos seran los polmeros capaces de desempear la funcin de enzimas primitivasydeduplicarseenausenciadeenzimasproteicas.Laconclusinlgicaera,entonces,queel ARNhabaaparecidoenlaTierraantesquelasprotenas.LasevidenciasafavordelARNresultaban
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tancontundentesque llevaronen1986aWalterGilbert,delaUniversidaddeHarvard,aespecular sobrelaexistenciadeunafaseevolutivaenlaquelosambientesacuticosdenuestroplanetahabran estado poblados por molculas de ARN con las ms variadas secuencias: era el "mundodelosARN". Segn este modelo, los ARN seran capaces de autorreplicacin y podran poseer mecanismos de autoeliminacin y autoinsercin de secuencias. Sera as posible la aparicin de una inmensa variedad de ellos, tanto por mecanismos de recombinacin(vasela figura 2) como por errores en su duplicacin. En el "mundo de los ARN" estos polmeros desempearan al mismo tiempo el papel de fenotipo y de genotipo(vaseNature, vol. 319, 1989, pg. 618). (El fenotipo es la expresin fsica de la informacin guardada en el mensaje gentico ogenotipo.)
Fig.2:Ejemplodeunprocesoprimitivodecombinacindetresdiferentes molculas de ARN. C representa a la citosina y U al uracilo; ambos son basees constituyentes de los ribonucletidos. En una primera etapa se produciralaautoeliminacindelasregionesquesepresentanenrojo.En una segundaetapa, las nuevas molculas de ARNas formadas (cada una de ellas constituida por seis ribonucletidos) podran asociarse entre s para formar otras 33 molculas con diferentes secuencias de bases. El nmero 33 resulta de excluir del total de 36 (6x6) secuencias posibles aquellaas tres que simplemente regeneraran las secuencias originales (ARN1,2y3).
Gilbert propuso tambin que, en una etapa ulterior de la evolucin, los ARN habran comenzado a sintetizar protenas a partir de aminocidos activados (como los aminoaciladenilatos utilizados por losorganismoscontemporneosparalasntesisdeprotenas)yqueconeltranscurrirdeltiempoesas protenashabranadquiridounamayorcapacidadcatalticaqueladelARN.Enunaetapaulteriorla funcin de almacenar la informacin gentica habra sido transferida del ARN al ADN mediante un procesoannoesclarecido. Elmodelodel"mundodelosARN"parecaperfectohastaque,afinesdelosaos'80,loscientficos volvieronatenerdudasenrelacinconlahiptesisdequeelARNhabrasidolaprimeraestructura autorreplicable del planeta. La crtica fue formalizada principalmente por Robert Shapiro de la
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UniversidaddeNuevaYorkyporGeraldF.JoycedelResearchInstitutedelaScrippsClinic(enLaJolla, California).Todocomenzcuandoestoscientficosdecidieronformularlasiguientepregunta:puede el ARN, con todos sus componentes, ser sintetizado en las condiciones primitivas a una velocidad mayorqueladesudestruccinporlaradiacinultravioleta,porhidrlisisoporsureaccinconotras molculas del ambiente? La respuesta fue queello no eraposible(cf.Origins of Life,vol. 18, 1988, pgs.7195,yNature,vol.338,1989,pgs.217224). Ante esta actitud crtica, los cientficos comenzaron a analizar las dificultades que presentaba el caminodelasntesisprimitivadelARN(vase"LasntesisprimitivadelARN").Elrendimientofinalde una sntesis de ARN que hubiera partido de gases y de fosfato sera increblemente bajo, de modo que,aunquelasntesisfueraposibleenelambientedelaTierraprimitiva,eseprocesodeevolucin qumicadaralugaracantidadesmuypequeasdeARN.Apartedelmuybajorendimientoquedara otroserioobstculoparalaaparicindel"mundodelosARN":enlascondicionesprimitivasocurrira una fuerte inhibicin de la duplicacin debido a la presencia de mezclas que contendran los dos ismeros pticos de los ribonucletidos activados. (Los ismeros son molculas que siempre presentanunamismacomposicinatmicayunmismopesomolecular,peroquetienendiferentes configuraciones geomtricas. En el caso de los ismeros pticos, esta diferencia geomtrica les confiere la propiedad de producir una distinta rotacin del plano de polarizacin de un haz de luz polarizada que los atraviese, de ah la denominacin de "pticos". Slo uno de los dos ismeros pticosdelosribonucletidosestpresenteenelARN.) De ese modo, volviendo al ejemplo del experimento de Leslie Orgel, la formacin de policitosina utilizandocomomoldealapoliadenosinaserafuertementeinhibidaporlapresenciadeunamezcla formada por la misma cantidad de los ismeros pticos de la riboguanosina activada. Como en los ambientesprimitivosdebendehaberexistidomezclasdeestetipo,puedeinferirsequeelARNhabra tenidograndesdificultadesparareproducirse. LosfalsosARN Dificultades como las mencionadas estn llevando a los investigadores a buscar otro polmero primordialautorreplicable.Estepodriaser,talvez,muysemejantealARNpuessepiensaquehabran existido sustancias de comportamiento semejante, o sea "anlogos del ARN". Existen muchas sustanciasdeestetipo;enlafigura3serepresentanalgunosanlogosderibonuclesidosenlosque
Fig.3.Comparacindeunribonuclesido"verdadero"a)conanlogos"primitivos".Enstos,elazcar ribosaesreemplazadoporotroscompuestos:elglicerol(b),laacrolena(c)yeleritrol(d).
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otroscompuestosocupanellugardelazcarribosa. La atencin se concentr en un determinado tipo de anlogos del ARN que podran existir en los ambientes acuticos de la Tierra primitiva: los aciclonuclesidos derivados del glicerol. (El prefijo " aciclo"indicaqueelcompuestoquereemplazaalaribosacarecedelaestructuracclicacerradaen anillodelaribosa,comoseobservaenlafigura1).Estoscompuestospodranhabersidoformadosen dos etapas: primero por la condensacin del glicerol con formaldehdo y la generacin de hemiacetalesyluegoporlareaccindeestoshemiacetalesconbasesnitrogenadas.Enelambiente primitivo,laincorporacindefosfatoapartirdepolifosfatospodrahabergeneradoanlogosdelos ribonucletidos. Unaspectoquehaceatractivaestahiptesisloconstituyeelhechodequelaestabilidaddelglicerol es muy superior a la de la ribosa, lo que puede haber permitido su acumulacin en los ambientes acuticos de la Tierra primitiva en cantidad suficiente como para formar los aciclonuclesidos. Una ventaja adicional es que estos compuestos no tienen ismeros pticos "indeseables". Los aciclonucletidospuedenpolimerizarse(generandoanlogosdelARN)yformarlosmoldesnecesarios paralaautorreplicacindeestospolmeros.Procesossimilarespuedenhaberocurridoconotrostipos deanlogosdelARN. Por esa razn, el problema que hoy preocupa a los investigadores es determinar cmo se pas del "mundo de los anlogos del ARN'' al "mundo de los ARN". Quiz, los primeros anlogos del ARN estaban compuestos de diferentes variedades de anlogos y podran contener, incluso, algunos "autnticos"ribonucletidos.Laseleccinnaturalenel"mundodelosanlogosdelARN"debehaber favorecido aquellos polmeros que presentaban una mejor relacin entre capacidad de autoduplicacinyresistenciaaladestruccin. En un plazo corto en trminos de la evolucin (no ms de 0,4 eones) se habran ido seleccionando progresivamente aquellos polmeros con mayor cantidad de "autnticos" ribonucletidos. De ese modo, poco a poco, habra aparecido el "mundo de los ARN". En el curso de este proceso, los anlogos del ARN habran iniciado la sntesis de las primeras protenas por mecanismos muy primitivos. Las primeras protenas podran haber desempeado una funcin importante en la seleccinpositivadelosARN. A partir de esta etapa se entra en un campo altamente especulativo, que carece prcticamente de sustentoexperimental.Hayporlotantomuchoquetrabajarparareconstruirellargocaminoquela evolucinhaseguidodesdelosprimerosanlogosdelARNhastalosorganismosmscomplejosque contienenADNcomomolculaqueguardaytransmitelainformacingentica. La edicin de texto de este artculo, originariamente escrito en portugus, fue realizada por los equipos tcnicos de la revista Ciencia Hoy. Traduccin al castellano y revisin tcnica: Patricio J. Garrahan. LECTURASSUGERIDAS FERRIS, J. P. y USHER, D.A., 1988, "Origins of life", en Biochemistry, G. Zubay/Macmillan PublishingCompany,NewYork,pgs.11201151. HERMESLIMA,M,1990,"NaturalselectionintheRNAlikeworld",Naturwissenschaften,vol.
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77,pgs.22627. HERMESLIMA, M., TESSIS, A.C. y VIEYRA, A., 1990, "Adsorption of 5'Adenosine monophosphate onto precipitated calcium phosphate: effects of inorganic polyphosphates andcarbonylphosphate",OriginsofLifeandEvolutionoftheBiosphere.vol.20.pgs.2741.
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CAPTULO SEGUNDO:
La Qumica de las Clulas
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LAQUMICADELASCLULAS
Introduccin Las clulas son estructuras increblemente diversas y complejas, capaces no slo de replicarseasimismasunadelascaractersticasesencialesdelavidasinotambinde realizarunaampliagamadetareasespecializadasenlosorganismosmulticelulares. Las clulas adems obedecen las mismas leyes qumicas y fsicas que determinan el comportamiento de los sistemas no vivos. Consecuentemente, la biologa celular moderna,apuntaacomprenderlosprocesoscelularesentrminosdereaccionesfsicas yqumicas. Consideraremosenestaunidadlosprincipiosbiolgicosfundamentalesquegobiernanla vida de las clulas. No es nuestra intencin realizar una discusin completa de la bioqumica de las clulas ni de todas las cartas de las reacciones metablicas que ocurren dentro de las clulas. Enfocaremos aqu cinco tpicos mayores: los tipos de molculas dentro de las clulas, el rol central de las protenas como catalizadores biolgicos, la generacin y utilizacin de energa metablica, la biosntesis de los mayoresconstituyentescelularesylaestructuradelamembranasbiolgicas. LaComposicinMoleculardelasClulas Las clulas estn compuestas de agua, iones inorgnicos y molculas que contienen carbono (molculas orgnicas). El agua es la molcula ms abundante de las clulas, contabiliza hasta el 70% o ms de la masa celular total. En consecuencia, las interacciones entre el agua y los otros constituyentes celulares son de importancia centralenlaqumicabiolgica.Lapropiedadcrticadelaguaesladeserunamolcula polar, en la que el tomo de Oxgeno posee una ligera densidad de carga negativa, mientrasquelostomosdeHidrgenoposeenunaligeradensidaddecargaspositivas. Debidoasunaturalezapolarlasmolculasdeaguapuedenformarpuenteshidrgeno entresioconotrasmolculaspolares,ascomointeractuarconionescargadospositiva o negativamente. Como resultado de estas interacciones, los iones y las molculas polares sonsolublesen agua (hidroflicos). En contraste, las molculas no polares, son pobremente solubles en ambientes acuosos (hidrofbicos). En consecuencia, las 36

molculas nopolares tienden a minimizar sus contactos con agua asocindose entre
ellas. Los iones inorgnicos de las clulas incluyendo: Sodio (Na+), Potasio (K+), Magnesio (Mg2+),Calcio(Ca2+),Fosfato(HPO42),Cloruros(Cl)yBicarbonato(HCO3)constituyen 1%omenosdelamasadelasclulas.Sinembargo,estosionesestninvolucradosen numerosos aspectos del metabolismo celular y poseen roles crticos en la funcin celular. Las molculas orgnicas son constituyentes crticos de las clulas. La mayora de estos componentesorgnicospertenecenaunadecuatroclasesdemolculas:carbohidratos, protenas,lpidosocidosnucleicos.Lasprotenas,loscidosnucleicosylamayorade los carbohidratos (polisacridos), son polmeros de cientos o miles de precursores de bajo peso molecular: aminocidos, nucletidos y azcares simples respectivamente. Talesmolculasconstituyendel80al90%delpesosecodelamayoradelasclulas.Los lpidos son los otros constituyentes mayores de las clulas. La masa remanente de las clulas est compuesta de una variedad de molculas orgnicas pequeas, incluyendo los precursores macromoleculares. La base qumica de las clulas puede ser as comprendida en trminos de estructuras y funciones de las cuatro mayores clases de molculasorgnicas. CARBOHIDRATOS Los carbohidratos incluyen azcares simples as como tambin polisacridos. Estos azcares simples, tales como la glucosa, son los mayores nutrientes de las clulas. Su descomposicin provee tanto la fuente de energa de las clulas como el material de partida para la sntesis de otros constituyentes celulares. Los polisacridos son formas dealmacenamientodeazcaresycomponentesestructuralesdelasclulas.Adems,los polisacridos y polmeros de azcares ms cortos actan como marcadores para una variedaddeprocesosdereconocimientocelular,incluyendolaadhesindelasclulasa susvecinosyeltransportedeprotenasasusdestinosintracelularesapropiados. Losmonosacridos,loscarbohidratosmssencillos,sonaldehdosocetonasquetienen dosomsgruposhidroxilo;lafrmulaempricademuchoses(CH2O)n,literalmenteun 37

"hidratodecarbono".Losmonosacridosmspequeos(n=3),sonladihidroxiacetona
yelDyLgliceraldehdo(Fig.21).
Fig. 2-1 Representacin de Dihidroxicetona, D-Gliceraldehdo y LGliceraldehido respectivamente (Modificado de Biochemistry de Berg). Estas molculas tambin reciben el nombre de TRIOSAS. La dihidroxiacetona es una cetosa porque contiene un grupo ceto, mientras que el gliceraldehdo es una aldosa porquecontieneungrupoaldehdo.LosDyLGliceraldehdos,desdeelpuntodevista desuisomera,sedenominanenantimeros,oimgenesespecularesunodelotro. Losmonosacridosyotrosazcaresamenudosonrepresentadosporlasdenominadas proyecciones de Fischer (Fig. 22). Las proyecciones de Fischer son tiles para representar las estructuras de los carbohidratos, ya que proporcionan vistas claras y sencillasdelaestereoqumicaencadacentrodeltomodecarbono.
Fig. 2-2: proyecciones de Fischer de D- y L-Gliceraldehdo y de Dihidroxicetona. (Modificado de Biochemistry de Berg). Losmonosacridossencillosconcuatro,cinco,seis,ysietetomosdecarbonosellaman tetrosas, pentosas, hexosas, y heptosas, respectivamente. Con respecto a estos monosacridos, los smbolos D y L designan la configuracin absoluta del carbono asimtrico ms alejado del grupo carbonilo (aldehdo o cetona). En la Fig. 23 se 38

presentan las Daldosas ms comunes: DRibosa, una aldosa de cinco tomos de
carbono;laDGlucosa,Dmanosa,yDgalactosaaldosasdeseistomosdecarbono.Si observamoslasfrmulasdelaDglucosayDmanosa,observamosquedifierensloen laconfiguracindelC2.
DGliceraldehdo
DEritrosa
DTreosa
DRibosa
DArabionosa
DXilosa
DLixosa
Fig 23. SeriedelasDaldosasmsimportantes(ModificadodeBiochemistrydeBerg). D-Alosa D-Altrosa D-Glucosa D-Manosa D-Gulosa D-Idosa D-Galactosa D-Talosa Los azcares que difieren en la configuracin de un solo centro asimtrico se llaman epimeros. As, Dla glucosa y Dmanosa son epmeros en el C2 y la Dglucosa y D galactosasonepmerosenelC4. Comoyadijimosanteriormente,ladihidroxiacetonaeslacetosamssencilla.Larelacin estereoqumicaentrelasDcetosasquecontienenseistomosdecarbono,muestraque lasmismastienenuncentroasimtricomenosquelasaldosasconelmismonmerode tomosdecarbono.LaDFructosaeslaCETOHEXOSAmsABUNDANTE(CETO=degrupo funcionalceto,yHEXOSA=deseistomosdecarbonos). Estructurasdepentosasyhexosascclicasderivadasdelanillodepiranoyfurano.
39

Lasformaspredominantesensolucindelaribosa,glucosa,fructosa,ydemuchosotros
azcaresnosonprecisamentecomocadenasabiertas.Lasformasdecadenaabiertade estosazcares,ensolucinseciclanformandoanillos.Estosefundamentaengeneral, en que un aldehdo (considerando una aldosa) puede reaccionar conun grupo alcohol Fig. 24. Formacin de un Hemiacetal (ModificadodeBiochemistrydeBerg).
AldehdoAlcoholHemiacetal
paraformarunhemiacetal.(Fig.2.4) Para una aldohexosa, tal como la glucosa, el C1 aldehdico en la cadena abierta, reaccionacon el grupo hidroxilo del C5 para formar un hemiacetalintramolecular. El resultado es la formacin de un hemiacetal cclico, es decir, un anillo de seis tomos, llamado piranosa, a causa de su similitud al anillo de pirano (Fig. 25). De modo semejante,unacetonapuedereaccionarconunalcoholparaformarunhemicetal.(Fig. 26).
Fig.25(ModificadodeBiochemistrydeBerg)Fig.26(ModificadodeBiochemistrydeBerg)
CetonaAlcoholHemicetal
DGlucopiranosa
DGlucosa
DGlucopiranosa
ElgrupocetodelC2deuncetohexosadecadenaabierta,talcomolafructosa,puede formarunhemicetalintramolecular,cuandoreaccionaconelgrupodehidroxilodelC6 para formar un anillo de seis tomos, o tambin con el grupo hidroxilo del C5 para formar un anillo de cinco tomos (Fig. 27). El anillo de cinco tomos se denomina furanosaacausadesusimiltudalanillodefurano.
40
DFructosaDFructofuranosa
Fig.27(ModificadodeBiochemistrydeBerg). Lasdescripcionesdelaglucopiranosasyfructofuranosasmostradasenlasfigs.26y27 sonlasproyeccionesdeHaworth.ComoenlasproyeccionesdeFischer,lasproyecciones de Haworth permiten realizar una descripcin fcil de la estereoqumicadelosazcares. Al generarse un hemiacetal cclico, se crea un nuevo centro asimtrico. As, en el anillo se pueden formar dos estructuras
DRibosa
denominadosanmeros.Paraelcasodelaglucosa,estsrecibenel nombre de glucopiranosa y glucopiranosa (ver la fig. 26). El carbono anomrico es el C1. El anmero es el que presenta el grupohidroxilodelhemiacetal,pordebajodelplanodelanilloyel
2DeoxiDRibosa
porencimadelplano. La misma nomenclatura se aplica a la forma del anillo furansicodelafructosa(verlafig.27).Lafructosaforma
Fig 28 (Modificado de
BiochemistrydeBerg)
tanto los anillos de piranosa como de furanosa. La forma piranosica predomina en la fructosalibreensolucin,ylaformadefuranosicapredominaenmuchosderivadosde lafructosa(Fig.28) Identificacindeazcares Laglucosa,entreotros,reaccionaconagentesoxidantestalescomoioncprico(Cu2 +) en medio alcalino, debido a que la forma abierta de la cadena tiene un grupo libre aldehdolibrequesecomportacomounreductor.(Fig.29) Lassolucionesdesalesdecobreenmedioalcalino(conocidascomosolucindeFehling), proporcionanunapruebasencillaparaazcares,talcomolaglucosayotroshidratosde carbono con propiedades reductoras. Los azcares que reaccionan se llaman azcares 41

reductores.
Fig.29(ModificadodeBiochemistrydeBerg) DISACRIDOS Debidoaquelosazcarescontienenmuchosgruposhidroxilos,losenlacesglicosdicos puedenunirunmonosacridoconotro.Losoligosacridosseconstruyenporlauninde dosomsmonosacridosporenlacesOglicosdicos(Fig.210).
Unin
Fig.210(ModificadodeBiochemistrydeBerg). Un disacrido consiste en dos azcares unidos por un enlace Oglicosdico. Los tres disacridos ms abundantes son la sacarosa, lactosa, y la maltosa. En la sacarosa, se encuentranunidoslostomosdecarbonoanomricosdeunaunidaddeglucosayuna unidaddefructosa,siendolaconfiguracindeestauninglicosdica paralaglucosay paralafructosa. Lalactosa,eldisacacridodeleche,consisteenunagalactosaunidaaunaglucosapor unaunin 1,4glucosdica.
Enlamaltosa,dosresiduosdeDglucosaestnunidosporenlacesglicosdicosentreC1 42

anomricoalfa,yelhidroxilodelC4delazcaradyacente.Taluninsellamaenlace1,
4glicosdico.(Fig.211)
SACAROSA
LACTOSA
MALTOSA
Fig.211(ModificadodeBiochemistrydeBerg). POLISACRIDOS Los grandes polmeros de oligosacridos, formados por la unin de mltiples monosacridos,sonllamadospolisacridos.Lospolisacridosjueganpapelesesenciales en el almacenamiento de energa y mantenimiento de la integridad estructural de un organismo.Sielmonosacridopresenteenlaestructuraeselmismo,estospolmerosse llamanhomopolimeros. Almidnyglucgeno Tanto el almidn, que pertenece a las clulas vegetales, como el glucgeno, de las clulas animales, son polisacridos de almacenamiento que se acumulan formando grnulos.Estospolisacridosestnaltamentehidratadosyaquetienencientosomiles de grupos hidroxilos expuestos al medio acuoso. Ambos son polmeros de glucosa en distintasestructuras. 43

Elalmidnestcompuestopor2tiposdepolmerosdeglucosa:
1.Amilosa(gluc(alfa14)gluc)npolmerolineal(PM500.000) 2. Amilopectna (glucosa (alfa 14) gluc), cada 2430 residuos glucosa (alfa16) gluc (PM1.000.000).(Fig.212)
Enlace 1,6 glucosdico
Fig.212(ModificadodeBiochemistrydeBerg). El glucgeno es un polmero ramificado de glucosa como la amilopectina del almidn, salvoquelasramificacionesocurrencada812residuosenlacadenalinealporloquees unpolmeromscompactoqueelalmidn. En las clulas animales, el glucgeno se encuentra en forma de grnulos en ciertas clulascomolashepticasymusculares.Cadamolculadeglucgenotieneunpesode variosmillonesytieneasociadoalamolculalasenzimasdesntesisydegradacindel polmero. Laglucosaesalmacenadaalinteriordelaclulavegetalyanimalcomounpolmerode alto pesomolecular,y nocomo glucosalibre,yaque deestaformacontribuyepocoa generar diferencia osmolar entre el interior de la clula y el medio externo (la osmolaridad est dada por el nmero de molculas en solucin y su diferencia con el medio externo). La forma del depsito en la clula vegetal es como almidn, y como glucgenoenlaclulaanimal. Celulosayquitina.
44

Tantolacelulosacomolaquitinasonhomopolisacridosestructurales.Lacelulosaesun
polmerodeDglucosaunidasporenlaceglicosdico 14ylaquitinaunpolmerodeN acetilglucosaminaconelmismoenlace. Elenlaceglicosdico14generapolmeroslinealesmsrgidosquelosdelaamilosaque son 14 y permite que varios polmeros lineales interacten entre ellos formando fibrasquesonmsresistentes. Lacelulosaformalaparteleosayresistentedemuchosvegetales,laquitinacompone elcaparazndemuchosartrpodos. Los animales pueden degradar amilosa, amilopectina y glucgeno, ya que tienen las enzimas que hidrolizan el enlace 14, pero no pueden degradar celulosa o quitina (exceptolosrumiantes)porquenotienenenzimasparaelenlace14.
GLICOSAMINOGLICANOS
Unaclasediferentedepolisacridosestpresenteenlasuperficiedelaclulaanimaly en la matriz de extracelular. Los glicosaminoglicanos y proteoglicanos son heteropolisacridosqueconformanlamatrizextracelularqueexisteentrelasclulasde lostejidosanimales. Los glicosaminoglicanos son polmeros lineales compuestos por la repeticin de un disacrido. El disacrido es Nacetilglucosamina o Nacetilgalactosamina. Los grupos hidroxilos de la Nacetilglucosamina o galactosamina estn muchas veces esterificados conungrupofosfato,loscuales,sumadoalosgruposcarboxilodelcidournicoledan carganegativaalglicosaminoglicano. Elsulfatodecondroitin,sulfatodequeratan,laheparina,sulfatodeheparan,sulfatode dermatan,yelhialuronato;sonlosglicosaminoglicanosmsimportantes. Los glicosaminoglicanos se encuentran conectados generalmente a protenas para formarproteoglicanos.Enlosproteoglicanos,elcarbohidratocomponeel95%delpeso delabiomolecula.Lafuncindelosproteoglicanosesladeactuarcomocomponentes estructurales deltejido conectivo y mediarla adhesin celular alamatrizextracelular, entre otros. Los proteoglicanos estn compuestos por una molcula central larga de 45

cidohialurnicoalaqueseunendeformanocovalente,pequeasprotenas(20.000),
ydeformacovalenteotrosglicosaminoglicanoscomoelsulfatodecondroitn,sulfatode queratn,sulfatodeheparnysulfatodedermatn. Losproteoglicanospuedenllegarasermolculasinmensasqueseentremezclanconlas fibras de colgeno y elastina para formar la matriz extracelular. Se unen a ciertas protenasdemembrana,yestasseunenasuvezaprotenasintegralesdemembrana llamadasintegrinas.Deestaformaseanclanlosproteoglicanosdelamatrizextracelular alaclula. Glicoprotenas Losdiferentesgruposdecarbohidratosseconectancovalentementeamuchasprotenas diferentesparaformarglicoprotenas.Loscarbohidratosaquocupanunporcentajems pequeo del peso de la glicoproteina. Muchas glicoproteinas son componentes de las membranasdecelulares,dondejueganunavariedaddepapelesenprocesostalescomo laadhesincelular. Losoligosacridosunidosaprotenassongeneralmenteheterooligosacridos,enlosque secombinandiferentesmonosacridoscondiferentestiposdeuniones(13,14.12,1 6,23). Puedehabervariascadenasdeoligosacridosunidosaunamismaprotena.Lascadenas puedensercortasolargas,ylinealesoramificadas. Los oligosacridos se unen a la protena a travs de un enlace Oglicosdico cuando el azcar terminal se une al hidroxilo (OH) de una serina o treonina, o a un enlace N glicosdicocuandoel azcar se unea una asparagina.La enorme cantidad de azcares queexisten,ledanunavariabilidadmuygrandealasglicoprotenas. Elprocesodeglicosilacindeunaprotenaseverendetallesenelcaptulodesistemas deendomembranas. FUENTESDECARBOHIDRATOS Adems de ser obtenida a partir de los alimentos o generados por fotosntesis, la glucosa puede ser sintetizada a partir de otras molculas orgnicas. En las clulas 46

animales, la sntesis de glucosa (gluconeognesis) usualmente comienza con el lactato
(producido por gluclisis anaerobia), aminocidos, (derivados de la descomposicin de las protenas), o glicerol (derivado de la descomposicin de los lpidos). Los vegetales (pero no los animales) son capaces de sintetizar glucosa a partir de cidos grasos un proceso particularmente importante durante la germinacin de las semillas donde la energa almacenada en forma de semillas debe ser convertida a carbohidratos para sostener el crecimiento de las plantas. Tanto en clulas vegetales como en las animales,losazcaressimplessonpolimerizadosyalmacenadoscomopolisacridos. La gluconeognesis involucra la conversin de piruvato a glucosa esencialmente la inversa de la gluclisis Sin embargo, la conversin de glucosa a piruvato es una va productora de energa, que genera dos molculas de ATP y NADH. Aunque algunas reacciones de gluclisis son realmente reversibles, otras proceden slo en la direccin deladescomposicindelaglucosa,yaqueestnasociadasconunagrandisminucinde la energa libre. Estas reacciones energticamente favorables de la gluclisis son salteadas durante la gluconeognesis por otras reacciones (catalizadas por diferentes enzimas)que estn acopladas al consumo deATP y NADHenorden deconducirlasen direccindelasntesisdeglucosa.Engeneral,lageneracindeunamolculadeglucosa apartirdedosmolculasdepiruvatorequierecuatromolculasdeATP,dosdeGTPy dosdeNADH.Esteprocesoesconsiderablementemscostosoquelasimplereversin de la gluclisis (que requiere dos molculas de ATP y dos molculas de NADH), ilustrando la energa adicional requerida para conducir una va en la direccin biosinttica. Tanto en clulas vegetales como animales, la glucosa es almacenada en forma de polisacridos (almidn y glucgeno respectivamente). La sntesis de polisacridos requiereelaportedeenerga.Comoseindicanteriormentelareaccindeunindedos azcaresporunpuenteglucosdicoesesencialmenteunareaccindedeshidratacin,en la que se elimina agua (Figura 2.3). Sin embargo, tal reaccin es energticamente desfavorable y por lo tanto incapaz de proceder en la direccin de formacin. En consecuencia,laformacindeunauninglucosdicadebeestaracopladaaunareaccin proveedoradeenerga,queestacompaadaporelusodeazcaresnucleotdicoscomo
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intermediariosenlasntesisdepolisacridos(Figura).Laglucosaesprimerofosforilada
en una reaccin conducida por ATP a glucosa6fosfato, que luego es convertida a glucosa1fosfato. La glucosa1fosfato, reacciona con UTP (uridina trifosfato) produciendo glucosaUDP + pirofosfato, que luego es hidrolizado a fosfato con la liberacindelaenergalibreadicional.LaglucosaUDPesunintermediarioactivadoque luegodonasuresiduodeglucosaaunacadenanacientedepolisacridoenunareaccin energticamentefavorable. As, la energa en forma de ATP y UTP conduce la sntesis de polisacridos a partir de azcaressimple. LPIDOS Los lpidos cumplen tresrolescrticos en las clulas.Primero, proveen una importante forma de almacenamiento de la energa, segundo, y de gran importancia en biologa celular,loslpidossoncomponentesprincipalesdelasmembranascelularesytercero, loslpidosjueganunimportanterolenelsealamientocelular,tantocomohormonas esteroides(porej.estrgenosytestosterona)ocomomolculasmensajerasqueenvan sealesdesdelasuperficiecelularablancosespecficosenelinteriordelasclulas. Loslpidosmssimplessonloscidosgrasos(Fig.213)queconsistendelargascadenas hidrocarbonadas,muyfrecuentementeconstituidaspor1618tomosdecarbonocon un grupo carboxilo en uno de sus extremos (COO). Los cidos grasos insaturados contienen una o ms dobles ligaduras entre tomos de carbono; en los cidos grasos saturadostodoslostomosdecarbonoestnunidosalmximonmerodetomosde H.LaslargascadenashidrocarbonadasdeloscidosgrasoscontienenslounionesCH no polares, que son incapaces de interactuar con agua. La naturaleza hidrofbica de estas cadenas hidrocarbonadas de los cidos grasos son las responsables del comportamientodemuchosdeloslpidoscomplejos,particularmenteenrelacinconla formacindelasmembranasbiolgicas. Loscidosgrasossonalmacenadosenformadetriacilgliceroles(Fig.214)ograsas,los que consisten de tres cidos grasos ligados a una molcula de glicerol. Los triacilgliceroles, son insolubles en agua y se acumulan como gotas de grasa en el 48

citoplasma.Cuandosonnecesarios,puedenserdegradadosparausarlasenreacciones
productoras de energa. Es de destacar que los lpidos son una forma de almacenamientodeenergamseficiente,produciendomsdeldobledeenergapor pesodematerialdegradado.Loslpidos,permitenasimismo,almacenarlaenergaen menos de la mitad del peso corporal que se requerira para almacenar la misma cantidad de energa en forma de carbohidratos una consideracin particularmente importanteparaanimalesenfuncindesumovilidad. Fig. 214 (Modificado de Molecular Biology of the CellAlbert) Los Fosfolpidos (fig. 2 15), son losprincipalescomponentes dela membranacelular, consistende dos cidos grasosunidosaunacabezapolar.Enlosfosfolpidos,losdoscidosgrasosestnunidos a tomos de carbn del glicerol, como en los triacilgliceroles. Sin embargo, el tercer carbonodelglicerol,estunidoaungrupofosfato,elcualasuvezpuedeestarunidoa unamolculapolarcomolacolina,laserina,elinositololaetanolamina(Fig.216).La esfingomielina,el nicofosfolpidonoacilglicerlicodelamembranacelular,contiene doscadenashidrocarbonadasunidasacabezaspolaresformadasporserinaenlugarde glicerol.As,todoslosfosfolpidostienencolashidrofbicas,consistentesdedoscadenas hidrocarbonadas y cabezas hidroflicas, consistentes de grupos fosfato y sus anclajes polares. En consecuencia, los fosfolpidos son molculas anfipticas, parte solubles en agua y parte insolubles en agua. Esta propiedad de los fosfolpidos es la base de la formacindelasmembranasbiolgicas,comosediscutirmsadelante.
49
Fig.215(ModificadodeMolecularBiologyoftheCellAlbert) (Modificado
213 de Molecular Biology Fig.
oftheCellAlbert)
Fig.216Fosfolpidosdelamembranaplasmticayunfosfolpidodelasmitocondrias
Adems de los fosfolpidos, la mayora de las membranas celulares poseen glucolpidos y colesterol. Los glucolpidos (Fig. 217) consisten de dos cadenas hidrocarbonadas unidas a cabezas formadas por grupos polares que contienen carbohidratos. As, son similares a los fosfolpidos en su organizacin general como molculas anfipticas. En contraste, el colesterol (Fig. 218) consiste de cuatro anillos hidrocarbonados en lugar de cadenas hidrocarbonadas lineares. Los anillos hidrocarbonadossonfuertementehidrofbicos,peroelgrupohidroxilo(OH)ancladoa un extremo del colesterol es dbilmente hidroflico, lo que le confiere al colesterol caractersticasanfipticas.
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Fig.217(ModificadodeMolecularBiologyoftheCell,Albert)
Fig.218(ModificadodeMolecularBiologyoftheCell,Albert) Ademsdesusrolescomocomponentesdelasmembranascelularesloslpidosactan como molculas de sealamiento, tanto dentro como entre las clulas. Las hormonas 51

esteroides son derivados del colesterol. Estas hormonas son un grupo diverso de
mensajerosqumicos,quesecaracterizanporposeercuatroanilloshidrocarbonadosa losqueseunendiferentesgruposfuncionales.Losderivadosdelosfosfolpidostambin actancomo molculasmensajerasdentrodelasclulas,transmitiendosealesdesde losreceptoresdelasuperficiehaciablancosintracelulares. Los lpidos son molculas muy importantes en el almacenamiento de la energa y un constituyenteprincipalenlasmembranascelulares.Ellossonsintetizadosapartirdela acetilCoA,laqueestformadaporladescomposicindeloscarbohidratosapartirde unaseriedereaccionesquerecuerdanalainversadelaoxidacindeloscidosgrasos. Sinembargo,comoocurreenlasntesisdecarbohidratos,lasreaccionesqueconducena lasntesisdecidosgrasosdifierendelainvolucradaensudegradacinenquedeben estar acopladas al aporte de energa en forma de ATP y poder reductor en forma de NADPH. Los cidos grasos se sintetizan por la adicin de unidades de dos carbonos derivados de la acetilCoA a una cadena creciente. La adicin de cada una de estas unidadesdedoscarbonosrequiereelaportedeunamolculadeATPydosmolculasde NADPH. Losprincipalesproductosdelabiosntesisdecidosgrasos,queocurreenelcitosolde las clulas eucariticas, es el cido graso de 16 tomos de carbono palmitato. Los principales constituyentes de las membranas celulares (fosfolpidos, esfingomielina, y glucolpidos)sesintetizanluegoapartirdecidosgrasoslibresenelREyelaparatode Golgi.
LPIDOSDEMEMBRANA
ESTETEMASEDESCRIBIRESPECFICAMENTEENELCAPTULO3 cidosNucleicos Los cidos nucleicos son las principales molculas portadoras de la informacin de las clulas.Elcidodesoxirribonucleico(ADN)poseeunrolcrticocomomaterialgentico, queenlasclulaseucariotas,estlocalizadoenelncleo.Losdiferentestiposdecido ribonucleico(ARN)participanennumerosasactividadescelulares.Elcidoribonucleico 52

mensajero (ARNm) lleva la informacin desde el ADN a los ribosomas, donde acta
como patrn para la sntesis de protenas. Los otros dos tipos de ARN, el de transferencia (ARNt) y el ribosomal (ARNr) estn involucrados en la sntesis de protenas.HayanotrostiposdeARNsinvolucradosenelprocesamientoyeltransporte deprotenas.Ademsdeactuarcomomolculaportadoradelainformacingentica,el ARN es capaz de catalizar numerosas reacciones qumicas. En las clulas de nuestros das,estasreaccionesincluyentantolasntesisdeprotenascomoelprocesamientode ARN. El ADN y el ARN son polmeros de nucletidos que consisten de bases pricas y pirimdicas (Fig. 219) unidas a azcares fosforilados. El ADN contiene dos purinas (adeninayguanina)ydospirimidinas(citosinaytimidina).Adenina,gunaninaycitocina tambin estn presentes en el ARN pero la timina esta reemplazada por uracilo. Las basesestnligadasaazcares(2desoxirribosaenelADN,oribosaenelARN)formando nuclesidos (Fig. 120). Los nucletidos adicionalmente contienen uno o ms grupos fosfato,unidosalcarbono5delazcardelnuclesido.(Fig.221) Adenina Pirimidinas Fig.219(Modificada deBiochemistrydeBerg) Citocina Uracilo Timina Guanina
Purinas
53
Ribosa
Pentosa
2 deoxiribosa (DNA)
Fig.220(ModificadodeMolecularBiologyoftheCellAlbert)
Lapolimerizacindelosnucletidosparaformarcidosnucleicosinvolucralaformacin depuentesfosfodisterentreelgrupofosfato5deunnucletidoyelgrupohidroxilo3
Base Fosfato
Azucar
Fig.221(ModificadodeMolecularBiologyoftheCell,Albert)
delotro.(Fig.222). Los oligonucletidos son polmeros pequeos que contienen slo unos pocos nucletidos, los
polinucletidosgrandesqueconstituyenlosARNyADN celulares pueden contener miles a millones de nucletidos respectivamente. Es deimportancia notar que una cadena polinucleotdica posee un sentido de direccin, con un extremo de la cadena finalizando en un grupo fosfato 5 y el otro finalizando en un grupo hidroxilo 3. Los polinucletidos siempre son sintetizados en la direccin 53, en el que los nucletidoslibressonagregadosalextremohidroxilo3 de una cadena creciente. Por convencin la secuencia debasesenelADNoenelARNsiempreseescribeenla 54
Fig. 222 (Modificado Molecular Biology of de the Enlace fosfodister

direccin53.
LainformacinenelADNyelARNestransmitidaporelordendelasbasesenlacadena polinucleotdica. El ADN es una molcula de doble hebra consistente de dos cadenas polinucleotdicasorientadasendireccionesopuestas.Lasbasesestnorientadashaciael interior de la molcula, y las dos cadenas estn unidas por puentes hidrgeno entre paresdebasescomplementariasadeninaapareadacontiminayguaninaapareadacon citocina La consecuencia importante de este apareamiento complementario es que una hebra de ADN (o ARN) puede actuar como patrn para dirigir la sntesis de una hebracomplementaria.Loscidosnucleicossonasnicosensucapacidaddedirigirsu propia replicacin, permitindoles a ellos funcionar como molculas fundamentales portadorasdelainformacindelasclulas.LainformacinportadaporelADNyelARN dirigelasntesisdeprotenasespecficas,lasquecontrolanlamayoradelasactividades celulares. Losnucletidosnoslosonimportantescomolosbloquesconlosqueseconstruyenlos cidosnucleicos,sinoquetambinjueganunimportanterolenotrosprocesoscelulares. Quizselejemplomsprominenteeseladenosina5trifosfato(ATP)queeslaprincipal forma de energa qumica de las clulas. Otros nucletidos actan como carriers de energa como de grupos reactivos en una amplia variedad de reacciones metablicas. Adems, algunos nucletidos, (por ejemplo el AMP cclico) son importantes molculas desealamientodentrodelasclulas. Base Adenina (A) Guanina (G) Citosina (C) Timina (T) Adenina (A) Guanina (G) Citosina (C) Uracilo (U) Nuclesido Desoxiadenosina Desoxiguanosina Desoxicitidina Desoxitimidina Adenosina Guanosina Histidina Uridina Nuclotidos dADP dGDP dCDP dTDP ADP GDP CDP UDP
ADN
ARN
dAMP dGMP dCMP dTMP AMP GMP CMP UMP
dATP dGTP dCTP dTTP ATP GTP CTP UTP
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Ribozimas
Por convencin los ARN con actividad cataltica se denominaron ribozimas. Estas molculasde ARN poseen capacidad intrnseca para realizar la rupturay formacinde enlacescovalentesenreaccionesquesontericamentereversibles.Enestasreacciones no intervienen protenas, aunque son reacciones qumicas dependientes de Magnesio. En forma genrica se puede decir que las ribozimas son ARN autocatalticos o con capacidaddecatlisis.Podemosconsideraralmenoscuatroclasesdistintasderibozimas odeARNscatalticos: a) LOSINTRONESAUTOCATALTICOSDELGRUPOI,queconstituyeronlosprimerosARNcon actividad de ribozima descriptos; poseen una longitud aproximada de 413 nucletidos,estnpresentesenelARNt,elARNryalgunosgenesquecodifican para protenas, han sido detectados en hongos, ADN mitocondrial, Tetrahymena, ADN de cloroplastos, bacterifagos y eubacterias; su conservacin evolutiva estructural fue definida por medio de comparaciones filogenticas y caractersticas especficas que han sido confirmadas por mutacionesymapeoestructuralinvivoeinvitroloquehapermitidodefinirque los intrones catalticos del grupo I se encuentran constituidos por 9 dominios estructuralesdenominadosP1P9,loscualescontienensitiosdeprocesamiento 5 y 3; cuentan asimismo con una secuencia gua interna (IGS) la que se encuentra localizada adelante del sitio de procesamiento 5 y entre las secuencias del sitio de procesamiento exnico. El sitio de procesamiento 5 es definidoporelapareamientodebasesentreP1ylaIGS,entantoquelaregin deprocesamiento3sedefineporelapareamientodebasesentreeldominioP9 y la IGS, la cual involucra los dos nucletidos que preceden la G terminal del intrn. Su mecanismo de accin para el procesamiento de intrones y exones involucraalARNintrnicoqueseunealnuclotidoguanosina,autocatalizndose atravsdedosreaccionesdetransesterificacin;enlaprimeraelgrupohidroxilo 3 terminal ataca al fsforo del sitio de procesamiento 3, autoliberndose la regin intrnica; este grupo I de Intrones autocatalticos ha sido clasificado en cuatrograndessubgruposquevandelIAalID.Fig.(a)(Cech,1990).
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b) LOS INTRONES AUTOCATALTICOSDEL GRUPO II:hansidoencontradosenalgunostipos dehongos,mitocondriasdevegetalesyencloroplastos.LosIntronescatalticos del grupo II son particularmente interesantes debido a su posible relacin evolutiva con los Intrones del preARNm, lo cul ha sido inicialmente sugerido por la descripcin de similitudes en los mecanismos de corte, eliminacin de intrones y unin de regiones exnicas en el procesamiento del preARNm; el mecanismo de accin de los Intrones autocatolticos del grupo II ocurre de la siguiente manera: en primer lugar, ocurre que la unin intrnexn 5 es procesada y la unin 2 5 se establece con el residuo A de la regin de procesamiento 3 y el primer nucletido, generalmente una G de la regin de procesamiento 5; as la unin 3 intrn exn es procesada permitiendo el enlacedelosdosexonesyliberandoalintrnenformadelazo.Ladefinicinde la estructura secundaria ha permitido conocer que los Intrones autocatalticos delgrupoIIposeenseisdominosautocatalticosdenotadosdel1al6,entrelos que se ubican dos tipos importantes de regiones, una conocida como sitios de enlace al exn (EBS) y otra denominada sitio de enlace al intrn (IBS); la interaccin y ataque nucleoflico entre estas dos regiones es muy similar a lo descripto para el del
procesamiento
preARNm, en el que participan pequeos localizacion ARN de nuclear
(U1, U2, U5, U2/U4 ARNpn). Figs. (b)
(Jacquier1990;Michel &cols.,1989). c) Los dominios de ARN autocatalticos de
cabeza de martillo, presentan forma de Y 57
e incluyen en su conformacin dos tallos (1 y 2), formando los brazos de la Y, adems de un tercer tallo que constituye la base. La regin cataltica de la ribozima contiene dos dominios estructurales, la secuencia consenso CUGA (nucletidos en la posicin C3A6) y una repeticin de secuencias GA; esta aparente simplicidad estructural parece permitir su funcionamiento como enzima; la ribozima tipo cabeza de martillo corta enlaces tipo fosfodister, originandofosfatoscclicos2y3yunareginhidroxlica5enunareaccinque esdependientedeMg2+(fig.c)Estetipoderibozimasincluyefundamentalmente cuatro tipos: [1] la clsica en cabeza de martillo, de aproximadamente 40 nucletidos de longitud, detectada en viroides de plantas y ARNs satlites, y recientemente en bastantes generadas sintticamente. [2] la de tipo horquilla deaproximadamente55nucletidosdelongitud,encontradaenARNsatlitede vegetales as como tambin en mltiples de ellas generadas sintticamente; la [3]ladeltade85nucletidosdelongitudquefuedetectadacomounelemento deARNenlahepatitisdeltayla[4]Neurosporaquerepresentaundominiode localizacinmitocondrial. d) El ltimo grupo de ribozimas descriptas y clasificadas hasta el momento corresponde al ARN de la ARNasa P involucrada en el procesamiento de precursoresdelARNt.
RIBOZIMAS: RESABIOS DEL MUNDO PRIMITIVO

Silvia Billi Jefe deTrabajos Prcticos- Depto. de Qumica Biolgica FCEyN - UBA El estudio de catalizadores biolgicos se intensific a mediados de 1800 cuando Louis Pasteur llam fermentos a los agentes presentes en las levaduras que convertan azcar en alcohol. En 1926 se purific la primera enzima, la "ureasa", a partir de plantas, encontrando que estaba compuesta por material proteico. Los cientos de enzimas purificadas y analizadas desde entonces resultaron ser de naturaleza proteica, por lo que se concluy que todas las enzimas eran protenas. Este dogma pareci cambiar cuando en 1982, en el laboratorio de Thomas Cech, (1) estudiando el procesamiento de ARN en el protozoo ciliado Tetrahymena thermophila observ que el corte y empalme (splice) de un intrn del pre-ARNr era autocataltico. El RNA se escinda por s mismo sin ayuda de un catalizador proteico! Paralelamente, en el laboratorio de Sidney Altman (2) se investigaban las propiedades de la enzima ribonucleasa
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que se encuentra en todos los organismos. Los sustratos de esta enzima son una serie de P, molculas precursoras de ARNt inactivo que son transformadas en ARNt funcional. La ribonucleasa P consta de una subunidad proteica y un ARN de 377 nuclotidos enlazados en una sola cadena. Al separar los componentes, la subunidad ARN fue capaz de catalizar la hidrlisis de ARNt precursor en ausencia completa de la parte proteica. Como la caracteristica prominente de estas molculas de ARN era clivar otras cadenas de ARN se les llam ribozimas. En 1989 Cech y Altman recibieron el premio Nobel por el descubrimiento de estos catalizadores biolgicos no proteicos. El descubrimiento de las ribozimas fortaleci la teora del "mundo de ARN" que intenta develar el misterio del origen de la vida. La hiptesis del "mundo de ARN" propone que la evolucin basada en la replicacin del ARN precedi a la aparicin de la sntesis proteica (3, 4, 5, 6). En algn momento de la evolucin de la vida la continuidad gentica habra sido asegurada por la replicacin del ARN, sin involucrar como catalizadores a las protenas codificadas genticamente, siendo el apareamiento de bases descubierto por Watson y Crick la clave para la replicacin (3). Las evidencias(5, 6) que sustentan esta teora estn basadas en las mltiples funciones que pueden cumplir el ARN o los ribonucletidos: 1) el ARN es capaz de almacenar informacin gentica, 2) puede servir de molde para la sntesis de cadenas complementarias de polinucletidos, 3) puede actuar como catalizador, 4) los nuclotidos del ARN actan como coenzimas en muchas reacciones biolgicas, 5) los deoxirribonucletidos precursores del ADN son sintetizados a partir de ribonuclotidos, 6) la presencia de pequeas ribonucleoprotenas ayudan en la expresin gentica y en el mantenimiento del genoma, 7) las molculas de ARN guia participan en la edicin del ARN, y 8) numerosos virus llevan como nico materal gentico ARN de cadena simple o doble. Durante la evolucin, a medida que el metabolismo celular se fue sofisticando el requerimiento de biocatalizadores con distinta especificidad hizo que las protenas, con mayor versatilidad que el ARN (20 aminocidos en comparacin con cuatro bases) asumieran el rol de biocatalizadores, mientras que el ADN presumiblemente adquiri la funcin de guardar y transmitir la informacin gentica, dada su mayor estabilidad. Los descendientes de la era dominada por el ARN habitan hoy en el mundo en forma de ribozimas presentes en organismos que van desde las bacterias al hombre. Las ribozimas aumentan sustancialmente la velocidad de reaccin (3,4,5,6). As las constantes cinticas son comparables a las de enzimas proteicas. Pueden usar cofactores como imidazol y presentar regulacin alostrica. Su estructura molecular a semejanza de los catalizadores proteicos presenta pliegues dando origen a estructuras tridimensionales que forman sitios activos como hendiduras profundas, protegidas, e inaccesibles a solventes. Mediante esta estructura terciaria se facilita la catlisis orientando los sustratos al sitio cataltico.
Fig. 1 Ribozima grupo I intrn Diagrama de cintas de la estructura terciaria. El sitio cataltico
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est formado por dos dominios P4-P6 y P3-P9. Ref (3) El 2'-OH del ARN (Fig 2) acta como nuclefilo cataltico tanto para el autoprocesamiento de intrones como para el procesamiento catalizado por "spliceosomes". Acta tambien como ligando de metales, de hecho, algunas ribozimas se comportan como metaloenzimas (7).
Fig.2 Reaccin catalizada por la ribozima hammer-head (ver ms abajo) y otras ribozimas pequeas. Ribozimas naturales Las ribozimas que estn presentes en la naturaleza son de distinto tipo, se conocen: Grupo I intrn (3,4,5,6): Remueven intrones mediante dos transesterificaciones produciendo uniones 3'-5'y un 3'-OH. El mecanismo de accin involucra el sitio de unin al nucletido, ataque nucleoflico (3'-OH de una guanosina exgena) y catlisis mediada por metales (Fig 3). Se encontraron en los ncleos de protozoos, mitocondrias de hongos, cloroplastos de algas, bacterias y sus fagos. Grupo II intrn (3,4,5): Producen el autoclivaje de intrones va dos transesterificaciones, produciendo una unin inicial 2'-5' y un 3'-OH. El mecanismo involucra ataque nucleoflico por un 2' OH de una adenosina especial dentro del intron que produce un cambio en la estructura del ARN (formacin de un lazo). Se cree que los iones Mg++ estn dentro del intrn partipando de la catlisis. Esta clase se encontr en bacterias y genes de organelas de levaduras de clulas eucariotas.
Fig 3 Reacciones catalizadas por las ribozimas: grupo I intrn (NOH: 3'-OH de una guanosina), grupo II intrn (NOH: 2'-OH de una adenosina dentro del intrn) y RNasaP
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(NOH: H2O). Ribonucleasa (Rnasa) P (3, 4, 5): Cataliza la hidrlisis sitio-especfica de precursores de ARN incluyendo ARNt, ARN-5S y la partcula de reconocimiento de ARN (SRP). Estos sustratos comparten probablemente caractersticas estructurales que permiten el reconocimiento epecfico por RnasaP posicionando los fosfatos reactivos en el sitio de unin para el ataque nucleoflico por una molcula de agua. Acta como una endoribonucleasa hidroltica que cliva el extremo 5' del ARN para producir 5'-fosfato y 3'-OH. RnasaP es un complejo ARN-protena cuya actividad cataltica en bacterias reside en el componente ARN, en humanos no es activa sin el componente proteico. Es un verdadero catalizador en el sentido que cada ribozima cataliza el clivaje de mltiples sustratos. Tiene 300 a 400 nucletidos de largo, forma dos dominios uno de los cuales tiene el sitio de reconocimiento del sustrato y el otro el sitio activo. Cabeza de martillo (hammerhead) (3, 4, 8): Es la ribozima ms pequea, consiste en un ARN de 40 nucletidos que se autocliva, contiene un motivo altamente conservado que ha sido encontrado en varios viroides y virus satlites de ARN que se autoreplican a travs de un mecanismo de crculo rodante ("rolling-circle"). Su estructura involucra tres ramas cortas I, II, y III, tiene una conformacin en `Y', las ramas estan conectadas en una secuencia altamente conservada, donde se encuentran los nucletidos esenciales para la catlisis. La rama I contiene el residuo citosina 17 que contiene la unin que se cliva. Cataliza el clivaje sitio especfico de sus propias uniones fosfodiester por un ataque nucleoflico del 2'-OH al fosfato a ser escindido. Se cree que hay iones divalentes que participan en el mantenimiento de la estructura.
Fig.4 Estructura de la ribozima cabeza de martillo. En azul se indica un ADN inhibidor de la ribozima. El sitio cataltico est en color rojo. La rama I y III en verde y la II en prpura. Ref (8) Virus de hepatitis delta (HDV) y Horquilla (Hairpin): Catalizan la misma reaccin que la ribozima tipo cabeza de martillo y son los responsables de clivar intermediarios generados durante la replicacin de HDV y de virus satlites de ARN de las plantas. "Spliceosome" (U2+U6) (3,4,5,6,7): El ncleo de las clulas eucariotas contiene numerosas copias de varios ARN de 60 a 250 nucletidos de longitud denominados ARN nucleares pequeos (snRNA), los cuales forman complejos con protenas (ribonucleoprotenas: RNP). Los snRNP U1....U6 son miembros de una subfamilia de snRNA rica en uracilo que intervienen en el procesamiento del pre-ARNm. Los snRNP U1, U2, U5 y U4-U6 se ensamblan en los sitios de corte y empalme formando un gran complejo o "spliceosome". Los U2 y U6 producen el corte de sustratos de ARN via transesterificacin. Se ensamblan con pre-ARNm y escinden los intrones (no es autoclivaje). El producto de la reaccin es un fosfotriester a diferencia de los obtenidos con otros "spliceosomes". Ribozimas sintticas
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Los cientficos han sintetizado ribozimas in vitro, (6, 8, 9) parten de secuencias de ARN seleccionadas al azar (ms de 1015), luego separan a las molculas en base a su habilidad para realizar funciones bioqumicas (unin a ligandos, catlisis), el material seleccionado es amplificado y el ciclo de seleccin y amplificacin es repetido hasta que las secuencias activas dominan el conjunto. Por ltimo se pueden introducir mutaciones para ampliar la diversidad de secuencias, incorporando de esta manera las caractersticas ms relevantes de la evolucin. Mediante esta tcnica lograron sintetizar catalizadores de ARN ms eficientes que pueden intervenir en otro tipo de reacciones, tal como formar nuclotidos a partir de un azcar y una base, o sintetizar uniones amida. Se disean ribozimas para cortar determinados ARN con fines teraputicos (6), remedando la estructura y la actividad cataltica de las ribozimas naturales conocidas. Se ha pensado que la funcin que cumplen estas ribozimas puede ser aplicada para varios problemas mdicos, como el cncer y el sida, teniendo en cuenta que si la molcula de ARN es clivada antes de llegar al ribosoma, la codificacin que encierra esa cadena nunca se expresar completamente. Bibliografa 1- Kruger, K., Grabowski, P.J., Zaug, A.J. Sands, J., Gottschling, D.E., Cech, T.R. (1982) Cell 31,147-157. 2- Guerrier-Takada, C., Gardiner, K., Mardh, T. Altman, S. (1983) Cell 35, 849-857. 3- The RNA World. Gesteland, R. F, Cech, T y Atkins J.F. Ed Cold Spring Harbor Laboratory Press. 4- Doudna, J.A. Cech, T.R. (2002), Nature 418, 222-228. 5- http://walden.mvp.net/~sklib/ribozyme.html Ribozymes: Structure, function and application. 6- http://www.aibs.org/biosciencelibrary/vol48/feb.98.html Landweber L.F., Simon P.J., Wagner, T.A. (1998) Bioscience 48, 94. 7- http://www.chembio.uoguelph.ca/educmat/chm730/k730.htm Chem*730. Proteins and Nucleic acids. Ribosomes and Ribozymes folding and function of RNA. 8- http://attila.stevens-tech.edu/chembio/rsamuel/index.html. The structure and function of the Hammer Head ribozyme. 9- http://web.mit.edu/newsoffice/tt/1995/Sep13/40700.html Nicholson E.K. Scientists produce ribozymes in study molecules evolution. 10-Bartel, D.P., Szostk J.W. (1993) Science 261, 1411-1418.
PROTENAS Mientras que los cidos nucleicos portan la informacin gentica de las clulas, la principal responsabilidad de las protenas es ejecutar las tareas dirigidas por esa informacin. Las protenas son las ms diversas de todas las macromolculas, y cada clulacontienevariosmilesdeprotenasdiferentesquerealizanunaampliavariedadde funciones. Los roles de las protenas incluyen: ser componentes estructurales de clulas y tejidos, actuando en el transporte y almacenamientodemolculaspequeas,(porej.transportedeO2 por la hemoglobina), transmitir la informacin entre las clulas 62

(por ej. hormonas proteicas) y conferir la defensa contra infecciones (por ej.,
anticuerpos).Sinembargo,lafuncinmsimportantedelasprotenasessucapacidad deactuarcomoenzimas,quecomosediscutemsadelante,catalizanlamayorpartede lasreaccionesqumicasquese desarrollanenlossistemas biolgicos.Aslasprotenas desarrollanlamayoradelasactividadesdelasclulas. Lasprotenassonpolmerosde20aminocidosdiferentes.Cadaaminocidoconsistede un carbono,(llamado carbono ) unido a un grupo carboxilo (COO), un grupo amino (NH3+),unhidrgeno(H)yunacadenalateraldistintiva. Las propiedades qumicas de las diferentes cadenas laterales de los aminocidos determinanlosrolesdecadaunodeellosenlaestructuradelasprotenas. Los aminocidos pueden ser agrupados en cuatro amplias categoras de acuerdo a las propiedades de las cadenas laterales. Diez aminocidos tienen cadenas laterales no polaresquenointeractanconelagua.Laglicinaeselaminocidomssimpleconun tomodeHidrgenocomocadenalateral.Alanina,Valina,Leucina,eIsoleucina,tienen cadenas laterales de hasta cuatro tomos de carbono, las cadenas laterales de estos aminocidos son hidrofbicas por lo que tienden a localizarse en el interior de las protenas,dondenoentranencontactoconelagua.Deigualmanera,laProlinatiene unacadenalateralhidrocarbonada,peroesnicaenelhechoquesucadenalateralest unida al nitrgeno de los grupos amino y al carbono , formando una estructura cclica.Lacadenalateraldedosaminocidos:CistenayMetionina,contienetomosde azufre.Lametioninaesmuyhidrofbica,perolacistenaporposeerungruposulfidrilo (SH)loesmenos.Comosediscutirmasadelante,elgruposulfidrilodelacistenajuega unrolmuyimportanteenlaestructuradelasprotenas,porlaposibilidaddeestablecer puentes disulfuro entre las cadenas laterales de dos residuos cistena diferentes. Finalmente,dosaminocidosnopolareslaFenilalaninayelTriptofanotienencadenas lateralesconanillosaromticosmuyhidrofbicos. Cincoaminocidostienencadenaslateralespolaresnocargadas.Estasincluyenserina, treonina y tirosina, que poseen grupos hidroxilo sobre su cadena lateral, as como asparagina y glutamina, que tiene grupos amida polares (O=CNH2). Debido a que las 63

cadenaslateralesdeestosaminocidospuedenformarpuenteshidrgenoconelagua,
estos aminocidos son hidroflicos y tienden a estar localizados en el exterior de las protenas. Losaminocidoslisina,arginina,ehistidinaposeencadenaslateralescongruposbsicos queenlaclulaseencuentrancargadospositivamente.Enconsecuencia,ellossonmuy hidroflicosyseencuentranencontactoconaguasobrelasuperficiedelasprotenas.La histidina, a pH fisiolgico, puede estar tanto sin cargar como positivamente cargada jugando un rol activo en las reacciones enzimticas que involucran un intercambio de ioneshidrgeno. Finalmente, dos aminocidos: el cido asprtico y el cido glutmico poseen cadenas lateralescidasqueterminanengruposcarboxilo.Estosaminocidosfrecuentementese denominan aspartato y glutamato. Como ocurre con los aminocidos bsicos los aminocidoscidossonmuyhidroflicosyusualmenteestnlocalizadosenlasuperficie delasprotenas. Aminocidos nopolares Alanina Cdigode tresletras Ala
Cadenalateral -CH3
Valina
Val
Leucina
Leu
Isoleucina
Ile
Metionina
Met
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Prolina
Pro
Fenilalanina
Phe
Triptfano
Trp
Glicina Cistena Aminocidos polares Serina Treonina Asparagina Glutamina Tirosina Aminocidos Bsicos Lisina
Gly Cys Cdigode tresletras Ser Thr Asn Gln Tyr Cdigode tresletras Lys -CHOH-CH3 -CH2-CO-NH2 CH2-CH2-CO-NH2 Cadenalateral -CH2-CH2-CH2-CH2 -+NH3
Cadenalateral
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Arginina
Arg
Histidina
His
Aminocidos cidos cidoasprtico cido glutmico Cdigode tresletras Asp Cadenalateral -CH2-COO-CH2-CH2-COO-
Glu
Los aminocidos se unen por medio de uniones peptdicas (Fig. 223) entre el grupo amino de un aminocido y el grupo carboxilo del segundo. Los polipptidos son cadenas lineales de aminocidos, usualmente de cientos a miles de aminocidos de longitud.
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Enlacepeptdico
Fig:223(ModificadodeBiochemistrydeBerg) Cada cadena polipeptdica tiene dos extremos distintos uno es un grupo amino (extremo amino o extremo N) y el otro un grupo carboxilo (extremo carboxilo o extremo C). Los polipptidos son sintetizados desde el extremo amino al extremo carboxiloylasecuenciadeaminocidosseescribe(porconvencin)enelmismoorden. En 1953, Frederick Sanger fue el primero en determinar la secuencia completa de aminocidosenunaprotena,lahormonainsulina.Seencontrquelainsulinaconsiste de dos cadenas polipeptdicas, unidas por puentes disulfuro entre los residuos de cistena.MsanlosexperimentosdeSangerdeterminaronquecadaprotenaconsiste de una secuencia especfica de aminocidos. Las protenas de las que se conoce la secuencia de aminocidos completa son, al presente, unas 100.000. Cada una de ellas consiste en una secuencia de aminocidos nica, determinada por el orden de los nucletidosenungen. La secuencia de aminocidos de una protena es slo el primer elemento de su estructura. Una vez que se han extendido las cadenas de aminocidos las protenas adoptan diferentes conformaciones tridimensionales que son crticas para su funcin. EstofuedemostradoporprimeravezporC.Anfinsenquiendestruydichaestructura, usando por ejemplo calor, por ruptura de las uniones no covalentes en un proceso conocido como desnaturalizacin. Luego de incubacin bajo condiciones medias, tales protenasdesnaturalizadasamenudoretornanasusconformacionesnativas,indicando queestasconformacionesestabandeterminadasporlasecuenciadeaminocidos. La estructura tridimensional de las protenas es frecuentemente determinada por cristalografaderayosX.Estatcnicapermiteestudiarelarreglodelostomosdentro delamolcula.UnhazderayosXsedirigesobrelaprotenacristalizadayelpatrnde losrayosXquepasaatravsdelcristalesdetectadosobreunfilmderayosX. 67

Laestructuradelasprotenasesusualmentedescriptaencuatroniveles.Laestructura
primariadeunaprotenaeslasecuenciadeaminocidosensucadenapolipeptdica.La estructurasecundariaeselarregloregulardelosaminocidosdentrodelasdiferentes regiones de las protenas. Linus Pauling y Robert Corey propusieron en 1951 dos estructuras muy comunes: hlices y hojas. Ambas estructuras secundarias son mantenidaspormediodepuentesHentregruposC=OyNH.Unahlicealfaseforma cuandounaregindeunacadenapolipeptdicaseenrollaalrededordesimisma,conlos gruposC=OdeunpptidoformandounauninpuenteHconelgrupoNHdeunaunin peptdica,cuatroresiduosmsabajoenlacadenapolipeptdicalineal.Encontrastelas hojasseformancuandodospartesseordenanladoaladopormediodepuentesH. Tales hojas pueden formarse entre varias hebras de polipptidos, los que pueden estarorientadostantoenformaparalelacomoantiparalelaunaconotra. Laestructuraterciaria,eselplegamientodelacadenapolipeptdicacomoconsecuencia delasinteraccionesdelascadenaslateralesdelosaminocidosubicadosendiferentes regionesdelasecuenciaprimaria.Enlamayoradelasprotenas,lascombinacionesde hlices y hojas, conectadas por lazos de cadenas polipeptdicas, se pliegan en estructurasglobularescompactasdenominadasdominiosqueconstituyenlasunidades bsicas de las estructuras terciarias. Las protenas pequeas tales como las ribonucleasas o la mioglobina poseen slo un dominio, las protenas ms grandes puedencontenervariosdominios diferentes,que frecuentementeestnasociadoscon funcionesdiferentes. Una determinante crtica de la estructura terciaria es la localizacin de aminocidos hidrofbicos en el interior de las protenas y de los aminocidos hidroflicos en la superficie,dondeinteraccionanconelagua.Enelinteriordelasprotenasplegadas,en general,seubicanlosaminocidoshidrofbicos,enarreglosdehlicesalfayhojasbeta. Estas estructuras secundarias se encuentran en el centro hidrofbico de las protenas debidoaquelospuenteshidrgenoneutralizanelcarcterpolardelosgruposC=OyNH delesqueletodelospolipptidos.Lasregionesdelazoqueconectanloselementosdela estructurasecundariaseencuentranenlasuperficiedelasprotenasplegadasdondelos componentespolaresdelasunionespeptdicasformanpuenteshidrgenoconelaguao 68

conlascadenaslateralesdeaminocidoshidroflicos.Lasinteraccionesentrelascadenas
lateralesdelosaminocidospolares(puentesHypuentesinicos)sobrelasuperficiede las protenas son tambin importantes determinantes de la estructura terciaria de las protenas. Adems, los puentes disulfuro covalentes entre residuos de cistena estabilizan las estructuras plegadas de muchas protenas de la superficie celular o de protenasdesecrecin. El cuarto nivel de la estructura proteica, la estructura cuaternaria, consiste en la interaccinde diferentes cadenaspolipeptdicas, en protenas compuestas por msde un polipptido. Por ejemplo la hemoglobina, est compuesta de cuatro cadenas polipeptdicas que se mantienen juntas por los mismos tipos de interacciones que mantienenlaestructuraterciaria. Las distintas caractersticas qumicas de los 20 aminocidos diferentes llevan a una considerablevariacinenlaconformacintridimensionaldelasprotenasplegadas.En consecuencia,lasprotenasconstituyenungrupodemacromolculasextremadamente complejoydiverso,queconcuerdaconlaampliavariedaddetareasqueellasrealizanen labiologacelular. PROTENASDEMEMBRANA ESTETEMASEDESCRIBIRESPECFICAMENTEENELCPITULO3 Enzimas:ConceptosBsicosyCintica Las enzimas, sistemas catalizadores biolgicos, son dispositivos moleculares que determinan los patrones de transformaciones qumicas. Tambin son los responsables de mediar la transformacin de una forma de energa en otra. Las caractersticas ms importantesde las enzimas son supoder cataltico y su especificidad.Lacatlisis tiene lugarenunsitioparticulardelenzima, denominadositioactivo.Lamayorpartedelas enzimasconocidassonprotenas.Sinembargo,lasprotenasnotienenelmonopoliode la catlisis; el descubrimiento de la actividad cataltica activa de las molculas de ARN proveelaevidenciaqueelARNtieneunaactividadbiocatalticatemprana. 69

Lasprotenas,comounaclasedemacromolculassoncatalizadoresaltamenteefectivos
paraunaenormediversidaddereaccionesqumicasdebidoasucapacidadparaunirse especficamente a un muy amplio rango de molculas. Utilizando un amplio rango de fuerzas intermoleculares las enzimas mantienen substratos unidos en una ptima orientacin, el preludio que produce la ruptura de uniones qumicas. Ellos catalizan reacciones estabilizando estados de transicin, las especies de ms alta energa en un patrn de reaccin. Estabilizando selectivamente un estado de transicin, una enzima determinacualdevariaspotencialmenteposiblesreaccionestienenlugarrealmente. LasEnzimassonPoderososCatalizadoresaltamenteespecficos LasEnzimasaceleranlasreaccionesenfactoresquepuedenllegarhastaunmillnoms veces.Enefectolamayoradelasreaccionesensistemasbiolgicosnotendranlugara tasas perceptibles en ausencia de las enzimas. An una reaccin tan simple como la hidratacindedixidodecarbonoescatalizadaporunaenzimadenominada,anhidrasa carbnica.LatransferenciadeCO2desdelostejidosalasangreyluegoalairealveolar seraprcticamentenulaenausenciadeestaenzima.Enefecto,laanhidrasacarbnica es una de las enzimas ms rpidas conocidas. Cada molcula de esta enzima puede hidratar 106 molculas de CO2 por segundo. Esta reaccin catalizada es 107 veces ms rpida que la no catalizada. Las enzimas son altamente especficas tanto en las reacciones que catalizan, como en la eleccin de los reactantes, que se denominan substratos. Una enzima usualmente cataliza una reaccin qumica o un conjunto de reaccionesestrechamenterelacionadas.Reaccioneslateralesquelleven a la formacin deproductosdedesechosonrarasenlasreaccionesenzimticasencontrasteconlasno catalizadas.
Consideremos ahora las enzimas proteolticas como ejemplo. In vivo, estas enzimas catalizanlaprotelisis,estoeslahidrlisisdeunauninpeptdica.
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Lamayoradelasenzimastambincatalizanunareaccindiferenteperorelacionadain vitro denominada la hidrlisis de una unin tipo ster. Tales reacciones son ms fcilmente monitoreables que la protelisis y son utilizadas en las investigaciones de estasenzimas.
Lasenzimasproteolticasdifierenmarcadamenteensugradientedelaespecificidadpor el substrato. Por ejemplo, la subtilisina, que se encuentra en ciertas bacterias es muy indiscriminada: puede clivar cualquier unin peptdica con muy poca identidad de las cadenas laterales adyacentes. Por otro lado, la tripsina, una enzima digestiva, es muy especficaycatalizaelclivajedelasunionespeptdicassloenelladocarboxlicodelos residuos lisina y arginina (Figura). La trombina, una enzima que participa en la coagulacin de la sangre, cataliza la hidrlisis de las uniones ArgGly en secuencias particularessolamente,esanmsespecficaquelatripsina. La ADN polimerasa I, es una enzima que agrega nucletidos a una hebra de ADN que estsiendosintetizadaenlasecuenciadeterminadaporlasecuenciadenucletidosde otra hebra de ADN que sirve como patrn. La ADN polimerasa I es remarcablemente precisaportandolasinstruccionesdadasporelADNpatrn.Estasenzimasinsertanlos nucletidosenunanuevahebradeADNerrneamentemenosdeunaenunmillnde veces. LAESPECIFICIDADDEUNAENZIMASEDEBEALAPRECISAINTERACCINDELSUBSTRATOCONLAENZIMA.ESTA PRECISINESELRESULTADODELAINTRINCADAESTRUCTURATRIDIMENSIONALDELAPROTENAENZIMTICA. MuchasEnzimasRequierenCofactoresparasuActividad La actividad cataltica de muchas enzimas depende de la presencia de pequeas molculasdenominadascofactores,aunqueelprecisorolvaraconloscofactoresylas enzimas. Tal enzima sin su cofactor es referida como una apoenzima, la enzima 71

completa,catalticamenteactivasedenominaholoenzima.
Apoenzima+cofactor=holoenzima Los cofactores pueden ser subdivididos en dos grandes grupos: metales y molculas orgnicaspequeas(Tabla1).Laenzimaanhidrasacarbnica,porejemplo,requiereZn2+ para su actividad. Glicgeno fosforilasa, que moviliza glicgeno para obtener energa, requierelapequeamolculaorgnicapiridoxalfosfato(PLP). Los cofactores que son pequeas molculas orgnicas, se denominan coenzimas. A menudo derivados de vitaminas, las coenzimas pueden estar tanto firme como relajadamenteunidosalaenzima.Silauninesfirme,sedenominangruposprostticos. Lascoenzimasasociadasmsrelajadamentesonmssemejantesacosubstratosdebido aqueellosseunenaysonliberadosdelaenzimacomolossubstratosylosproductos.El uso de la misma coenzima por una variedad de enzimas y su fuente de vitaminas mantienen las coenzimas separadas de su substrato normal. Las enzimas que usan la mismacoenzimausanusualmentemecanismossimilares. Tabla1.CofactoresEnzimticos Cofactor Coenzima Tiaminapirofosfato Flavinaadeninanucleotido Nicotinamida dinucletido Piridoxalfosfato CoenzimaA(CoA) Biotina 5 Desoxiadenosilcobalamina Tetrahidrofolato Metal Zn Zn Mg2+ 72
2+ 2+
Enzima Piruvatodeshidrogenasa Monoaminaoxidasa adenina Lactatodeshidrogenasa Glicogenofosforilasa AcetilCoAcarboxilasa Piruvatocarboxilasa Metilmalonilmutase Thimidilatosintetasa AnhidrasaCarbonica Carboxipeptidasa EcoRV
Mg2+ Ni2+ Mo Se Mn K
+ 2+
Hexocinasa Ureasa Nitratoreductasa Glutationperoxidasa Superoxidodismutasa Propionil carboxilasa CoA
Lasenzimaspuedentransformarenergadeunaformaaotra En muchas reacciones bioqumicas, la energa de los reactantes es convertida con alta eficienciaenunaformadiferente.Porejemploenlafotosntesis,laenergalumnicaes convertida en energa qumica a travs de un gradiente inico. En las mitocondrias la energaqumicacontenidasenmolculaspequeasderivadasdelalimentoesconvertida primero en energa libre de un gradiente inico y luego en una diferente forma de energa, la energa libre de la adenosina trifosfato. Las enzimas pueden luego usar la energadelosenlacesdelATPdemuchasformas.Porejemplo,lamiosinaconviertela energa de ATP en energa mecnica de contraccin muscular. Las bombas en las membranas de clulas y organelas pueden pensarse como enzimas que en lugar de alterar qumicamente los substratos los moviliza creando gradientes elctricos o qumicos usando la energa del ATP para transportar iones o molculas (Figura 2). Los mecanismos moleculares de estas enzimas transductoras de energa estn siendo desentraados.
Lasenzimassonclasificadasenbasealostiposdereaccionesquecatalizan Muchasenzimastienennombrescomunesqueproveenpocainformacinacercadelas reacciones que ellas catalizan. Por ejemplo, una enzima proteoltica secretada por el pncreassedenominatripsina,sinembargo,lamayoradelasenzimassedenominande acuerdoasussubstratosylareaccinquecatalizan,conelagregadodelsubfijoasa. As,unaATPasaesunaenzimaquehidrolizaATPmientrasquelaATPsintetasaesuna enzimaquesintetizaATP. Para darle alguna consistencia a la clasificacin de las enzimas, en 1964 la Unin 73

Internacional de Bioqumica estableci una Comisin de Enzimas para desarrollar una
nomenclatura para las enzimas. Las reacciones fueron subdivididas en seis grupos mayoresnumeradosdel1al6(tabla3).Estosgruposfueronsubdivididoshastaqueun nmero de cuatro dgitos precedidos por las letras EC (por Comisin de Enzimas) que permitenidentificartodaslasenzimas. Considrese como ejemplo la nucleosido monofosfato (NMP) quinasa una enzima que catalizalasiguientereaccin:
La NMP quinasa transfiere un grupo fosforilo del grupo ATP a NMP para formar un nucleosidodifosfato(NDP)yADP.Consecuentemente,esunatransferasa,ounmiembro delgrupo2.Muchosgruposademsdelgrupofosforilo,talescomoazcaresyunidades decarbonopuedesertransferido.Lastransferasasquecambianungrupofosforiloson designadascomo2.7.Variosgruposfuncionalespuedenaceptarelgrupofosforilo.Siun fosfato es el aceptor, la transferasa es designada como 2.7.4. El nmero final designa msprecisamentealaceptor.ElNMPquinasa,unnucleosidomonofosfatoeselaceptor, y la designacin de la enzima es EC 2.7.4.4. A pesar que los nombres comunes son usadosrutinariamente,elnmerodeclasificacinesusadocuandolaidentidadprecisa delaenzimapuedeserambigua.
Laenergalibreesunafuncintermodinmicatilparacomprenderalasenzimas Paracomprendercompletamentecmotrabajanlasenzimasesnecesarioconsiderarlas dospropiedadestermodinmicasdelareaccin.(1)ladiferenciaenlaenergalibre(DG) entrelosproductosylosreactivosy(2)laenergarequeridaparainiciarlaconversinde reactivos en productos. Los primeros determinan si la reaccin ser espontnea, mientrasquelaltimadeterminalatasaalaqueseproducirlareaccin.Lasenzimas afectanslolaltimadeestas.Primeroentoncesconsideraremoslatermodinmicade lasreaccionesyluegolastasasdelasreacciones.
Loscambiosenlaenergalibreproveeninformacinacercadelaespontaneidaddela reaccinperonodesutasa 74

Elcambioenlaenergalibredeunareaccin(G)noshabladesiestapuedeonoocurrir
espontneamente. 1.UnareaccinpuedeocurrirespontneamenteslosielGesnegativo.Talreaccin decimosqueesexergnica. 2. Un sistema esta en equilibrio y no tiene lugar un cambio neto si G es cero. 3.UnareaccinnopuedeocurrirespontneamentesilaGespositiva.Siestoocurrela reaccinrequiereunaportedeenergalibreparaquetengalugardichareaccin.Estas reaccionessedenominanendergnicas. Debenasimismoenfatizarsedospuntosadicionales.ElGdeunareaccinslodepende de la energa libre de los productos (el estado final) menos la energa libre de los reactivos (el estadio inicial). La G de una reaccin es independiente del patrn (o mecanismo molecular) de la transformacin. El mecanismo de una reaccin no tiene efecto sobre la G. Por ejemplo, la G para la oxidacin de glucosa a CO2 y H2O es la misma si ocurre por combustin in vitro o por una serie de pasos catalizados por enzimasenunaclula.LaGnoproveeinformacinacercadelatasadeunareaccin. Una G negativa indica que una reaccin puede ocurrir espontneamente, pero no significaquevaaprocederaunatasaperceptible.Comoserdiscutidoprontamente,la tasa de una reaccin depende de la energa libre de activacin (Go), que no est relacionadaalaGdelareaccin.
Los cambios de la energa libre estndar estn relacionados a la constante de equilibrio Comoparatodareaccin,debemossercapacesdedeterminarlaGparaunareaccin catalizada por una enzima para conocer si la reaccin es espontnea o requiere un aporte de energa. Para determinar este importante parmetro termodinmico, debe tenerseencuentatantolanaturalezadelosreactivoscomodelosproductosascomo susconcentraciones. Considreselareaccin:
75
LaGdeestareaccinestadadapor:
En la cual G son los cambios en la energa libre estndar, R es la constante de los gases,Teslatemperaturaabsoluta,y[A],[B],[C],y[D]sonlasconcentracionesmolares (msprecisamente,lasactividades)delosreactivos.Gsonloscambiosdelaenerga libre para esta reaccin bajo condiciones estndar que es, cuando cada uno de los reactivos A, B, C y D estn presentes a una concentracin de 1,0 M (para un gas, el estadoestndaresusualmente1atmsfera).As,laGdeunareaccindependedela naturalezadelosreactivos(expresadoenelterminoGdelaecuacin1)ysobresus concentraciones(expresadoseneltrminologartmicodelaecuacin1). Unidadesdeenerga Una calora (cal) es equivalente a la cantidad de calor requerido para incrementar la temperatura de 1 gramo deaguade14.5Ca15.5C. Unakilocalora(kcal)esiguala1000cal. Un joule (J) es la cantidad de energa necesaria para aplicar una fuerza de 1newton a una distancia de 1 metro. Akilojoule(kJ)esiguala1000J. 1kcal=4.184kJ Para simplificar los clculos de energa libre se ha adoptado la convencin para las reaciones bioqumicas. El estado estndar est definido como si el pH fuese 7. Consecuentemente cuando el H es un reactivo si actividad tiene el valor 1 (correspondindose a un pH 7) en la ecuacin 1 y 4. La actividad del agua tambin es considerada en esa ecuacin 1. El cambio de energa libre a pH 7 denotado por el smboloGserusadoenestecaptulo.Lakilocalorayloskilojoules(kJ)sernusados 76

comounidadesdeenerga.Unakilocaloraesequivalentea4,184kilojoules.
Larelacin entrelaenergalibreestndar ylaconstantedeequilibriode una reaccin puedenserderivados.Estaecuacinesimportantedebidoaqueexhibelaenergticade la reaccin entre productos y reactantes en trminos de su concentracin. En condicionesdeequilibrio,G=0.Luegolaecuacin1pasaa:
Yas:
Laconstantedeequilibrioencondicionesestndar,Keq,sedefinecomo:
Substituyendolaecuacin4enecuacin3da:
quepuedeserreagrupadadando:
SubstituyendoR=1.98710 kcalmol deg yT=298 K(correspondientea25C)da: Donde: G es aqu expresado en kilocaloras por mol debido a la eleccin de las unidades para R en la ecuacin 7. As, la energa libre estndar y la constante de equilibriodeunareaccinestnrelacionadasporunaexpresinsimple.Porejemplouna 77
3 1 1 o

constante de equilibrio de 10 veces un cambio de energa libre estndar de 1.36 kcal
mol1(5.69kJmol1)a25C.Ntesequeporcada10veceselcambioenlaconstantede equilibrioenlaconstantedeequilibrio,elGocambia1.36kcalmol1(5.69kJmol1). Como ejemplo, calculemos G y la G para la isomerizacin de la dihidroxiacetona fosfato(DHAP)agliceraldehdo3fosfato(GAP).Estareaccintienelugarenlagluclisis. Alequilibrio,larelacindeGAPaDHAPes0.0475a25C(298K)ypH7.Porlotanto,Keq = 0.0475. Los cambios de energa libre estndar para esta reaccin es luego calculado desdelaecuacin6:
Bajo estas condiciones la reaccin es endergnica, La DHAP no podr ser espontneamenteconvertidaaGAP. Calculemos ahora DG para esta reaccin cuando la concentracin inicial de DHAP es 2x104MylaconcentracininicialdeGAPes3x106M.Substituyendoestosvaloresenla ecuacin1da:
78
Estos valores negativos para el G indican que la isomerizacin de DHAP a GAP es exergnicay puede ocurrirespontneamentecuandoestasespeciesestnpresentesa lasconcentracionesanteriores.NoteGparaestasreaccionessonnegativas. Lasenzimasalteranslolatasadereaccinynoelequilibriodelareaccin Debido que las enzimas son soberbios catalizadores uno podra estar tentado a adscribirle poderes que ellas no tienen. Una enzima no puede alterar las leyes de la termodinmica y consecuentemente no pueden alterar el equilibrio qumico de una reaccin qumica. Esta inestabilidad significa que una enzima acelera tanto las reacciones directas como las reversas precisamente debido a los mismos factores. Considerando la interconversin deA a B. Supngase que en ausencia dela enzima la constantedelatasadirecta(kF)es104s1y;mientrasquelatasareversaes(kR)esde106 s1.LaconstantedeequilibrioKvienedadaporlarelacindeestastasasconstantes:
LaconcentracindeequilibriodeBes100vecesladeA,tantolaenzimaestpresenteo no.Sinembargopuedetomaruntiempoconsiderableparallegaraesteequilibriosinla enzima. Las enzimasaceleranel alcance del estado de equilibriopero no cambian su posicin. La posicin de equilibrio slo es una funcin de la diferencia de la energa libreentrereactivosyproductos. Lasenzimasaceleranlasreaccionesfacilitandolaformacindelestadodetransicin. Laenergalibreentrelosreactivosyproductosaccountsporelequilibriodelareaccin, pero las enzimas aceleran cuan rpidamente este equilibrio es alcanzado. Cmo se puede explicar el aumento de la tasa en trminos termodinmicos? Para hacerlo 79

nosotrostenemosque considerarno elpuntofinal delareaccin,sinolavaentrelos
puntosfinales. Una reaccin qumica del substrato S a producto P pasa a travs de un estado de transicin S# que tiene una ms alta energa libre que la que tienen tanto S o P. El smbolo denota una propiedad termodinmica del estado de transicin. El estado de transicineselquemsraramenteocupanlasespeciesenlareaccinpuesesunoque posee la ms alta energa libre. La diferencia en la energa libre entre el estado de transicinyelsubstratosellamalaenergalibredeactivacindeGibbsosimplementela energadeactivacinsimbolizadoporG (Figura8.3).
Figura 3. Las enzimas Disminuyen la Energa de Activacin. Las enzimas aceleran las reaccionespordisminucinG,delaenergalibredelaactivacin. DebenotarsequelaenergadeactivacinoG noentraenelclculofinaldelaGde la reaccin pues el aporte de energa requerido para llegar al estado de transicin retorna cuando el estado de transicin forma el producto. La barrera de la energa de activacinsugiereninmediatamentecomolasenzimasaumentanlatasadelareaccin sin alterar G de la reaccin: la funcin de las enzimas disminuyen la energa de activacin, o en otras palabras, las enzimas facilitan la formacin del estado de transicin. Una forma de comprender como trabajan las enzimas para realizar esta facilitacin es asumirqueelestadodetransicin(S)yelsubstrato(S)estnenequilibrio. enlacualK eslaconstanteequilibrioporlaformacindeSyeslatasadeformacin delproductoS# LatasadelareaccinesproporcionalalaconcentracindeS 80
Debido a que slo S puede ser convertido en producto. La concentracin de S est luegorelacionadaaladiferenciadelaenergalibreentreSyS,debidoaqueestasdos especiesqumicasqueseasumeestnenequilibrio;lamayordiferenciaentreestosdos estadoselmenorlacantidaddeS. DebidoaquelareaccinesproporcionalalaconcentracindeS,ylaconcentracinde SdependedeG,latasadereaccinVdependedeG. Especficamente:
EnestaecuacinkeslaconstantedeBolzmannsyheslaconstantedePlanck.Elvalor dekT/ha25oCes6,2x1012s1.Suponemosquelaenergalibredeactivacinesde6,82 kcal/mol1 (28,53kJ mol1) la relacin [S][S] es luego 105]. Si asumimos simplemente porobradivinaque[S]=1M,luegolatasadelareaccinVes6,3x107s1.SiGfue disminuidoa1.36kcalmol1(5.69kJmol1),larelacin[S]/[S]esluego104ylatasade reaccindeberaser6.2108s1 comomuestraenlatabla8.4unadisminucinde0.36 kcal mol1 en G produce una V diez veces mayor. Una relativamente pequea disminucin en G (20% en esta reaccin particular) resulta en un mucho mayor incrementoenV: "Pienso que las enzimas son molculas que,
estructuralmente complementan a los complejos de activacin que catalizan, esto es, a la configuracin que intermediaria entre las substancias reactantes y los productos de la reaccin catalizados por estos procesos. La atraccin de las molculas enzimticas por el complejo activadopodraasllevaradisminuirensuenergaydeesta forma, a una disminucin en la energa de activacin de la reaccinyaunincrementoenlatasadelareaccin". LinusPauling Nature161(1948):707 As,puedeobservarsequelaclavedecmolasenzimasoperan:lasenzimasaceleranlas reacciones por disminucin del G. La combinacin del substrato y la enzima crea un nuevopatrndereaccincuyoestadodetransicinesmenorqueladelareaccinen ausencia de la enzima. La disminucin de la energa de activacin significa que ms molculas tienen la energa para llegar al estado de transicin. La disminucin de la 81

barreradeactivacinesanlogaaladisminucindelaalturaenunabarradesalto,as masatletasserncapacesdepasarla.Laesenciadelacatlisisessuligazonalestadode transicin.
La formacin de un complejo EnzimaSubstrato es el primer paso en la catlisis enzimtica Mucho del poder cataltico de las enzimas proviene de su capacidad para mantener substratosjuntosyenorientacionesfavorablesparapromoverlaformacindeestados detransicinencomplejosenzimasubstrato(ES).Lossubstratosestnunidosaregiones especficasdelaenzimadenominadaselsitioactivo.Laprincipalcaractersticaqueleda laespecificidadcatalticaalasenzimas,dependeenpartedelaespecificidaddesuunin alsubstrato. Cualeslaevidenciaparalaexistenciadeuncomplejoenzimasubstrato? 1.Laprimeraclavefuelaobservacinque,aunaconcentracinconstantedelaenzima, la tasa de la reaccin se incrementa conforme lo hace la concentracin del substrato hastaquesealcanzaunavelocidadmxima(Figura8.4).Encontraste,lasreaccionesno catalizadasnomuestranesteefectodesaturacin.Elhechoqueunareaccincatalizada tiene una velocidad mxima sugiriendo la formacin de una cantidad discreta del complejo ES. A una tasa suficientemente alta concentracin del substrato, todos los sitioscatalticosestncompletosyaslatasadereaccinnopuedeincrementar.Aunque indirecta,estaeslaevidenciamsgeneraldelaexistenciadecomplejosES.
Figura 8.4. Velocidad de la Reaccin Versus Concentracin del Substrato en una Reaccin Catalizada por Enzimas. Una reaccin catalizada por enzimas llega a una velocidadmxima. 2.LacristalografaderayosXhaprovistodeimgenesdealtaresolucindesubstratosy anlogosdesubstratosunidosalsitioactivodemuchasenzimas.Losestudiosderayos X,llevadosacaboabajastemperaturas(paradisminuirlareaccin)proveenimgenes querevelanvisionesdecomplejosenzimasubstratoysuposteriorreaccin.Unanueva tcnica,lacristalografaderesolucintemporalserealizacocristalizandounanlogode substrato fotolbil con la enzima. El anlogo del substrato puede ser convertido a un 82

substratoluz,ylaimagendelcomplejoenzimasubstratoseobtienenenunafraccin desegundoporelbarridodelcristalconunsincrotrnderayosXpolicromticos.
Figura 8. 5. Estructura de un Complejo EnzimaSubstrato. (Izquierda) la enzima citocromo P450 es ilustrada uniendo a su substrato camphor. (Derecha) En el sitio activo,elsubstratoestarodeadoporresiduosdelaenzima.Notetambinlapresencia deuncofactorheme. 3. La espectroscopa caracterstica de muchas enzimas y substratos cambia en la formacin de un complejo ES. Estos cambios son particularmente crticos si la enzima contieneungrupoprostticocoloreado.Latriptofanosintetasaunaenzimabacteriana que contiene un grupo prosttico piridoxal fosfato (PLP). La adicin subsecuente de indol,elsegundosubstrato,reduceestafluorescenciaaunnivelanmenorqueaquella delaenzimasola.Aslaespectroscopadefluorescenciaaunnivelmenorqueeldela enzimasola,proveeunabellailustracin.staenzimacatalizalasntesisdeLtriptofano a partir de la Lserina y derivados de indol. Otra tcnica espectroscpica, tal como la resonancia magntica nuclear y la resonancia electrnica de espn tambin son altamenteinformativasacercadeestainteraccindeES.
83
Figura 8.6. Cambios en la espectroscopa caracterstica con la formacin de un complejoenzimasubstrato.Laintensidaddelafluorescenciadelgrupopiridoxalfosfato alsitioactivodelatriptofanosintetasacambiaconlaadicindelossubstratosserinae indol. Lossitiosactivosdelasenzimastienenalgunascaractersticascomunes Elsitioactivodeunaenzimaeslareginqueunelossubstratos(oelcofactor,siesque existe alguno). Tambin contiene los residuos que participan directamente en la formacin y la ruptura de las uniones. Estos residuos se denominan los grupos catalticos.Enesencia,lainteraccindelaenzimayelsubstratoalsitioactivopromueve laformacindelestadodetransicin.Lossitiosactivossonlaregindelaenzimaque directamentedisminuyelaG# delareaccin,resultandoenelaumentocaracterstico de la tasa de accin enzimtica. Aunque la enzima difiere ampliamente en estructura, especificidad y modo de catlisis, pueden puntualizarse varias generalizaciones concernientesasussitiosactivos. 1.Elsitioactivoesunahendiduratridimensionalformadaporgruposqueprovienende diferentes partes de la secuencia de la protena. En efecto los residuos alejados en la secuencia pueden interactuar ms fuertemente que los residuos adyacentes en la secuenciadeaminocidos.Enlalisozima,unaenzimaquedegradalasparedescelulares dealgunasbacterias,losgruposimportantesenelsitioactivoson35,52,62,63,101,y 108enlasecuenciade129aminocidos(Figura8.7)
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Figura8.7.Lossitiosactivospuedenincluirresiduosdistantes.(A)diagramadecintas delaenzimalisozimaconvarioscomponentesdelsitioactivosemuestranencolor.(B) Representacinesquemticadelaestructuraprimariadelalisozimamostrandoqueel sitio activo est conformado por residuos que provienen de diferentes partes de la cadenapolipeptdica. 2. El sitio activo ocupa slo una pequea parte del volumen total de una enzima. La mayora de los residuos de aminocidos en una enzima no estn en contacto con el substrato.Estoaumentalacuestindeporqulasenzimassonmolculastangrandes? Prcticamentetodaslasenzimasposeenmsde100residuosdeaminocidosloqueles daunamasasuperiora10kdyundimetrodemsde25.Losaminocidosextra actan como andamios creando el sitio activo tridimensional que estn alejados en la estructuraprimaria.Losaminocidoscercanosenlaestructuraprimariaamenudoestn estricamente impedidos para adoptar las relaciones estructurales necesarias para formar los sitios activos. En muchas protenas los aminocidos remanentes tambin contribuyen a los sitios regulatorios, los sitios de interaccin con otras protenas, o canalesparallevaralossubstratosalsitioactivo. 3.Lossitiosactivossonhendiduras,surcosopliegues.Entodaslasenzimasdeestructura conocida,lasmolculasdesubstratosseunenaunsurcoopliegue.Elaguausualmente nopuedeingresarsalvoqueseapartedelosreactivos.Elcarcternopolardelamayora de los surcos aumenta la afinidad de la unin del substrato as como la catlisis. No obstante, los pliegues pueden tambin contener residuos polares adquiriendo propiedades especiales esenciales para la unin al substrato o a la catlisis. En las posicionesinternasdeestosresiduospolares,hayexcepcionesbiolgicamentecruciales alareglageneralquelosresiduospolaresestnexpuestosalagua. 4.Lossubstratosseunenalasenzimaspormltiplesatraccionesdbiles.Loscomplejos ES usualmente tienen constantes de equilibrio cuyo rango va de 102 a 108 M, correspondiendoalaenergalibredelainteraccinquevandesdecercade3a12kcal mol1(desde13a50kJmol1)LasinteraccionesnocovalentesenloscomplejosESson muchomasdbilesquelasinteraccionescovalentesquetienenenergasentre50y110 85

kcal mol1 (entre 210 y 460 kJ mol1). Las uniones electrostticas, las uniones puente hidrgeno, las fuerzas de van de Waals y las interacciones hidrofbicas median las interacciones reversibles de biomolculas. Las fuerzas de van der Waals se tornan significativas en la unin slo cuando numerosos tomos de los substratos simultneamente quedan prximos a muchos tomos de las enzimas. De all que las enzimas y los substratos tienen formas complementarias. El carcter direccional de unioneshidrgenoentrelasenzimasysubstratoamenudoafuerzanunaltogradode especificidad, como se observa en la enzima degradante de ARN: ribonucleasa (Figura 8.8).
Figura 8.8. Puentes hidrgeno entre una enzima y un substrato. La enzyma ribonucleasaformapuenteshidrgenoconlauridinadelsubstrato.[F.M.Richards,H. W.Wyckoff,andN.Allewel.InTheNeurosciences:SecondStudyProgram,F.O.Schmidt, Ed.(RockefellerUniversityPress,1970),p.970.]. 5.Laespecificidaddelaunindependedelprecisoarreglodetomosenunsitioactivo. Debidoaquelaenzimayelsubstratointeractanpormediodefuerzasdecortorango, que requieren de contactos cercanos, un substrato debe coincidir en cuanto a forma paraunirseenelsitiod.LaanalogadeEmilFischerdelallaveylacerraduraexpresada en1890haprobadoseraltamenteestimulanteyfructfera.Sinembargo,ahorasesabe que la forma del sitio activo puede ser marcadamente modificando por la unin al substrato,comohasidopostuladoporDanielE.KoshandJr.En1958.Elsitioactivode algunas enzimas asumen que una forma que es complementaria a la del estado de transicinsolodespusqueelsubstratoestunido.Esteprocesosedenominadeencaje
inducido. ElmodelodeMichaelisMentendacuentadelaspropiedadescinticasdedemuchas enzimas 86

funcin primaria de una enzima es aumentar la tasa de las reacciones as que ellas La soncompatiblesconlasnecesidadesdelorganismo.Paracomprendercmofuncionan lasenzimassenecesitaunadescripcincinticadesuactividad.Paralamayoradelas enzimas la tasa de catlisis Vo es definida como el nmero de moles de producto formadoporsegundo,stevaraconlaconcentracindesubstrato[S]enlaformaque se muestra en al figura 8.11. La tasa de catlisis aumenta linealmente con la concentracin del substrato. Para poder interpretar este grfico es necesario comprender como es generada. Considerando una enzima que cataliza el S a P por el siguientepatrn:
Figura 8.11. Cintica de MichaelisMenten. Una grfica de la velocidad de la reaccin (V0)comofunccindelaconcentracindelsubstrato[S]deunaenzimaqueserigepor lacinticadeMichaelisMentenmostrandoquelamximavelocidad(Vmax)seaproxima asimtticamente. La constante de Michaelis (KM) es la concentracin del substrato produciendounavelocidaddeVmax/2. Lacantidad de producto formado viene determinadacomo funcin deltiempo de una seriedeconcentracionesdelsubstrato(Figura8.12)Comoesdableesperarencadacaso lacantidaddeproductoformadoincrementaconeltiempo,aunqueeventualmenteun tiempoisreachedcundonohaycambiosnetosenlaconcentracindeSoP.Laenzima an convierte activamente substrato en productos y viceversa pero la reaccin de equilibrio ha sido attained. La figura 8.13 ilustra los cambios en la concentracin observados en todas las reacciones participante con el tiempo hasta que se llega al equilibrio.
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Figura8.13.Cambiosenlaconcentracindelareaccinparticipantesdeunareaccin catalizada por una enzima con el tiempo. Cambios de concentracin bajo (A) condicionesdeequilibrio,y(B)condicionesdepreequilibrio. Las cinticas enzimticas son mas fcilmente aproximadas si podemos ignorar la reaccin reversa. Definiendo V0 como la tasa de incremento en el producto con el tiempo cuando [P]es bajo;estoes,atiemposcercanosacero(V0)(Figura8.13B).As porelgrficodelafigura8.11,V0esdeterminadoparacadaconcentracindelsubstrato pormedicindelatasadelaformacindelproductoatiempostempranosantesdeque seacumuleP(verFigura8.12). Comenzandoconelexamendelaactividadcinticaconlagrficamostradaenlagrfica 8.11.Aunaconcentracinfijadadelasenzimas,V0escasilinealmenteproporcionala[S] es pequea pero parece independizarse de [S] cuando [S] es grande. En 1913, Leonor MichaelisyMaudMentempropusieronunmodelosimpleparadarcuentadelacintica. LacaractersticacrticadeensutratamientoesqueenuncomplejoESespecficoesun intermediarionecesariodelacatlisis.Elmodelopropuestomssimplequedacuenta delaspropiedadescinticasdemuchasenzimases:
UnaenzimaEcombinadaconelsubstratoSparaformaruncomplejoES,conunatasa constantek1.ElcomplejoEStienedosposiblessalidas.PuededisociarseenEySconuna tasaconstantek1,opuedeprocederaformarunproductoP,conunatasaconstantek2. Nuevamente,sepuedeasumirquecasiningnproductoreviertealsubstratoinicial,una condicinquemantieneelestadoinicialdeunareaccinantesdequelaconcentracin delproductoseaapreciable. Si se requiere una expresin que relacione la tasa de catlisis a la concentracin del substratoylaenzimaylatasadelospasosindividuales.Elpuntodepartidainicialesque latasacatalticaesigualalproductodelaconcentracindelcomplejoESyk2 Ahora nosotros necesitamos expresar [ES] en trminos de cantidades conocidos. Las tasasdeformacinydestruccindeloscomplejosdeESvienendadospor: 88
Tosimplifymatters,wewillworkunderthesteadystateassumption.Inasteadystate, the concentrations of intermediates, in this case [ES], stay the same even if the concentrations of starting materials and products are changing. This occurs when the ratesofformationandbreakdownoftheEScomplexareequal.Settingtherighthand sidesofequations11and12equalgives Enmateriadesimplificacin,sepuedetrabajarbajolaasuncindelestadodeequilibrio, las concentraciones de intermediarios, en este caso [ES], stay the same an si la concentracindelosmaterialesdepartidaylosproductossoncambiantes.Estoocurre cuandolatasadeformacinylarupturadelcomplejodeESsoniguales. Reemplazdoselostrminosdelasecuaciones11y12: Porrearreglodelaecuacin13,seobtiene: Ecuacin 14 puede ser simplificado definiendo una nueva constante, KM, llamado la constantedeMichaelis:
Note que la KM tiene las unidades de concentracin. La KM es una importante caracterstica de interacciones enzimasubstrato es independiente de las concentracionesdesubstratoyenzimas. Insertandolaecuacin15enlaecuacin14yresolviendopor[ES]produce
Examinemosahoraelnumeradordelaecuacin16.Laconcentrcindelsubstrato[S]no combinadoesprcticamentecercanamenteigualalaconcentracintotaldelsubstrato. Laconcentracindelaenzimanocombinada[E]esigualalaconcentracintotaldela enzima[E]TmenoslaconcentracindelcomplejoES Substituyendoestaexpresinpor[E]enlaecuacin16da: 89
Resolviendolaecuacin18por[ES]da
Substituyendoestaexpresinpor[ES]enlaecuacin10,obtenemos
Lamaximatasa,Vmax,seobtienecuandolossitioscatalticosenlaenzimasesaturacon lossubstratos estoes,cuando[ES]=[E]T.as,
Substituyendolaecuacin22enlaecuacin21produciendolaecuacindeMichaelis Menten:
Esta ecuacin da cuenta de los datos cinticos dados en la Figura 8.11. A muy baja concentracindesubstrato,cuando[S]esmuchomenorqueKM,V0=(Vmax/KM)[S];esto es la tasa es directamente proporcional a la concentracin de substrato. A altas concentracionesdesubstratocuando[S]esmuchomayorqueKM,V0=Vmax;estoesla tasaesmxima,independientedelaconcentracindesubstrato.
90
CAPTULO TERCERO:
La Superficie Celular
91

SUPERFICIECELULAR LA
LAMEMBRANAPLASMTICAOPLASMALEMA (DELGRIEGOPLASMA =FORMA,LEMMA =CSCARA,LMINA) ESUNADELGADACAPADE610nmDEESPESOR(PORDEBAJODELLMITEDERESOLUCINDELMICROSCOPIO OPTICO),SEOBSERVAMEDIANTEMICROSCOPAELECTRNICACOMOUNAESTRUCTURATRILAMINARCONUN CENTROCLAROYPORENCIMAYDEBAJODOSCAPASDENSAS. ES EL ELEMENTO QUE CONTROLA LAS RELACIONES DE LA CLULA CON SU MEDIO, ES UNA ESTRUCTURA NETAMENTE DINMICA Y DE ELEVADA COMPLEJIDAD. ESCENCIALMENTE, LA MEMBRANA PLASMTICA SE COMPONE DE UNA CAPA BIMOLECULAR DE FOSFOLPIDOS CON PROTENAS; LA PORCIN FOSFOLIPDICA, IMPERMEABLE A LAS MOLCULAS HIDROSOLUBLES, A LA VEZ ES SOLVENTE PARA LAS PROTENAS DE LA MEMBRANA.
Jonhatan Singer en 1972 plante el modelo de mosaico fludo en el cual los fosfolpidosformanunadoblecapamientrasquelasprotenasintegralesestninsertas enlacapafludayaunquetieneestabilidad,sufluidezlepermitealoslpidosyprotenas desplazarseenelplanoestructural. Laorganizacinesasimtrica,locualsignificaqueloscomponentesaambosladosdela membrana se distribuyen de manera dispar, esto es ms evidente en el caso de los oligosacridos que se encuentran solo en la superficie extracelular de la membrana o haciaelinteriordecompartimentosdecisternas,vacuolasovesculas. LaMPtienecomofunciones: Determinarlacomposicindiferencialentreelcitosolyelmedio extracelular Permitirlacomunicacinentrelasclulas Relacionarlasmatricesextracelulares Transportedenutrienteshaciaelinterior Transportededetritushaciaelexterior Impedirlaprdidadelosmetabolitosnecesarios Mantenerlacomposicininica,elpH(7,2)ylapresinosmtica adecuados delcitosol LPIDOSDELAMEMBRANA Los bloques fundamentales con los que se construyen todas las membranas celulares sonlosfosfolpidos.Estossonmolculasanfipticasqueconsistendedoscidosgrasos hidrofbicos unidos a una cabeza hidroflica que contiene un grupo fosfato. Debido a 92

que sus colas de cidos grasos son pobremente solubles en agua, los fosfolpidos, en
soluciones acuosas, forman bicapas espontneamente orientando las cabezas hacia ambos lados en contacto con el agua y las colas hidrofbicas hacia el interior de la membrana (Fig.3.1). Tales bicapas fosfolipdicas, forman barreras estables entre dos compartimentos acuosos, y representan la estructura bsica de todas las membranas biolgicas.
Fig.3.1.ModificadodeBiochemistrydeBerg
TABLA 3.1 COMPOSICIN DE LOS LPIDOS DE LA MEMBRANA CELULAR (% DE MOLES) MEMBRANA PLASMTICA RER MEMBRANA MITOCONDRIAL EXTERNA
LPIDOS E. COLI ERITROCITOS 50 55 17 Fosfatidilcolina O 2 3 6 0 Fosfatidiserina 23 16 16 80 Fosfatidiletanolamina 5 3 17 0 Esfingomielina 0 0 2 0 Glucolpidos >5 6 45 0 Colesterol Los lpidos constituyen aproximadamente el 50% de la masa de la mayora de las membranascelularesaunqueestaproporcinvaradependiendodeltipodemembrana. Por ejemplo la membrana plasmtica aproximadamente contiene 50%
lpidos y 50% de protenas. Lamembranainternadelas mitocondrias contiene una inusualmente alta
proporcin de protenas (~75%), complejo reflejando proteico el que

Fig.3.2.ModificadodeBiologaCelularyMoleculardeLodish
93

participadeltransportedeelectronesylafosforilacinoxidativa.Lacomposicindelos
lpidosdelasdiferentesmembranascelularestambinvara(Tabla3.1). Una propiedad importante de las bicapas lipdicas es que se comportan como fluidos bidimensionalesenlosquelasmolculasindividualmente(tantolpidoscomoprotenas) pueden rotar y moverse en sentido lateral. Tal fluidez es una propiedad crtica de las membranasyestadeterminadatantoporlatemperaturacomoporlacomposicinde loslpidos.Porejemplo,lasinteraccionesentreloscidosgrasoscortossonmsdbiles que las que se dan entre las cadenas mas largas, as las membranas que contienen cidosgrasoscortos,sonmenosrgidasypermanecenfluidasabajastemperaturas.Los lpidos contienen cidos grasos insaturados, incrementan la fluidez, debido a la presenciadedoblesligadurasqueintroducenbuclesenlascadenasdecidosgrasos, haciendo ms difcil su empaquetamiento. Los fosfolpidos (ff) son molculas anfipticas(Fig.3.2):losfosfolpidosestnconstituidospordoscadenasdegruposacilo derivadas de cidos grasos, unidos (por lo general por un enlace ster) a pequeos gruposmuyhidrfilos.Enconsecuencia,losfosfolpidosnoseagrupanentresengotas, sino que se orientan en lminas que exponen sus extremos hidrfilos al ambiente acuoso.Lasmolculasenlascualesunextremo(lacabeza)interactaconelaguayel otroextremo(lacola)eshidrfobasedenominananfipticas(toleranteaambos). Enlosfosfoglicridos,unadelasclasesprincipalesdefosfolpidos,lascadenaslaterales decidosgrasos(AG)estnesterificadascondosdelostresgruposhidroxilodeglicerol, yeltercergrupohidroxiloestesterificadoconunfosfato. Este ltimogrupotambin estesterificadoporungrupohidroxilodeotrocompuestohidrfilo,comolacolinaen la fosfatidilcolina. En otros fosfoglicridos, el fosfato est unido a aminoalcoholes u aminocidos, comolaetanolamina y serina, o derivados de azcares,comoelinositol, enlugardelacolina.Laviscosidaddelabicapasermayorcuantomslargasseanlas cadenas de A.G (generalmente de 16 a 22 C). Los dobles enlaces en las cadenas aumentan la fluidez de la bicapa. Ambas cadenas laterales de AG del fosfoglicrido puedensesaturadasoinsaturadas,porlogeneral,unacadenaessaturadaylaotrano. La esfingomielina es un fosfolpido que se encuentra sobre todo en membranas plasmticas ycarecedelacolumnavertebral de glicerol,y enlugardestatieneuna 94

columnadeesfingosina.
Debidoasunaturalezaanfiptica,enunmedioacuoso,tiendenaagruparseadoptando tresformasdiferentes:micelas,liposomasylminasbicapasimtricasdedosmolculas deespesorsimilaresalamembranaplasmtica(Fig.3.3).Esposiblequelaleccinms importanterecabadadelestudiodemembranasdebicapasdefosfolpidospurosseala tendencia espontnea a unirse para formar estructuras cerradas que separan dos compartimentosacuosos.Siunabicapafosfolipdicaformaraunalmina,conextremos en los cuales el interior hidrfobo estuviera en contacto con el H2O, esa lmina sera inestable, por lo tanto, una estructura esfrica sin extremos es el estado ms establedeunabicapafosfolipdica. Cada capa fosfolipdica de esta estructura hojuela. laminar Las se denomina laterales
cadenas
hidrocarbonadas de cada hojuela reducen al mnimo el contacto con agua, al distribuirse en un estrecho alineamiento,enelcentrodelabicapa, para formar un ncleo hidrfobo de 3 nm de espesor el estrecho
Fig.3.3 ModificadodeBiologaCelulary
agrupamiento de estas cadenas laterales de hidrocarburo se estabiliza mediante interaccionesdevanderWaalsentreellas.Enlacesinicosydehidrgenoestabilizanlas uniones entre s y con agua de los grupos polares de la cabeza del fosfolpidos. A pH neutrolosgrupospolaresdelacabezadealgunosfosfolpidosnotienencargaelctrica neta,mientrasquelosgruposdelacabezadeotrostienenunacarganegativaneta.Sin embargo todos los se pueden agrupar para formar la estructura bicapa caracterstica. Varios tipos de evidencias indican que la bicapa fosfolipdica es la unidad estructural bsicadecasitodaslasbiomembranas. Todaslasmembranascelularessonestructurascerradasquerodeantodalaclulaolos compartimentos separados. Por lo tanto, las membranas celulares tienen una cara 95

interna o fase citoslica (orientada hacia el interior del compartimento) y una cara
externa o fase extracelular (orientada hacia el medio). Dado que la mayora de las organelas est rodeada por una membrana de bicapa nica, el citosol es la parte del citoplasma exterior a las organelas. En consecuencia, la cara exoplasmtica est orientada hacia su interior. Algunas organelas como el ncleo, las mitocondrias y los cloroplastos, estn rodeadas por dos membranas; en estos casos, las superficies exoplasmticasestnorientadashacialaluzoelespacioentrelasdosmembranas.Enla MembranaPlasmticalosfosfolpidoscargadosseencuentrandelladocitoslicoyson muyimportantesparalosprocesosdeendoyexocitosis. Colesterol:debidoasuestructuracompuestadeanilloshidrocarbonados,elcolesterol juegaunroldiferenteenladeterminacindelafluidezdelamembrana.Lasmolculas decolesterolseinsertanenlabicapaconsusgrupospolareshidroxlicosprximosalas cabezas polares de los fosfolpidos. El anillo hidrocarbonado rgido interacta con las regionesdelascadenasdecidosgrasos.Estainteraccindisminuyelamovilidaddelas porciones externas de las cadenas de los cidos grasos, tornando esta parte de la membrana ms rgida. La insercin de colesterol, por otra parte interfiere con las interacciones entre cidos grasos, manteniendo as la fluidez a bajas temperaturas. La MembranaPlasmticadelasclulaseucariotastienetantocolesterolcomofosfolpidos yseintercalanentres.Enlamayorpartedelasprocariotaselcolesterolestausentey serelacionaconel5%decolesterolpresenteenlasmitocondrias. El colesterol es anfiptico, posee una cabeza polar (el OH del C3), dirigida hacia la superficieacuosayelrestodelamolculaeshidrofbicaypermaneceenelinteriorde labicapaeinteraccionaconlaparteinicialdeloscidosgrasosdelosfosfolpidosylos inmovilizaparcialmente,estosefectoscausan: Aumentoenlapermeabilidaddelamembrana DisminucindelafluidezyflexibilidadalaTcorporalde37C Ante eventuales descensos de oT, el colesterol previene la transicin de fase de cristal lquido a gel que ocurrira si la bicapa fuera slo de fosfolpidos, es decir,
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mantienelafluidezcuandobajalaoT.
Elcolesterolconstituyeentreel30yel50%deloslpidosdelaMembranaPlasmticaen clulaseucariotasvegetalesyconstituyeciertosesteroidesexclusivosdelasplantas. COLESTEROL Procariotas Ausente*salvo excepciones Eucariotaanimal Presenteenalto% Eucariotavegetal Presentehastaun3050%
PROTENASDELAMEMBRANA Si bien todas las biomembranas tienen la misma estructura de bicapa fosfolipdica y ciertas funciones comunes, cada tipo membrana celular tambinposee ciertas
Fig.3.4ModificadodeBiologaCelularyMoleculardeLodish
de
actividades distintivas determinadas, sobre todo, por el exclusivo grupo de protenas relacionadas con esa membrana (Fig. 3.4).Las protenas son los otros componentes importantesdelasmembranascelulares,constituyendoentreel25al75%delamasade las protenas. El modelo de membrana actualmente vigente es el propuesto por Jonhatan Singer & Garth Nicolson en 1972, visualiza la membrana como un mosaico fluidoenelquelasprotenasestninsertadasenunabicapalipdica.Mientrasquelos fosfolpidosproveenlaorganizacinestructuralbsica,lasprotenasdemembranaestn encargadasdedesarrollarlasdiferentesfuncionesdelasmembranasdelasclulas.Los dominiosproteicossobrelasuperficiedelamembranaextracelularsueleninterveniren las seales o interacciones intercelulares. Los dominios dentro de la membrana, en particular los que forman canales y poros, desplazan molculas a travs de la membrana.Losdominiosubicadosalolargodelacaracitoslicadelamembranatienen un amplio espectro de funciones, desde el anclaje de protenas citoesquelticas a la membranahastadesencadenarvasdesealintracelulares.Estasprotenassondivididas 97

endosclasesgenerales,basadasenlanaturalezadesuasociacinconlamembrana:las
protenas integrales de membrana, que estn embebidas directamente dentro de la bicapa lipdica y las protenas perifricas de membrana, que no estn insertadas sino asociadas indirectamente con las membranas, generalmente mediante interacciones conprotenasintegralesdemembrana. Protenas integrales o intrnsecas: muchas protenas integrales de membrana (denominadas protenasdetransmembrana),atraviesanlabicapalipdica,exponiendo porciones a ambos lados de la membrana. Las porciones de estas protenas que atraviesan la membrana, usualmente son regiones helicoidales de 20 a 25 aminocidos nopolares. Las cadenas laterales hidrofbicas de estos acs interactan conlascadenasdeloscidosgrasosdeloslpidosdemembrana,ylaformacindeuna hlice neutraliza el carcter polar de las uniones peptdicas. Como ocurre con los fosfolpidos, las protenas de transmembrana son molculas anfipticas, con sus porciones hidroflicas expuestas a los ambientes acuosos, lo cual significa que los aminocidoshidrofbicosquedanexpuestoshacialasuperficieporloquedebenquedar enelinteriordelabicapayslolasparteshidroflicasasomanalmedioacuoso(porlo tanto son anfipticas), adems, se pueden establecer enlaces inicos con las cabezas polaresdelosfosfolpidosystobrindamsestabilidad. Algunasprotenasdetransmembranaatraviesanlasmembranasunavez;otraslohacen mltiples veces. La mayora de las protenas de transmembrana de las membranas plasmticasdelasclulaseucariotassehanmodificadoporlaadicindecarbohidratos, que estn expuestos sobre la superficie de la clula y pueden participar en las interaccionesclulaclula. Las protenas pueden estar tambin ancladas en las membranas por lpidos que son retenidos por uniones covalentes a la cadena polipeptdica. Diferentes modificaciones delpidosanclanprotenasalafasecitoslicayextracelulardelamembranaplasmtica. LasprotenaspuedenserancladasalafasecitoslicadelaMPporlaadicindecidos grasosde14carbonos(cidomirstico)asuextremoaminooporlaadicindeuncido grasode16carbonos(cidopalmtico)ogruposprenilode15a20tomosdecarbono enlas cadenas laterales de los residuos decistena.Alternativamente,las protenas se 98

anclanalafaseextracelulardelamembranaplasmticaporlaadicindeglucolpidosa
suextremocarboxilo. Para poder extraer las protenastransmembrana se requieren detergentes o solventes orgnicosquedestruyenlaintegridaddelamembrana. En ciertos casos, las protenas integrales no son transmembrana, sino que estn ancladasaunadelascarasdelamembranamedianteenlacescovalentesconloscidos grasos del lado citoslico o extracelular, es decir, que en este caso la cadena polipeptdica no ingresa en la bicapa, este tipo de anclaje es a travs de una cadena hidrocarbonada fijada por enlace covalente. Algunas protenas de superficie celular estnancladasalacaraextracelularpormediodeuncomplejofosfolipdicoglucosilado unidoalextremoCterminal,variasenzimascomolafosfatasaalcalinaylafosfolipasaC pertenecenaestaclasedemolculas. Algunas protenas del citosol estn ancladas a la cara citoslica de las membranas mediante una cadena hidrocarbonada, fijada por enlace covalente a una cistena cercanaalCterminal.Enotrogrupodeprotenascitoslicasancladasmediantelpidos, ungrupoacilograsoseuneatravsdeunenlaceamidaalrestodeglicinaNterminal, enestasprotenas,elanclajeNterminalesnecesariopararetenerlassobrelamembrana ypuededesempearunpapelimportanteenunafuncinasociadaalamembrana,por ejemplo,vSrc,unaformamutantedeunatirosinaquinasacelular,esoncognicayslo puedetransformarlasclulascuandoretieneunNterminalmiristilado. Lashliceshidrofbicasdelasprotenastransmembranaestnincludasenlabicapa: Lasprotenasintegralesquecontienendominioshlicesqueatraviesanlamembrana, seincluyenenlamembranamedianteinteraccioneshidrofbicasconelinteriorlipdico de la bicapa y probablemente tambin por interacciones inicas con los grupos de las cabezas polares de los fosfolpidos. Las cadenas laterales hidrofbicas forman interacciones van der Waals con las cadenas acilos grasos y resguardan los grupos carbonilos(C=O)eimino(NH)delenlacepeptdico. Muchas protenas integrales contienen mltiples hlices transmembrana: en la actualidadsesabequemuchasprotenastransmembranacontienendosomshlices 99

que atraviesan la membrana. Por ejemplo el centro de reaccin fotosinttico
bacteriano(PRC)comprendecuatrosubunidadesyvariosgruposprostticos,entreellos cuatromolculasdeclorofila.Enestacomplejaprotena,tresdelascuatrosubunidades atraviesanlamembrana;dosdeestassubunidades(LyM)contienencadaunacinco(5) hlicesqueatraviesanlamembrana. Una familia de protenas de membrana importante y numerosa se define por la presencia de siete (7) hlices que atraviesan la membrana, son ejemplos de esto la bacteriorrodopsina (protena que se encuentra en bacterias fotosintetizadoras), las opsinas (protenas de la retina del ojo que absorben la luz), los receptores de varias hormonassobrelasuperficiecelularylosreceptoresparalasmolculasaromatizantes. Las hebras mltiples de las porinas forman barriles que se extienden de una superficieaotradelamembrana:lasporinassonunaclasedeprotenastransmembrana queproporcionancanalesparaelpasajededisacridos,fosfatosymolculassimilares. Las secuencias de aminocidos de las porinas son en su mayor parte polares y no contienen segmentos hidrfobos tpicos de las protenas integrales con dominios helicoidales. Las porinas son trmeros de subunidades idnticas, en cada subunidad, diecisis (16) hebras forman una estructura con forma de barril, con un poro en el centro.Enunmonmerodeporina,losgruposlateralesorientadoshaciafueradecada unadelashebrassonhidrfobas,porloquepuedeninteractuarconlosgruposacilos grasosdeloslpidosdemembranaoconotrosmonmerosdeporina.Entrelosgrupos laterales orientados hacia el interior de un monmero de porina predominan los hidrfilosyrevistenelporo. Protenasperifricasoextrnsecas:sonlasquenointeractanconelncleohidrofbico de la bicapa y se asocian con la membrana de manera indirecta mediante enlaces dbiles a las otras protenas o de manera directa a las cabezas polares de los fosfolpidos, del lado citoslico o del lado extracelular. Entre las protenas perifricas localizadas sobre la cara citoslica de la bicapa se encuentran las del citoesqueleto: espectrinayactinadeloseritrocitosylaenzimaproteinasaC.Ungrupoimportantede protenas perifricas son enzimas hidrosolubles, que se asocian con los grupos polares de los fosfolpidos de la membrana. Un grupo bien definido de estas enzimas son las 100

fosfolipasas, que hidrolizan distintos enlaces en los grupos de las cabezas de los
fosfolpidos, estas enzimas tienen un importante papel en la degradacin de las membranascelularesdaadasoenvejecidas. Paraelaislamientodeprotenasperifricassepuedenutilizartratamientossuavescon solucionessalinas,pHelevadooagentesquelantesdecationesbivalentes. PROTENAS Tipo transmembranosa Asociacin a la MP Mtodo de extraccin G LCIDOSDELAMEMBRANA Son oligosacridos o monosacridos unidos covalentemente a lpidos, como constituyentes de glucolpidos o protenas, como glucoprotenas. Los INTRNSECAS SI /NO Mediante enlaces fuertes Fuerte EXTRNSECAS NO Mediante enlaces dbiles Suave
glucosaminoglucanos(GAGs)usualmenteseencuentranunidosaprotenas.Loshidratos de carbono as ligados aumentan el carcter hidrfilo de los lpidos y las protenas, y contribuyen a estabilizar las conformaciones de muchas protenas de membrana. Los glcidosseencuentrancasiexclusivamentedelladoextracelular. Porlogeneral,losespaciosdentroyfueradeloscompartimentoscerradosformadospor las membranas celulares tienen distintas composiciones. Esta asimetra es un aspecto esencial de la estructura y la funcin de las membranas biolgicas y se refleja en la asimetradetodaslasprotenasintegralesdemembrana.As,cualquiertipodeprotena integral de membrana tiene una orientacin especfica exclusiva respecto de las caras citoslicas y exoplasmticas de una membrana celular, y todas las molculas de una protena integral comparten esta orientacin. La asimetra de una protena de membrana, establecida durante su biosntesis e insercin en una membrana, se mantienedurantetodalavidadelaprotena. Las glucoprotenas y glucolpidos son especialmente abundantes en las membranas de lasclulaseucariotas,peronoseencuentranenlamembranamitocondrialinterna,las laminillasdeloscloroplastosyvariasotrasmembranasintracelulares.Casisiemprehay hidratosdecarbonoadosadosalacaraexoplasmticadelamembrana.Losglucolpidos 101

siempreseencuentrandelladoextracelular,aligualquelasglucoprotenas,lascadenas
hidrocarbonadas polares se orientan hacia el exterior, hacia el medio externo y hacia fueradelaclula. Lamayoradelosfosfolpidosytambinelcolesterol,porlogeneralseencuentranen ambashojuelasdelamembrana,sibienamenudosonmasabundantesenunauotra. Se puede determinar la abundancia relativa de un fosfolpidos particular, en las dos caras dela membrana plasmtica sobrela base de su susceptibilidad a ser hidrolizado por las fosfolipasas especficas (enzimas que hidrolizan los enlaces fosfoster). Los fosfolpidosdelacaracitoslicasonresistentesalahidrlisisporfosfolipasas. FLUIDEZ DE MEMBRANA: hace referencia a que tanto los lpidos como las protenas puedentenerunaconsiderablelibertaddemovimientolateraldentrodelamembrana. Los fosfolpidos pueden girar sobre su eje, balancearse y flexionar sus cadenas de AG, pero no pueden realizar movimiento de inversin o traslacin (flipflop), es decir, no migran o alternan de una cara de la membrana a la otra. Desde el punto de vista energtico estos movimientos son muy desfavorables, porque la cabeza polar de un fosfolpido debe ser transportada por el interior hidrfobo de la membrana. En las membranas naturales y artificiales, una molcula lipdica tpica puede intercambiar su lugar con las molculas vecinas unas 107 veces por segundo, y se difunde varios micrmetrosporsegundoa37C.Aestavelocidad,unlpidopodradifundirseportoda lalongituddeunaclulabacterianatpica(1m)enslo1segundo,ylalongitudde unaclulaanimalenunos20segundos. Distintosexperimentoshandemostradoquemuchasprotenasintegralesdemembrana, aligualquelosfosfolpidos,flotanconciertalibertaddentrodelplanodelamembrana natural.Estosexperimentossugierenquemuchasprotenasintegralessedifundencon libertadenunmardelpidosenelespaciobidimensionaldelamembrana.Deacuerdo con este concepto, conocido como modelo de mosaico fluido, la membrana se interpreta como un mosaico bidimensional de molculas de fosfolpido y protena con movilidadlateral. Nunca se observ que las protenas atraviesen la membrana en un movimiento alternadodeidayvuelta(flipflop),enelquedeberaintervenirunpasajetransitoriode 102

restos de aminocidos y azcares hidrfilos a travs del interior hidrfobo de la
membrana,loqueseradesfavorabledesdeelpuntodevistaenergtico. GLICOCALIZoGLUCOCALIX Se denomina de esta manera al revestimiento externo de la mayora de las clulas eucariotas,ycuyaimportanciavaraconformelafuncindeltipocelular. Tieneaproximadamenteunespesorde1020nmycontienelascadenaslateralesde los oligosacridosdelasglicoprotenasydelosglicolpidosqueseven enla superficie externa de la membrana plasmtica. Se renueva constantemente. Cumple entre otras, una funcin antignica, y en ciertas clulas, como algunas endoteliales, contribuye a formar un filtro; tambin proporciona un microambiente, por su carga elctrica, pH y concentracin inica especial. Tiene funciones especficas en el metabolismo, reconocimientocelular,asociacincelularycomositiodereceptoresparahormonas.La potencialdiversidadestructuraldesdeelpuntodevistaqumicodeloscarbohidratos,les permiteasociarseentresenvariossitiosyhacenqueseanimportantestransportadores de informacin, tambin pueden combinarse en forma selectiva y reversible con las lectinas, protenas que frecuentemente aparecen en la superficie de las clulas, las cuales tienen la habilidad de distinguir no slo monosacridos sino tambin oligosacridosdiferentes.Perodebe tambinremarcarsequesibien loscarbohidratos delglicoclizsonmuyimportantesenlosreconocimientosointeraccionescelulares,hay tambinotrosmodosdereconocimientoointeraccinentrelasclulas,quedependeno se basan en un lenguaje de pptidos. Algunas formas de adherencia, por ejemplo involucranprotenasdesuperficiellamadasintegrinasypptidoscomplementarios;yes justamentelaexistenciademsdeunsistemaparalasactividadesdeadhesinloque otorgamayorflexibilidadalrepertoriodeinteraccionesdeunacluladada.
103

ELTRANSPORTEDEMOLCULAS
Lamembranaplasmticaesselectivamentepermeablealpasajedemolculaspequeas. La presencia de protenas
especficas para el transporte media el pasaje selectivo de molculaspequeasatravsde la membrana, permitiendo a la clula controlar la composicin desucitoplasma(Fig.3.5).
Fig 3.5 Tipos de transporte de membrana (modificado de Albert, 2002)
104
Fig. 3.6. Cinticas de la difusin simple y de la difusin mediada por protenas transportadoras D IFUSINSIMPLE Esunmecanismosencillo,enelqueunamolculasimplementesedisuelveenlabicapa de fosfolpidos, difunde y luego se disuelve en la solucin acuosa del otro lado de la membrana. Ninguna protena de la membrana est implicada, y la direccin del transporte es determinada simplemente por las concentraciones relativas de la molcula dentro y fueradelaclula.Esunprocesonoselectivo.Losgases(talescomoO2yCO2),molculas hidrofbicas (como el benceno), y molculas polares pequeas sin carga neta (tales comoH2Oyetanol)soncapacesdedifundir. D IFUSINFACILITADA Implica el movimiento de molculas en la direccin determinada por sus concentraciones relativas y/o por el potencial elctrico, para el caso de molculas cargadas.Noseproporcionaningunafuenteexternadelaenergaypresentancintica desaturacin. Difiere de la difusin pasiva en que las molculas transportadas no se disuelven en la bicapa de fosfolpidos. Su pasaje es mediado por protenas que permiten cruzar la 105

membranasininteractuarconsuinteriorhidrofbico.
Por este mecanismo se transportan: los carbohidratos, los aminocidos, nucletidos, y losiones. En la difusin facilitada intervienen dos clases de protenas: las protenas transportadorasylasprotenascanal. Lasprotenastransportadorasliganmolculasespecficasparasertransportadasenun lado de la membrana. Experimentan cambios conformacionales para funcionar.El transportadordelaglucosafueidentificadoinicialmentecomounaprotenade55kden glbulos rojos humanos. Tiene 12 segmentos de transmembrana hlice Los cambios conformacionales del transportador de la glucosa son reversibles. Tal flujo inverso (de adentrohaciaafuera)ocurreenclulasdelhgado,endondelaglucosasesintetizayes liberadaenlacirculacin. Lasprotenascanalsimplementeformanporosabiertos enla membrana, permitiendo que,molculaspequeas,deltamaoycargaapropiadaspasenlibremente. Permitentambin,elpasajedemolculasentreclulasconectadas.Tiposdeprotenas canal son las porinas, acuoporinas y las protenas de los canales inicos y estn presentesenlasmembranasdetodasclulas. Propiedadesdeltransporteatravsdecanalesinicos Rpido. Selectivo: restringen el pasaje a iones del tamao y carga apropiados. As, las protenascanalespecficaspermitenelpasajedeNa+,K+,Ca2+yClatravsdela membrana Laaperturadeloscanalesrespondeaestmulosespecficos
El flujo de iones por canales de membrana, es dependiente de la disminucin de la concentracindelion,ydebidoaquelosionessonsustanciascargadas, sutransporte tienecomoresultadoelestablecimientodeunadisminucinenelpotencialelctricoa 106

travs de la membrana. El flujo de iones a travs de una membrana es manejado por
amboscomponentes:concentracinyvoltajeelectroqumico. Existeunpotencialdeequilibrioseparadamenteparacadaion. Cuandolosimpulsosnerviososviajanporlosaxones,lamembranasedespolariza.Estos cambiosresultandelaaperturaycierresecuencialesyrpidosdeloscanalesdeNa+yK+ (alentrarNa+seproduceladespolarizacinycadadelpotencial). Allograrelequilibrio,loscanalesdesodioNa+sedesactivanyloscanalesdeK+seabren, con el consecuente aumento en la permeabilidad de la membrana al K+. Aumenta el flujorpidamentefueradelaclulallevandoaunadisminucinrpidaenelpotencialde membrana. Luego los canales se desactivan y regresa el potencial de membrana a su niveldereposo.Ladespolarizacinpermitequelospotencialesdeaccinviajenportoda lalongituddeaxonesdelasclulasnerviosascomosealeselctricas,teniendocomo resultado la transmisin rpida de impulsos de nerviosos sobre distancias ms largas, mediadasporlaliberacindelosneurotransmisores. LoscanalesdeNa+,K+,yCa2+pertenecenaunafamiliagrandedeprotenasrelacionadas: protenasdetransmembranas. Distribucindeionesendistintostiposcelulares Clula Ion Razn concentraciones (ext/int) 12 0,0026-98 30 15.000 9 0,029 14 10.000 Potencial de equilibrio (mV) +67 98 90 +123 +57 83 67 +118 60 Potencial de Membrana (mV) 90
Msculo Na+ K+ Cl Ca+2 Axn Na+ K+ Cl Ca+2 Transporteactivo
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produce en contra de un gradiente de concentracin. En el transporte activo, la Se
energa proporcionada por otra reaccin acoplada (hidrlisis de ATP) es utilizada para manejareltransporteencontradeestegradiente. La bomba de Na+/K+ proporcionan un ejemplo importante de transporte activo manejadodirectamenteporhidrlisisdeATP. LaconcentracindeNa+esaproximadamentediezvezmsaltaenelexteriorqueenel interiordelaclula,mientrasquelaconcentracindeK+esmsaltadentroquefuera. EstasdiferenciassonmantenidasporlaATPasadeNa+/K+queutilizalaenergaderivada delahidrlisisdeATP. Mecanismodelabomba Cambiosconformacionales:losionesNa+seunenasitiosdealtaafinidaddentro delaclulaloqueestimulalahidrlisisdeATPyfosforilacindelabomba.Luego se produce la exposicin del Na+ al exterior de la clula. Al mismo tiempo, los sitios de alta afinidad para el K+ se exponen en la superficie de la clula y se estimula la hidrlisis del grupo fosfato del ATP.Esto induce un segundo cambio conformacional,exponiendoelK+alinteriordelaclula. LabombatienetressitiosobligatoriosparaelNa+ydosparaK+. FuncindelabombadeNa+/K+: Propagacindesealeselctricasenelnervioyelmsculo. Manejareltransporteactivodeunagranvariedaddemolculas. Mantener el volumen osmtico de la clula (el citoplasma contiene una concentracinaltademolculasorgnicas.Enlaausenciadeuncontrapeso,esto manejaraelflujointernodeaguaporsmosis,dandocomoresultadoelestallido delaclula. El transporte activo de Ca2+ a travs de la membrana es manejado por una bomba de Ca2+,estructuralyfuncionalmenterelacionadaconlabombadeNa+/K+(laconcentracin deCa2+dentrodelaclulaesmuchomenorquefuera).Estoconcentracinintracelular 108

baja hace que la clula sea sensible a pequeos aumentos en sus niveles. Tales
aumentosjueganunpapelimportanteenlacontraccindelmsculo.
Fig.3.7.Labombadesodio/potasio
Fig.3.8.UnmodelodelciclodebombeodelabombadeNa+/K+ Otrasbombas: BombadeH+:responsabledeltransporteactivodeH+fueradelaclula. Aquellaspresentesenlasmembranasdebacterias,levaduras,yclulasvegetalesy animales ( clulas gstricas, lisosoma y endosomas, sntesis de ATP en las mitocondriasycloroplastos)
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Fig.3.9.Tresformasdetransporteactivo ElTransporteactivoacoplado(cotransporte) La disminucin de Na+establecido por la bomba Na+/ K+ proporciona una fuente de la energa que se utiliza frecuentemente para accionar el transporte activo de azcares, aminocidos,ydelosionesenclulasdemamferos.Lasclulasepitelialesdelintestino proporcionan un buen ejemplo del transporte activo manejado por la disminucin del Na+. Estaformadetransportepuedesercomocotransporte:transportededosmolculasen la misma direccin (sinporte) (Na+/glucosa) y por contratransporte (antiporte): dos molculassetransportanendireccionesopuestas(contratransporteNa+/Ca2+,Na+/H+).
Fig.3.10.Tiposdetransportemediadoporprotenastransportadoras(carriers).
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Fig.3.11.ModelodecmoelgradientedeelectroqumicodeNa+mediaeltransportede Glucosa ENDOCITOSIS Las clulas eucariotas son capaces de tomar macromolculas y partculas del medio circundante por un proceso llamado endocitosis. En la endocitosis, la materia internalizada es rodeada por un rea dela membrana dentro dela clula para formar vesculasquecontienenlamateriaingerida. F AGOCITOSIS
Durante fagocitosis, las clulas incorporan partculas grandes tales como bacterias, restoscelulares,oclulasanintactas.Laincorporacindelapartculaareceptoresen la superficie de la clula fagoctica, provoca la extensin de seudpodos. Se rodea la partcula y se fusiona para formar una vescula denominada fagosoma. Este luego se fusiona con los lisosomas, formando el fagolisosoma, en donde la materia ingerida es 111

destruidaporaccindeenzimashidrolticascidas.
Funcindelafagocitosis En las amebas, se utiliza para capturar las partculas de alimento, tal como bacteriasuotrosprotozoos. En animales pluricelulares, proporciona una defensa contra la invasin de microorganismos y para eliminar clulas daadas del cuerpo (leucocitos granulocitosneutrfilosymacrfagos).
E NDOCITOSISMEDIADASPORRECEPTORES Lapinocitosisescomnentreclulaseucariotas.Laformacaractersticadeesteproceso es la endocitosis mediada por receptores, que proporciona un mecanismo para la recepcinselectivademacromolculasespecficas Lasmacromolculas,paraserinteriorizadas,primeroseunenalaclulaporreceptores especficosdesuperficie.Estosreceptoresseconcentranenregionesespecializadasde la membrana. Luego se forman vesculas que contienen los receptores y su ligando unido,sefusionanenunendosomainmaduroysetransportahaciaellisosomaparaser reciclado. La captacin mediada por receptores del colesterol en las clulas de mamferos ha proporcionadounmodeloclaveparaentenderesteprocesoanivelmolecular.
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Fig.3.13.EndocitosisdeLDLmediadaporreceptores La endocitosis mediada por receptores tiene como resultado la incorporacin no selectiva de lquidos extracelulares y su contenido, adems de la interiorizacin de macromolculasespecficas.Elendosomainmadurosirvecomouncompartimientoque clasifica las molculas que sern recicladas a la membrana o bien transportadas al lisosomaparaladegradacin.Unacaractersticaimportantedelendosomainmaduroes quemantienenunpHinternocido(acercade6.0a6.2)comoresultadodelaaccinde unabombadeH+.EstepHcidollevaaladisociacindemuchosligandosunidosasus receptores dentro delcompartimiento tempranodelendosoma.Unejemploclsico es proporcionado por LDL, que se disocia de su receptor dentro de los endosomas inmaduros.Elreceptorentoncesesvueltoalamembranavavesculasdetransportey las LDL se transportan al lisosoma, donde su degradacin libera el colesterol. Los ligandos destinados para la degradacin, se transportan del endosoma inmaduro al maduro,elcualesmscido(pHacercade5.5a6.0)ymaduraenellisosoma.Dentro deloslisosomas,seproduceladegradacinporlaaccindehidrolasascidas.
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PAREDCELULARENVEGETALES La pared celular de las clulas vegetales es una matriz extracelular elaborada que encierracadaclulavegetal.Lasparedescelulares dedosclulasvecinas se cementan unas con otras formando una estructura ms gruesa, fuerte y rgida que la matriz extracelular de las clulas animales. La evolucin de la relativamente rgida pared celular,que puedellegaravariosmicrmetrosdeespesor,tuvo comoconsecuenciala prdidadelacapacidaddedesplazarseyreptarylasclulasvegetales,habranadoptado unestilodevidasedentario,quepersistihastalasplantasdelaactualidad.
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Lacomposicindelasparedescelularesdependedeltipocelular Todaslasparedescelularesvegetalestienensuorigenenladivisincelularconformese formaapartirdelaplacaenlacitocinesisparacrearunapareddeseparacinentrelas dos clulas hijas. Las nuevas clulas normalmente se forman en regiones especiales denominadas meristemos y normalmente son ms pequeas que las clulas adultas. Para poder crecer, las paredes celulares, denominadas pared primaria son delgadas y extensibles,aunqueresistentes. Unavezqueelcrecimientocesa,lapared nonecesita serextensible:algunasveceslaparedprimariaesretenidasinmayoresmodificaciones, peromscomnmenteseproduceunargidaparedsecundariapordepsitodenuevas lminas dentro de las ms viejas. stas pueden tener tener tanto una composicin similar a la de la pared primaria o ser marcadamente diferente. El polmero adicional mscomnmenteencontradoenlaparedsecundariaeslalignina,unaredcomplejade componentes fenlicos encontrados en la pared celular de los vasos del xilema y las fibras celulares de los tejidos leosos. La pared celular de las plantas constituye una especiedeesqueletoquesoportalaestructuradelasplantascomountodo,ytambin posee un rol de transporte ayudando al movimiento de fluidos a travs de la planta. Cuandolasclulasvegetalesseespecializangeneralmenteadoptanformasespecficasy producenparedescelularesespecializadas de acuerdoalascuales,lasmismas pueden serreconocidasyclasificadas.
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Aunque las paredes celulares de los vegetales superiores varan tanto en composicin cuanto en su organizacin, todos ellas estn construdas, como en las matrices extracelularesdelasclulasanimalesusandounprincipioestructuralcomnatodaslas fibras compuestas incluyendo fibras de vidrio, y concreto reforzado. Un componente provee de la fuerza tensil, mientras que el otro en el cual el primero esta embebido, provee resistencia a la compresin. Mientras que el principio es el mismo en clulas animalesyvegetaleslaqumicaesdiferente,Adiferenciadelasmetricesdelasclulas animales, que son ricas en protenas y otros polmeros que contienen nitrgeno, las clulasvegetalesprcticamenteposeenpolmerosquecarecendenitrgeno,incluyendo celulosa y lignina. Los rboles hacen grandes inviersiones en lignina y celulosa que comprendelamayorpartedesubiomasa.Paraunorganismosedentarioquedepende de CO2 y H2O y luz solar, estos dos biopolmeros representan materiales estructurales baratosbasadosencarbono,estrategiaqueayudaaconservarelescasonitrgenofijado enelsueloquegeneralmentelimitaelcrecimientodelasplantas. En la pared celular de plantas superiores las fibras tensiles estn conformadas de celulosa,lamolculaorgnicamsabundantesobrelatierra,fuertementeligadaenuna red de glicanos entrecruzados. En la pared celular primaria, la matriz en la cual la celulosa est embebida, est compuesta de pectina, una red altamente hidratada de polisacridosricosencidogalactournico.Laparedsecundariacontienecomponentes adicionales, tales como lignina, la cual es dura y ocupa los intersticios entre los otros 116

componentes,rigidizandolapared.Todasestasmolculassemantienenunidasporuna
combinacin de uniones covalentes y no covalentes para formar una una estructura altamentecompleja,cuyacomposicin,espesoryarquitecturadependedeltipocelular. Primero nos enfocaremos en la pared celular primaria y la arquitectura molecular que subraya su combinacin remarcable de fortaleza, resilencia y plasticidad, como la observadaenlasporcionesdecrecimientodeunaplanta. Lafuerzatensildelaparedcelularpermitealasclulasdelasplantasdesarrollarpresin deturgor Elambienteacuosoextracelulardeunaclulavegetal,consisteenelfluidocontenidoen la pared que rodea a las clulas. A pesar que el fluido en las paredes de las clulas vegetales, contiene ms solutos que los del agua del medio externo (por ejemplo el suelo), este es an hipotnico en comparacin con el interior celular. Este desbalance osmticoprovocaunapresinhidrostticamuyaltadenominadapresindeturgor,que causa unempujesobrelaparedcelular. Lapresin deturgorseincrementacuandoel punto donde la clula est en equilibrio osmtico, sin influjo neto de agua debido al desbalance salino. Esta presin es vital para las plantas debido a que es la principal fuerza que conduce el
crecimientodelostejidosvivosde lasplantas. La pared celular primaria est construida de microfibrillas de celulosa entretejida con una red depolisacridospcticos. La molcula de celulosa provee de las fuerzas tensiles a la pared celular primaria. Cada molcula consiste de una cadena linear de al menos 500 residuos de glucosa, que estn covalentemente ligados unos a otros, formando ristras estabilizadas por puentes hidrgeno dentro de la cadena. Adicionalemente, los puentes hidrgeno entre las molculas de celulosa causan adhesiones mutuas entre las molculas de celulosa 117

adyacentesyprovocandofuertesadhesionesenunarregloparaleloqueformaunhazde
aproximadamente 40 cadenas de celulosa, todas las cuales tienen la misma polaridad. Estos altamente ordenados agregados cristalinos de muchos micrmetros de longitud, sedenominanmicrofibrillasdecelulosa,ytienenunafuerzatensilcomparablealacero. Losconjuntosdemicrofibrillasestnarregladosenlminasolamelae,concadaunade estasmicrofibrillasdecercade2040nmdesusvecinosyseconectanpormolculasde glicanoentrecruzantesqueestnunidasporpuentesdehidrgenoalasuperficiedelas microfibrillas.Laparedcelularprimariaconsistedevariasdetaleslamelasarregladasen unaredsemejantealasdemaderaterciada. Los glicanos de entrecruzamiento, son un grupo heterogneo de polisacridos ramificadosqueseunenestrechamenteacadamicrofibrilladecelulosayqueayudana lasmicrofibrillasentrecruzadasen una redcompleja. Su funcin es anloga a la delas fibrillasasociadasalclgenodelasclulasanimales.Haymuchasclasesdeglicanosde entrecruzamiento pero todos ellos tienen un largo esqueleto lineal compuesto de un tpo de azcar (xilosa, glucosa o manosa) de las cuales protruyen cortas cadenas laterales de otros azcares, este es el esqueleto de molculas de azcar que forman puenteshidrgenoconlasuperficiedemicrofibrillasdecelulosa,entrecruzndolasenel proceso.Ambos,elesqueletoylalascadenaslateralesdeazcaresvariandeacuerdoa lasespeciesvegetalesyasuestadodedesarrollo. Coextensiva con esta red de microfibrilas de celulosa, y glicanos de entrecruzamiento, hayotrareddepolisacridosdeentrecruzamientobasadoenpectinas.Laspectinasson ungrupoheterogneodepolisacridosramificadosquecontienenmuchosresiduosde cido galactournico cargados negativamente. Debido a sus cargas negativas, las pectinas estn altamente hidratadas y asociadas con una nube de cationes que recuerdanalosglicosaminoglicanosdelasclulasanimales.CuandoseagregaCa2+auna solucin de pectina estas se entrecruzan entre ellas generando un gel semirgido (la pectina suele agregarse a los jugos para formar gelatinas). Ciertas pectinas son particularmenteabundantesenlalaminillamedialareginespecializadaquepromueve laadhesindeclulasvecinas;secreequeelCa2+cooperaenelmantenimientodelos entrecruzamientos de los componentes de la pared celular. Aunque los enlaces
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covalentestambienjueganunrolimportanteenesteproceso,pocoseconoceacercade
su naturaleza. La separacin regulada de las clulas en la lmina media subraya tal procesoenelripenningdelostomatesoenlaabscisindelashojasduranteelotoo. Adems de las dos redes basadas en polisacridos que estn presentes en todas las paredesprimariasdelasclulasvegetales,lasprotenaspuedencontribuirconcercadel 5% del peso seco de la pared, Muchas delas protenas son enzimas responsables del recambioyremodelacindelapared,particularmenteduranteeldesarrollo.Otraclase deprotenasdelaparedtienenaltosnivelesdehidroxiprolinacomoelcolgeno.Secree que estas protenas tambin provocan el reforzamiento de la pared y se producen en grandes cantidades como respuesta al ataque de agentes patgenos. De la secuenciacin del genoma de Arabidopsis se ha determinado que al menos 700 genes son responsables de la sntesis, el ensamble y la remodelacin de la pared celular de vegetales.Algunospolmerosencontradosenlaparedcelularprimariaosecundariason listadosenlatabla:
Polmero
Celulosa Glicanosdeentrecruzamiento Pectina
Composicin
Polmeroslinealesdeglucosa
Funciones
Lignina
Protenasyglicoprotenas
Las fibrillas le confiren fuerza tensilalasparedes. Xiloglucano, glucourono Entrecruzamiento de fibrillas de arabinoxilano,mannanos celulosaenunaredrobusta. Homogalacturonatos y Formas negativamente cargadas, ramnogalacturanos red hidroflica que da fuerzas de compresin a la pared primaria, adhesinclulaclula. Cumaril, coniferil y sinapsil Polmeros impermeables que alcoholesentrecruzados refuerzan las paredes celulares delasplantas. Enzimas, protenas ricas en Responsables del recambio y hidroxiprolinas remodelacinyayudaadefender contrapatgenos.
Losmicrotbulosorientaneldepsitodelaparedcelular Para que una clula crezca o cambie su forma la pared celular tiene que stretch o deformarsedebidoasuestructuracristalina,sinembargo,lasmicrofibrillasdecelulosa individualessonincapacesdestretch.Aselstretchingodeformacindelaparedcelular debe involucrar tanto el desplazamiento de una sobre otra, la separacin de microfibrillasadyacentesoambas. La forma final del crecimiento de las clulas de las plantas y an la forma final de las 119

plantas est determinada por la expansin de las clulas. La expansin ocurre en
respuesta a la presin de turgor en un arreglo de las microfibrillas de celulosa en la pared.Lasclulasasimismoanticipansumorfologafuturacontrolandolaorientacinde miofibrillasquedepositanenlaparedAdiferenciadeotrasmacromolculasdelamatriz queseproducenenelretculoendoplasmticoyelaparatodeGolgiysonsecretadas,la celulosa como el hialuronano es spun out de la superficie de la clula por una enzima unida a la membrana plasmtica (la celulosa sintetasa) que usa como substrato el conjugado de glucosaUDP suministrado por el citosol. Conforme son sintetizados, las cadenas de celulosa naciente se ensamblan espontneamente en microfibrillas que forman una lmina o lamella, en la cual todas las microfibrillas tienen casi el mismo alineamiento. Cada nueva lamella se forma internamente a las previas, producindose as un arreglo concntrico con las lamellas ms viejas en la periferia. Las microfibrillas formadas ms recientemente en clulas que se estn elongando, se disponen perpendicularmente al eje de elongacin de la clula. Aunque la orientacin de las microfibrillasenlaslamellaequesedepositaronpreviamentepuedaserdiferente,esla direccindelaltimalamellaelaquetienelainfluenciadominanteenladireccindela expansincelular. Una clave importante del mecanismo que dicta esta orientacin proviene de la observacindelosmicrotbulosenlasclulasdelasplantas.Estosestnarregladosen elcitoplasmacorticalconlamismaorientacinquelasmicrofibrillasquesedepositanen laparedcelularenestaregin,Estosmicrotbulosformanunarreglocorticalcercanoa la fase citoslica de la membrana plasmtica que se mantiene adherido por proteans pobrementecaracterizadas.Laorientacinconcordanciadelosmicrotbulosdispuestos corticalmente (justo por debajo de la membrana plasmtica), y las fibras de celulosa (justo por encima de la membrana) se observa en muchas tipos y formas de clulas vegetales y se presenta tanto durante el depsito de la pared primaria como de la secundariasugiriendounarelacincausal. Si todo el sistema de microtbulos corticales es desensamblado, tratando los tejidos vegetales con una droga despolimerizante, las consecuencias no son tan graves como podraesperarse.Eltratamientonoprovocaefectossobreeldepsitodenuevasfibrillas enlaorientacinpreexistente.Sinembargo,sebloqueantodosloscambiosenelpatrn 120

de distribucin de las miofibrillas que podra ocurrir posteriormente durante el
desarrolloentrelamellaesucesivas.Aspareceserquelaorientacindelasmicrofibrillas puede ser propagada en ausencia de microtbulos, pero todo cambio en el patrn requiere que seencuentrenpresentesmicrotbulosintactos paradeterminar la nueva orientacin. Estas observaciones son consistentes con el siguiente modelo. Los complejos que sintetizan celulosa se encuentran embebidos en la membrana plasmtica y liberan las largas molculas de celulosa. Conforme se produce la sntesis y autoensamble de molculasdecelulosa,elextremodistaldecadamicrofibrillaformaentrecruzamientos indirectosconlalminadematerialdelaparedconformesevaintegrandoenlatextura delapared.Conelcrecimiento,elextremoproximaldecadamicrofibrilla,loscomplejos sintetizantesnecesitanmoverseatravsdelamembranaenladireccindelasntesis. Yaquelasmicrofibrillasdelacelulosacrecientesonstaff.Cadalminademicrofibrillas deberatenderadepositarseporfueradelamembranaenlamismaorientacinquela lminaquese depositopreviamente,conelcomplejocelulosa sintetasasiguiendoalo largo de la senda preexistente de microfibrillas orientadas fuera de la clula. Sin embargo, los microtbulos dentro de la clula pueden cambiar la direccin predeterminada en la que se mueven los complejos sintetasa: ellos pueden crear boundaries en la membrana plasmtica actuando como los bancos de canal restringiendo los movimientos de los complejos sintetasas. En esta visin, la sntesis ocurreindependientementedelosmicrotbulosperoestosrestringenespacialmentea ladisposicindelosmicrotbulosqueseencuentranpresentesparadefinirlosdominios dentrodelosqueloscomplejosenzimticospuedenmoverse. AdhesinCelularenvegetalesyplasmodesmata Laadhesinentrelasclulasvegetalesesmediadaporsuparedcelularmsqueporlas protenas de transmembrana presentes en las clulas animales. En particular la regin especializada rica en pectina de la clula, denominanda laminilla media, aca como pegamentoentreclulasadyacentes.Debidoalarigidezdelaparedcelularvegetal,la asociacinestableentrelasclulasvegetalesnorequierenlaformacindeligamientos citoesquelticos tales como los provistos por desmosomas y uniones adherentes de 121

clulas animales. Sin embargo, clulas vegetales adyacentes se comunican entre ellas
mediante conexiones citoplasmticas denominadas plasmodesmata (singular plasmodesmo) que funcionan en forma equivalente a las gap junctions de las clulas animales. Apesardesussimilitudesenlafuncinlosplasmodesmatanoestanestructuralmente relacionados con las gap junctions de las clulas animales.En cada plasmodesmata, la membranaplasmticadecadaclulaescontnuaconladesuvecina,creandouncanal abierto entre los dos citosoles. Una extensin del retculo endoplasmtico liso pasa a travs del poro dejando un anillo de citoplasma alrededor por donde pasan iones y pequeas molculas entre las clulas. Adicionalmente los plasmodesmata pueden expandirse en respuesta a estmulos apropiados permitiendo el pasaje de molculas entre clulas adyacentes. Los plasmodesmata pueden as jugar un rol clave en el desarrollo de los plantas controlando el trfico de molculas regulatorias tales como factoresdetranscripcinomolculasdeARNsentrelasclulas.
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Captulo Cuarto:
El Citosol, el Citoesqueleto y el Movimiento celular
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MATRIZCITOPLASMTICA(CITOSOL)
Estafasedelasclulaseucariotascontieneesencialmenteunacomposicinsemejantea la de las clulas procariotas. Bsicamente la matrz contiene una alta proporcion de agua, protenas solubles, enzimas, molculas deARN, amenudo formando estructuras complejasconprotenas,etc. Las clulas eucariotas poseen un medio interno que rellena todos los espacios no ocupados por los compartimientos subcelulares y el citoesqueleto. Este citosol, es especialmente notable en las clulas poco diferenciadas ya que estas poseen un desarrollorelativamenteescasodeendomembranas. Laspropiedadescoloidalesdelasclulas,ascomolastransformacionesdesolagel,o las modificaciones de viscosidad, dependen entre otros factores, de la matriz citoplasmticaamorfa. Esenelcitosolendondeseproducenlamayorpartedelasfuncionescitoplasmticas, En esta fase se encuentran numerosas macromolculas, enzimas, ribosomas, el citoesqueleto y un nmero variable de cuerpos de inclusin que son estructuras transitorias que carecen de envolturas de membrana (depsitos de glucgeno, gotas lipdicas,critales,pigmentos,etc.).Cuandoserealizaelfraccionamientocelularyunavez que se han separado las fraciones nuclear, mitocondrial y microsmica, se obtiene la fraccinsobrenadantesolubleocitosol. La matriz citoplasmtica o citosol contiene agua iones, metabolitos de bajo peso molecularymacromolculas.Deestas,alrededordel20%sonlasprotenastotalesque posee la clula aunque pueden llegar a constituir una proporcion an mayor. Las enzimas de la gluclisis anaerobia, las responsables de la sntesis y degradacin del glucgeno, la maquinaria necesaria para la sntesis de protenas, las chaperonas, etc. AdicionalementeseencuentranenestafaselasmolculasdeARNmensajero,losARN solubles,ylasenzimasrelacionadasconestosprocesos. Inclusionestransitorias: Suspendidos en el seno del citosol existe un nmero variable de componentes 124

citoplasmticosquerepresentanacmulosdenutrientesosubproductosrelativamente
inertesdelmetabolismocelular.Salvocontadasexcepciones,noposeenmembranasde recubrimiento. Su concentracin en las clulas depende de la edad de las clulas, del tipocelularysuactividadfisiolgica. PartculasGlucgeno: Cuandoladisponibilidaddeglucosaeselevada,laglucgenosintetasaelaboragrandes polmerosramificadosqueconstituyenlasmolculasdeglucgeno,queeslaformade depsitointracelulardeglucosatransitoriamenteinmovilizada. Estas molculas forman estructuras electroopacas que pueden visualizarse a nivel ultraestructural usando MET. Estas partculas pueden tener varios niveles de organizacin.Losglucosomasopartculassonestructurasesferoidalesdeunos30nm, formadas por un centro del polisacrido rodeado por una capa de enzimas que intervienenensuformaciny degradacin.Losglucosomaspuedenmantenersecomo estructurasindependientesoformaracmulos(partculasorosetas). Los hepatocitos y las clulas musculares son tipos celulares que contienen grandes cantidadesdeglucgenoalmacenadoenalgunasfasesdesuvida.Cuandoelcontenido esespecialmentealtoselopuedevisualizaralMOmediantelatcnicadePAS.Cuando la clula requiere glucosa, las enzimas de la glucogenlisis (glucgeno fosforilasas) localizadas en la superficie de los glucosomas pueden degradar el polmero y liberar glucosa 1fosfato hacia el citosol, mas tarde esta es convertida al ismero glucosa 6 fosfatoquepuedeiniciarlaviacatablicadelagluclisis. Los hepatocitos constituyen un tipo celular nico dado que no almacenan glucgeno para su consumo sino para exportar glucosa a la sangre a fin de mantener un nivel relativamente constante de azucar (glucemia) an despus de varias horas de ayuno. Dado que la membrana no puede transportar la glucosa 6fosfato a travs de las permeasas,loshepatocitosposeenunsistemadesfosforilanteconstituidoporlaglucosa 6fosfatasaque enel retculoendoplasmtico liso genera glucosalibrelaque esluego transportadaalexterior.
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InclusionesLipdicas:
Los acmulos ms comunes son las inclusiones de triglicridos. Estas formaciones carecendemembranayposeentamaosmuydiversos.Algunassonvisiblessoloconel ME, mientras que otras alcanzan decenas de micrmetros como las gotas citoplasmticasdelosadipocitosquesonlasclulasespecializadasenlaacumulacinde lpidos como reserva concentrada de nutrientes para todo el organismo. Otros tipos como las musculares pueden almacenar pequeas gotas lipdicas como reserva energticaparasupropiautilizacin.Enelhgado,queeselprincipalrganoinvolucrado en el metabolismo lipdico, es comn la presencia de estas inclusiones de tamao submicroscpico en el citoplasma de los hepatocitos Ciertas glndulas, como las sebceas, acumulan triglicridos como material de secrecin. Pese a que las clulas utilizan ampliamente el colesterol para la sntesis de sus membranas no existen depsitos visibles de este esterol. Una excepcion son las glndulas endcrinas que sintetizanysecretanhormonasesteroidesdondelasgotitaslipdicasformansteresde colesterol que son los precursores hormonales que se movilizan y desaparecen rpidamentecuandolasclulassonestimuladas. Inclusionescristalinas Loscristalesfuerondescriptoscomoconstituyentesnormalesdealgunostiposdeclulas porlosprimerosmicroscopistaspticoscomoporejemplolasclulasdeSertoliylasde Leydigdeltestculohumano.Estoscristalesestnsuspendidosenelcitosol,peroexisten estructuras cristalinas en otros compartimientos celulares como el ncleo, las mitocondrias, etc. Aunque la mayora de las inclusiones cristalinas son protenas de funcin y estructura desconocidas, en algunos casos la composicin no es proteica, ejemplo de ello son los cristales intranucleares de hepatocitos caninos que estn compuestosdeuratos,lomismoqueenlasclulasdelacorneahumanadeindividuos quesufrendegota. Enotroscasoslacomposicinproteicadeloscristalesesbienconocida,porejemplo,el complejodeapoferritinayhierro(ferritina),queeslaformaintracitoslicadedepsito del hierro, la cual cuando se acumula en grandes proporciones puede cristalizar de 126

maneracaracterstica.
Enotroscasos,lapresenciadecristalesconstituyeunaadaptacinfuncionalimportante como en el tapetum lucidum de animales de hbitos nocturnos. Estos cristales regularmenteespaciados,actanreforzandolasensibilidaddelavisinnocturna. Pigmentos Muchasclulasposeengranulacionescitoplasmticasdecolorpardo,descriptasporlos citlogos clsicos como inclusiones de lipofusina o lipocromo . Estas inclusiones no se presentan en clulas de vida corta o en organismos juveniles, pero conforme los individuosenvejecensucantidadseincrementapaulatinamente.Ejemplodeelloseda en las clulas que como las neuronas y los cardiocitos se encuentran terminalmente diferenciadosyquehanperdidosucapacidaddedividirse. Estos pigmentos se tien positivamente con la tincin de PAS1 y dbilmente con los colorantes para lipidos. Actualmente se sabe que estos pigmentos representan los estadios finales de la desintegracin en vacuolas autofgicas que con el correr de los aos se acumulan en forma de residuos no digeribles, metablicamente inertes que permanecensindesdoblareseporlasenzimaslisosmicas. Otro pigmento que puede observarse en las clulas es la melanina. Es un pigmento derivado del aminocido tirosina que se sintetiza en clulas especializadas llamadas melanocitos. ELCITOESQUELETOYELMOVIMIENTOCLULAR El citoesqueleto, se compone de una red de filamentos proteicos que se extienden a travs del citoplasma de todas las clulas eucariotas. Aunque las estructuras del
PeriodicacidSchiff(PAS)esunmtododetincinusadoenhistologaypatologa.Estemtodose usaprincipalmenteparaidentificarglucgenoenlostejidos.Lareaccindelcidoperidicooxidalos residuosdeglucosa,creandoaldehdosquereaccionanconelreactivodeSchiffydesarrollauncolor prpuramagenta. Tambin puede utilizarse como tcnica de contratincin. La tincin de PAS es principalmente usada para teir estructuras que contienen una alta proporcin de carbohidratos (glicgeno, glicoprotenas, proteoglicanos), tpicamente se encuentran en tejidos conectivos, en mucusyenlalminabasal.
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127

citoesqueleto se han considerado exclusivas de eucariotas, recientemente se ha
demostradoquealgunosprocariotascomolosbacilosposeenprotenasquefuncionan de forma semejante a los mictofilamentos (protenas de la familia MreB), a los microtbulos (la protena FtsZ) y a los filamentos intermedios (por ejempo la denominada crescentina). Aunque las protenas baterianas no se parecen a las homlogas eucariticas enloquea composicinde aminocidos serefiere,cuando se ensamblan los polmeros, su estructura general es muy similar. El citoesqueleto proporcionaunarmaznestructuralparalaclula,sirvedeandamioparadeterminarla forma dela clula yla organizacingeneral del citoplasma.Ademsde jugar unpapel estructural, el citoesqueleto es responsable de los movimientos de la clula. Estos incluyennoslolosmovimientosdelaclulacomountodo,sinotambineltransporte internodeorganelasyotrasestructuras(talescomoloscromosomasdurantelaanafase deladivisincelular).Esunaestructuradinmicaquesereorganizacontinuamente.El citoesqueletosecomponedetrestiposprincipalesdefilamentosproteicos:filamentos de actina, filamentos intermedios y microtbulos, los cuales se mantienen unidos a organelas intracelulares y a la membrana plasmtica por una variedad de protenas accesorias. LaestructuraylaorganizacindelosFilamentosdeactina La protena mas abundante del citoesqueleto de la mayora de las clulas es la actina, la cual polimeriza para formar filamentos, fibras flexibles de
aproximadamente 7 nm de dimetro y hasta varios micrmetros de longitud. Dentro de la clula, los filamentos de actina (llamados tambin microfilamentos) estn organizados en estructurasmuyordenadas.Formanhacesoredestridimensionalesconpropiedadesde geles. El ensamble y desensamble de filamentos de actina, su organizacin en haces y redes,ysuasociacinconotrasestructurascelulares,estnreguladosporunavariedad deprotenasdeuninaactina.Losfilamentosdeactinasonespecialmenteabundantes pordebajodelamembranaplasmtica,dondeformanunaredqueproporcionaapoyo mecnico,determinalaformadelaclula,ypermiteelmovimientodelasuperficiedela
128

clula,determinandolamigracinyabsorcindepartculas.
Ensambleydesensambledefilamentosdeactina La actina fue originalmente aislada de clulas musculares, en donde constituye aproximadamente 20% de las protenas totales. Aunque inicialmente se pens que se encontraba implicada slo en la contraccin de msculo, ahora se sabe que es una protenaextremadamenteabundante(tpicamente5a10%delcontenidoproteicototal) entodaclasedeclulaseucariotas. Las estructuras tridimensionales de los monmeros y filamentos de actina fue determinadaen1990porKennethHolmes,WolfgangKabschycol.Losmonmerosson protenas globulares de 375 aminocidos. Cada monmero de actina (actina globular [G])tienesitiosobligatoriosquemedianlasinteraccionesdecabezaycolaconotrosdos monmerosdeactina,parapolimerizarseformandofilamentos(actinafilamentosa[F]). Debido a que todos los monmeros de actina se orientan en la misma direccin, los filamentosdeactinatienenunapolaridaddefinida(terminalespositivasynegativas). El primer paso en la polimerizacin de la actina, es la formacin de un agregado pequeo compuestoportresmonmerosdeactina.Losfilamentosdeactinaentonces crecen por la adicin
reversible de monomeros en ambos extremos, pero una terminal (positiva) se alarga cincoadiezvecesmsquela terminal monmeros negativa. de Los actina
tambin ligan ATP, que es hidrolizadoaADP.AunqueelATPnoserequiereparalapolimerizacin,losmonmeros deactinaquefijanelATP,polimerizanmsrpidoquelosqueliganADP. Debido a que la polimerizacin de la actina es un proceso reversible, los filamentos pueden despolimerizarse por disociacin en subunidades de actina. As, existe un equilibrioaparenteentrelosmonmerosdeactinaylosfilamentos,queesdependiente delaconcentracinde monmeroslibres. Lavelocidadconla quelosmonmerosde 129

actina seincorporan alos filamentosesproporcionalasuconcentracin,por lotanto,
hay una concentracin crtica de monmeros de actina, en donde la velocidad de polimerizacinenfilamentosesigualalavelocidaddedisociacin. Cabemencionar,quevariasdrogasseunenalaactinaafectandosupolimerizacin.Por ejemplo,lascitocalasinasseunenalasterminalespositivasdelosfilamentosdeactinay bloqueansualargamiento.Estotienecomoresultadocambiosenlaformadelaclula ascomolainhibicindealgunostiposdemovimientos. Dentrodelaclula,elensambleydesensambledefilamentosdeactinaesreguladopor protenas de unin a actina. La protena clave responsable del desmontaje de filamentos de actina dentro de la clula es la cofilina, que se une a los filamentos de actina y aumenta la velocidad de disociacin de monmeros de actina en la terminal negativa. Adems, puede cortar filamentos de actina, engendrando ms terminales y aumentandoeldesensambledelfilamento.
Figura 41. Curva de polimerizacin. Se puede apreciar que el polmero que se esta formando crece mas rpidamente en el extremo (+). La concentracin crtica (Cc) es aquellapordebajodelacualnohaypolimerizacin.Tr=treadmilling,serefierealrango deconcentracinenelpolmerosepolimerizaenelextremo(+)ysedespolimerizaenel (). Otraprotenadeuninaactina,laprofilina,sta,puedeinvertiresteefectoyestimulala 130

constitucindemonmerosdeactinaenfilamentos.
Organizacindelosfilamentosdeactina Los filamentos de actina se disponen en dos tipos de estructuras generales, llamadas hacesy redesdeactina. Enlos haces,losfilamentosdeactinase eslabonan enseries empaquetadas y paralelas. En las redes, los filamentos de actina estn dbilmente eslabonadosenseriesparaformarmallastridimensionalesconpropiedadesdegeles.La formacindeestasestructurasseencuentragobernadaporunavariedaddeprotenas. Las protenas que disponen los filamentos de actina en haces son generalmente protenasrgidasquefuerzanlosfilamentosparaalinearloscercaelunoconelotro.Por contraste, las protenas que organizan filamentos de actina en redes tienden a ser las protenasgrandesyflexibles,quepuedeneslabonarfilamentosperpendiculares. Haydostiposestructuralyfuncionalmentedefinidosdehacesdeactina.Elprimertipo dehaces,contienefilamentosdeactinaalineadosenformaparalelacomoproyecciones queseapoyansobrelamembranaplasmtica,denominadasmicrovellosidadesEnestos haces, todos los filamentos tienen la misma polaridad, con las terminales positivas adyacentesalamembranaplasmtica.Unejemplodeunaprotenaqueestimplicada en la formacin de estas estructuras es la fimbrina, que fue primero aislada de las microvellosidades intestinales y posteriormente se encontr en proyecciones de superficiedeunagranvariedaddeclulas. El segundo tipo haces de actina se compone de filamentos ms espaciados, y cumple funcionesenlacontraccin,talcomolaactinadelanillocontrctilquedividelasclulas enlamitosis. Losfilamentosdeactinaorganizadosenredesestnadheridosaprotenasgrandes,tal comolafilamina.Lafilaminaformalasconexionesentrefilamentosdeactina,creando una malla tridimensional dbil. Tales redes de filamentos de actina subyacentes a la membranaplasmtica,sirvendesostnalasuperficiecelular. Asociacindelosfilamentosdeactinaconlamembranaplasmtica Losfilamentosdeactinaseconcentranenlaperiferiadelaclula,dondeformanunared tridimensionalpordebajodelamembranaplasmtica.Estareddefilamentosdeactina 131

yprotenasasociadasasta,determinanlaformadelaclulayestimplicadaenuna
variedaddeactividadesenlasuperficiecelular. Laprotenaqueproporcionalabaseestructuralparaelcitoesqueletoenloseritrocitos eslaespectrina,queestenrelacinconlafilamina.Laespectrinadeloseritrocitoses un tetrmero compuesto de dos pares de cadenas polipeptdicas, llamadas y , con pesosmolecularesde240y220kd,respectivamente.Lacadenatieneunsolodominio obligatoriodeactinaensuextremoaminoterminal.Lascadenasyseasocianpara formar dmeros y luego tetrmeros con dos dominios obligatorios de unin a actina separados aproximadamente a una distancia de 200 nm. Las terminales del tetrmero deespectrinaseasocianconfilamentoscortosdeactina,dandocomoresultadolared de actina y espectrina, que forma el citoesqueleto submembranoso de los glbulos rojos. Otros tipos celulares contienen uniones entre el citoesqueleto y la membrana plasmticaquesonsemejantesalosobservadosenglbulosrojos. ACTINA,MIOSINA,YELMOVIMIENTOCELULAR Losfilamentosdeactina,generalmenteestnasociadosamiosina.Laprotenamiosina eselprototipodeunmotormolecularunaprotenaqueconviertelaenergaqumica enmecnica.Elejemplomsllamativodeestainteraccinentrelaactinaylamiosinalo constituyelacontraccinmuscular. Existen tres tipos de clulas musculares: msculo esqueltico, cardiaco y liso. En el msculo esqueltico y cardiaco, los elementos contrctiles del citoesqueleto estn presentesenseriessumamenteorganizadas. El msculo esqueltico est constituido por haces de fibras, formadas por clulas grandes (aproximadamente 50 m de dimetro) fusionadas. La mayor parte del citoplasma se compone de miofibrillas (haces cilndricos de dos tipos de filamentos: filamentosgruesosdemiosinayfilamentosdeactina).Cadamiofibrillaseorganizacomo unacadenadeunidadescontrctilesdenominadassarcmeros(Fig.42).Lossarcmeros miden aproximadamente 2,3 m longitud y se compone de varias regiones claras, discerniblepormicroscopaelectrnica.Las 132

terminalesdecadasarcmerosondefinidasporeldiscoZ.Dentrodecadasarcmero,
lasbandasoscuras(A)sealternanconbandasclaras(I).Estasbandascorrespondenala presencia o la ausencia de filamentos de miosina. Las bandas I contienen slo actina, mientrasquelaAcontienefilamentosgruesosdemiosinayactinaintercalados.Lazona H contiene slo miosina, y los filamentos de actina se conectan en sus terminales positivas al disco Z, que incluye la protena actinina. Los filamentos de miosina se anclanenlalneaMenelcentrodelsarcmero.Durantelacontraccindelmsculo,el sarcmeroseacorta,acercandolosdiscosZ.NohaycambiosenelanchodelabandaA, perolaIylazonaHcasidesaparecencompletamente.As,lacontraccindelmsculo resultadeunainteraccinentrelosfilamentosdeactinaymiosina.
Fig.42:esquemadeunsarcmeroysuscomponentes La miosina tipo II es una protena de 500 kd, compuesta de dos cadenas pesadas idnticas(cercade200kdcadauna)ydosparesdecadenaslivianas(cercade20kdcada una). Cada cadena pesada se compone de una regin globular (cabeza) y una cola organizadaenunahlice. Losfilamentosgruesosdelmsculosecomponendemsdecienmolculasdemiosina, asociadasporinteraccionesentrelascolas.Laactividadmotrizdelamiosinaconsisteen moversuscabezassobreelfilamentodeactina,enladireccindelaterminalpositiva. Estemovimientodeslizalosfilamentosdeactinadeambosladosdelsarcmerohaciala lneaM,acortandoelsarcmero,teniendocomoresultadolacontraccindemsculo. LascabezasdemiosinaunenehidrolizanATP,queproporcionalaenergaparaconducir 133

elmovimiento.LahidrlisisdeATPconducelosciclosrepetitivosdelainteraccinentre
cabezasdemiosinayactina.Durantecadaciclo,seproducencambiosconformacionales enlamiosina,dandocomoresultadoelmovimientodesuscabezassobrelosfilamentos deactina. La contraccin de msculo esqueltico es provocada por impulsos nerviosos, que estimulan la liberacin de Ca2+ del retculo sarcoplsmicouna red especializada de membranas internas, semejante al retculo endoplasmtico. El aumento en el Ca2+ sealalacontraccinporaccindedosprotenasaccesorias:tropomiosinaytroponina (Fig 43). La tropomiosina es una protena fibrosa que se liga longitudinalmente por la ranuradefilamentosdeactina.Enelmsculoestriado,cadamolculadetropomiosina seligaalatroponina,queesuncomplejodetrespolipptidos:troponinaC,troponinaI y troponina T. Cuando la concentracin de Ca2+ es baja, el complejo de troponinas se bloquea y el msculo no se contrae. En concentraciones altas de Ca2+ se activa la troponinaCcambialaposicin,rompelainhibicinypermitequelacontraccin.
Fig43Distribucinyrelacionesdelatroponinaytropomiosinamusculares EnsamblescontrctilesdeActinayMiosinaenclulasnomusculares Losfilamentosdeactinaenclulascontrctilesnomusculares,seasociantambincon tropomiosina,quefacilitasuinteraccinconmiosinaII.Enclulasnomusculares,yenel msculoliso,lacontraccinestreguladaprincipalmenteporfosforilacindelacadena livianadelamiosina. Existeungrupodenominado,miosinasnoconvencionales,quenoformanfilamentosy por lo tanto no estn implicadas en la contraccin. Intervienen en una variedad de movimientoscelulares,talcomoeltransportedevesculasdemembranayorganelas,y en movimientos a travs de seudpodos en las amebas. La miosina I presenta una cabezaglobularqueactacomounmotormolecular.EsmspequeaquelamiosinaIIy 134

fijanloshacesdeactinaalamembranaplasmticaenlamicrovellosidades.Ademsde
miosinasIyII,existenporlomenosdoceclasesmsdemiosinasnoconvencionales. Filamentosintermedios Los filamentos intermedios son polmeros de ms de 50 tipos de protenas que se expresan en varios tipos de clulas. No estn involucrados en los movimientos, pero proveendelsoportemecnicoparaclulasytejidos. ENSAMBLEDELOSFILAMENTOSINTERMEDIOS Losfilamentos intermediosestnformadospordmeros dedoscadenaspolipeptdicas enrolladosunosobreelotro.Losdmerosluegoseasocianparaformartetrmerosque se ensamblan en protofilamentos. Los filamentos intermedios estn formados por enrollamientodeunossobreotrosformandoestructurasquesemejanasogas. ORGANIZACIN INTRACELULAR FILAMENTOSINTERMEDIOS Losfilamentosintermediossonde longitud variable y posiblemente se extienden hasta el citoplasma delaclulaparainteraccionarcon otras estructuras, como los
DE LOS
llamados desmosomas en las membranas, dndoles rigidez y ayudando a su funcin de manteneralasclulasunidasentres(Fig.44).Generalmentesepiensaquetienenuna funcin mecnica dentro de las clulas, puesto que existen siempre en forma polimerizada.Lapresenciadeclasesespecficasdefilamentosintermedios,endiferentes tipos celulares, ha
permitido tipificar a una clula e identificar de dnde proviene, lo cual ha resultado muy til en 135

los casos de cnceres en que el origen de las clulas en una metstasis puede
determinarseporeltipodeprotenasqueconstituyenalosfilamentosintermediosque contiene,yaslocalizarelpuntodeorigendelametstasis. Figura 44. Micrografa por inmunofluoresencia de clulas en cultivo que han sido decoradasconunanticuerpocontrafilamentosintermedios(enestecasovimetina).La intrincadareddeestosfilamentosseextiendeportodalaclulahastasuperiferia. Losfilamentosintermediostambinjueganrolesespecializadosenclulasmuscularesy nerviosas. Hay tambin protenas asociadas a filamentos intermedios; dos bien conocidas son la filagrinaylasinemina.Sinembargo,sufuncinespecficaespococlaratodava,yaque los filamentos intermedios son muy estables. En algunas enfermedades, como la de Alzhemer, se ha demostrado que las protenas de los filamentos intermedios estn alteradas.Lafosforilacindelasprotenasqueformanalosfilamentosintermediosest relacionadaconalgunasdesusfunciones,esreversibleyseobservacuandolasclulas cambian de forma o se reestructura un componente celular, como sucede con la envoltura nuclear. No se conocen drogas que los despolimericen, aunque en clulas tratadasconcolchicinaestosfilamentossecolapsansobreelncleosindesensamblarse, por lo que se ha postulado que la organizacin de los microtbulos controla la organizacindelosfilamentosintermediosyentonceslacolchicina,aldesensamblarlos microtbulos,produceuncolapsodelareddefilamentosintermedios.Esteprocesoes reversible y tanto los filamentos como los microtbulos se reorganizan al quitarse la colchicina. Sin embargo, no se han hallado los cofactores que participan en la reorganizacindefilamentosintermedios. FUNCIONESDE QUERATINASY NEUROFILAMENTOS:ENFERMEDADESDELAPIELYDELSISTEMANERVIOSO:la importancia de los filamentos intermedios en conferir fuerza mecnica a clulas en tejidos ha sido demostrado por la introduccin de genes mutantes de queratina en ratones mutantes. Mutaciones similares del gen de queratina son responsables de algunasenfermedadeshumanasdelapiel,yanormalidadesenlosneurofilamentoshan sido implicadas en el desarrollo de enfermedades de las motoneuronas (como se
136

mencionanteriormente).
Nuevos Roles de los filamentos intermedios: Un nuevo estudio identifica a la lmina-B de los filamentos intermedios como un componente estructural clave de la matriz del huso en mitosis.
La segregacin de los cromosomas durante la mitosis es coordinada por el huso mittico. Este proceso requiere la actividad conjunta de microtbulos, protenas de unin a microtbulos y cromosomas. An cuando se ha sugerido que un andamiaje estructural denominado la matriz del huso une factores de ensamble del huso (FEHs) y soporta el armado del huso. Hasta el presente, la naturaleza de este andamiaje ha permanecido elusiva. Recientemente, Yixian Zheng y sus colegas reportaron en Science que la lamina-B (protena de los filamentos intermedios) es necesaria para el ensamble del huso, proponiendo un rol estructural para sta, en la matriz del huso. Es ampliamente sabido que la lmina tiene funciones regulatorias y estructurales en el ncleo interfsico, pero estudios previos indicaban que una fraccin de lamina-B podra tambin asociarse con el huso mittico pudiendo asimismo tener un rol en mitosis. Zheng y sus colegas mostraron, usando tcnicas de inmuno-fluorescencia, que la lmina-B se asocia con el huso mittico en extractos de ovocitos de Xenopus laevis y en clulas HeLa. Se mostr que la deplecin de lmina-B usando tcnicas de ARN de interferencia en clulas HeLa, lleva a un incremento en defectos asociados con el ensamble y la funcin de esta estructura, lo que indica que la lmina-B podra actuar en el ensamble del huso mittico. Para eliminar la posibilidad que los defectos en el huso fuesen el resultado indirecto de la perturbacin de su funcin en la interfase, los autores desarrollaron experimentos en la fase M de extractos de ovocitos de X. laevis y obtuvieron resultados similares. A continuacin, los autores mostraron protenas de la lmina-B ensamblados en una red semejante a la matriz durante la mitosis, demostrando que este proceso depende de la presencia de GTP-unido a las formas pequeas de la GTPasa Ran. El huso fue ensamblado en extractos de ovocitos de X. laevis en presencia o ausencia de Ran-GTP, y los microtbulos del huso fueron a continuacin despolimerizados con nocodazol. Esto revel una matriz fibrilar de lmina-B-especfica, que slo se forma en presencia de Ran-GTP. Una posible explicacin del requerimiento de Ran-GTP es que las protenas de importacin nuclear importinas y interfieren con el ensamble de la matriz de lmina-B, y que el Ran-GTP desplaza a las importinas y de las protenas tales como la lmina-B que son requeridos para el ensamble de la matrz. Anlisis de doble-inmunofluorescencia de la matriz de lmina-B mostraron la presencia tanto de lmina-B y SAFs (poli (ADP-ribosa), NuMA, Eg5, XMAP215 y TPX2) en la misma matriz. A pesar de que la deplecin de lmina-B inhibe la formacin de estructuras de la matriz que contienen SAFs, la deplecin tanto de Eg5 o XMAP215 an permite la formacin de matrices de lmina-B que contienen otras SAFs. Estos descubrimientos indican que se requiere lmina-B para el ensamble de una matriz asociada al huso. Zheng y colaboradores fueron capaces de aislar la matriz de lmina-B a partir de extractos de ovocitos de fase M tratados con nocodazol, y asimismo fueron capaces de detectar la presencia de lmina-B y varias SAFs. Cuando incubaron con tubulina pura, aislaron matrices que causan la nucleacin de los microtbulos, que ataron a las matrices. En contraste, no se produjo ensamble de microtbulos en ausencia de matrices. Un hecho muy importante lo constituye el que las matrices en las que no haba XMAP215 fueron incapaces de promover el ensamble de microtbulos. Esto implica que las matrices de lmina-B matrices pueden promover el ensamble por SAFs ligadoras. Finalmente, los autores mostraron que los mutantes de lmina-B que eran incapaces para formar lminas nucleares interfsicas adecuadas rompen los ensambles del huso. Asimismo, la localizacin de SAFs sobre las estructuras de los microtbulos en las matrices que contienen mutantes de lmina-B son anormales. De este modo, el adecuado ensamble de la matriz de la lmina-B es esencial para la organizacin y localizacin de SAFs sobre el huso durante la mitosis. Este trabajo indica que las lminas podra tener un rol nuclear estructural no slo en la interfase, pero tambin en mitosis e ilumina importantes visiones sobre la elusiva matriz del huso. R EFERENCIA 1. Tsai, M.-Y. et al. A mitotic lamin B matrix induced by RanGTP required for spindle assembly. Science 311, 18871893 (2006) |Article|PubMed|
Microtbulos La unidad bsica de los microtbulos es el dmero, formado por tubulinas y en iguales proporciones. El ensamble de estos dmeros para formar un microtbulo requieredelahidrlisisdeGTP,unnucletidotrifosfatoquecontienelabaseguaninaen 137

lugar de adenina, como en el ATP, y que se encuentra asociado a cada dmero. La
energa provista por la hidrlisis del GTP favorece la polimerizacin en el extremo del tbulo, que aumenta de tamao. El otro extremo, al no crecer, se empieza a despolimerizar. Por esta razn los microtbulos son muy inestables y pueden polimerizarseydespolimerizarsecongran rapidez.Losdmeros,alpolimerizar,forman filamentosalargados(Fig.45)queposteriormenteseasocianengruposde13ydejan una luz central que le da a la estructura el carcter de tbulo en el citoplasma. Los microtbulos,deaproximadamente25nm,seformandemaneraespontneapartiendo decentrosdenucleacinllamadosorganizadoresdemicrotbulos(MTOC),endondese concentran las subunidades de tubulina. En base a estas estructuras, se organizan los microtbulos que irradian hacia el citoplasma (Fig. 46). Los centros organizadores de microtbulosformanlossteresenlamitosisytambinloscuerposbasalesdeloscilios yflagelosenmuchasclulas. Figura 45. Microfotografa de microtbulos polimerizadosinvitro.Latubulinaseobtuvode cerebro de rata y se hizo polimerizar en presenciadeGTP. Algunosdmerosdetubulinasemodificanuna vez ensamblados en un microtbulo, para participar en funciones definidas. As vemos cmo algunas tubulinas se acetilan yotras pierden el aminocido tirosina.Tambin, al asociarseaalgunasprotenaslosmicrotbulos,seestabilizan.
Figura46.Centrosorganizadoresdemicrotbulos (MTOC). Los microtbulos se observan por microscopa de inmunofluoresencia dentro de las clulas, ya que se decoraron con un anticuerpo contra la tubulina. La regin ms brillante alrededordelosncleoscorrespondealMTOC,de dondeirradianlosmicrotbulosatodoelcitoplasma.
LosCentrosomasylaOrganizacindelosMicrotbulos 138

Elcentrosomaesunorgnuloenigmticoysufamaenestesentidohaidoaumentando
durantelosltimos100aos. Ubicado en el centro de la clula y foco de los microtbulos, se le considera como el principal centro organizador de microtbulos. Se observa como una estructura clave en la progresin del ciclo celular y en su control. Recientes evidencias indican que los centrosomasnosonesencialesenlaformacindelhusomittico,perosserandegran importancia para el inicio de la fase S del ciclo celular y para la terminacin de la citocinesis. Se han identificado, adems, las molculas que regulan la duplicacin del centrosoma y sigue en expansin la lista de actividades sujetas a esta estructura, sus funciones, algunas an por determinar que prometen interesantes descubrimientos futuros. Est compuesto por los centriolos, situados en su centro y que suelen aparecer en nmerode2,formandoelllamadodiplosoma.Cercadeellospuedehaberunospocos cuerposdensosdepequeotamao,denominadossatlitescentriolares.Loscentriolos estn rodeados por un material amorfo y electrnicamente denso que es el llamado materialpericentriolar. Suscomponentesmayoritariossonunconjuntodetubulinas.Enelcentrosomaexisten variostiposdetubulinas:,,ylasrecientementedescubiertasy(enhumanos). Tubulinasy Seencuentranformandolos9tripletesdemicrotbulosqueconstituyencadaunodelos centrolos. Estn organizadas en dmeros con una tubulina y una cada uno. La asociacindeestosdmerosesloquedalugaralaformacindeunfilamentolinealo protofilamentoy13protofilamentoscomponenunmicrotbulo. Tubulina Se encuentra formandocomplejos en forma anular, en elmaterial pericentriolar. Es la encargadadelanucleacindelosmicrotbulos,peronoseincorporaalosmismos. Tubulinasy: Son dos tipos de tubulinas humanas identificadas recientemente y que tambin estn 139

asociadas con el centrosoma. La tubulina es homloga de la tubulinaOni3 de
Chlamydomonas. La tubulina ha sido recientemente descubierta. La localizacin de estasdostubulinasenelcentrosomaesindependientedelosmicrotbulos,ytambin lospatronesdelocalizacinsondistintosalgosimilarocurreconlatubulina. La tubulina se encuentra en asociacin con los centriolos mientras que la tubulina estlocalizadaenelmaterialpericentriolar. Latubulinamuestraunpatrndelocalizacinespecficodelciclocelular,asocindose slo conelcentrosomams viejoen unparrecin duplicadoydespusasocindosea amboscentrosomas.As,latubulinapermitedistinguirelcentrosomaviejodelnuevoa nivel del material pericentriolar, indicando que habra un proceso de maduracin centrosomal,marcadomedianteelreclutamientodetubulina. Los microtbulos nucleados por el centrosoma son polarizados, con un extremo de crecimientorpidooextremo(+),yotrodecrecimientolentoo:().Esteextremo()es el que se relaciona con el centrosoma, y el (+) es el ms alejado, y a partir del que alarganlosmicrotbulos. Lageometradeestosmicrotbulosesregular,cadaunoconstade13protofilamentos que estn organizados en una estructura tubular. Como contraste, microtbulos creciendoinvitroconaltasconcentracionesdetubulinaposeenunnmerovariablede protofilamentos. Esto indica que requieren de una especie de plantilla para nuclearse correctamente. Esta plantilla para la nucleacin de microtbulos en el centrosoma es un complejo proteicoconformadeanilloquecontienetubulina,unaprotenasimilaralastubulinas yperoqueseencuentraprincipalmenteenloscentrosomasynoseincorporaalos microtbulos. LareorganizacindelosmicrotbulosDURANTELAMITOSISocurrealcomienzodelamisma paraformarelhusomittico,queeselresponsabledelaseparacindeloscromosomas. El posicionamiento del huso mittico dentro de las clulas es importante para varios procesos fundamentales, incluyendo la segregacin correcta de los cromosomas, la distribucinasimtricadelosdeterminantesdeldestinocelularduranteeldesarrollo,las 140

divisionescelularesnormalyasimtricaascomoladefinicindelplanodecitocinesis.
Loscentrosomasylosmicrotbulosastralesasociadosparecenserimportantesparael posicionamiento del huso en mamferos y clulas de levaduras. Una caracterstica comn de estos sistemas es la interaccin de las molculas de los extremos (+) de los microtbulosastralesasociadosalcentrosoma,conladinenacitoplasmticalocalizada en la corteza celular. Fuerzas generadas fuera del huso central por la dinena, contribuyen, al menos en parte, a la fuerza conductora para el posicionamiento del huso. En clulas de mamferos que carecen de centrosomas, se producen microtbulos no astrales y los husos no llegan a estar bien posicionados, causando los consecuentes problemasdurantelacitocinesis. ESTABILIZACIN DE LOS MICROTBULOS Y POLARIDAD CELULAR: la estabilizacin selectiva de los microtbulosporlasprotenasasociadasaestos(MAPs)puedendeterminarlaformay polaridad de las clulas, tales como la extensin de los axones y las dendritas de las clulasnerviosas. EntrelasprotenasqueestabilizanalosmicrotbulosseencuentranlasllamadasMAPs, quesondepesomolecularelevadoyqueestnformadasporaproximadamente2.000a 3.000aminocidos,ylasllamadasTAU,con400a600aminocidos.Ambasseasociana los microtbulos y contienen dos dominios, uno que une a varios dmeros y ayuda a polimerizarlosyotroquepermitequelosmicrotbulosseunanaotrasprotenas. Lapolimerizacindelosmicrotbulospuedeinhibirseportemperatura,presin,faltade cationescomoCa2+yMg2+ypordrogas,comolacolchicinaque,alinteraccionarconlos dmerosdetubulina,impidequestosseintegrenalmicrotbuloqueestacrciendoen un extremo, causando la despolimerizacin del otro extremo. Ya que un microtbulo est en un equilibrio dinmico entre dmeros y polmeros, cualquier factor que interrumpa este equilibrio interferir con su funcionamiento. Es por esto que la colchicinaesuninhibidordelamitosis,deltransporteaxonalydeotrasfuncionesque requieren la participacin de microtbulos. La droga llamada taxol acta en forma contrariaalacolchicina,estoes,estabilizaalpolmerodemodoquelosmicrotbulosno puedendespolimerizarse,conlacorsecuenteinhibicindelequilibriodinmicoydelos 141

procesosyamencionados,enlosqueparticipanlosmicrotbulos.
Motoresmicrotubularesymovimientos IDENTIFICACINDELOS MOTORESMICROTUBULARES PROTEICOS: dosfamiliasdeprotenasmotoras sonlasresponsablesdelosmovimientosalolargodelosmicrotbulos:lasquinesinasy lasdinenas.Lasquinesinasylamayoradelasmolculasrelacionadassemuevenhacia el extremos plus (+) de los microtbulos, mientras que las dinenas y algunas de la familiadelasquinesinassemuevenhaciaelextremominus(). SEPARACIN DE LOS CROMOSOMAS MITTICOS: durante la anafase mittica, los cromosomas hijos se separan y mueven a los polos opuestos del huso mittico y las protenas motoresparticipandelproceso. EL TRANSPORTEDELA ORGANELAYLA ORGANIZACIN INTRACELULAR:losmovimientosalolargode los microtbulos transportan vesculas de membrana y organelas a travs del citoplasma,ascomoposicionanlasorganelascitoplasmticasdentrodelasclulas. CILIAS Y FLAGELOS: estas estructuras son extensiones de la membrana plasmtica. Sus movimientosresultandedeslizamientodelosmicrotbulos,conducidosporlaaccinde lasdinenasmotoras.Laestructuramicrotubularmsorganizadaestalvezelaxonema de cilios y flagelos, en el cual nueve pares exteriores de microtbulos se arreglan alrededor de un par central, todos ellos conectados entre s por un gran nmero de protenas diversas que ayudan a que este axonema lleve a cabo el movimiento de deslizamientoqueresultaenelmovimientobatientedelosciliosydeltigootirabuzn de algunos flagelos (Fig. 47). En el caso de cilios y flagelos los microtbulos son muy estables y no se despolimerizan con facilidad. Cada par exterior tiene asociada una protena con actividad de ATPasa, que se conoce como dinaina, y que al hidrolizar el ATP genera la energa necesaria para permitir el deslizamiento de los tbulos y, por consiguiente,delosflagelosocilios.
142
Figura47.A)VideomicrografadelprotozoarioparsitoGiardiaconsusdosflagelosenmovimiento. B)Representacinesquemticadelaxonemadetbulosarregladosennueveparesexterioresyunpar central.Elmovimientodelosmicrotubuloscausalaflexindelosflagelosyestopermitealaclula desplazarseensumedioambiente.
EXISTEUNCITOSQUELETOENPROCARIOTAS?
R AMN M UOZ C HPULI
La transicin de procariotas a eucariotas ha sido uno de los hitos ms importante en la evolucin de los seres vivos. En la comprensin de cmo se produjo dicha transicin han sido importantsimas las aportaciones conceptuales de Lynn Margulis, y en especial su audaz propuesta, hoy generalmente aceptada, de que mitocondrias y cloroplastos derivan de procariotas endosimbiticos que se asociaron a otros procariotas. La formacin de un compartimento nuclear diferenciado del citoplasma y el desarrollo de un citosqueleto son otras dos marcas caractersticas de los eucariotas. Hoy vamos a tratar del citosqueleto y su origen. Como es sabido, los filamentos de actina, junto con toda una serie de protenas que modulan su funcionalidad, forman un entramado que no slo es fundamental para dar forma y soporte mecnico a la clula, sino para procesos tales como la migracin celular, la fagocitosis, la divisin celular, el movimiento de protenas motoras que la utilizan como gua, etc. La actina es muy abundante,
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alcanzando el 5% de la protena total en una clula animal tpica. Otros elementos del citosqueleto son los filamentos intermedios, de diferentes tipos segn la clase de clula, y los microtbulos de tubulina. El origen del citosqueleto se relaciona, como ya hemos dicho, con la transicin procariota/eucariota, del mismo modo que el ncleo celular o las mitocondrias. La cuestin es cmo se produjo dicho origen. Esta cuestin ha recibido una sorprendente respuesta gracias a dos trabajos publicados en los ltimos meses en una competencia que emula a la de las famosas regatas en el Tmesis. Por un lado, el grupo de Jeffery Errington, en la Universidad de Oxford, ha descubierto que filamentos muy similares a los de actina, formados por las protenas MreB y Mbl, controlan la forma de las bacterias [Jones et al., Cell 104:913-922 (2001)]. Por otro, el equipo de Jan Lwe en Cambridge ha demostrado que la protena MreB polimeriza en filamentos estructuralmente muy similares a los de la F-actina [van den Ent et al., Nature 413:39-44 (2001)]. Vamos a intentar explicar el alcance de estos dos sorprendentes descubrimientos, que se unen a la constatacin, hecha hace algunos aos, de que las bacterias tienen una protena similar a la tubulina, denominada FtsZ, que forma filamentos implicados en la divisin celular. El estudio de estos grupos se ha centrado bsicamente en dos protenas que ya se conocan en bacterias, denominadas MreB y Mbl. Ambas presentan similaridades superficiales con las protenas pertenecientes a la superfamilia de la actina, aunque esto, en principio, no quera decir nada. A esta superfamilia pertenecen tambin enzimas como la hexosaquinasa (que fosforila azcares) o chaperonas como la DnaK/Hsp70 (por heat shock protein). Estas protenas no tienen nada que ver con el citosqueleto. Lo que hizo el grupo de Oxford fue generar anticuerpos policlonales contra las dos protenas, MreB y Mbl e intentar localizarlas por inmunofluorescencia al microscopio confocal en la bacteria Bacillus subtilis, que normalmente tiene forma de bastoncillo, es decir, alargada. Para su sorpresa observaron que las protenas parecan disponerse en una estructura en forma de hlice dextrgira que recorra la bacteria inmediatamente por debajo de la membrana plasmtica, en un plano transversal al eje mayor. Dicha estructura daba entre una vuelta y una vuelta y cuarto a la periferia celular. Por otro lado el nmero de bandas fluorescentes pareca pasar de una a dos o incluso ms en los momentos previos a la divisin celular, sugiriendo algn proceso, acoplado al ciclo celular, de replicacin o sntesis de la estructura. Por otro lado, procedieron a generar cepas mutantes inducibles de Bacillus subtilis que dejaban de expresar mreB cuando se retiraba un componente del medio de cultivo. Las bacterias moran al cabo de un tiempo, pero result interesante que antes de morir sufrieran espectaculares cambios en su forma. Se inflaban y redondeaban, perdiendo su aspecto alargado. La disrupcin del gen mreB, por tanto, resultaba en una prdida de control del dimetro celular. En cuanto a la protena Mbl, tambin apareca en forma de estructuras filamentosas y helicoidales dextrgiras, pero situadas a lo largo de la bacteria, en lugar de transversalmente a ella. Esto le da a la estructura una forma de 8. Los autores calcularon el nmero de molculas de MreB y Mbl por bacteria, y obtuvieron una cifra de 8000 y 12000-14000, respectivamente. Esta cantidad es ms que suficiente para justificar una estructura microscpica del tamao observado. Quiz uno de los resultados ms llamativos obtenidos por estos investigadores fue el obtenido mediante la bsqueda de genes similares a mreB en distintas bacterias. Despus de un exhaustivo recorrido por las bases de datos, pudieron establecer dos grupos de procariotas, segn tuvieran o no genes similares a mreB. En el primer apartado se agrupaban bacterias alargadas como Bacillus subtilis, Escherichia coli, Pseudomonas fluorescens, Haemophilus influenzae y la arquea Methanobacterium thermoautotrophicum. Tambin tienen genes mreB bacterias filamentosas como Streptomyces coelicolor y helicoidales como Treponema pallidum o Helicobacter pylori. En cambio, bacterias esfricas (cocos) como Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Synechocystis sp o las arqueas Pyrococcus horikoshii y Methanococcus janaschii, no tienen genes parecidos a mreB. Varias consecuencias se pueden extraer de esta observacin. Por otro lado parece que la presencia o ausencia de MreB est perfectamente correlacionada con la morfologa de la bacteria. A menos que exista esta protena, la bacteria adopta una forma esfrica. Por otro lado, los genes que controlan la forma bacteriana mediante la sntesis de estas estructuras helicoidales, se distribuyen por los dos grandes grupos de procariotas, Eubacterias y Arqueas. Hubiera sido un hallazgo de gran inters filogentico que uno de los dos grupos compartiera con los Eucariotas un carcter derivado como son las protenas citosquelticas, pero no es as. Dichas protenas debieron estar ya presentes en los antepasados comunes de los tres grandes grupos de seres vivos, Eubacterias,
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Arqueas y Eucariotas. La comparacin de la secuencia de MreB con la de la actina de los eucariotas revela un porcentaje total de homologa muy bajo, pero con interesantes coincidencias en zonas especialmente importantes. Dichas zonas parecen estar bien conservadas, y probablemente son claves para la funcin de la protena, ya que mutaciones puntuales, con sustitucin de un slo aminocido, la convierten en no funcional. Por otra parte el alineamiento de las secuencias requiere muy pocos "gaps" o espacios, lo que indica no slo un tamao similar de ambas protenas, lo que ya se saba, sino adems un espaciamiento similar de las zonas conservadas. Los autores del artculo de Cell concluyen que MreB y Mbl forman estructuras filamentosas, probablemente por ensamblaje de los monmeros proteicos en polmeros. Dichas estructuras se dispondran segn el modelo representado en la figura, lo que explicara que MreB y Mbl controlen, respectivamente, la anchura y la longitud de la clula. La polimerizacin de MreB es exactamente lo que han demostrado los autores del segundo artculo. El grupo de Cambridge ha purificado la protena MreB de la bacteria Thermotoga maritima y la ha sometido a ensayos de polimerizacin in vitro. As han demostrado que MreB forma polmeros slo si se encuentra en presencia de ATP o GTP. Es importante recordar que la polimerizacin de la actina tambin es dependiente de la hidrlisis de ATP. Los polmeros de MreB, observados al microscopio electrnico, recuerdan a los filamentos de actina, con una diferencia importante. Los protofilamentos de actina, formados por un alineamiento de monmeros, suelen asociarse por pares girando uno alrededor del otro, en forma de doble hlice. Los protofilamentos de MreB tambin estn asociados por pares, pero dispuestos paralelamente. La distancia entre monmeros en los protofilamentos es de 51, ligeramente inferior a los 55 de la actina. Los autores del artculo de Nature lograron cristalizar MreB y determinar su estructura atmica mediante difraccin de rayos X. La estructura tridimensional result ser casi idntica a la de la actina, con dos dominios divididos cada uno en dos subdominios. Es decir, que a pesar de las grandes diferencias en estructura primaria, en la secuencia de aminocidos, de las que hablbamos antes, las regiones conservadas parecen determinar una estructura terciaria muy similar en MreB y en actina. Conocida la estructura tridimensional de MreB, es posible calcular que las 8000 molculas de MreB bastan para ensamblar un polmero de 41 micrmetros de longitud. Dado que los filamentos observados por Jones y cols., miden alrededor de 3 mm, deberan estar formados por una decena de protofilamentos, probablemente suficiente para garantizar rigidez mecnica y mantener la forma de la bacteria. A partir de ahora se abren interesantes interrogantes. Por ejemplo, existe un mecanismo regulador de la polimerizacin y despolimerizacin en MreB y Mbl, igual al existente en actina? Este mecanismo es fundamental para la motilidad de las clulas eucariotas, y quiz su precursor estuviera ya presente en procariotas. Por otro lado, puesto que en procariotas se han descubierto ya precursores de los filamentos de actina y de los microtbulos, que suceder con los filamentos intermedios? Sern los nicos elementos citosquelticos realmente eucariotas? Ramn Muoz-Chpuli es Catedrtico de Biologa Animal en la UMA Encuentros en la Biologa 73:5-7 (2001)
F ILAMENTOSDE A CTINAEN P LANTAS

Los estudios de genmica de plantas han revelado la existencia de isovariantes proteicas dentro de la familia de genes de la actina; dentro de Arabidopsis thaliana, una dicotilednea empleada como organismo modelo, existen al menos 10 tipos de actinas, 9 de alfa tubulinas,
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seis de beta tubulinas, seis de profilinas y docenas de miosinas. Tal diversidad se explica de acuerdo a la necesidad evolutiva de poseer variantes ligeramente diferentes en su pauta de expresin temporal y espacial; no obstante, la mayora de ellas se expresan conjuntamente en los tejidos analizados. El entramado de redes de actina se distribuye por todo el citoplasma de las clulas cultivadas in vitro, con un refuerzo en torno al ncleo que se conecta, mediante radios, a la corteza celular; dicho entramado es altamente dinmico, con un polimerizado y despolimerizado continuo. Estructuradelavillina,unaprotenaaccesoriadelcitoesqueletodeactina. Si bien las clulas vegetales poseen generalmente una pared que define su morfologa e impide su movimiento, sus microfilamentos generan las fuerzas necesarias para varias actividades celulares, por ejemplo, las corrientes citoplasmticas generadas por los microfilamentos y las miosinas. Adems, la actina interviene en el movimiento de orgnulos y morfognesis celular, procesos que incluyen la divisin celular, la elongacin y la diferenciacin. En cuanto a las protenas asociadas al citoesqueleto de actina presentes en plantas cabe mencionar: villina, una protena perteneciente a la familia de la gelsolina/severina, capaz de cortar microfilamentos y unir monmeros de actina en presencia de catin calcio; fimbrina, un elemento capaz de reconocer y unir monmeros de actina y que interviene en la formacin de entramados (mediante una regulacin diferente a la propia de clulas animales y levaduras) ; forminas, protenas capaces de actuar como agente nucleante de la polimerizacin a actina F; miosina, tpico motor moleculares propio de eucariotas que, en
Arabidopsis thaliana, est codificado por 17 genes clasificados en dos clases distintas;
CHUP1, capaz de unir actina e implicado en la distribucin espacial de los cloroplastos en la clula; KAM1/MUR3, una protena que define la morfologa del complejo de Golgi as como la composicin en xiloglucanos de la pared celular; NtWLIM1, protena que faculta la aparicin de estructuras aovilladas de actina; y ERD10, que participa en la asociacin entre orgnulos delimitados por membranas y los microfilamentos y que parece desempear un papel especialmente relevante en presencia de estrs.
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CAPTULO QUINTO:
El Retculo Endosplasmtico, el Aparato de Golgi y Lisosomas
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ELRETCULOE NDOPLASMTICOELAPARATODEGOLGIYLOSLISOSOMAS
Ademsdelapresenciadelncleo,lasclulaseucariotassedistinguendelasprocariotas porlaposesin,dentrodesuscitoplasmas,deorganelasrodeadasdemembrana.Estas organelas proveen compartimentos discretos en los cuales tienen lugar las actividades celulares especficas. La subdivisin del citoplasma les permite a las clulas eucariotas funcionareficientemente a pesardesurelativamente grantamao(aproximadamente 1.000veceseldeunabacteria). Debido alacompleja organizacininternadelas clulaseucariotas laclasificacin yel direccionamiento delasprotenasasusdestinosapropiadosnosontareas sencillas.El primerpasoenlaclasificacindelasprotenastienelugarmientrasseestproduciendo el transporte. Muchas protenas destinadas al retculo endoplasmtico, al aparato de Golgi, a los lisosomas, a la membrana plasmtica y a la secrecin desde la clula, son sintetizadassobrelosribosomasqueestnunidosalamembranadelretculo.Conforme seproducelatraduccin,lacadenapolipeptdicaestransportadaalinteriordelretculo endoplasmtico,dondeseproduceelprocesamientoyelplegamiento.Desdeelretculo endoplasmticolasprotenassontransportadasenvesculasalaparatodeGolgi,donde sonnuevamenteprocesadasyclasificadasparaloslisosomas,lamembranaplasmtica, olasecrecindesdelaclula.ElRE,elaparatodeGolgiyloslisosomassedistinguendel restodelasotrasorganelascitoplasmticasporsupapelcomnenelprocesamientode protenasyporlaconexinestablecidaporeltransportevesicular. ELRETCULOENDOPLASMTICO(RE) ElREesunareddetbulosycisternasrodeadosdemembranaqueseextiendedesdela membrananuclearatravsdelcitoplasma.ElREestrodeadocompletamenteporuna membranacontinuayeslaorganelamsgrandedelamayoradelasclulaseucariotas. Sumembranapuedecontabilizarcercadelamitaddetodaslasmembranascelularesy elespacioencerradoporelRE,(laluzoespaciocisternal)puederepresentarcercadel 10%delvolumencelulartotal. Existen dos tipos de RE que realizan funciones diferentes dentro de las clulas. El RE rugoso est cubierto de ribosomas sobre su superficie externa, y acta en el procesamientodeprotenas.ElRElisonoestasociadoaribosomasyestainvolucrado 148

fundamentalmenteenelmetabolismodelpidos(Fig.5.1). Retculo endoplasmtico rugoso Retculo endoplasmtico liso
Fig.5.1Modificadode:TheCellaMolecularApproach.G.Cooper ELRETCULOENDOPLASMTICOYLASNTESISDEPROTENAS El rol del RE en el procesamiento y clasificacin de protenas fue demostrado por G. Palade y sus colaboradores en la dcada del 60. Estos investigadores estudiaron las clulasacinarespancreticaslasquesecretanprotenasdigestivasalintestinodelgado. Usaron aminocidos radioactivos para marcar las protenas de neosntesis. La determinacindelasprotenasradiomarcadasdentrodelaclulafuedeterminadapor autoradiografa. Despus de una breve exposicin de las clulas pancreticas a los aminocidos radioactivos, las protenas neosintetizadas se detectaron en el RE rugoso. El cual fue identificado como el sitio de sntesis de las protenas destinadas a la secrecin. Si las clulas se incuban luego con aminocidos no radioactivos (un proceso conocido como chase)lasprotenaserandetectadasenelaparatodeGolgi.Despusdeunlargoperodo decortedelsuministrodeaminocidosmarcados,lasprotenasmarcadasviajandesde elGolgihacialasuperficiecelularatravsdevesculassecretoriasquesefundenalaMP yliberansucontenidoenlasuperficiedelaclula. Estos experimentos definieron una va para las protenas de secrecin, el patrn secretor:
RErugosoGolgivesculassecretorasexteriorcelular
Estudios posteriores permitieron determinar que este patrn no esta restringido a protenasdestinadasalasecrecindeprotenasfueradelasclulas.Lasprotenasdela 149

membranaplasmticaylasprotenaslisosomalestambinviajandesdeelRERalGolgiy
desdeallasusdestinosfinales.Anotrasprotenasviajanatravsdelospasosiniciales del patrn secretor, pero luego son retenidas y funcionan en el RE o en el Golgi. La entrada de las protenas al RER constituye un punto de ramificacin para el trfico de protenasdentrodelasclulaseucariotas. EnlasclulasdemamferoslamayoradelasprotenassontransferidasalinteriordelRE mientrasestnsiendotraducidasporlosribosomasunidosalamembrana.Encontraste, las protenas destinadas al citosol o las que debern ser incorporadas al ncleo, las mitocondrias,loscloroplastosolosperoxisomassonsintetizadasenlosribosomaslibres yliberadasenelcitosolcuandolatraduccinsehacompletado. DIRECCIONAMIENTODELASPROTENASALRE LasprotenassontranslocalizadashaciaelRERdurantesusntesissobrelosribosomas unidosamembrana(translocalizacincotraduccional),odespusquesutraduccinha sido completada en los ribosomas libres (translocalizacin postraducional). En las clulas de mamferos la mayora de las protenas entran al RE cotraduccionalmente, mientrasquelaslevadurasusanambospatrones. Elprimerpasoenelpatrncotraduccionaleslaunindelribosomaalamembranadel RER.Losribosomassondireccionadosporlasecuenciadeaminocidosdelacadenade polipptidosqueseestsintetizando. La secuencia seal est formada por una corta ristra de aminocidos hidrofbicos precedido por residuos bsicos como la arginina. La secuencia seal se cliva por una proteasamicrosomalconformeelpptidoestransferidoallumendelRE. Losexperimentosparaestudiarelprocesoserealizaroninvitroutilizandomicrosomas. Annoseconoceconexactitudelmecanismoporelquelasprotenassondireccionadas alRERdurantelatraduccin(patrncotraduccional) Conforme la secuencia seal emerge del ribosoma, la cadena es reconocida por una partculadereconocimientodelaseal(PRS)queconsistedeseispolipptidosyunARN citoplasmtico pequeo (ARN7SL). La PRS se une a la secuencia seal y al sitio A 150

(aminoacil) del ribosoma, inhibiendo todo el proceso de traduccin y direccionando el
complejoPRSribosomacadenapolipeptdicacrecientealREdondeseunealreceptor de la PRS. La unin al receptor libera la PRS del sitio aminoacil del ribosoma y del pptidoseal. Elribosomaseune,riboforinasmediante,auncomplejodetranslocalizacinproteicay lasecuenciasealesinsertadaenuncanaldemembrana.Enmamferosestecanalest formado 3 protenas de transmembrana llamadas Sec61 (emparentadas con las protenas de la membrana plasmtica de bacterias SecA, responsables de procesos de secrecinenprocariotas). UnaspocasprotenasenlevadurasyenclulasdemamferossondireccionadasalRER unavezquesutraduccinsehacompletado. EstasprotenassonsintetizadasenribosomaslibresysuincorporacinalRERdespus quesehacompletadosutraduccin(postraduccional)norequieredelasPRS. Su secuencia seal es reconocida por protenas de reconocimiento diferentes (el complejoSec62/63)asociadoevolutivamenteconelcomplejoSec61enlamembrana. En este ltimo caso, se requieren un conjunto de chaperonas citoplasmticas que mantienenlacadenasinplegaryotrachaperonaenlaluzdelRE:BiPsenecesitapara realizarlatranslocalizacinpostraduccional. INSERCINDEPROTENASENLAMEMBRANADELRE Lasprotenasquesondestinadasalsistemademembranasdelaclulasoninicialmente insertadasenlamembranadelREenlugardeserliberadasenellumendelRE. Desde la membrana del RE siguen el mismo camino que las protenas del patrn secretor:
RE Golgi Membrana Plasmtica /o Lisosomas

Las protenas integrales de membrana son incluidas en la membrana por sus regiones hidrofbicasatravesandolabicapadefosfolpidos. Las porciones de transmembrana estn constituidas por 2025 aminocidos 151

hidrofbicosformandohlices.
Lasprotenaspuedenatravesarlamembranaunaomsveces(uniomultipaso). AlgunasprotenasseubicanconsuextremoCOOhaciaellumendelREyotrasconel extremoNH3+. EllumendelREestopolgicamenteequivalentealexteriordelaclula. Elmodomsdirectodeinsercinhacialamembranaresultaenlasntesisdeprotenas detransmembranaconsuextremoCOOhaciaelcitosol. EstasprotenasposeenunasecuenciaNterminalnormal,queesclivadaporpeptidasas seal durante la translocalizacin a travs de la membrana del RE por el canal Sec61. Luego son anclados a la membrana por una hlice hidrofbica en medio de la protena. Esta secuencia se denomina de stop o parada de la transferencia que cierra el canal Sec61,bloqueandotodatransferenciadelacadenaatravsdelamembranaconloque la porcin COOrestanteessintetizadaenelcitosol.El dominio transmembranaluego saledelcanalyseubicaenlabicapalipdica. Lainsercindeestasprotenasenlamembranarequierede2elementos:unasecuencia sealaminoterminalclivablequeinicialatranslocalizacinatravsdelamembranay una secuencia de transmembrana stop o de parada de la transferencia que ancla la protenaalamembrana. Haytambinprotenasquenosonclivadasporpeptidasasseal,quesonancladaspor secuenciassealinternas. EstassecuenciassonreconocidasporlaPRSytransportadasalamembranadelREcomo sediscutiantes. PROCESAMIENTOYPLEGAMIENTOENELRE ElREeselsitiodeplegamientodelasprotenas,delensambledemltiplessubunidades, delaformacindepuentesdisulfuro,delaadicindegucolpidosaalgunasprotenas demembranaydelosestadiosinicialesdelprocesodeglicosilacin. 152

LasprotenasatraviesanlasmembranasdelREcomopolipptidosnoplegadosmientras
estnsiendotraducidos. Los polipptidos se pliegan en sus conformaciones tridimensionales dentro del RE asistidosporlaschaperonasintraluminales. Unodelosmiembrosdelafamiliadelaschaperonasmejorconocida,laHsp70eslaBiP. Las protenas correctamente plegadas se separan de la BiP y son transportadas al aparato de Golgi mientras que las que han fallado en el proceso de plegamiento permanecenunidasalBiPyluegosondegradadasdentrodelRE. La formacin de puentes disulfuro entre las cadenas laterales de residuos del aminocidocistena,esunaspectoimportantedelplegamientodeprotenasdentrodel REyesfacilitadoporlaenzimadisulfuroisomerasadeprotenas,localizadaenlaluzdel RE. LasprotenastambinsonglicosiladassobreresiduosespecficosdeAsp(Nglicosilacin) mientraselprocesodetraduccinestsucediendo Algunas protenas son ancladas a la membrana por glucolpidos en lugar de hacerlo a travsderegioneshidrofbicasdelacadena. Los glucolpidos de anclaje se denominan glucosidilfosfatidilinositol (GPI) y son ensambladostambinenlamembranadelRE. ELRETCULOENDOPLASMTICOLISOYLASNTESISDELPIDOS Ademsdesurolenelprocesamientodeprotenasdesecrecinydemembrana,elREL eselprincipalsitiodesntesisdeloslpidosdemembrana. Enfuncindesuextremadahidrofobialoslpidosdemembranadebensersintetizados enasociacinconlosdelamembranacelular.PosteriormentesontrasladadosporelRE asusdestinosfinalestantoenvesculascomoporprotenastransportadoras. Lasmembranasdelasclulaseucariotasestncompuestaspor3tiposdelpidos Fosfolpidos(fosfoglicridosyesfingofosftidos) Glucolpidos
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Colesterol
La mayora de los fosfolpidos, que son los componentes estructurales bsicos de las membranasbiolgicas,sonderivadosdelglicerol. Estos son sintetizados en la hojuela citoslica de la membrana del REL, como precursores. Los cidos grasos son primero transferidos desde la coenzima A, que acta como transportadora,alglicerol3fosfatoporunaenzimaunidaalamembranayelfosfolpido resultante,elcidofosfatdicoesinsertadoenlamembrana. LasenzimaslocalizadasenlafasecitoslicadelREcatalizan,luegolaadicindedistintos grupos polares, resultando en la formacin de fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolaminayfosfatidilinositol. Losfosfolpidossiempresesintetizanenlacaraexterna(citoslico)delRE,parapasara lacaraluminalrequierenlaaccindeunaenzimallamadaflipasaquecatalizaelpasajea travsdelaporcinpolaratravsdelacapahidrofbica. AdemsdefosfolpidoselRELeselsitiodesntesisdeotrosdoslpidosdemembrana:el colesterolylaceramida. La ceramida luego puede convertirse, en el aparato de Golgi, en glucolpidos (galactsidos o cerebrsidos) o esfingomielina (el nico fosfolpido no derivado de glicerol). El REL es abundante en tipos celulares particularmente activos en el metabolismo de lpidos. Por ejemplo las hormonas esteroides son sintetizadas en el REL a partir del colesterol.AdemselRELisoesparticularmenteabundanteenelhgadoquecontiene enzimas que metabolizan varios compuestos liposolubles. Estas enzimas son destoxificantes. EXPORTACINDEPROTENASYLPIDOSDESDEELRE Tantolasprotenascomoloslpidosqueviajanporelpatrnsecretorviajanenvesculas quebrotandelamembranadeunaorganelaysefusionanluegoconlamembranadela 154

siguiente:
RE Compartimiento Intermedio Aparato de Golgi Compartimientos del Golgi Membrana Plasmtica /o Lisosomas Laorientacintopolgicaesmantenidaentodalava. LassecuenciasKDEL(LisAspGluLeu)enelextremoCterminalsonlassecuencias quepermitenlaretencindeprotenasquesonnecesariasparasuusoenelRE(como porejemplolasBiP,laprotenadisulfuroisomerasa,etc.) LasecuenciaKKXX(lisLisXX)tambinpromuevelaretencindeprotenasenel RE. Actualmente se piensa que las otras protenas que deben seguir la va secretoria tambinposeensealesespecficasannodilucidadascompletamente. ELAPARATODEGOLGIOCOMPLEJODEGOLGI ElaparatodeGolgifuncionacomounafbricaenlaquelasprotenasrecibidasdelRE son procesadas a sus eventuales destinos: lisosomas, membrana plasmtica o secretadasalexteriordelaclula. LasntesisdeglucolpidosyesfingomielinasecompletaenelAparatodeGolgi. Enplantas,lospolisacridoscomplejosdelaparedcelular,tambinsonsintetizadosen elGolgi. ORGANIZACINDELGOLGI Est formado por una serie de sacos aplanados rodeados de membrana (cisternas) y vesculasasociadas(Fig.5.2). UnacaractersticadistintivadelaparatodeGolgiessudiferentepolaridadestructuraly funcional.
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LasprotenasprovenientesdelREentranporsucaracisqueposeeformaconvexahacia
elncleoyqueestasociadaestrechamentealelementotransicional(CIERG)conelRE.
Compartimiento intermedio RERGolgi
Golgi Cis
Cara Medial Golgi
Apilamiento Trans Golgi
Cara Trans del Golgi
Secrecin
Fig5.2ModificadodeTheCellaMolecularApproach.G.Cooper(2000) LasprotenassontransportadasporelGolgiysalenporlacaracncavatrans. Conforme pasan a travs del Golgi, las protenas son clasificadas y modificadas ordenadamenteparasertransportadasasusdestinosdentrodelaclula ElprocesamientoylaclasificacintienenlugarendiferenteslugaresdelGolgi. Sedistinguencuatroregionesfuncionales: LaredcisdelaparatodeGolgi:sitiodeentradadesdeelCIERG(ERGIC) ElapilamientomedialdelGolgi 156
ElapilamientotransdelGolgi LaredtransdelGolgi(transGolginetwork)
Lasprotenas,loslpidosylospolisacridosmodificadospasanalaredtransqueacta como centro de clasificacin y distribucin, dirigiendo el trfico molecular a los lisosomas,lamembranaplasmticaoelexteriorcelular. CLASIFICACINYEXPORTACINDEPROTENASDESDEELAPARATODEGOLGI Lasprotenas,ascomoloslpidosylospolisacridossontransportadosdesdeelaparato deGolgiasusdestinosfinalesatravsdelpatrnsecretor. EstoimplicalaclasificacinendiferentestiposdevesculasdesdelafasetransdelGolgi. Algunas protenas son transportadasdesde el Golgi, a la membrana plasmtica por un patrnsecretorconstitutivo,quepermitelaincorporacindenuevoslpidosyprotenas alamembranaplasmtica,ascomolasecrecincontinuadeprotenasdesdelaclula. Otrasprotenassontransportadasporunpatrndesecrecinreguladaosondirigidasa otrosdestinosintracelularescomoloslisosomasenlasclulasanimalesolasvacuolasen levaduras LasprotenasqueposeenunafuncindentrodelaparatodeGolgidebenserretenidas enestaorganela. En contraste con el RE todas las protenas retenidas en el Golgi estn asociadas a la membranaynoselasencuetraenellumenenformasoluble. Las secuencias de retencin de estas protenas estn localizadas en sus dominios de transmembrana. La clasificacin de protenas en el patrn secretor regulado parece involucrar el reconocimiento de parches de sealizacin compartido por mltiples protenas que entranenestepatrn. Las clulas epiteliales poseen una complicacin adicional en el transporte de las protenas a la membrana plasmtica ya que estas clulas poseen dos regiones separadas, el domino apical y el dominio basolateral que contienen protenas 157

relacionadasconsusfuncionesparticulares.
El patrn constitutivo debe transportar desde la red trans del Golgi, a estos distintos dominiosdelamembranaplasmtica.Estolorealizanporelempaquetamientoselectivo deprotenasenalmenosdostiposdevesculassecretorasconstitutivasquedejanlared transdelGolgidireccionadashacialascarasapicalobasolateraldelasclulas. LASCADENASDEOLIGOSACRIDOSSONPROCESADOSENELAPARATODEGOLGI EnelretculoendoplasmticoseproduceunnicotipodeoligosacridoNligadoauna granvariedaddeprotenas.EstassonluegomodificadasenelAparatodeGolgi.Lasdos clases de oligosacridos Nligados son los oligosacridos ricos en manosa y los oligosacridoscomplejos.LosprimerosslotienendosresiduosdeNacetilglucosamina, que se agregan originalmente en el RE y los residuos manosa presentes en el dolicol (cadenadelpidoquetransportaestasecuenciaenelRE). Los oligosacridos complejos por el contrario poseen ms de dos residuos de N acetilglucosaminaquesonagregadosenelAG.Tambinposeenresiduosdegalactosa, cidosilico,yenalgunoscasosdefucosa. El cido silico es de especial importancia pues es el nico que posee carga neta negativa. Losoligsacrdoscomplejosposeenunaregindenominadacore,yunareginterminal. LaregincorederivadelareginNligadaoriginalquecontienelosdosresiduosdeN acetilglucosamina y tres residuos de manosa. La regin terminal contiene un nmero variabledetrmerosdeNacetilglucosaminagalactosacidosalico(ocidoNacetil neuramnico). Frecuentemente la regin terminal est truncada conteniendo slo N acetilglucosaminaygalactosaoansloNacetilglucosamina. TodoslosazcaresagregadosenlareginterminalsonagregadosenelAGensufase trans por una serie de glucosiltransferasas que actun en una secuencia rgidamente determinada. Los substratos son azcares activados por ligamiento a nucletido (comnmente UDP o CDP). La galactosidil transferasa es usualmente usada como marcadordelasvesculasderivadasdelGolgi.
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Elprocesamientoquegeneraoligosacridossigueunpatrnltamenteordenado.
FIGURA53REPRODUCIRESQUEMADELALBERT. El que un oligosacrido permanezca como rico en manosa o sea procesado para transformarseen un polisacrido complejodepende en gran parte delaprotena a la que est unido. Si el oligosacrido es estricamente accesible al procesamiento de la enzimaenelAG,entoncesesconvertidoaunoligosacridocomplejo,siesinaccesible permanececomooligosacridoricoenmanosa. UnapreguntaquecabehacerseesCaleselpropsitobiolgicodelaglicosilasinN ligada? A diferencia de la sntesis de ADN, ARN o protenas la sntesis de oligsacridos requiere una enzima diferente en cada paso, cada producto de reaccin es reconcido porcomoelsubstratodelaenzimasubsiguientedelaserie.Dadoelcomplicadopatrn, quehaevolucionadoparasusntesis,pareceraquelosoligosacridosolosglucolpidos poseeranunaimportantefuncinperoensumayoraestasnoseconocen. La Nglicosilacin parece ser excusiva de las clulas eucariotas y no se conoce en bacterias. LOSPROTEOGLICANOSSONENSAMBLADOSENELAPARATODEGOLGI En el trnsito del RE al aparato de Golgi no slo se produce el Nligamiento sino que muchasprotenassonmodificadasdeotraforma. Algunas protenas poseen azcares agregados sobre los residuos treonina o serina a travsdesuscadenaslaterales.EstasprotenassedenominanOligadasyparalaadicin delosoligosacridosrequierentambindeenzimasglicosiltransferasasespecficasque usanazcresunidosanucletidosparaagregarunresiduoporvezenellmendelAG. Usualmente primero tambin se agrega Nacetilglucosamina, seguido de un nmero variabledeazcareshastaaproximadamenteunnmerode10. Las protenas ms altamente glicosiladas son algunos cores proteoglicanos, que son modificados en el AG. Esto implica la polimerizacin de ms de una cadena de glicosaminoglicanos (largas cadenas de unidades repetidas de disacridos no ramificados)unidosalosresiduosserinadelasprotenasalosqueprimeroselesagrega 159

xilosa en lugar de Nacetilglucosamina. Muchos proteoglicanos se segregan hacia la
matriz extracelular, mientras que otros permanecen anclados a la MP como protenas integrales de esta. Adicionalemente, el mucus que es secretado para formar una cubierta protectora de los epitelios consiste en una mezcla de proteoglicanos y glicoprotenas. Los azcares incorporados en los glicosaminoglicanos son fuertemente sufatados inmediatamentedespusquesonprocesadosenelAG.Eldonantedelsulfatoesla3 fosfoadenosina5fosfosulfato (PAPs) que es transportada desde el citosol hacia el lumendelAG. OtramodificacinqueseproduceenelAGeselagregadodesulfatosapartirdelaPAPs enlosresiduostirosinadealgunasprotenas.Estastirosinassulfatadasseencuentranen losdominiosextracelularesdelaMP. LASPROTENASAMENUDOSONPROCESADASPROTEOLTICAMENTEDURANTELAFORMACINDEVESCULAS
SECRETORAS.
Muchas hormonas polipeptdicas y neuropptidos son sintetizados como precursores inactivosapartirdeloscualesseliberanlasmolculasactivasporprotelisis. Esteclivagesecree quecomienzaen la redtrans del Golgi ycontina enlas vesculas que lo forman. El procesamiento inicial se realiza por las proteasas unidas a la membranaquecortancercadeparesdeaminocidosbsicos(LysLys;LysArg;ArgLys; ArgArg)ylasreaccionesdeescisinproducenluegoelproductofinalsecretado. Enelcasomssimple,unpolipptidoposeeunapropiezaaminoterminalqueesclivada enelRER.Algunossonalgomsquemolculasquecontienenpptidosseales,estosse encuentrancomopoliprotenasconteniendomltiplescopiasdelamismasecuenciade aminocidos.Finalmente,unavariedaddemolculaspeptdicasdesealamientocomo parte de una poliprotena que acta como precursor para mltiples productos finales que son individualmente clivados de la cadena principal. En este caso, la misma poliprotenapuedeserprocesadadevariasformasparaproducirdiferentespptidosen diferentestiposcelulares,incrementandoladiversidaddelsealamientoqumicoentre 160

lasclulas.
Por qu este tipo de procesamiento proteoltico demorado se observa para tanta cantidaddepolipptidos? Agunos de los pptidos producidos por esta va, tales como las encefalinas (neuropptidos de 5 aminocidos) son muy cortos para que sus formas maduras sean eficientemente sintetizadas por los ribosomas, mientras que pptidos ms largos, podrancarecerdelassealesnecesariasparaserempaquetadasenvesculas.Msan, la demora en la produccin de una protena activa hasta que llega a una vescula secretoria, tiene la ventaja que previene su actividad en el interior de la clula que la sintetiza. LASCISTERNASDELGOLGIESTNORGANIZADASCOMOUNASERIESECUENCIALDECOMPARTIMIENTOSDE
PROCESAMIENTO
ElpatrndeprocesamientoestaltamenteorganizadoenpilasdelGolgi.Cadacisterna, esuncompartimientodistintoconsupropioconjuntodeenzimasdeprocesamiento,de tal forma que cada apilamiento forma una unidad de procesamiento multiestado. Las protenas son modificadas en estados sucesivos conforme ellas se mueven de un compartimientoaotroatravsdelapilamiento. Las protenas exportadas del RE ingresan al primer compartimiento del Golgi (el compartimiento cis del Golgi),luego se mueveal siguiente (el compartimiento medial) consistenteenlacisternascentralesdelapilamientoyfinalmentesemovilizanhaciael compartimiento trans (consistente de la ltima cisterna) donde se completa la glicosilacindelasprotenas.Desdeelcompartimientotrans,lasprotenassemovilizan hacialaredtransdelGolgiqueeselcompartimientotubularenelquesonsegregados endiferentesvesiculassecretoras. Las diferencias funcionales entre las subdivisiones cis, medial y trans fueron primero descubiertasporlalocalizacindelasenzimas.
161
CIERG Fosforilacin de Oligosacridos Lisosomales Apilamiento cis
Apilamiento medial
Remocin de manosa / adicin de GlcNAc
Adicin de Gal / NANA Apilaminto trans
Clasificacin
Red trans del Golgi Lis Vesculas de secrecin
LISOSOMAS Sonorganelasrodeadasdemembranaquecontienenunarreglodeenzimascapacesde rompertodotipodepolmerosbiolgicos(Fig.5.4). Puedenconsederarsecomoelsistemadigestivodelasclulasanimales.Tomantanto loscomponentesobsoletosdelexteriorcelularcomolosdelinteriormismo. Sevisualizancomovacuolasesfricasdensas,peroexhibenconsiderablesvariacionesen formaytamao. MP
162

Los lisosomas representan organelas morfolgicamente diversas, definidas por la
funcincomndedegradarmaterialintracelular.
Retculo Endoplasmatico Lisosoma
Mitocondria
Autofagosomas
Fagolisosomas
Fig5.4ModificadodeTheCellAMolecularApproachdeCooper Hidrolasascidaslisosomales Loslisosomascontienenaproximadamente50tiposdiferentesdeenzimasdegradativas quepuedenhidrolizarprotenas,ARN,ADN,polisacridosylpidos. Las mutaciones en los genes que codifican estas enzimas son la causa de ms de 30 enfermedades hereditarias humanas. Por ejemplo la patologa de Gaucher, es una enfermedadresultantedeunamutacinqueafectaalgenquecodificaunaenzimaque hidrolizapolisacridos. Todaslasenzimaslisosomalessonhidrolasascidasqueposeenactividada~pH5(Fig 5.5).EstepHprevieneladigestindelasmolculasorgnicasfueradeloslisosomasya queelpHdelcitosolesaproximadamente7,2.
163

AnsiserompelamembranaLisosomal,lashidrolasascidaspermaneceninactivas
ParamantenerelpHcidoensuinterior,loslisosomasdebenbombearcontinuamente protonesH+.Estoserealizamedianteunabombaprotnicaenlamembranalisosomal. EstebombeorequiereenergaatravsdelahidrlisisdeATP EndocitosisyFormacindeLisosomas Una de las principales funciones de los lisosomas es la digestin de los materiales capturadosdelexteriordelasclulasporendocitosis.
Lisosoma
Hidrolasas cidas
Citosol
Fig5.5Modificadode:TheCellaMolecularApproach.G.Cooper(2000)
FagocitosisyAutofagia Adems de la degradacin de las molculas capturadas por endocitosis, los lisosomas digierenmaterialderivadodeotrasdosrutas:fagocitosisyautofagia. Enelprocesodefagocitosissedegradanpartculasporclulasespecializadascomolos macrfagos. Los lisosomas tambin son responsables del intercambio gradual de los componentes 164

celularespropios.
Laautofagiaesresponsabledelrecambiogradualdelasorganelascitoplasmticas.
165
CAPTULO SEXTO:
Bioenergtica Mitocondrias Cloroplastos y Peroxisomas
166
BIOENERGTICA
Laenergapuededefinirsesimplementecomolacapacidadpararealizartrabajo,locual incluye sintetizar molculas, mover objetos, y generar calor y luz. Hay dos tipos de energa: energa cintica y energa potencial. Ambas a su vez pueden presentarse de muchasformasdistintas.Laenergacinticaodemovimientoincluyelaluz(movimiento de fotones), el calor (movimiento de molculas), la electricidad (movimiento de partculas con carga elctrica). La energa potencial o energa almacenada, incluye la energa qumica almacenada en una batera y la de posicin almacenada en un clavadista que est a punto de lanzarse. En las condiciones apropiadas, la energa cinticasepuedetransformarenpotencialyviceversa. Para comprenderel flujo de energanecesitamos conocer dos cosas: (l) la cantidad de energa disponible y (2) la utilidad de la energa; ambos temas son descriptos por las leyesdelatermodinmica. Lasleyesdelatermodinmicadefinenlaspropiedadesbsicasyelcomportamientode laenerga.Laprimeraleydelatermodinmicaestablecequesinohayaportedeenerga lacantidadtotaldeenergasemantieneconstante.Losprocesosordinariosnopueden nicrearnidestruirenerga,perosipuedencambiarladeunaformaenotra(porejemplo energa qumica en energa trmica). Por esto la primera ley de la termodinmica se denominatambin:leydelaconservacindelaenerga. Lasegundaleydelatermodinmicaestablecelatendenciauniversaldelossistemasal desorden:eneluniversooenunsistemaaislado(unacoleccindemateriaqueseaisla completamente del universo) el grado de desorden solo puede incrementarse. La cantidaddedesordenqueusamosparamedirestedesordensedenominalaentropade unsistema:cuantomsgrandeeslaentropamayoreseldesorden. Lasclulas vivaspara sobrevivir,crecer, yconformar organismoscomplejos generan ordenyasaparecencomocontradiciendoalsegundoprincipiodelatermodinmica.Sin embargo,comolaclulanoesunsistemaaisladoyaquetomaenergadelambienteen formadealimentos,fotonesdeluzocomoocurreenalgunasbacteriasquimiotrofasde molculasinorgnicas,yusanestaenergaparagenerarordendentrodeellasmismas. Enelcursodelasreaccionesqumicasquegeneranorden,partedelaenergaesdispada 167

ambiente en forma de calor. Este calor desordena el ambiente circundante, de tal al
formaquelaentropatotalsumandolaclulamssuambienteincrementacomolo demandala2daleydelatermodinmica. MITOCONDRIASCLOROPLASTOSYPEROXISOMAS Ademsdeestarinvolucradaseneltransporteyclasificacindeprotenas,lasorganelas citoplasmticasproporcionancompartimientos enloscualestienen lugaruna variedad de actividades metablicas. La generacin de energa metablica es una de las actividadesprincipalesdelasclulasysondoslasorganelasqueestnespecficamente dedicadas al metabolismo energtico y a la produccin de ATP. Las mitocondrias son responsables de la generacin de la mayor parte de la energa derivada de la degradacindecarbohidratosylpidos.Loscloroplastos,porotrolado,usanlaenerga capturada de la luz solar para generar tanto ATP como poder reductor para sintetizar carbohidratosapartirdeCO2yH2O.Unaterceraorganela,losperoxisomas,contienen las enzimas involucradas en varias vas metablicas que incluyen la degradacin de cidosgrasosyelmetabolismodeunsubproductodelafotosntesis. Las mitocondrias, los cloroplastos y los peroxisomas difieren de las otras organelas no sloensusfuncionessinoenlosmecanismosdeensamble.Enlugardesersintetizadas enlosribosomasunidosamembrana,ytranslocalizadasalRE,lasprotenasdestinadasa mitocondrias, cloroplastos y peroxisomas, son sintetizadas sobre ribosomas libres e importadosalinteriordelasorganelasblancocomocadenaspolipeptdicascompletas. Lasmitocondriasyloscloroplastoscontienensupropiogenoma,elcualincluyealgunos genesquesontranscriptosytraducidosdentrodelaorganela. MITOCONDRIAS Estas organelas juegan un rol crtico en la generacin de la energa metablica en las clulas eucariotas (Fig 6.1). Tal como se revis antes, son las responsables de la generacin de la mayor parte de la energa til derivada de la degradacin de los carbohidratos y los cidos grasos, que son convertidos a ATP por el proceso de fosforilacinoxidativa.Lamayoradelasprotenasmitocondrialessontraducidasenlos ribosomas citoslicos libres e importados hacia la organela por seales de direccionamientoespecficas. 168

Las mitocondrias poseen su propioADN quecodifica ARNts, ARNrs y algunas protenas
mitocondriales.Elensamble delasmitocondriasinvolucraprotenascodificadas porsu propio genoma y traducidas dentro de la organela, as como tambin protenas codificadasporelgenomanuclear,eimportadasdelcitosol.
Crestas Matriz
Membrana MitochondrialInt.
Membrana MitocondrialExt. Espacio intermembrana
Fig6.1Modificadode:TheCellaMolecularApproachdeG.Cooper(2000)
ORGANIZACINYFUNCINDELASMITOCONDRIAS Lasmitocondriasestnrodeadasdeundoblesistemademembrana,consistenteenuna membrana interna y una externa separadas por un espacio intermembrana. La membranainternapresentanumerosospliegues,(crestas) quese extienden alinterior (matriz)delaorganela.Cadaunodeestoscomponentesjuegaunrolfuncionaldiferente conlamatrizylamembranainternarepresentandolosprincipalescompartimientosde trabajodelasmitocondrias.Lamatrizcontieneelsistemagenticodelasmitocondrias as como las enzimas responsables de las reacciones centrales del metabolismo oxidativo. La degradacin oxidativa de la glucosa y de los cidos grasos son las principalesfuentesdeenergametablicaenlasclulasanimales.Losestadiosiniciales en el metabolismo de la glucosa (gluclisis) ocurren en el citosol, donde la glucosa es convertidaapiruvato.Elpiruvatoesluegotransportadohacialamitocondria,dondese producesuoxidacincompletaformandoCO2yelgruesodelaenergautilizable(ATP). 169

EstoinvolucralaoxidacininicialdepiruvatoaacetilCoA,queluegoesdegradadaaCO2
vaelciclodelcidoctrico.Laoxidacindecidosgrasos,tambinproduceacetilCoA queesmetabolizadoenformasimilarenelciclodelcidoctricoenlasmitocondrias.Las enzimas del ciclo del cido ctrico (localizadas en la matriz de las mitocondrias) son claves en la degradacin tanto de los carbohidratos como de los cidos grasos. La oxidacin de acetilCoAa CO2 estacoplada a la reduccin de NAD+ y FAD a NADH y FADH2 respectivamente. La mayor parte de la energa derivada del metabolismo oxidativoesluegoproducidaporelprocesodefosforilacinoxidativaelcultienelugar en la membrana mitocondrial interna. Los electrones de alta energa provenientes del NADH y FADH2 son transferidos a travs de una serie de transportadores en la membrana a oxgeno molecular. La energa derivada de estas reacciones de transferencia es convertida a energa potencial almacenada en un gradiente de protones a travs de la membrana que es luego utilizada para conducir la sntesis de ATP. La membrana mitocondrial interna representa el principal sitio de generacin de ATP y este rol crtico se refleja en su estructura. Primero, su rea superficial est substancialmente incrementada por su plegamiento en crestas. Adems, la membrana mitocondrialinternacontieneuninusualmentealtoporcentajedeprotenas(superioral 70%) involucradas en el proceso de fosforilacin oxidativa, en el transporte de metabolitos(porej.,piruvato,cidosgrasos)entreelcitosolylasmitocondrias.Porotro lado, la membrana interna es impermeable a la mayora de los iones y molculas pequeasunapropiedadcrticaparamantenerelgradientedeprotonesqueconducea la fosforilacin oxidativa. En contraste con la membrana interna, la externa es libremente permeable a las molculas pequeas. Esto se debe a que esta contiene protenas llamadas porinas que forman canales que permiten la libre difusin de molculas menores a 6.000 daltons. La composicin del espacio intermembrana en cuanto a iones y molculas pequeas, es similar al citosol. La membrana mitocondrial interna es la verdadera barrera funcional al pasaje de pequeas molculas entre el citosol y la matriz y mantiene el gradiente protnico que conduce la fosforilacin oxidativa. ElSistemaGenticodelasMitocondrias Lasmitocondriascontienensupropiosistemagentico,queestseparadoyesdiferente 170

del genoma de la clula. Se piensa que las mitocondrias habran evolucionado de
bacterias libres, capaces de metabolizar el oxgeno (aerobias). Estas bacterias, escapandoaladigestin,sehabrandesarrolladoensimbiosis,viviendoenelinteriorde clulas ms grandes, presumiblemente anaerobias (endosimbiosis). As, en esta asociacinmutual,lasmitocondriashabranobtenidoproteccionynutriciondelaclula predadora en retorno a la generacin de energa que le proveyeron a la clula hospedadora. Esta hiptesis ha sido recientemente sostenida por los resultados de anlisis de secuencia de ADN que revelan fuertes similitudes entre los genomas de mitocondrias y de bacterias como Rickettsia prowazekii. Las Rickettsia son parsitos intracelularesque,comolasmitocondrias,slosoncapacesdereproducirsedentrode clulaseucariotas.Consistenteconsustiposdevidasimbitica,lassecuenciasdeADN demitocondriasyRickettsiasugierenquecompartenancestroscomunes,deloscuales habra evolucionado el sistema gentico de las mitocondrias de nuestros das. Los genomasmitocondrialesusualmentesonmolculascircularesdeADN,similaresalosde lasbacterias,lascualesestnpresentesenmltiplescopiaspororganela.Losgenomas varan considerablemente en tamao entre las distintas especies. Los de las mitocondrias humanas y de otros animales poseen slo 16 Kb, pero, genomas mitocondriales substancialmente mayores, se encuentran en levaduras
(aproximadamente 80 kb) o en plantas (ms de 200kb). Sin embargo estos genomas mitocondriales grandes, estn compuestos predominantemente de secuencias no codificantesynoparecencontenermsinformacingenticasignificativa.Porejemplo, el genoma mitocondrial de secuencia ms larga, es el de Arabidopsis thaliana. Sin embargo, el ADN mitocondrial de Arabidopsis de alrededor de 367 Kb codifica slo 32 protenas, aproximadamente dos veces el nmero codificado por el ADN mitocondrial humano.Elmayornmerodegenesmitocondrialeshasidoencontradoenelprotozoo Reclinomonas americana el cual es de 69 kb y contiene 97 genes. El genoma mitocondrialdeReclinomonasrecuerdamsestrechamentealgenomadelasbacterias delascualeslasmitocondriashabranevolucionado,quealgenomadelasmitocondrias actualeslasqueslocodificanunpequeonmerodeprotenasquesoncomponentes esenciales del sistema de fosforilacin oxidativa. El genoma mitocondrial codifica tambintodoslosARNsribosomalesylamayoradelosARNdetransferencianecesarios 171

para la traduccin de estas secuencias codificantes de protenas dentro de las
mitocondrias.Otrasprotenasmitocondrialessoncodificadaspor losgenesdelncleo, loscualessepiensaquehansidotransferidosalncleodesdeelgenomamitocondrial ancestral. Elgenomamitocondrialhumanocodifica13protenasinvolucradaseneltransportede electronesylafosforilacinoxidativa.TambincodificalosARNrs16Sy12Sy22tiposde ARNts requeridos para la traduccin de las protenas requeridas por la organela. Los ribosomasmitocondrialesdeanimalesylevadurasslocontienendostiposdeARNrs,en contrasteconlostrescomponentesdelosribosomasdelasbacterias(23S,16Sy5S).El ADNmitocondrialdevegetalestambincodificauntercerARNrde5S.Lasmitocondrias deplantasyprotozoostambindifierenenelhechodeutilizartantoARNtscodificados por el genoma nuclear, como por el de la organela, mientras que las mitocondrias animalesslousanARNtscodificadosporelgenomamitocondrial. El pequeo nmero de ARNts codificados por el genoma mitocondrial resalta una caracterstica del sistema gentico mitocondrial el uso de un cdigo gentico ligeramentediferente,delusadoporlasclulasprocariotasyeucariotas.
Tabla 1. Diferencias entre el cdigo gentico universal y el cdigo gentico de mitocondrias. Codn Cdigo Universal Cdigo mitocondrial humano Trp Stop UGA Stop Arg AGA Stop Arg AGG Met Ile AUA En plantas y levaduras hay otros codones que varan en relacin al cdigo universal.
MuchosARNtstantoenclulasprocariotascomoeucariotassoncapacesdereconocer ms de un codn en el ARNm en funcin del wobble que permite algn error de apareamientoentreelARNtylaterceraposicindeciertoscodonescomplementarios. Sin embargo, se requieren al menos 30 ARNts diferentes para traducir el cdigo universaldeacuerdoalasreglaswobble.AnelADNmitocondrialhumanocodificaslo 22 ARNts, y estos son los nicos ARNts usados para la traduccin de los ARNm mitocondriales. Esto se realiza por una forma de wobble extrema en la que los nucletidos que contenienen U en el anticodn del ARNt, pueden aparearse con 172

cualquieradelascuatrobasesenlaposicindelARNmpermitiendoquecuatrocodones
sean reconocidos por un nico ARNt. Adicionalmente, algunos codones especifican diferentesaminocidosenmitocondriasqueenelcdigouniversal(tabla1). ComoelADNnuclear,elmitocondrialpuedeseralteradopormutaciones,lascualesson frecuentemente letales para la organela. Ya que casi todas las mitocondrias de los vulosfecundadosprovienendelosovocitos,msquedelesperma,lasmutacionesdel ADN mitocondrial son transmitidas a la siguiente generacin por va materna. Tales mutaciones se han asociado con numerosas enfermedades. Por ejemplo la neuropata ptica de Leber, una enfermedad que lleva la ceguera puede ser causada por mutaciones en los genes mitocondriales que codifican componentes de la cadena de electrones. Adicionalmente la acumulacin de mutaciones mitocondriales durante la vida de los individuos ha sido sugerida como uno de los contribuyentes al proceso de envejecimiento. ImportacinyEnsambledeProtenasenlasMitocondrias
En contraste a los componentes del ARN, (ARNrs y ARNts), la mayora de los genomas
mitocondrialesnocodificanlasprotenasrequeridasparalareplicacin,transcripciny traduccin mitocondrial. En su lugar, los genes que codifican las protenas requeridas paralareplicacinyexpresinestnenelgenomanucleardelaclula.Adicionalmente, el ncleo contiene la mayora de las protenas mitocondriales requeridas para la fosforilacin oxidativa y todas las mitocondrias involucradas en el metabolismo mitocondrial (por ejemplo las enzimas del ciclo del cido ctrico). Las protenas codificadas por estos genes (ms del 95% de las protenas mitocondriales) son sintetizadas en ribosomas citoslicos libres e importados hacia las mitocondrias conforme completan cadenas polipeptdicas. Debido a la doble membrana de las mitocondrias, la importacin de las protenas es considerablemente ms complepleja quelatransferenciadeunpolipptidoatravsdeunabicapafosfolipdicasimplecomo ocurreenelRER.Lasprotenasquesondireccionadashacialamatrizdebencruzarlas membranas mitocondriales interna y externa, mientras que otras protenas deben ser clasificadasadistintoscompartimientosdentrodelaorganela(porejemplo,elespacio intermembrana). 173

Laimportacindeprotenascuyodestinoeslamatrizmitocondrialeselaspectomejor
comprendidodelaclasificacindeprotenasmitocondriales.Lamayoradelasprotenas son direccionadas hacia la mitocondria por secuencias aminoterminales de 20 a 35 aminocidos llamadas presecuencias, que son removidas por clivaje proteoltico despus de ser importadas hacia la organela. Las presecuencias de las protenas mitocondriales contienen mltiples residuos de aminocidos bsicos cargados positivamentequeusualmentesepresentancomounahlicealfaanfiptica.Elprimer pasoenlaimportacindelasprotenaseslaunindeestaspresecuenciasaunreceptor sobre la superficie de la mitocondria. Las cadenas polipeptdicas son luego insertadas hacia un complejo proteico que dirige la translocalizacin a travs de la membrana externa(latranslocasadelamembranaexternaocomplejoTOM,delinglsTranslocase Outer Membrane complex). Las protenas son luego transferidas a un segundo complejo en la membrana interna, (la translocasadelamembranainterna o complejo TIM: del ingls Translocase Inner Membrane complex). La continuidad de la translocalizacin de las protenas requiere que se establezca el gradiente de potencial electroqumicoatravsdelamembranamitocondrialinterna,loquecomoveremos,se produce durante el transporte de electrones. Como se ver en la siguiente seccin, la transferenciadeelectronesdealtaenergadesdeelNADHyFADH2aloxgenomolecular estacopladaalatransferenciadeprotonesdesdelamatrizalespaciointermembrana. Como los protones son partculas cargadas, esta transferencia establece un potencial elctricoatravsdelamembranainterna,quedandolamatrizconcarganegativa. Debido a que los protones son partculas cargadas, esta transferencia establece un potencialelctricoatravsdelamembranainterna,elculconducelatranslocalizacin delaspresecuenciaspositivamentecargadas. Parasertranslocalizadasatravsdelamembrana,lasprotenasdebenpermanecer,al menosparcialmente,sinplegarse.Consecuentemente,laimportacindeprotenashacia las mitocondrias requiere la presencia de chaperonas moleculares adems de las protenasdelamembranainvolucradasenlatranslocalizacin.Enelladocitoslico,los miembros de la familia de las chaperonas Hsp70 mantienen a las protenas en estado parcialmente desplegado de tal manera que pueden ser insertadas en la membrana 174

mitocondrial.Conformecruzanlamembrana,elpolipptidosinplegarsese uneaotro
miembro de la familia de las chaperonas Hsp70 que se asocia con el complejo Tim y acta como motor que conduce la importacin de protenas. El polipptido es luego transferidoaunachaperonadelafamiliadelasHsp60(unachaperonina)dentrodela cul tiene lugar el plegamiento de las protenas. Ya que estas interacciones de las cadenaspolipeptdicasconlaschaperonasmolecularesrequierenATP,laimportacinde protenas requiere de ATP tanto del lado interno como externo de la membrana; ademsdelpotencialelctricoatravsdelamembranainterna. Como se indic antes, algunas protenas mitocondriales son direccionadas a las membranasmitocondrialesexterna,interna,oalespaciointermembranaenlugardela matrizporloquerequierendeunmecanismoadicionalparadireccionarestasprotenas al compartimiento submitocondrial correcto. Estas protenas son direccionadas a sus destinosporunasegundasealdedireccionamiento.Lasprotenascuyosdestinosson lasmembranasmitocondrialesparecenestarmediadasporsecuenciasdeparadadela transferenciaquedetienenlatranslocalizacindelacadenapolipeptdicaatravsdelos complejos Tim o Tom, conduciendo su insercin hacia la membrana externa o interna respectivamente.Lasprotenaspuedenserdireccionadasalespaciointermembranapor varios mecanismos diferentes. Algunas protenas son transferidas a travs de la membrana externa a travs del complejo Tom pero son luego liberadas dentro del espacio intermembrana en lugar de ser transferidas al complejo Tim. Otras protenas son transferidas al complejo Tim pero luego son liberadas hacia el espacio intermembrana como resultado del clivaje de secuencias de parada hidrofbicas. An puede ocurrir que otras protenas puedan ser completamente importadas hacia la matrizmitocondrialyluegoretroexportadasatravsdelamembranainternahaciael espaciointermembrana. No slo las protenas sino los fosfolpidos de las membranas mitocondriales son importadasdelcitosol.Enclulasanimales,lafosfatidiletanolaminaylafosfatidilcolina son sintetizadas en el REL y transportadas a las mitocondrias por protenas transportadoras de fosfolpidos que extraen molculas de fosfolpidos simples de la membrana del RE. Los lpidos pueden ser luego transportados a travs del ambiente 175

acuosodelcitosol,encerradasensitiodeuninhidrofbicodelaprotena,yliberados
cuando el complejo arriba a una nueva membrana como la de las mitocondrias, directamenteenalgunadelashojuelasdelabicapafosfolipdica.Lasmitocondriasluego sintetizan fosfatidilserina, a partir de la fosfatidiletanolamina, adems de catalizar la sntesisdeunfosfolpidoinusual,lacardiolipinaquecontienecuatrocadenasdecidos grasos. ElmecanismodelaFosforilacinOxidativa La mayor parte de la energa utilizable, obtenida de la degradacin de los hidratos de carbono, es derivada de la fosforilacin oxidativa que tiene lugar dentro de las mitocondrias.Porejemplo,ladegradacindelaglucosaporgluclisisyelciclodelcido ctricoproducenuntotalde4(cuatro)molculasdeATP,10(diez)molculasdeNADHy 2(dos)molculasdeFADH2.LoselectronesdelNADHyFADH2sonluegotransferidosa oxgeno molecular acoplados a la formacin de 32 a 34 molculas de ATP por fosforilacin oxidativa. El transporte de electrones y la fosforilacin oxidativa son actividades crticas de una serie de complejos proteicos en la membrana mitocondrial interna,quefinalmenteactancomolasprincipalesfuentesdeenerga. Cadenatransportadoradeelectrones Durante la fosforilacin oxidativa los electrones derivados del NADH y del FADH2 combinadosconO2,ylaenergaliberadadeestasreaccionesdeoxidacinreduccines usada para conducir la sntesis de ATP a partir de ADP. La transferencia de electrones desde NADH a O2 es una reaccin productora de mucha energa, con un G= 52.5 kcal / mol por cada par de electrones transferidos. Para ser cosechada como energa utilizable,estaenergadebeserproducidagradualmente,porelpasajedeelectronesa travsdeunaseriedetransportadores,lacualconstituyelacadenatransportadorade electrones. Estos transportadores estn organizados en cuatro complejos en la membranamitocondrial interna.Unquintocomplejo deprotenasactaacoplandolas reaccionesproductorasdeenergadeltransportedeelectronesasntesisdeATP. LoselectronesdelNADHentranalacadenatransportadoradeelectronesenelcomplejo I elculconsisteenaproximadamente40cadenas polipeptdicas.Estoselectronesson 176

inicialmentetransferidosdesdeNADHalflavinmononucletidoyluego,atravsdeun
transportadorquecontienesulfurodehierroalacoenzimaQunprocesoproductorde energa con un G= 16.6 kcal/mol. La coenzima Q (tambin llamada ubiquinona) es una pequea molcula liposoluble que transporta electrones desde el complejo I a travsdelamembranaalcomplejoIII,queconsisteenalrededorde10polipptidos.En elcomplejoIII,loselectronessontransferidosdesdeelcitocromobalcitocromoc,una reaccin con un rendimiento energtico con un G= 10,0 kcal/mol. El citocromo c, unaprotenaperifricademembranaunidaalacaraexternadelamembranainterna, luego transporta los electrones al complejo IV (citocromo oxidasa), donde son finalmentetransferidosalO2(G=25,8kcal/mol). Uncomplejodeprotenasdiferente,(elcomplejoII),queconsistedecuatropolipptidos recibe los electrones del intermediario del ciclo del cido ctrico, succinato. Estos electrones son transferidos del FADH2 (en lugar del NADH), y luego a la coenzima Q. DesdelacoenzimaQ,loselectronessontransferidosalcomplejoIIIyluegoalcomplejo IVcomoyasehadescripto.EncontrasteconlatransferenciaelectronesdesdeelNADH a la coenzima Q del complejo I, la transferencia de electrones desde FADH2 a la coenzimaQnoestasociadaconunadisminucinsignificativaenlaenergalibre,esta disminucinesimportantesloentreloscomplejosIIIyIV. LaenergalibrederivadadesdeelpasajedeelectronesatravsdeloscomplejosI,IIIyIV escosechadaporestaracopladaalasntesisdeATP. Unhechoimportante,esque el mecanismo por el cul la energa derivada de estas reacciones de transporte de electrones est acoplada a la sntesis de ATP es fundamentalmente diferente de la sntesis de ATP durante la gluclisis o el ciclo del cidoctrico.Enelltimocaso,unfosfatodealtaenergaestransferidodirectamente. Acoplamientoquimiosmtico El mecanismo de acoplamiento del transporte de e a la generacin de ATP: el acoplamiento quimiosmtico es un ejemplo dela ajustada relacin entre estructura y funcinenbiologacelular.
177

hiptesis del acoplamiento quimiosmtico fue propuesta por P. Mitchell en 1.961 La
quin sugiri que el ATP se genera por el uso de la energa almacenada en forma de gradiente protnico a travs de las membranas biolgicas, ms que por transferencia qumicadegruposdealtaenerga. Estahiptesisnofuecompartidaensumomentoydebitranscurrirunadcadaparaser aceptadaporlacomunidadcientficaengeneral. El transporte de e a travs de los complejos I, III y IV est acoplado al transporte de protones desde la matriz de la mitocondrias al espacio intermembrana. As, las reacciones productoras de energa del transporte de electrones estn acopladas a la transferenciadeprotonesdesdelamatrizalespaciointermembrana.LoscomplejosIy IV parecen actuar como bomba de protones que transportan protones a travs de la membranacomoresultadodecambiosconformacionalesinducidosporeltransportede electrones.EnelcomplejoIIIlosprotonessontransferidosatravsdelamembranapor la accin de la coenzima Q que transporta electrones desde la matriz hacia el espacio intermembranaenelcomplejoIII.LoscomplejosIyIIItransfierencadauno4protonesa travsdelamembranaporcadapardeelectrones.EnelcomplejoIV,sebombeandos protonesporcadapardeelectronesbombeadosatravsdelamembranayotroparde protonescombinandoconO2yparaformarH2Odentrodelamatriz.As,elequivalente de cuatro protones por par de electrones es transportado fuera de la matriz mitocondrialencadaunodeestos3complejos.Estatransferenciadeprotonesdesdela matrizhaciaelespaciointermembranajuegaunrolcrticoenlaconversindelaenerga derivadadelasreaccionesdeoxidacinreduccinalaenergapotencialdeltransporte deelectronesalmacenadaenungradientedeprotones. Debidoaquelosprotonessonpartculascargadas,laenergapotencialalmacenadaen elgradienteprotnicoestantodenaturalezaqumicacomoelctrica,correspondeala diferenciadevoltajeatravsdelamembranamitocondrialinterna,dentrodelamatriz delamitocondriaesnegativayelespaciointermembranaespositivo. Lacorrespondienteenergalibre(G)estdadaporlaecuacin:
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G=F.Vn
Donde: F:constantedeFaradayy
V:potencialdemembrana
La energa libre adicional correspondiente a la diferencia en la [H+] est dada por la ecuacin.
G=RT.ln[H+]i/[H+]0xx
Donde:[H+]iconcentracindentrodelasmitocondrias[H+]0:fueradelasmitocondrias. Enclulasmetablicamenteactivas,losprotonessonbombeadosfueradelamatriz,de tal manera que el gradiente de protones es cerca de una unidad de pH o una concentracindiezvecesmenor.ElpHdelamatrizmitocondrialescercanoa8(bsico) comparadoconelpHneutral(~7)delespaciointermembranaydelcitosol. Estegradientegeneraunpotencialelctricodecercade0,14Vatravsdelamembrana conlamatriznegativa.Tantoelgradientede pHcomo el potencialelctricoconducen los protones de regreso a la matriz, desde el citosol, combinndose para formar un gradiente electroqumico a travs de la membrana mitocondrial interna, correspondiendo a un G ~ 5 kcal / mol por cada protn. Debido a que la bicapa fosfolipdica es impermeable a los iones, los protones son capaces de atravesar la membrana slo a travs de un canal proteico. Esta restriccin permite cosechar la energadelgradienteelectroqumicoyconvertirlaenATPcomo resultadodelaaccin del complejo V o ATP sintetasa. sta est organizada en 2 componentes estructuralmentediferentes:F0yF1ligadosporuntallodelgado.LaporcinF0atraviesa la membrana interna y provee el canal a travs del cual fluyen los protones. En particular,elflujodeelectronesatravsdeF0conducelarotacindeF1,elquecomoun motorrotativo,conducelasntesisdeATP. ParecequeelflujodecuatroprotonesqueregresanatravsdeF0sonnecesariospara conducirlasntesisdeunamolculadeATPporF1,consistenteconlatransferenciadeal 179

complejoI,IIIyIVcadaunacontribuyendoconsuficienteenergalibrealgradientede
protonesparaconducirlasntesisdeunamolculadeATP.Laoxidacindeunamolcula deNADHllevaasala sntesisde tresmolculasdeATP,mientrasquelaoxidacinde FADH2,queingresaalacadenatransportadoradeelectronesalcomplejoII,produciendo slodosmolculasdeATP. CloroplastosyotrosPlstidos Loscloroplastos,lasorganelasresponsablesdelafotosntesis,sonenmuchosaspectos similares a las mitocondrias. Ambas organelas tienen como funcin la generacin de energa metablica, habran evolucionado por endosimbiosis, contienen su propio sistemagenticoysereplicanpordivisin.Sinembargo,loscloroplastossonmayoresy mscomplejosquelasmitocondrias,yrealizanvariastareascrticasademsdegenerar ATP. Los cloroplastos son los responsables de la conversin fotosinttica de CO2 a carbohidratos.Adicionalmente,loscloroplastossintetizanaminocidos,cidosgrasosy los componentes lipdicos de su propia membrana. La reduccin de nitrito (NO2) a amonio (NH3+),unpasoesencialenla incorporacinde nitrgeno enlos componentes orgnicos, ocurre en los cloroplastos. Los cloroplastos son slo un tipo de varias organelas relacionadas (Plstidos) que juegan una variedad de papeles en las clulas vegetales. LaEstructurayFuncindelosCloroplastos Loscloroplastosvegetalessonorganelasgrandes(5a10mdelongitud)quecomolas mitocondriasestnlimitadasporunadoblemembranallamadalacubiertacloroplstica. Ademsdelasmembranasinternayexternadelacubierta,loscloroplastosposeenun tercer sistema de membranas internas llamado la membrana tilacoides. Esta ltima, forma una red de discos aplanados denominados tilacoides que frecuentemente se arreglan formando pilas que se llaman grana. Debido a esta estructura de membrana triple, la estructura interna de los cloroplastos es ms compleja que la de las de mitocondrias. En particular sus tres membranas dividen al cloroplasto en tres compartimientosinternos:(1)elespaciointermembranosoentrelasdosmembranasde la cubierta del cloroplasto, (2) el estroma, el cual estpor dentro delacubiertay por fueradelamembranatilacoides;(3)ellumendeltilacoides. 180

Apesardelamayor complejidadestructural,lamembrana delcloroplasto tieneclaras
similitudes funcionales con la de las mitocondrias como es de esperar dado el rol de ambasorganelas,enlageneracinquimioosmticadeATP.Lamembranaexternadela cubierta del cloroplasto contiene porinas y es libremente permeable a pequeas molculas. En contraste, la membrana interna es impermeable a iones y metabolitos que pueden penetrar al cloroplasto slo por medio de transportadores especficos de membrana. Estas propiedades de las membranas interna y externa de la cubierta del cloroplasto son similares a las membranas interna y externa de las mitocondrias. El estroma del cloroplasto es tambin equivalente a la matriz mitocondrial, contiene el sistemagenticodeloscloroplastosyunavariedaddeenzimasmetablicas,incluyendo lasresponsablesdelaconversindeCO2acarbohidratosdurantelafotosntesis. La mayor diferencia entre cloroplastos y mitocondrias en trminos de estructura y funcin, es la membrana tilacoides. Esta membrana es de importancia central en cloroplastos donde acta como la membrana mitocondrial interna en el transporte de electrones y en la generacin quimiosmtica de ATP. La membrana interna de los cloroplastosquenoestplegadaformandocrestascomoenlasmitocondrias,noacta en la fotosntesis. El sistema de transporte de electrones de los cloroplastos est localizadoenlamembranatilacoidal,yloselectronessonbombeadosatravsdeesta membrana desde el estroma al lumen del tilacoides. El gradiente electroqumico resultanteconducelasntesisdeATPconformelosprotonescruzanhaciaelestroma.En funcindeesterolenlageneracindeenergametablica,lamembranatilacoidesde loscloroplastosesequivalentealamembranainternadelasmitocondrias. ElGenomadelosCloroplastos Como las mitocondrias, los cloroplastos poseen su propio sistema gentico, reflejando susorgenesevolutivosapartirdebacteriasfotosintticas.Elgenomadeloscloroplastos es similar al de las mitocondrias en que consiste de molculas circulares de ADN, presentes en mltiples copias por organela. Sin embargo, los genomas de los cloroplastossonmasgrandesymscomplejosquelosdelasmitocondrias,conunrango quevadesdelos120a160kbyconteniendoaproximadamente120genes.
Tabla 6.2: Genes codificados por el ADN del Cloroplasto
181
Funcin N de genes Genes para el aparato gentico 4 ARNrs (23S; 16S; 5S; 4,5S) 30 ARNts 21 Protenas ribosomales 4 Subunidades de la ARN polimerasa Genes para la Fotosntesis 5 Fotosistema I 12 Fotosistema II 4 Complejo Citocromo bf 6 ATP sintetasa 1 Ribulosa bifosfato carboxilasa Los anlisis de secuencia indican que los genomas de los cloroplastos contienen cerca de 30 genes adems de los listados aqu. Algunos de estos genes codifican protenas involucradas en la respiracin pero la mayora an deben ser identificadas
Los genomas de los cloroplastos de varias plantas, han sido completamente secuenciadosllevandoalaidentificacindemuchosdelosgenescontenidosenelADN de la organela. Estos genes de los cloroplastos codifican tanto ARNs como protenas involucrados en la expresin gnica como as tambin una variedad de protenas que actanenlafotosntesis.TantolosARNsribosomalescomolosdetransferenciausados enlatraduccindelosARNmsdeloscloroplastossoncodificadosporelgenomadela organela. Estos incluyen cuatro ARNrs: 23S, 16S, 5S y 4,5S y 30 especies de ARNts. En contraste con el menor nmero de ARNts codificado por el genoma mitocondrial, los ARNtsdeloscloroplastossonsuficientesparatraducirtodosloscodonesdelARNmde acuerdoalcdigogenticouniversal.AdemsdeestosARNscomponentesdelsistema detraduccin,elgenomadeloscloroplastoscodificaaproximadamente20protenasde los ribosomas de los cloroplastos, las que representan aproximadamente 1/3 de las protenasdelosribosomasdeloscloroplastos.AlgunasdelassubunidadesdelasARN polimerasassontambincodificadasporloscloroplastos,aunquesenecesitanalgunas subunidadesdelaARNpolimerasayotrosfactoresquesoncodificadosporelgenoma nuclear. El genoma de los cloroplastos tambin codifica aproximadamente 30 protenas que estn involucradas en el proceso de la fotosntesis incluyendo componentes de los fotosistemasIyII,delcomplejodecitocromosbfydelaATPsintetasa.Adems,unade lassubunidadesdelaribulosacarboxilasabifosfato(rubisco)escodificadaporelADN deloscloroplastos.EstaenzimaescrticayaquecatalizalaadicindeCO2alaribulosa 182

1,5bifosfatoduranteelciclodeCalvin.Nosloeselprincipalcomponentedelestroma
mitocondrialsinoquesecreequeeslaprotenamsabundantesobrelatierra. ImportacinyClasificacindelasProtenasdelosCloroplastos Aunque los cloroplastos codifican una mayor proporcin de sus propias protenas que lasmitocondrias,cercadel90%delasprotenasdeloscloroplastossoncodificadaspor losgenesnucleares.Comoocurreconlasmitocondrias,estasprotenassonsintetizasen los ribosomas citoslicos y luego son importadas hacia los cloroplastos conforme se completan las cadenas polipeptdicas. Estas deben ser luego clasificadas hacia sus localizacionesapropiadasdentrodelos cloroplastosunatareaanmscomplejaque enlasmitocondriasyaqueloscloroplastosposeentressistemasdemembranaquelos dividenentrescompartimientosinternosdiferentes. La importacin de protenas hacia los cloroplastos generalmente recuerda la importacin de las protenas mitocondriales. Las protenas son direccionadas para ser importadashacialoscloroplastosporsecuenciasNterminalesde30a100aminocidos denominados pptidos de trnsito, los cuales direccionan la translocalizacin de las protenasatravsdelasdosmembranasdelascubiertasdeloscloroplastosyluegoson removidos por clivaje proteoltico. Los pptidos de trnsito son reconocidos por los complejosdetranslocalizacindelamembranacloroplsticaexterna(elcomplejoToc), y las protenas son transportadas a travs de este complejo cruzando la membrana. Estas son transferidas a los complejos de translocalizacin de la membrana interna (el complejoTic)ytransportadasatravsdelamembranainternahaciaelestroma.Como ocurre con las mitocondrias, se requieren chaperonas moleculares tanto sobre el lado estromalcomosobreelcitoslicodelacubiertaparalaimportacindelasprotenas,las que requieren energa en forma de ATP. En contraste con las presecuencias de la importacinmitocondrial,lospptidosdetrnsitonoestncargadospositivamenteyel transportedelascadenaspolipeptdicasnorequiereunpotencialelctricoatravsdela membrana. Las protenas que van a ser direccionadas hacia el lumen del tilacoide, son transportadashaciasusdestinosendospasos.Primerosonimportadashaciaelestroma como se ha descripto y luego son direccionadas por una segunda secuencia seal 183

hidrofbica,queesexpuestaluegodelclivajedelpptidodetrnsito.Lasecuenciaseal
hidrofbica dirige la translocalizacin de los polipptidos a travs de los tilacoides y luego es removida por un segundo clivaje proteoltico dentro del lumen. La va de clasificacin de las protenas a los otros cuatro destinos las membranas externa e interna, la membrana mitocondrial y el espacio intermembrana no estn claramente establecidos. Como en las mitocondrias, las protenas parecen ser insertadas directamentehacialamembranaexternadelacubiertadelcloroplasto.Encontraste,las protenasdestinadastantoalamembranatilacoidalcomoalamembranainternadelos cloroplastos son inicialmente direccionadas importndolas hacia el estroma por pptidosdetrnsitoNterminales.Acontinuacindelclivajedelospptidosdetrnsito, estasprotenassondireccionadasparasuinsercinenlamembranaapropiadaporotras secuencias,que an nohan sidobien caracterizadas. Finalmente ni las secuencias que direccionan las protenas al espacio intermembrana, ni las vas por las que viajan a aquellosdestinoshansidoidentificados. OtrosPlstidos Loscloroplastossonslouno,aunqueelmsimportantemiembrodeunagranfamilia de organelas vegetales llamadas plstidos. Todos los plstidos contienen el mismo genomaqueloscloroplastos,aunquedifierenenestructurayfuncin.Loscloroplastos, estn especializados en la fotosntesis y son los nicos que poseen un sistema de membranastilacoides.Otrosplstidosqueestninvolucradosendiferentesaspectosdel metabolismo de vegetales estn rodeados por las dos membranas de la cubierta plastidialperocarecende lamembrana tilacoidaly deotroscomponentes del aparato fotosinttico. Losdiferentestiposdeplstidossonclasificadosfrecuentementedeacuerdoaltipode pigmento que contienen. Los cromoplastos contienen carotenoides que son responsables de los colores amarillos, rojos, anaranjados de algunas flores y frutas, aunquesufuncinenelmetabolismocelularnoesclara.Losleucoplastossonplstidos no pigmentados, que almacenan una gran variedad de fuentes de energa en tejidos vegetales no fotosintticos. Los amiloplastos y los elaioplastos son ejemplos de leucoplastosquealmacenanalmidnylpidosrespectivamente. 184

Todoslosplstidosincluyendoloscloroplastossedesarrollanapartirdelosproplstidos
(0,5 a 1 m de dimetro), organelas indiferenciadas presentes en las clulas que se dividen activamente de races y meristemos. Los proplstidos se diferencian en los diferentes tipos de plstidos maduros de acuerdo a las necesidades de las clulas diferenciadas.Adicionalmente,losplstidosmadurossoncapacesdecambiardeuntipo a otro. Los cromoplastos se desarrollan a partir de los cloroplastos, durante la maduracindefloresyfrutos(porej.,tomates).Duranteesteproceso,laclorofilaylos tilacoidessedegradanmientrassesintetizannuevostiposdecarotenoides. Una caracterstica interesante de los plstidos es que su desarrollo es controlado por seales ambientales y por un programa intrnseco de diferenciacin celular. En las clulas fotosintticas de las hojas, por ejemplo, los proplstidos se desarrollan en cloroplastos. Durante este proceso, la membrana tilacoidal est formada por vesculas que brotan de la membrana interna de la cubierta del cloroplasto y varios de los componentes del aparato fotosinttico son sintetizados y ensamblados. Sin embargo, loscloroplastossediferenciansloenpresenciadeluz.Silasplantassemantienenenla oscuridad, el desarrollo de los proplastidios en las hojas es arrestado en un estado intermedio (llamado etioplastos), en el cual se forma un arreglo semicristalino de membranastubularesinternasenelquenosehasintetizadolaclorofila.Silasplantas que crecen en la oscuridad son luego expuestas a la luz los etioplastos continan su desarrolloacloroplastos.Esnotablequeestecontroldualdeldesarrollodelosplstidos involucra tanto la expresin coordinada de los genes dentro de los plstidos como los delgenomanuclear.Elmecanismoresponsabledetalexpresingnicaesdesconocido, y su dilucidacin representa un problema desafiante en la biologa molecular de vegetales. Fotosntesis Durantelafotosntesis,laenergaprovenientedelaluzsolarescolectadaparaconducir lasntesisdeglucosaapartirdeCO2yH2O.Porconvertirlaenergasolarenunaforma utilizabledeenergaqumica,lafotosntesiseslafuentefinaldeenergametablicapara todoslossistemasbiolgicos.Lafotosntesistienelugarendosestadosdiferentes.Enlas reacciones de luz, la energa de la luz solar conduce a la sntesis de ATP y NADPH, 185

acopladaalaformacindeO2apartirdeH2O.Enlasreaccionesdeoscuridad,llamadas
as por no requerir luz, el ATP y el NADPH producidos durante las reacciones de luz llevanadelantelasntesisdeglucosa.Enlasclulaseucariotas,tantolasreaccionesdela fase lumnica como las reacciones oscuras de la fotosntesis ocurren dentro de los cloroplastos las reacciones lumnicas en la membrana del tilacoide, y las reacciones oscurasdentrodelestroma.Verlareaccinoscuramsabajo. ElFlujodeElectronesaTravsdelosFotosistemasIyII La luz solar es absorbida por los pigmentos fotosintticos, el ms abundante de los cuales es la clorofila. La absorcin de la luz excita un electrn, llevndolo a un estado mayor de energa, convirtiendo as la energa solar en energa qumica potencial. Los pigmentos fotosintticos, estn organizados en fotocentros en la membrana del tilacoide, cada uno de los cuales contiene cientos de molculas de pigmentos. Las numerosas molculas de pigmentos de cada fotocentro actan como una antena que absorbeluzytransfierelaenergaaunamolculadeclorofilaqueactacomouncentro de reaccin. La clorofila del centro de reaccin luego transfiere su electrn de alta energa a una molcula aceptora en una cadena transportadora de electrones. Los electrones de alta energa son luego transferidos a travs de una serie de transportadoresdemembranaacopladosalasntesisdeATPyNADPH. El centro de reaccin fotosinttica mejor caracterizado es el de la bacteria Rhodopseudomonas viridis, la estructura de los cuales fue determinada en 1985 por DeisenhoferJ.,MichelH.,HubertR.,ysuscolegas.Elcentrodereaccinconsistedetres polipptidosdetransmembrana,unidosauncitocromotipocsobreelladoexteriorde lamembrana. La energa de laluz solar escapturada por un par demolculas de clorofila conocidas comoelparespecial.Loselectronessonluegotransferidosdesdeelparespecialaotro pardeclorofilasydesdeaquaotrosgruposprostticos(feofitinasyquinonas).Desde aquloselectronessontransferidosalcomplejodelcitocromobcenelculeltransporte deelectronesseacoplaalageneracindeungradientedeprotones.Loselectronesson luegotransferidosalcentrodereaccincitocromoydeallfinalmenteretornadosalpar especial de la clorofila. El centro de reaccin convierte as la energa de la luz solar a 186

electrones de alta energa, la energa potencial de los cuales es convertida a un
gradienteprotnicoporelcomplejocitocromobc. Las protenas involucradas en la reacciones de luz de la fotosntesis en plantas estn organizadasencincocomplejosenlamembranadeltilacoides.Dosdeestoscomplejos sonfotosistemas(fotosistemasIyII),enloscualeslaluzesabsorbidaytransferidaalos centros de reaccin de la clorofila. Los electrones de alta energa son transferidos a travsdeunaseriedetransportadoresenambosfotosistemasyenuntercercomplejo proteico, el complejo del citocromo bf. Como ocurre en las mitocondrias, esta transferenciadeelectronesestacopladaalatransferenciadeprotonesenellumende los tilacoides, estableciendo de este modo un gradiente de protones a travs de la membrana tilacoides. La energa almacenada en este gradiente de protones es luego cosechada por uncuarto complejo de protenasen lamembrana del tilacoides,la ATP sintetasa, que (como ocurre con la enzima mitocondrial) acopla el flujo inverso de protonesatravsdelamembrana,alasntesisdeATP. Una diferencia importante entre el transporte de electrones en cloroplastos y la que ocurre en las mitocondrias es que la energa derivada de la luz solar durante la fotosntesisnosloseconvierteenATPsinoquetambinse usaparagenerarNADPH requeridoparalasubsiguienteconversindeCO2acarbohidratos.Estoserealizaporel usodedosfotosistemasenlasreaccioneslumnicasdelafotosntesis,unoparagenerar ATPyotraparagenerarNADPH.Loselectronessontransferidossecuencialmenteentre los dos fotosistemas, con el fotosistema I actuando como generador de NADPH y el fotosistemaIIactuandocomogeneradordeATP. La va del flujo de electrones comienza en el fotosistema II, el cul es homlogo del centrodereaccinfotosintticadeR.viridisdescriptoanteriormente.Sinembargoenel fotosistemaII la energaderivada dela absorcinde fotones es usada para dividirlas molculasdeaguaaoxgenomolecularyprotones.Estareaccintienelugardentrodel lumen del tilacoide, de tal forma que la liberacin de protones del agua establece un gradiente de protones a travs de la membrana del tilacoide. Los electrones de alta energa derivados de este proceso son transferidos a travs de una serie de transportadoresalaplastoquinona,untransportadorliposolublesimilaralacoenzimaQ 187

(ubiquinona) de las mitocondrias. La plastoquinona transporta electrones del
fotosistemaIIalcomplejocitocromobf,dentrodelcualloselectronessontransferidosa laplastocianinaylosprotonesadicionalessonbombeadoshaciaellumendeltilacoide. EltransportedeelectronesatravsdelfotosistemaIIestacopladoalestablecimiento delgradientedeprotones,elculconducelasntesisquimiosmticadelATP. Desde el fotosistema II los electrones son transportados por la plastocianina (una protena perifrica de membrana) al fotosistema I, donde la absorcin de fotones adicionales genera nuevamente electrones de alta energa. El fotosistema I, sin embargo,noactacomounabombadeprotones,ensulugar,usaloselectronesdealta energa para reducir NADP+ a NADPH. El centro de reaccin de la clorofila del fotosistema I transfiere sus electrones excitados a travs de una serie de transportadoresdesdelaferrodoxina,unapequeaprotenasobreelladodelestroma delamembranadeltilacoide.LaenzimaNADPreductasaluegotransfiereloselectrones desdelaferrodoxinaalNADP+,generandoNADPH.Elpasajedeelectronesatravsdelos fotosistemasIyIIgeneratantoATPcomoNADPH,loscualessonusadosporlasenzimas delciclodeCalvinenelestromadelcloroplastoparaconvertirelCO2acarbohidratos. ElFlujoCclicodeElectrones Una segunda va del transporte de electrones llamada el flujo cclico de electrones, produceATPsinlasntesisdeNADPH,subministrandodeestaformaATPadicionalpara otros procesos metablicos. En el flujo cclico de electrones la energa lumnica colectadaporelfotosistemaIesusadaparalasntesisdeATPmsqueparalasntesis de NADPH. En lugar de ser transferidos al NADP+, los electrones de alta energa son transferidos desde el fotosistema I, al complejo citocromo bf. La transferencia de electronesatravsdelcomplejocitocromobfesluegoacoplada,comoenelfotosistema II,alestablecimientodeungradientedeprotonesatravsdelamembranadeltilacoide. LuegolaplastocianinaretornaestoselectronesalfotosistemaIenunestadomenorde energa,completandounciclodetransportedeelectronesenelcullaenergalumnica colectadaenelfotosistemaIesusadaparabombearprotonesalcomplejocitocromobf. LatransferenciadeelectronesdesdeelfotosistemaIpuedeasgenerartantoATPcomo NADPH,dependiendodelasnecesidadesmetablicasdelasclulas. 188

SntesisdeATP
La ATP sintetasa de la membrana del tilacoide es similar a la enzima mitocondrial. Sin embargo,laenergaalmacenadaenelgradientedeprotonesatravsdelamembrana deltilacoide,encontrasteconlamembranamitocondrialinterna,escasienteramente de naturaleza qumica. Esto se debe a que la membrana del tilacoide aunque es impermeable a los protones difiere de la membrana mitocondrial interna en que es permeableaotrosiones,particularmentealMg2+ yalCl.Ellibrepasajedeestosiones neutraliza el voltaje del gradiente protnico, por lo que la energa derivada de la fotosntesis es conservada principalmente como la diferencia en la concentracin de protones(pH)atravsdelamembranatilacoidal.Sinembargo,debidoaqueellumen del tilacoide es un compartimiento cerrado, esta diferencia en la concentracin de protones puede ser muy grande, correspondiendo a una diferencia de ms de tres unidadesdepHentreelestromayellumentilacoidal.Enfuncindelamagnituddeeste diferencialdepH,laenergalibretotalalmacenadaatravsdelamembranatilacoidales similaralaalmacenadaatravsdelamembranamitocondrialinterna. Porcadapardeelectronestransportados,dosprotonessontransferidosatravsdela membranatilacoidalalfotosistemaIIydedosacuatroprotonesalcomplejocitocromo bf. En funcin que se necesitan cuatro protones para conducir la sntesis de una molculadeATP,elpasajedecadapardeelectronesatravsdelosfotosistemasIyII por el flujo no cclico de electrones produce entre 1 y 1.5 molculas de ATP. El flujo cclico de electrones tiene un menor rendimiento, correspondiendo entre 0,5 y 1 molculadeATPporcadapardeelectrones. En las reacciones de oscuridad, el NADPH y el ATP producidos en la reaccin lumnica conducenlasntesisdecarbohidratosapartirdeCO2yH2O.Seagregaunamolculade CO2 en cada ciclo de reaccin conocido como el ciclo de Calvin que conduce a la formacindecarbohidratos(Figura).EngeneralelciclodeCalvinconsume18molculas deATPy12molculasdeNADPHporcadamolculadeglucosasintetizada.Senecesitan dos electrones para convertir cada molcula de NADP+ en NADPH, por lo que deben pasar24electronesatravsdelacadenatransportadoradeelectronesparagenerarel suficiente NADPH como para sintetizar una molcula de glucosa. Estos electrones se 189

obtienenporlaconversinde12molculasdeH2OaseismolculasdeO2,consistente
conlaformacinde6molculasdeO2porcadamolculadeglucosa.Sinembargo,no estclarosielpasajedelosmismos24electronesatravsdelacadenadeelectroneses suficienteparagenerarlos18ATPsquesonrequeridosparaelciclodeCalvin.Algunas deestasmolculasdeATPpuedensergeneradasporcadenasdeelectronesalternativas queusanlaenergaderivadadelaluzsolarparasintetizarATPsinlasntesisdeNADPH. Peroxisomas Los peroxisomas son organelas pequeas encerradas por membrana que contienen enzimas involucradas en una variedad de reacciones metablicas incluyendo varios aspectos del metabolismo energtico. A pesar que los peroxisomas son morfolgicamentesimilaresaloslisosomas,sonensambladoscomolasmitocondriaso los cloroplastos, a partir de protenas que son sintetizadas sobre ribosomas libres y luego son incorporadas a los peroxisomas como cadenas polipeptdicas completas. A pesar que los peroxisomas no contienen su propio genoma, son similares a las mitocondriasyloscloroplastosenquesereplicanpordivisin FuncindelosPeroxisomas Losperoxisomascontienenalmenos50enzimasdiferentes,queestninvolucradasen unavariedaddevasbioqumicasendiferentestiposdeclulas.Losperoxisomasfueron originalmentedefinidoscomoorganelasquerealizanreaccionesdeoxidacinllevandoa laproduccindeperxidodehidrgeno.Debidoaqueelperxidoespeligrosoparalas clulastambincontienenlaenzimacatalasa,quedescomponeperxidodehidrgenoa aguaolousaparaoxidarotroscomponentesorgnicos.Unagranvariedaddesubstratos son degradados por tales reacciones en peroxisomas, incluyendo: cido rico, aminocidos y cidos grasos. La oxidacin de cidos grasos es un ejemplo particularmenteimportanteyaqueproveeunadelasprincipalesfuentesdeenerga.En clulas animales, los cidos grasos son oxidados tanto en peroxisomas como en mitocondrias, pero en levaduras y en vegetales los cidos grasos su oxidacin esta restringidaalosperoxisomas.
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Peroxisomas

Fig6.2ModificadadeTheCellaMolecularApproachdeCooper(2000).
Adems de constituir un compartimiento para las reacciones de oxidacin, los peroxisomas estn implicados en la biosntesis de lpidos. En las clulas animales el colesterol y el dolicol son sintetizados en los peroxisomas, as como en el RE. En el hgado,losperoxisomastambinestninvolucradosenlasntesisdeloscidosbiliares, los cuales se derivan del colesterol. Adicionalmente los peroxisomas contienen las enzimasrequeridasparalasntesisdeplasmalgenosunafamiliadefosfolpidosenlos cualesunadelascadenashidrocarbonadasestunidaaglicerolporunauninterms que por una unin ster. Los plasmalgenos son importantes componentes de membrana en algunos tejidos particularmente en corazn y cerebro, aunque estn ausentesenotros. Losperoxisomasjuegandosrolesparticularmenteimportantesenplantas.Primero,los peroxisomas en las semillas son responsables de la conversin de los cidos grasos almacenadosacarbohidratos,loscualessoncrticosenlaprovisindeenergaymateria prima para el crecimiento de las plantas germinantes. Esto ocurre va una serie de reacciones denominadas el ciclo del glioxilato, que es una variante del ciclo del cido ctrico. Los peroxisomas en los cuales esto tiene lugar algunas veces se denominan glioxisomas. Los peroxisomas en las hojas estn involucrados en la fotorespiracin, que acta metabolizandounproductolateralformadodurantelafotosntesis.ElCO2esconvertido 191

acarbohidratosdurantelafotosntesisvaunaseriedereaccionesdenominadaselciclo
de Calvin. El primer paso es la adicin de CO2 al azcar de 5 carbonos ribulosa 1,5 bifosfato produciendo dos molculas de 3fosfoglicerato (tres carbonos cada una). Sin embargo, la enzima involucrada, la ribulosa bifosfato carboxilasa o rubisco) algunas veces cataliza la adicin de O2 en lugar de CO2 produciendo una molcula de 3 fosfoglicolatodedoscarbonos).Estaesunareaccinlateral,yelfosfoglicolatonoesun metabolito til. Esta molcula es primero convertida a glicolato y luego transferida a peroxisomas,dondeseoxidayseconvierteaglicina.Laglicinaesluegotransferidaalas mitocondriasdondedosmolculasdeglicinasonconvertidasaunamolculadeserina, conprdidadeunamolculadeCO2yNH3.Laserinaesluegoconvertidaaglicerato.La serina es retornada a los peroxisomas, donde se convierte a glicerato. Finalmente, el glicerato es luego retornado a los cloroplastos, reentrando al ciclo de Calvin. La fotorespiracinnopareceserbeneficiosaparalosvegetalesyaqueesesencialmentela inversa de la fotosntesis consume O2 y libera CO2 sin ninguna ganancia de ATP. Sin embargo la ocasional utilizacin de O2 en lugar de CO2 parece ser una propiedad inherente de rubisco, as que la fotorespiracin es un acompaamiento de la fotosntesis.As,losperoxisomasjueganunpapelimportantepermitiendoquelamayor partedelcarbonoenelglicolatosearecuperadoyutilizado.
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CAPTULO SPTIMO:
El Ncleo Celular
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ElNcleo
Lapresenciadencleoeslaprincipalcaractersticaqueseparaalasclulaseucariotas delasprocariotas. Lasbacteriasyarquibacteriasengeneral,carecendeestaestructura.Elarriboaescena delncleo pudohaber aceleradola generacindela diversidaddelavida multicelular observadaennuestrosdas,porloqueestaorganelahafascinadoaloscientficosque intentanprobarlaevolucindelosorganismosmodernos. Elorigendelncleotambinestintimamenteligadoconnuestrospropiosorgenes.En relacinconelorigendelncleosereconocentresteoraslderesenestesentido2.Una deellassostienequelaorganelaeselresultadodelafusinmicrobiana.Otrasustenta queelncleoresidual,ocultoenalgunasbacteriasactuales,fueunainnovacincrucial ms antigua de lo que comnmente se piensa. La teora ms radical sostiene que los virushabranjugadounrolclaveeneldesarrollodelasclulaseucariotas. Se ha propuesto que en los das tempranos de la evolucin celular, las archaeas productoras de metano, habran vivido dentro de bacterias que dependan de la fermentacinparasumantenimientoenunarelacindenominadaelmodelosintrfico. Larelacinhabrafuncionadoparalasarqueaspueslafermentacinprovealafuentede H2 que ellas requeran. Las bacterias por ortro lado se habran beneficiado pues la fermentacinrequierequeelcontenidodeH2permanezcabajo. Se ha hipotetizado que las cambiantes condiciones ambientales sobre la tierra finalmente promovieron un cambio en la simbiosis. Las arqueas habran perdido gradualmentesuapetitoporelH2,cesandosuproduccindemetanoyenlugardeeso sehicieronmsdependientesdelabacteriahospedadoracomofuentedenutrientes.La membranadelaarqueaqueantescumplaunrolcrticoparalametanognesissehabra tornado superflua en estas condiciones. Al mismo tiempo, la membrana bacteriana externa se habra invaginado y rodeado el compartimiento celular, eventualmente rodeando el ADN arqueal pero excluyendo a los ribosomas. El cambio habra sido
2
ElizabethPennisi.TheBirthofthenucleus.Science(2004)305:766768.
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beneficioso para las bacterias debido a que la separacin de los ribosomas de los
cromosomas microbianos habra ayudado a asegurar una ms precisa transmisin del mensaje del ADN. Esta disposicin persisti y finalmente habra evolucionado en el nucleoeucaritico.Elremanentedelcitoplasmaarquealsehabratornadoncleo. Quienes sostienen esta teora sobre el origen del ncleo, sugieren que las modernas archaea metanognicas poseen caractersticas que recuerdan a las clulas eucariotas seranlasposiblesdescendientesdelasantiguasarqueasmetanognicas.Estasarqueas comparten con los eucariotas el hecho de tener genes similares involucrados con la estructuradelADNydelARN.Porejemplocompartengenesparalacodificacindelas histonas,quesonlasprotenasqueayudan aestabilizarloscromosomas. Encontraste lasbacteriascarecendehistonasensuscromosomas. Otro microbio moderno, el Myxobacterium recuerda a los antiguos hospedadores bacterianos en los que habra evolucionado el ncleo. Como las clulas eucariotas, myxobacteria se comunica con otras clulas, se mueve y puede formar complejos multicelulares. Myxobacterium tiene estructuras complejas que son muy semejantes y reminiscentes de clulas eucariotas. Esta bacteria tiene molculas de sealamiento celulartalescomoquinasasyprotenasG,comunesconloseucariotas. Quienes sostienen esta teora asumen que bacterias y arqueas habran aparecido ms tempranamentequeeucariotasenelrboldelavida, pero otros autores sostienen que lo contrario tambinpodraserverdad. Por ejemplo, John Fuerst de la Universidad de Queensland, Australia, est convencido que clulas similares a eucariotas aparecieron antes que las bacterias y las arqueas, o que emergieron en el tiempoenelqueestasprocariotassesepararonpara formar unnuevo reino.Fuerstpuntualiza susteoras en un inusual grupo de bacterias que l ha estudiado durante la ltima dcada. Este notablemicrobiotieneunncleooalgosimilaraestaestructuraypodrasersemejante 195

alasclulastempranasquepudieronevolucionarenlaseucariotasmodernas.
Estas bacterias que se encuentran en el suelo y en el agua dulce se denominan Planctomycetes. Estos organismos poseen paredes celulares que no son mucho ms rgidas que las de otras bacterias. En 1984 los investigadores haban sugerido que algunos planctomycetes posean membranas internas. En el 2001, Fuerst y sus colaboradores, usando sofisticadas tcnicas de microscopa electrnica confirmaron la existenciadeestasmembranas,revelandoqueestasposeanestructuradoblecomolas delncleoeucariota.
Micrografa electronica de una seccin de Gemmata obscuri globus.Lamembranaquerodeaal ncleo esta marcada con la M: el citoplasma que rodea el cuerpo nuclear est marcado con (C) y posee una diferente textura que el citoplasma(G).Bar=0.5m.
Estas observaciones tiraron abajo el dogma de que las clulas procariotas carecen de membranas internas, argumenta Philip Bell un bilogo de levadurasdelauniversidaddeMacquarieenSydney, Australia.
Usandosofisticadastcnicasdemicroscopaelectrnica,Fuerstysuscolegashanahora verificadoqueexistencompartimientosdiscretosrodeadosdemembranadentrodedos planctomycetes, Gemmata obscuriglobus y Pirellula marina. Uno de los compartimientos, ubicado en la periferia parece contener muy poco en su interior. El segundo ubicado en el centro del microbio contiene una densa coleccin de material genticoADN,ARNyprotenasprocesantesdeADNyARN.Elcitoplasmaseencuentra llenodeprotenas,ribosomasyARN.
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menos uno de los planctomicetos estudiados posee una doble membrana de Al
alrededor de su ADN en lugar de la ms tpica membrana simple. La membrana no es contnua sino que consiste en dobles membranas plegadas mantenidas juntas. Las interrupciones entre las membranas podran indicar cmo se originaron los complejos de poro nucleares, puntualiza Fuerst. Explicar estasestructurassiemprefueunpuntocontroversialpara laevolucinnuclear.Sincomplejosdeporo,elncleono puede funcionar. Pero nada similar a este complejo ha sido observadoenlasbacteriashasta lafecha.Enelao 2004 Fuerst mostr dramticas micrografas de estructurassimilaresacrteresenlasmembranasinternasdelosplanctomicetes,estas depresiones recuerdan a los poros nucleares, indica Fuerst. Aunque son difciles de compararlosgenesquecodificanlasprotenasdeloscomplejosdeporo,eseeselactual objetivo de Fuerst quien tiene pruebas que los genomas planctomicetes tienen versionesprimitivasdelosgeneseucariotasparaalgunasprotenasclavesdelcomplejo deporo. Sisecombinantodasestasevidenciaselpanoramaparececonvincente.Gemmataesun modelo vlido para explicar un orgen no simbitico del ncleo. Pero Fuerst dice que estenoeselnicoejemplo,elloshandescubiertorecientementeunfilumdebacterias habitantesdeesponjasquetambinparecetenerncleoysostienequeanpodranser descubiertas otras especies. Bacterias con membranas internas y poros nucleares, caractersticas estas, propias de las clulas eucariotas, sugieren que el ncleo podra haber aparecido mucho antes de lo que tradicionalmente se crea. Si el escenario de Fuerstescorrecto,entonceselncleoprecedealoseucariotas. En efecto, este compartimiento puede llevar al ltimo ancestro universal comumun (LUCAdelingls:LastUniversalCommonAncestor),unorganismoputativoapartirdel cual habran emergido eucariotas, bacterias y archaeas. Si este fuese el caso, ciertas caractersticasdelncleofueronretenidaseneucariotasperosehabranperdidoenla mayora de las bacterias y archaeas. Ciertamente, si esta aseveracin fuese cierta, las 197

clulas eucariotas actuales poseeran caractersticas ahora observadas en cada uno de
lostresgrupos. Una tercera opcin para el orgen del ncleo gira alrededor de los virus. Los virus predatan la divergencia de los tres dominios de la vida, sostiene David Prangishvili un virlogodelauniversidadde Resenverg,Alemania.El argumentaquelosvirusyaeran muycomunesenlasopaprimordialysoloposteriormentesetornarondependientesde lasclulasparasobrevivir.Cuandoapartecieronlasclulaslosvirusjugaronunpapelen laevolucindelossistemas[eucariotas]complejos. Losvirus poseenlacapacidad deresidir permanentementeen unaclula,infectndola pero no matando a la hospedadora. As, ellos y sus genes pueden mantenerse e influenciar la evolucin celular. Hay diversas propuestas de cmo los virus pudieron influenciar la evolucin del ncleo. Los datos disponibles son provocativos pero circunstancialesycontrovertidos.Elhechoquelosviruspersistanenlaclulaenlugarde matarla, permite que stas adquieran un conjunto nuevo de genes en unsolo evento, sostiene Luis Villarreal de la Universidad de California, Irving. Mientras se encuentran residiendopormillonesdeaoslosnuevosgenesvirales,podranreemplazargenesde bacteriasoarchaeas,porejemplolosquecodificanalasprotenasqueprocesanADN. Estosgenesextrapodranhaberjugadonuevosrolesenlasclulas. Villarrealapuntaquehayextraordinariassimilitudesentreelncleoylosvirus.Ambos sonpaquetesdeADNcubiertosporprotenasyamenudopormembrana.Enlasalgas rojasporejemplo,unncleopuedemoversedeunaclulaaotracomosifueseunvirus infeccioso. En general el ncleo celular y los virus carecen de mecanismos para la produccindeprotenasylpidosdentrodesuslmites.AmboscontienenADNenforma de cromosomas lineales mientras que en la mayora de las bacterias los cromosomas son circulares. Ambos desensamblanlamembranadurantesudivisin.Ambos transcribenADNperonotaducenelARNmdentrodesus lmites.Algunosviruspoxformanunacubiertaalrededor de su ADN usando el RE de la clula hospedadora. Las clulas eucariticas usan este mismo material para 198

construirsuncleo.
Los largos y complejos ADNs virales entre los que se incluyen a los virus pox como el virus de la fiebre de cabras africanas, parece compartir estrechamente el putativo ancestro viral del ncleo. La hebra de ADN en estos virus tiene telmeros primitivos, secuencias de ADN protectoras encontradas en los extremos de los cromosomas eucariticos.Bellespeculaquevirusviviendoenarqueasestablecieronelcomienzodel ncleo.FinalmenteelADNviralyelADNarquealsehabranfusionadodentrodelvirusy el nuevo genoma habra portado el material gentico para ambos. Al final argumenta Bell, la arquitectura gentica nica de los eucariotas, sera el resultado de la superposicin de la arquitectura viral sobre la arquitectura gentica arqueal. Si esto fueseas,remarcaBell,seramosdescendientesdelosvirus. FuncionesdelNcleo Elncleo,comoalojamientodelgenomacelularactacomodepsitodelainformacin genticaycomocentrodecontrolcelular. Enelncleotienenlugar: lareplicacindelADN, latranscripcin,elprocesamientodelosdistintostiposdeARNysutransporte haciaelcitoplasma. Al separar el genoma del citoplasma, la cubierta nuclear permite regular la expresin genticapormecanismosquesonnicosdeeucariotas.ElARNmdelosprocariotases traducido mientras su transcripcin est an en proceso, el ARNm eucaritico sufre procesamiento postranscripcional (por ej. el splicing o empalme), antes de ser transportadodesdeelncleoalcitoplasma. La limitacin del acceso de protenas al material gentico de eucariotas, tambin constituyeunmecanismodecontroldelaexpresingnicaaniveltranscripcional.Por ejemplo la expresin de algunos genes puede ser controlada por el transporte de algunosfactoresdetranscripcindesdeelcitoplasmaalncleo,unaformaderegulacin transcripcionaldelaquecarecenlosprocariotas.
199

LaseparacindelgenomadelsitiodetraduccindelARNmjuegaasunrolcentralenla
expresingenticadeloseucariotas. LACUBIERTANUCLEARYELTRFICOENTREELNCLEOYELCITOPLASMA La cubierta nuclear separa el contenido nuclear del citoplasma y provee el marco estructuraldelncleo.As,elncleosemantienecomouncompartimentobioqumico distinto. Los nicos canales entre el ncleo y el citoplasma son los complejos de poro nuclear. El trfico selectivo de protenas y ARNs a travs de los complejos de poro no slo establecelacomposicininternadelncleo,sinoquejuegaademsunrolcrticoenla regulacindelaexpresingenticaeneucariotas. ESTRUCTURADELACUBIERTANUCLEAR Laestructuradelacubiertanuclearescompleja,poseeunsistemadobledemembranas, unalminanuclearsubyacenteyloscomplejosdeporonuclear.Elncleoestrodeado porunsistemadedosmembranasconcntricas,llamadaslamembrananuclearinterna (MNI)ylamembrananuclearexterna(MNE). LamembrananuclearexternaposeecontinuidadconelREporloqueelespacioentre las membranas nucleares interna y externa tienen continuidad con el lumen del RE. Adicionalmente, la membrana nuclear externa es funcionalmente similar al retculo endoplasmticoytieneribosomasunidosalasuperficiecitoplasmtica.Encontraste,la MNIposeeprotenasquesonexclusivasdelncleo. Lafuncincrticadelasmembranasnuclearesesactuarcomobarrerasqueseparanel contenidonucleardelcitoplasmtico.Comoocurreconotrasmembranascelulares,las MNsonbicapasfosfolipdicas,permeablessloapequeasmolculasnopolares.Otras molculassonincapacesdedifundiratravsdelabicapalipdica.Elporonuclearesuna estructuracomplejaresponsabledeltrficoselectivoentreelncleoyelcitoplasma. Por debajo de la MNI se encuentra la lmina nuclear, un entramado que provee de soporteestructuralalncleo.Lalminanuclearestcompuestadeunaomsprotenas relacionadasllamadaslminas.Lamayoradelasclulasdemamferoscontienencuatro tiposdiferentesdelminas:A,B1,B2yC.Todaslaslaminassonprotenasfibrosasde60 200

80Kd,relacionadasconlasprotenasdelosfilamentosintermediosdelcitoesqueleto.
Como otras protenas de los filamentos intermedios, las lminas se asocian unas con otras para formar filamentos. El primer estado de esta asociacin es la interaccin de doslminasparaformarundmeroenelcuallasregionesdehelicesalfadedoscadenas polipeptdicas estn enrolladas una alrededor de la otra formando una estructura denominada coiled coil. Estos dmeros luego se asocian unos con otros para formar filamentosqueconformanlalminanuclear. La asociacin de lminas con la MNI est facilitada por la adicin postraduccional de lpidosenparticularlaprenilacinCterminaldelosresiduoscistena.Laslminasse unenademsaprotenasdelaMNI,loquepermitequelaslminasseorganicenenuna mallaentramadaymediansuanclajealamembrana. Ademsdeproveersoportealncleo,secreequelalminanuclearsirvecomositiode anclaje de la cromatina. La cromatina dentro del ncleo est organizada formando grandeslazosdeADN,algunosdeloscualesaparecenunidosalacubiertanuclear.Las laminasuniendolacromatinapodranayudaramediarestainteraccin. ElComplejodePoroNuclear Son los nicos canales a travs de los que son capaces de pasar pequeas molculas polares,ionesymacromolculas(ARNyprotenas). El complejo de poro nuclear es una estructura extremadamente grande, con un dimetro de aproximadamente 120 nm y una masa estimada de 125.000 kd (aproximadamente30veceseltamaodeunribosoma). Envertebradoselcomplejodeporoestaformadoporentre50y100tiposdiferentesde protenas. Dependiendodesutamao,lasmolculaspueden atravesaratravsdelporopordos mecanismos diferentes. Las molculas pequeas y algunas protenas con masas moleculares menores que 50 kd pasan libremente a travs de la cubierta nuclear en ambasdirecciones:delcitoplasmaalncleoydelncleoalcitoplasma.Estasmolculas difundenpasivamenteatravsdeuncanalacuosode9nmdedimetro.Lamayorade lasprotenasylosARNs,sinembargosonincapacesdeatravesarestoscanalesabiertos. 201

Por esto, estas macromolculas atraviesan estos complejos
porunprocesoactivo,enelqueprotenasyARNsapropiados sonreconocidosy transportadosselectivamenteen una sola direccin.Eltrficodeestasmacromolculasocurreatravs decanalesreguladosenelcomplejodeporonuclearqueen presenciadesealesadecuadaspuedeabrirsemsde25nm dedimetro. La visualizacin de los complejos de poro nuclear por microscopa electrnica revelque poseenuna estructura de simetra ortogonal organizada alrededor de un canal central. Los estudios estructurales detallados, incluyendo anlisis de imgenes basados en computadoras han llevado al desarrollo de modelos tridimensionales del complejo de poro nuclear. Estos estudios indican que el poro nuclear consiste de un ensamble de ocho radios arreglados alrededor de un canal central. Losradios estn conectadosaanillostanto
Imagen de TEM de un corte de la membrana nuclear. c: citoplasma; n: ncleo. Flechas: poros nucleares, cabezas de flecha: poros nucleoplamticos
enlasuperficienuclearcomoenlacitoplasmtica.Elensambledeanillosradiosest anclado dentro de la cubierta nuclear en los sitios de fusin de las membranas nuclearesinternayexterna.Lasprotenasfilamentosasseextiendendesdelosanillosen la fase nuclear, formando una estructura similar a una canasta, denominada jaula nuclear y en la citoplasmtica, se desprenden hacia el citosol perinuclear. Los canales centrales tienen aproximadamente 40 nm de dimetro, que es suficientemente ancho paraquepasenlaspartculasmsgrandescapacesdeatravesarlacubiertanuclear.Enel interior del canal existe una estructura llamada el transportador central, a travs del que se cree ocurre el transporte activo de macromolculas por un mecanismo no completamentedilucidado. Transporteselectivodeprotenasdesdeyhaciaelncleo La base del transporte selectivo a travs de la cubierta nuclear es mejor comprendida 202

paraprotenasquesonimportadasdesdeelcitoplasmahaciaelncleo.Talesprotenas
sonresponsablesdetodoslosaspectosdelaestructurayfuncindelgenoma.Incluyen histonas, ADN polimerasas, ARN polimerasas, factores de transcripcin, factores de empalme,ymuchosotros.Estasprotenassondirigidashaciaelncleoporsecuencias de aminocidos especficas llamadas seales de localizacin nuclear (SLN), que direccionan su transporte hacia el complejo de poro nuclear. La primera seal de localizacinnuclearensermapeadaendetallefuecaracterizadaporAllan Smithysus colegasen1984.EstosinvestigadoresestudiaronelantgenoTdelvirus40delossimios (SV40), una protena codificada por el virus que inicia la replicacin viral en clulas infectadas. Como poda esperarse, de una protena promotora de los procesos de replicacin,paraejercersufuncindebelocalizarseenelncleo.Lasealresponsable para su localizacin nuclear fue primero identificada por el descubrimiento que la mutacindeunresiduodelisinasimplequeevitalaimportacinnuclearresultaenla acumulacindelantgenoTenelcitoplasma.EstudiosposterioresdefinieronlaSLNdel antgenoTcomounasecuenciadesieteaminocidos:Pro~Lys~Lys~Lys~Arg~Lys~Val.No slosedemostrqueestasecuenciaesnecesaria,sinoquesuadicinaotrasprotenas citoplasmticas dirige su transporte y acumulacin en el ncleo. Las seales de localizacin nuclear, han sido identificadas en muchas protenas. La mayora de estas secuencias,demanerasimilaraloqueocurreconelantgenoT,soncortastirasricasen residuosdeaminocidosbsicos(comolisina,arginina)Enmuchoscasos,sinembargo, los aminocidos que forman la seal de localizacin nuclear estn prximos entre si, peronoadyacentesunosconotros.Porejemplo,lasealdelocalizacinnucleardela nucleoplasmina (una protena involucrada en el ensamble de los cromosomas consiste de dos partes: un par Lys~Arg seguida de cuatro residuos de lisina localizados diez aminocidoscorrienteabajo.TantolassecuenciasLys~ArgcomoLys~Lys~Lys~Lysson necesariasparaeldireccionamientonuclearperolos10aminocidosintermediosentre estas secuencias pueden ser mutados sin afectar la localizacin nuclear. Debido a que estassecuenciasdelocalizacinnuclearestncompuestaspordoselementosseparados se refieren como bipartitas. Adems algunas protenas, tales como las ribosomales, contienen distintas seales de localizacin nuclear que no estn relacionadas con las sealesricasenaminocidosbsicosdelanucleoplasminaoelantgenoT. 203

Laimportacindeprotenasatravsdelcomplejodeporonuclearpuedeserdivididaen
dos pasos distinguidos por su requerimiento de energa. En el primer paso, que no requiereenerga,lasprotenasquecontienensealesdelocalizacinnuclearseunenal complejo de poro nuclear sin pasar a travs de l. En este paso inicial, las seales de localizacinnuclearsereconocenporunaprotenacitoslicareceptora,yelcomplejose une al poro nuclear, el receptor prototipo se denomina importina, consiste de dos subunidades.Unasubunidad(importina),seunealasealdelocalizacinnuclearrica en aminocidos bsicos. La segunda subunidad, (importina) se une a los filamentos citoplasmticos del complejo de poro nuclear. Otros tipos de seales de localizacin nuclear,talescomolasdelasprotenasribosomalessonreconocidaspordistintostipos de molculas receptoras que estn relacionadas con la importina y funcionan como staduranteeltransportedesusprotenastargethaciaelncleo.Elsegundopasoenla importacinnuclear,esunprocesodependientedeenerga,apartirdelahidrlisisde GTP.Unjugadorclaveenesteprocesodetranslocalizacinsonlaspequeasprotenas unidasalGTPdenominadasRan,relacionadasconlasprotenasRas.Laconformaciny actividaddeestasprotenasestreguladaporlauninehidrlisisdeGTP,comoocurre con el Ras u otros factores de traduccin involucrados en la sntesis de protenas. Las enzimasqueestimulanlaunindeGTPaRanestnlocalizadasenelladonucleardela cubierta nuclear mientras que las enzimas que estimulan la hidrlisis de GTP estn localizadas en el lado citoplasmtico. En consecuencia hay un gradiente de Ran/GTP a travsdelacubiertanuclear,conunamayorconcentracinGTPRanenelladonucleary mayorconcentracinGDPRanenelcitoplasma.Secreequeestegradientedetermina ladireccionalidaddeltransporte. LahidrlisisdeGTPporRanpareceproveerlaenergadelamayorparte,sinotodala energanecesariaparalaimportacinnuclear. Elcomplejoimportinas / ysu molculatargetasociada estn enpresenciadeuna altaconcentracindeGDPRanenelladocitoplasmtico. Elcomplejo:{importinas/+laprotenatarget}sonimportadoshaciaelinteriordel ncleo,dondehayunamayorconcentracindeGTPRan.
204

Como consecuencia, los complejos GTPRan se unen a la subunidad de la importina
desplazandolasubunidadylaprotenatarget,quesonliberadosdentrodelncleo. El complejo: {GTPRan + la subunidad} es exportado al citosol, donde el GTP es hidrolizadoaGDP,liberandoalaimportina. Muchas enzimas target permanecen en el ncleo pero otras son reenviadas al citoplasma,algunasactuandocomotransportadorasdeotrasmolculascomolosARNs, otras coordinan funciones nucleares o citoplasmticas (por ejemplo regulacin de algunosfactoresdetranscripcin) Las protenas son direccionadas para la exportacin desde el ncleo por secuencias especficasdeaminocidosdenominadassealesdeexportacinnuclear(SEN) Como en el caso de las seales de localizacin nuclear, las SEN son reconocidas por receptores de exportacin nuclear llamados exportinas, que estn molecularmente relacionadasconlasubunidaddelasimportinas Comoocurreconlaimportina,lasexportinasseunenaRan,elcualesnecesariopara laimportacinylaexportacindelasprotenas. Sin embargo, un aspecto notable es que, los complejos RanGTP promuevan la formacindecomplejosestablesentrelasexportinasysuprotenatarget,mientrasque, promuevenladisociacinentreimportinasysutarget. Este efecto de la unin RanGTP sobre las exportinas dirige los movimientos de protenasquecontienensealesdeexportacindelncleoalcitoplasma. RegulacindelaImportacindeProtenasNucleares Los factores de transcripcin son funcionales slo en el ncleo, de tal forma que su importacinhaciaelncleoesclaveparacontrolarlaexpresingnica La importacin hacia el ncleo de los factores de transcripcin y las protena quinasas juegan un rol muy importante en el control del comportamiento de la clula en respuestaaloscambiosenelambientecircundante. Unmecanismo deregulacines aquelenelquelosfactoresdetranscripcin(u otras 205

protenas) se asocian con otras molculas que enmascaran su seal de localizacin
nuclear; UnbuenejemploloproveeNFBqueactivalatranscripcindelacadenaKlivianadelas inmunoglobulinasenloslinfocitosT. TransportedeARNs LosARNssonexportadosdesdeelncleohaciaelcitoplasma. Yaquelasprotenassonsintetizadasenelcitoplasma,laexpresinytransportedelos ARNms,ARNtsyARNrsesunpasocrticoenlasclulaseucariotas. LaexportacindeARNsatravsdelncleoesunprocesodependientedeenergaque requieredelcomplejo:protenaRanGTP. LosARNssontransportadosformandocomplejosconprotenas. Estas protenas son reconocidas como exportinas y transportan desde el ncleo al citoplasmacomosedescribianteriormente. Los preARNms y ARNms estn asociados con un conjunto de al menos 20 protenas (formandoribonucleoprotenasnuclearesheterogneasoRNPnhs) Almenos2deestas20protenasposeensealesdeexportacinnuclear Los ARNrs son ensamblados con protenas ribosomales en el ncleo y las subunidades intactassontransportadasluegoalcitoplasma. Suexportacinalcitoplasmapareceestarmediadaporsealesdeexportacinnuclear enlasprotenasribosomales. An no se han identificado las protenas especficas que median el transporte de los ARNt. En contraste con los ARNms, ARNt y ARNrs que actan en el citoplasma, los ARNs nucleares pequeos (snARNs) que desempean su funcin en el ncleo como componentes de la maquinaria de procesamiento del ARN son transportados desde el 206

ncleoalcitoplasma,dondeseasocianconprotenasparaformarsnRNPsyretornanal
ncleo Las protenas que se unen al cap 5 de los snARNs parecen involucradas en la exportacindeestosalcitoplasma. Las secuencias presentes en las snRNPs son las responsables de transportar estas molculasnuevamentealncleodesdeelcitoplasma. OrganizacinInternadelNcleo Elncleonoesunempaquetamientodecromatina,ARNsyprotenasnucleares El ncleo posee una estructura interna que organiza el material gentico y localiza algunasfuncionesnuclearesensitiosdiscretos El sitio ms obvio es el nucleolo que es el lugar en el que se transcribe el ARNr y en dondeseensamblanlosribosomas CromosomasyEstructuradelaCromatinaaltamenteordenada La cromatina se torna altamente condensada durante la mitosis formando los cromosomasmetafsicoscompactos. Durantelainterfase: Heterocromatinatranscripcionalmenteinactiva: Constitutiva(satlitesdeloscentrmeros) Facultativa Eucromatina El fenmeno de inactivacin delcromosoma X. Ejemplo, del rol dela heterocromatina enlaexpresindelosgenes. ElcromosomaXposeemilesdegenesquenoestnenelcromosomaYmspequeo. A pesar de esa diferencia machos y hembras poseen la misma cantidad de protenas codificadasporelcromosomaX.UnodeloscromosomasXenlashembrasesinactivado
207

conviertindoloenheterocromatina.
Annosecomprendetotalmentecmoseproduceestainactivacin. AparentementeexisteunARNregulatorioquecubreelcromosomaXinactivoeinduce suconversinaheterocromatnico. Aunque la cromatina interfsica parece
uniformemente distribuida, los cromosomas estn ordenadosenformaordenadaydivididaendominios discretosyfuncionales. En 1.885 C. Rabl propuso que en ncleo interfsico cada cromosoma ocupa un territorio distinto con centrmeros y telmeros anclados en los extremos opuestosdelacubiertanuclear. En1.984D.Mathogetal.,confirmaronlashiptesisdeRabl. Loscromosomasindividualestambinocupandistintosterritoriosdentrodelncleo. Los genes que son activamentetranscriptos aparecenlocalizados en laperiferia de los territoriosadyacentesaloscanalesqueseparanloscromosomas. Se piensa que los ARNs recin transcriptos son liberados en estos canales entre los cromosomasdondetienelugarelprocesamientodelARN. Comoenloscromosomasmetafsicos,lacromatinainterfsicapareceestarorganizada en dominios con forma de lazos de 50 a 100 Kb de ADN. Un buen ejemplo de esta organizacin es la de los cromosomas altamente transcribientes de los oocitos de anfibios en la regiones de ADN en activa transcripcin pueden ser visualizadas como lazos extendidos de cromatina descondensada. Estos dominios de cromatina parecen representar unidades funcionales discretas, que regulan independientemente la expresingnica. Losefectosdelaorganizacindeloscromosomassobrelaexpresindelosgeneshan sidodemostradosporvariosexperimentosquemuestranquelaposicindeungenenel 208
Territorios Cromosmicos

ADNcromosmicoafectaelnivelalqueestegenesexpresado.Porejemplo,laactividad
transcripcionaldegenesintroducidosenratonestransgnicosdependedelossitiosde integracin en el genoma del ratn. El efecto de la posicin cromosmica sobre la expresin gnica es aliviado por secuencias conocidas como locus control regions, que resultanenunaltoniveldeexpresindelosgenesintroducidos,sinqueincidasusitio de integracin. En contraste con los amplificadores transcripcionales, las regiones de control de locus estimulan slo genes transfectados que se integran en el ADN cromosmico, sin afectar la expresin de los plsmidos en ensayos transitorios. Adicionalmente,msqueafectarpromotoresindividuales,lasregionescontroldelocus parecenactivargrandesdominioscromosmicos,presumiblementeporintroduccinde alteracionesdeampliorangoenlaestructuradelacromatina. Laseparacinentrelosdominioscromosmicossemantieneporsecuenciasdeunino elementos aislantes que impiden que la estructura de la cromatina de un dominio se disperseentresus vecinos. Ademslosaislantesactancomo barrera paraprevenirla amplificacindepromotoresocisactinglocalizadosendominiosadyacentes.Comolas regiones de control de locus, los elementos de aislamiento, funcionan slo en el contexto del ADN cromosmico, sugiriendo que ellos regulan la estructura de la cromatinadeordensuperior.Aunqueelmecanismodeaccindelasregionesdecontrol de locus y los aislantes no ha sido dilucidado, su funcin claramente indica la importancia de la organizacin de orden superior de la cromatina en el control de la expresingnicaeucaritica. DominiosFuncionalesdentrodelNcleo Se ha postulado que actividades como la replicacin del ADN y el procesamiento del preARNmpodranestarlocalizadasensitiosdiscretosodominiosdelncleoeucariota. En una clula diploide de mamferos en cada instante de tiempo dado hay aproximadamente 4.000 orgenes de replicacin activos, cada uno de estos sitios agrupados de replicacin del ADN deben contener aproximadamente 40 horquillas de replicacin. Los genes que se encuentran en activo proceso de transcripcin, parecen estar 209

distribuidos en todo el ncleo, pero los componentes de la maquinaria de empalme
(splicing)estnconcentradosendominiosestructuralessubnuclearesdiscretos. Los componentes de empalme estn concentrados en 2050 estructuras discretas llamadas pecas nucleares en las que se piensa se acumulan los componentes de empalmequesonreclutadosdesdelaspecasalosgenesenactivatranscripcindonde ocurreelprocesamientodelpreARN. OtrasestructurassonloscuerposenrolladosyloscuerposPML.Losprimerossonricos enribonucleoprotenasnuclearespequeas(smallnuclearribonuclearproteins)(snRNP) ysecreequesonlossitiosdeensamblajedelassnARNs.LafuncindeloscuerposPML annohapodidodeterminarse. Algunosinvestigadoressostienenquelamatriznuclearesuncomponentecentraldela organizacinnuclearperoannohasidocaracterizada. ElNucleolo Eslaestructuramsprominentedelncleo.Eselsitiodetranscripcin,procesamientoy ensambledelARNr. Las clulas requieren de gran cantidad de ribosomas para cubrir sus necesidades de sntesisdeprotenas.Lasclulasdemamferos,porej.,poseenentre5y10millonesde ribosomasquedebensintetizarsecadavezquelaclulasedivide. GenesdelARNrylaorganizacindenucleolo Es una regin no delimitada por membrana, organizada alrededor de las regiones que contienenlosgenesparalosARNrs5.8S,18Sy28S. Losribosomaseucariticosposeen4tiposdeARNsdesignadoscomo:5S,5,8S,18Sy28S Los ARNs 5,8S, 18S y 28S son transcriptos como una unidad simple por la ARN polimerasaIproduciendounprecursordeARNrde45S. ElpreARNr45Sesprocesadoa18S(subunidadpequea40S) ya28Sy5,8S(subunidadgrande60S) La transcripcin del ARNr 5S se realiza fuera del nucleolo y es catalizada por la ARN 210

polimerasaIII,esteARNrseincorporaalasubunidad60S.
Estructura Nucleolo Tipo de preARN y Tipo de ARN polimerasa Pre ARNr 45S 18S ARN polimerasa I 28S 5,8S Extranucleolo Para con cubrir las Pre ARNr 5S ARN polimerasa III 5S Subunidad a la que se incorpora. Subunidad 40S Subunidad 60S
necesidades del nmero ARNr las gran de todas clulas
contienen mltiples copias de los genes de los ARNrs Porejemploenhumanos,cadaclulacontiene200copiasdelgenquecodificalosARNrs 5,8;18Sy28Syaproximadamente2.000copiasdelgenquecodificaelARNr5S. En humanos, los genes para ARNrs 5,8; 18S y 28S estn agrupados en un arreglo en tandemsobre5cromosomasdiferentes(13,14,15,21y22);elgenparaelARNr5Sest presenteenunarregloentndemsimpleenelcromosoma1. Losnucleolosconsistenmorfolgicamentedetresregionesdistinguibles: elcentrofibrilar(CF) 211
elcomponentefibrilardenso(CFD) elcomponentegranular(CG)
EstosserandiferentesestadosdemaduracindelARNr: CF:sitiodetranscripcindelosARNrs CFD:comienzodeprocesamientodelosARNrs CG: final del procesamiento y sitio de ensamble con las protenas ribosomales para formarlassubunidadespreribosomaleslistasparaserexportadasalcitoplasma. Eltamaodelnucleolodependedelaactividadmetablicadelaclula. EnsamblesdelosRibosomas ImplicaelensambledelosARNsribosomalesnucleolaresconlasprotenasyconelARNr 5S. Los genes que codifican las protenas ribosomales son transcriptos fuera del nucleolo por la ARN polimerasa II, produciendo ARNms que son traducidos en los ribosomas citoplasmticos. Luego las protenas son trasladadas desde el citoplasma al nucleolo dondeseensamblanconlosARNrsformandopartculaspreribosomales. Aunque los genes para el ARNr 5S son transcriptos fuera del nucleolo, por la ARN polimerasaIII,esteseensamblaenelnucleolo. ElNcleodurantelaMitosis Unacaractersticanicadelncleoesquesedesensamblayensamblacadavezquela clulasedivide. Al comienzo de la mitosis los cromosomas se condensan, el nucleolo desaparece y se rompelacubiertanuclearconloqueelcontenidonuclearsevierteenelcitoplasma. Alfinalseproduceelfenmenoinverso El proceso est controlado por la fosforilacin y desfosforilacin reversible de las protenas nucleares que resultan de la accin de la protena quinasa Cdc2 que es un 212

reguladorcrticodelamitosis
Disolucindelacubiertanuclear Marcaelfinaldelaprofaseperonoocurreentodaslasclulaseucariotasporloqueno puedeserconsideradaunacaractersticauniversal. LarupturadelacubiertanuclearesparalelaaunarupturadelRE,einvolucraalostres componentes: Lamembrananuclearsefragmentaformandovesculas Elcomplejodeporonuclearsedesensambla Lalminanuclearsedespolimeriza
Elmejorcomprendidodelosprocesosesladespolimerizacindelalminanuclear. Conforme se disuelve la lmina nuclear, la membrana nuclear se fragmenta formando vesculas. LaslminastipoBpermanecenasociadasconlasvesculasdelamembrananuclear. Las lminas tipo A y C se disocian de la membrana nuclear y se liberan como dmeros libresenelcitosol. Esta diferencia se origina en el hecho que las lminas tipo B son permanentemente modificadas por la adicin de grupos prenilo mientras que los grupos prenilo de las lamininasAyCsonremovidosluegoquelaslminasseincorporanalalmina. CondensacindelosCromosomas La cromatina se condensa aproximadamente 1.000 veces para formar cromosomas de clulasmitticas. Esta condensacin es necesaria para permitir el movimiento de los cromosomas en el husomittico. LoscromosomasmetafsicoscondensadosseorganizanformandograndeslazosdeADN quecomprendenaproximadamente100KbsdeADNqueestnancladosaunandamiaje
213

proteico
A pesar de la importancia el mecanismo de condensacin cromosmica no est completamentecomprendido. Nucleosoma La unidad bsica de la estructura de la cromatina es el nucleosoma que consiste en 146 pares de bases de ADN enrolladasalrededordeuncentrohistnicoconteniendo2 molculasdecadaunadelassiguienteshistonas:H2A,H2B, H3yH4 Una molcula de histona H1 est unida al ADN conforme esteingresaencadapartculadelcorenucleosomal. La histona H1 es substrato de la protena quinasa Cdc2 y es fosforilada durante la mitosis. Sin embargo, esta fosforilacin se ha demostrado que no es requerida para la condensacindeloscromosomas. En contraste, se ha encontrado que la fosforilacin de la H3 es necesaria para que se produzcalacondensacinaunqueannoseconoceexactamenteelmecanismo. Los estudios recientes, han identificado un complejo de protenas denominadas condensinas que juegan un rol destacado en la condensacin de los cromosomas. Las condensinassonfosforiladasporlasprotenasquinasasCdc2.
214
CAPTULO OCTAVO:
La Organizacin de los Genomas Celulares
215
LAORGANIZACINDELOSGENOMASCELULARES
Como material gentico, el ADN, constituye una especie de anteproyecto que dirige todas las actividades celulares y especifica el plan de desarrollo de los organismos multicelulares. La complejidad y el tamao de los genomas eucariticos son mayores que la de los procariotas.Estemayortamaodelosgenomaseucariticosnodeberasorprendernos yaqueseradeesperarqueorganismosmscomplejosposeanmsgenes.Sinembargo, el tamao del genoma de muchos eucariotas no parece estar relacionado con la complejidad gentica. Por ejemplo, los genomas de las salamandras y de las lilas contienenmsde10veceslacantidaddeADNqueelgenomahumano. Estaaparenteparadojafueresueltaporeldescubrimientoqueelgenomadelamayora de los eucariotas posee no slo genes funcionales sino tambin gran cantidad de secuencias de ADN que no codifican protenas. As, la diferencia entre el genoma humanoyeldelasalamandrareflejaqueestaltimaposeemayorcantidaddeADNno codificante que el humano. La presencia de grandes cantidades de secuencias no codificantesesunapropiedadgeneraldelosgenomasdeloseucariotascomplejos. Sehaestablecidoqueelgenomahumanocontienealrededorde30.000genes,slo7,5 vecesms queel de E. coli.Mucha dela complejidad de los genomaseucariotas esel resultadodelaabundanciadevariostiposdiferentesdesecuenciasnocodificantesque constituyenlamayoradelADNdelasclulaseucariotassuperiores. FAMILIASDEGENESYPSEUDOGENES Otrofactorquecontribuyealmayortamaodelosgenomaseucariotasesquealgunos genesserepitenmuchasveces,mientrasquelamayoradelosgenesprocariotasestn representadosunavezenelgenoma.As,muchosgeneseucariotasestnpresentesen mltiples copias, denominadas familias de genes. En algunos casos se requieren mltiplescopiasparaproducirARNsoprotenasengrandescantidades,talescomolos ARNsribosomalesolashistonas.Enotroscasos,diferentesmiembrosdeestasfamilias son transcriptos en diferentes tejidos o en diferentes momentos del desarrollo. Por ejemplo, las subunidades y de la hemoglobina son ambas codificadas por una familiadegenesenelgenomahumano,siendoexpresadosdiferentesmiembrosdeesta 216

familia en los diferentes estadios del desarrollo (ver figura). Los miembros de muchas
familiasdegenes(porejemplo,losgenesdelaglobina)estnagrupadosdentrodeuna regin del ADN, mientras que otras familias se encuentran dispersas en diferentes cromosomas. Se piensa que las familias de genes se originan por duplicacin de un gen ancestral original,condiferentesmiembrosdelafamiliadivergiendoluegocomoconsecuenciade mutacionesdurantelaevolucin.Taldivergencia,pudollevaralaevolucindeprotenas relacionadas, que estn optimizadas para funcionar en diferentes tejidos o en diferentes estadios del desarrollo. Por ejemplo, las globinas fetales tienen mayor afinidad por el oxgeno que las adultas, una diferencia que le permite al feto obtener oxgenodelacirculacinfetal. Sin embargo, como puede esperarse, no todas las mutaciones aumentan la funcin gnica.Algunascopiasdegeneshanresultadoenlaprdidadelacapacidaddeproducir ungenfuncional.Porejemplo,lasfamiliasdelasglobinasyhumanascontienen cada una genes que han sido inactivados por mutaciones. Tales copias de genes no funcionales, denominadas pseudogenes, representan relictos evolutivos que incrementan significativamente el tamao de los genomas eucariticos sin conferirle, aparentemente,unacontribucingenticafuncional. SECUENCIASREPETITIVASDEADN UnaporcinimportantedelADNdelosgenomaseucariotasconsistedesecuenciasde ADNaltamenterepetitivasnocodificantes.Estassecuencias,algunasvecespresentesen cientosdemilesdecopiasporgenoma,fueronprimerodemostradasporRoyBritteny David Kohne durante sus estudios de la tasa de reasociacin de fragmentos de ADN celular desnaturalizados. Las hebras desnaturalizadas de ADN hibridan una con otra (reasociacin),restableciendolaestructuradeWatson&CrikdelasmolculasdeADN. Ya que la reasociacin del ADN es una reaccin bimolecular (dos hebras separadas de ADN desnaturalizadas deben contactar una con otra para hibridar), la tasa de reasociacindependedelaconcentracindelashebrasdeADN.Cuandolosfragmentos de ADN de E. coli se desnaturalizan y se permite su hibridacin, la reasociacin se produce a la misma tasa, como es de esperar si cada secuencia se encontrase 217

representadaunavezencadagenoma.Sinembargo,lareasociacindelosfragmentos
de ADN extrados de clulas de mamferos, mostraron un patrn muy diferente. Aproximadamenteel60%delosfragmentosdeADNsereasociaronalatasaesperada parasecuenciasrepresentadasunavezporgenoma,mientrasqueelporcentajerestante lohizomasrpidamentequeloesperado.Lainterpretacindeestosresultados,fueque algunas secuencias estn presentes en mltiples copias y stas se reasociaron ms rpidamentequeaquellasqueestnrepresentadasunavezporgenoma.Enparticular, estos experimentos demostraron que el 40% del ADN de los mamferos consiste de secuenciasaltamenterepetitivas,algunasdelascualesestnrepetidas105a106veces. Anlisis ms profundos permitieron identificar varios tipos de secuencias altamente repetitivas.LaclasedenominadaADNdesecuenciasimple,contienearreglosentndem demilesdecopiasdesecuenciasimple,de5a200nucletidos.Porejemplo,untipode secuencia simple de ADN en Drosophila consiste de repeticiones en tndem de las unidades desiete nucletidosACAAACT.Debido a su composicin debases diferentes delrestodelADNgenmicomuchassecuenciasdebasessimplespuedenserseparadas delrestodelgenomaporcentrifugacinengradientesdedensidaddeCsCl.Ladensidad delADN est determinada por sucomposicin de bases siendo las secuencias ricasen timinaadenina menos densas que las secuencias ricas en CG. Por lo tanto, una secuenciasimplericaenATseubicaenunabandademenordensidadqueelgrueso del ADN genmico de Drosophila. Ya que estas secuencias repetitivas de ADN forman bandas como satlites separadas de la banda de ADN principal, a menudo se las refiere como ADN satlite. Estas secuencias estn repetidas millones de veces por genoma constituyendo entre el 10 y el 20% del ADN de la mayora de las clulas eucariotas superiores. Los ADNs de secuencia simple no son transcribibles y no llevan informacin gentica funcional. Sin embargo, pueden jugar importantes roles en la estructuradeloscromosomas. OtrassecuenciasdeADNrepetitivasestnesparcidasporelgenoma,enlugardeestar agrupadas como repeticiones en tndem. Estas secuencias se clasifican SINEs (short interspersedelements)oLINEs(longinterspertedelements).LosprincipalesSINEsdelos genomas de mamferos son las secuencias Alu, llamadas as porque usualmente contienen un sitio simple para la endonucleasa de restriccin AluI. Las secuencias Alu 218

tienenaproximadamente300basesdelongitud,ycercadeunmillndetalessecuencias
estn dispersas a travs del genoma, contabilizando cerca del 10% del total del ADN celular. Aunque las secuencias Alu se transcriben en ARN, no codifican protenas y su funcinesdesconocida.LosprincipalesLINEshumanos,(quepertenecenalafamiliaLINE 1oL1)sonalrededorde6000paresdebasesdelongitud,repetidosaproximadamente 50.000 veces en el genoma. Las secuencias L1 son transcriptas y al menos algunas de ellascodificanprotenas,perotalcomoocurreconlassecuenciasAluannoselesha encontradounafuncinenlafisiologacelular.TantolassecuenciasAlucomolasL1son ejemplos de elementos transportables, capaces de moverse a diferentes sitios en el ADN genmico. Algunas de estas secuencias podran ayudar a regular la expresin gnica,perolamayoradelassecuenciasAluyL1noparecentenerunacontribucintil a las clulas. Sin embargo, se considera que estas secuencias pudieron jugar un rol evolutivoimportantecontribuyendoalageneracindediversidadgentica. ELNMERODEGENESENLASCLULASEUCARIOTAS Estepuntohaquedadodesactualizado,seproponeverlosartculos:WhatIfThereAre only 30,000 Human Genes, by Jean Michael Claverie. Science vol., 291 pp. 12551257 (2001) & The Sequence of the Human Genome, by Venter J. C. et al., vol., 291 pp. 13041351(2001). Habiendo discutido varios tipos de ADNs no codificantes que contribuyen a la complejidad de los genomas de eucariotas superiores, es interesante considerar el nmerototaldegenesdelosgenomaseucariotas. CROMOSOMASYCROMATINA Nosloloscromosomasdelamayoradeloseucariotassonmscomplejosquelosde los procariotas, sino que el ADN de las clulas eucariotas est organizado de forma diferente que el de las procariotas. Los genomas de las clulas procariotas estn contenidosencromosomassimples,queusualmentesonmolculascircularesdeADN. En contraste, el genoma de los eucariotas est compuesto de mltiples cromosomas, cadaunodeloscualescontieneunamolculalinealdeADN.Apesardequeelnmero y tamao de los cromosomas vara considerablemente entre diferentes especies, su estructura bsica es la misma en todas las clulas eucariotas. El ADN de las clulas 219

eucariotas est firmementeunidoapequeasprotenasbsicasdenominadashistonas
las que permiten el empaquetamiento del ADN en una forma ordenada en el ncleo celular.EstatareaesesencialdadoelcontenidodeADNdelamayoradeloseucariotas. Porejemplo,lalongitudtotaldelADNdeunaclulacompletamenteextendidoesde2 m, peroeste ADN puede acomodarse en un ncleo de slo 5a 10 m dedimetro.A pesardequeelempaquetamientodelADNesunproblematambinparalasbacterias, el mecanismo por el que el ADN procariota est empaquetado es diferente y an no comprendidocompletamente. CROMATINA Los complejos formados entre el ADN eucaritico y las protenas se denomina cromatina. Estos contienen aproximadamente dos veces la cantidad de protenas en relacin alADN.Lasprincipales protenaspresentesenlacromatina sonlashistonas pequeasprotenasbsicasquecontienenunaaltaproporcindeaminocidosbsicos (argininaylisina)quefacilitansuuninalamolculadeADN,negativamentecargada. HaycincotiposprincipalesdehistonasdenominadasH1, H2A, H2B, H3 Y H4,losqueson H muysimilaresentrelasdiferentesespecies deeucariotas.Estas histonassonprotenas extremadamente abundantes en las clulas eucariotas, siendo su masa aproximadamente igual a la del ADN de la clula. La cromatina contiene adems una masa aproximadamente igual a la de histonas de una amplia variedad de protenas cromosmicas nohistnicas. Hay ms de un millar de diferentes tipos de estas protenas,
PROTENA 2 x ADN HMG
HISTONAS
las que estn involucradas en un rango de actividadesincluyendolareplicacindelADNy la expresin de los genes. Las histonas no se
MASA DE CROMATINA
ARN 10%
ADN
encuentran en las eubacterias (como E. coli) peroelADNdeestasbacteriasestasociadoa protenas que probablemente funcionen en
formasimilaralashistonas.Lasarquibacterias(Archaea),sinembargo,poseenhistonas queempaquetansuADNenestructurassimilaresalacromatinaeucaritica.
220

Labaseestructuraldelaunidaddelacromatina,elnucleosoma,fuedescriptoen1974
porRogerKornberg.Esteinvestigadorfue
El ADN se Enrolla en una Serie de Nucleosomas La nucleasa microccica digiere la cromatina La jerarqua microccica se genera cuando slo ~2% del ADN del ncleo es soluble en cido Se establecen series multimricas
llevado a la propuesta del modelo nucleosomal por dos serie de
experimentos llevados a cabo con nucleasa microccocal, (una enzima que degrada ADN) que se observ produca
605pb
405pb
205pb
fragmentos de aproximadamente 200 pb delongitud.Encontrasteunadigestinde
Separacin en Gel de Agarosa
> del 90% del ADN ~ 200 5 pb
ADN desnudo produca una chorreada continua de fragmentos aleatorios de ADN. Estos resultados sugirieron que las protenasunidasalADNproteganalADN deladigestindenucleasas,detalforma que el ADN poda ser atacado en sitios separados por distancias de
Niveles de Empaquetamiento de la Cromatina

En mitosis ~ 10.000 3 nivel ~ 1.000 2 nivel ~ 40 1 nivel ~ 6
aproximadamente 200 pb. Consistente con esta nocin el MET revel que las fibrasdecromatinaposeenunaestructura en forma de rosario, cuyas cuentas estn espaciadas cada 200 pb. Estas estructuras repetitivas (~ cada 200 pb) se denominaron nucleosomas.
La Fibra de 10 nm en estado desplegado
221

Una digestin de la cromatina ms extensiva
con nucleasa microccocal produce partculas (partculas centrales de nucleosomas) que se correspondenconlascuentasvisiblesporME.El anlisis detallado de estas partculas ha mostrado que contienen 146 pb de ADN que envuelven 1,65 veces alrededor de un centro
La Fibra de 30 nm
histnico cada uno de los cuales consiste de dos molculas de cada una de las: H2A, H2B,H3yH4(elcoraznhistnico).UnamolculadelaquintahistonaH1,estunidaal ADN,alaentradadecadapartculadeloscorazonesdenucleosomales.Estaformauna subunidad de cromatina conocida como cromatosoma, que consiste de 166 pares de bases de ADN envolviendo al corazn histnico mantenidos en su lugar por la H1 (histonalinker). ElempaquetamientodelADNconlashistonasproduceunafibracromatnicade10nm dedimetroqueestcompuestadecromatosomasseparadosporsegmentoslinkersde aproximadamente 80 pb de longitud en promedio. Por ME, esta fibra posee una apariencia de rosario que sugiere el modelo nucleosomal. Este empaquetamiento del ADN produce un acortamiento de aproximadamente seis veces. La cromatina puede espiralarse a su vez en fibras de 30 nm, cuya estructura an debe dilucidarse. La interaccin de las molculas de H1 parece jugar un rol importante en este segundo
1, 2 y 3 NIVEL DE ORGANIZACIN
estadodecondensacincromatnica. La extensin de la condensacin de la cromatinavaraduranteelciclodevidadelas clulas. En las clulas interfsicas, la mayora de la cromatina (eucromatina), est relativamente descondensada y distribuida a travs del
ncleo. Durante este perodo del ciclo celular, los genes son transcriptos y el ADN se replicaenpreparacindeladivisincelular. Duranteesteperododelciclocelular,los genessontranscriptosyelADNesreplicado.Lamayoradelaeucromatinaenelncleo 222

interfsicopareceestarenlaformadefibrasde30nm,organizadaengrandeslazosque
contienen aproximadamente 50 a 100 kb de ADN. Aproximadamente el 10% de la eucromatina, que contiene genes que se transcriben activamente, est en un estado ms descondensado (la conformacin de 10 nm) permitiendo la transcripcin. La estructura de la cromatina est ntimamente ligada al control de la expresin de los geneseneucariotas. En contraste con la eucromatina, un 10% de la cromatina interfsica denominada heterocromatina, constituye un estado altamente condensado que recuerda a la cromatina de las clulas en divisin. La heterocromatina es transcripcionalmente inactiva y contienen secuencias de ADN
Modelo de la Estructura de los Cromosomas
altamente repetidas, como las que se presentanentelmerosycentrmeros. Conforme la clula entra en mitosis, sus cromosomas se tornan altamente
condensadosdetalmaneraquepuedenser distribuidosenlasclulashijas.Loslazosde 30nmdelasfibrascromatnicas,sepliegan sobresimismosparaformarloscromosomasmetafsicosdelasclulasmitticas,enlos que el ADN se ha condensado cerca de 10.000 veces. Esta cromatina condensada no puedeusarseparalasntesisdeARN,porloquelatranscripcincesadurantelamitosis. LasmicrografiaselectrnicasindicanqueelADNenloscromosomasmetafsicosestn organizados en grandes lazos (o loops) anclados a un andamiaje proteco, pero an persiste mucho desconocimiento acerca de la estructura detallada de esta cromatina altamentecondensadaydelmecanismodecondensacincromatnica. Loscromosomasmetafsicosestntanaltamentecondensadosquesuestructurapuede ser estudiada usando el microscopio ptico. Varias tcnicas de tincin producen patronesdebandasalternantesclarasyoscurasqueresultandelauninpreferencialde colorantes fluorescentes por secuencias ricas en A = T versus CG. Estas bandas son especficasdecadacromosomayparecenrepresentardistintasregionescromosmicas. Losgenespuedenserlocalizadosenbandascromosmicasespecficasporhibridacinin 223

situ, indicando que el proceso de empaquetamiento es altamente ordenado y
reproducible. CENTRMEROS El centrmero es una regin especializada del cromosoma que juega un rol crtico asegurandolacorrectadistribucindeloscromosomasduplicadosenlasclulashijas.El ADNcelularesreplicadodurantelainterfaseresultandoenlaformacindedoscopias de cada cromosoma previo al comienzo de la mitosis. Conforme las clulas entran en mitosis, la condensacin de la cromatina, lleva a la formacin de cromosomas metafsicos que consisten de dos cromtidas hijas idnticas. Estas cromtidas se mantienen unidas por los centrmeros, los que se observan como una regin cromosomalconstreida.Conformetranscurrelamitosis,losmicrotbulos delhuso se unen al centrmero y las dos cromtidas hijas se separan y mueven hacia los polos opuestosdelhuso.Alfinaldelamitosisseformanuevamentelamembrananuclearylos cromosomas se descondensan, resultando en la formacin de los ncleos hijos que contienencadaunounacopiadecadacromosomaparental.Asloscentrmerosactan comolossitiosdeasociacindelascromtidashijasycomolossitiosdeanclajedelos cromosomas al huso mittico. Los centrmeros consisten de secuencias especficas de ADN a los que se unen varias protenas centromricas formando una estructura especializada llamada el cinetocoro La unin de los microtbulos a las protenas del cinetocoromedianelanclajedeloscromosomasalhuso.Lasprotenasasociadasconel cinetocoro actan como motores moleculares que conducen los movimientos de los cromosomasalolargodelasfibrasdelhuso,segregandoloscromosomasalosncleos hijos. Las secuencias de ADN centromrico han sido bien definidas en levaduras, donde su funcinpudoserensayadaconelseguimientodelosplsmidosdurantelamitosis.Los plsmidosquecontienencentrmerosfuncionalessesegregancomoloscromosomasy sondistribuidosenformaequitativaalasclulashijasdurantelamitosis.Enausenciade un centrmero funcional, sin embargo, los plsmidos no se separan correctamente, y muchasclulashijasfallanenheredarelADNdelosplsmidos.Ensayosdeestetipohan permitido determinar las secuencias requeridas para la funcin centromrica. Tales 224

experimentos mostraron, que las secuencias centromricas de los Saccharomyses
cereviceae contienen aproximadamente 125 pb consistentes de tres elementos: dos cortosde8y25paresdebasesseparadosporADNmuyricoensecuenciasATde7886 pb.EstaestructuracentromricacortadeS.cereviceaenoparecereflejarlaestructura deloseucariotasengeneral.Estudiosrecienteshanpermitidodefinirelcentrmerode fisin de la levadura Schizosaccharomyses pombe por medio de un mtodo similar. S. pombe,esmuydiferentedeS.cereviceaeenmuchosaspectos.Loscentrmerosdeesta especie,comprenden40a100kbdeADN.Consistendecuerpocentralde4a7kbde ADN decopia simple flanqueadopor secuenciasrepetitivas.Ambos tipos de secuencia serequierenparalafuncindeloscentrmeros. Los estudios de los cromosomas de Drosophila han provisto la primeracaracterizacin de los cromosomas de eucariotas superiores. Estos centrmeros estn comprendidos por 420 pb. Muchos de los cuales (ms del 85%) consiste de dos ADNs satlites altamenterepetitivosconlassecuenciasAATATyAAGAG.Elremanentedelcentrmero consiste de elementos transponibles que se encuentran tambin en otros sitios del genoma de Drosophila, adems de una regin no repetitiva de ADN rico en AT. La supresin de las secuencias satlite, los elementos transponibles, as como los elementos norepetitivos reducen la actividad de los centrmeros en los ensayos funcionales. Ambas regiones parecen contribuir a la formacin y la funcin de los centrmeros. Loscentrmerosdehumanosyotrosmamferos,annohansidodefinidosporestudios funcionales, pero han sido identificados por la unin de protenas asociadas a centrmeros. Los centrmeros de mamferos se caracterizan por extensas regiones de heterocromatina que consiste de secuencias de ADN satlite altamente repetitivas. En humanosyotrosprimateslasecuenciacentromricaprimariaeselADNsatlite,que es una secuencia de 171 pares de bases arregladas en repeticiones en tndem que comprenden millones de pares de bases. El ADN satlite parece jugar un rol en la estructurayfuncincentromrica,yaquesehaencontradoqueseunealasprotenas asociadas al centrmero. Sin embargo, su funcin y los potenciales roles de otras secuenciasenlacentrmerosdemamferosdebenserestablecidos.Consistenteconsu grantamao,loscentrmerosdelosmamferosformangrandescinetocoros,queunen 225

30 a 40 microtbulos, mientras que slo microtbulos simples son unidos en S.
cereviceae. TELMEROS Lasecuenciadelosextremosdeloscromosomaseucariticossedenominantelmeros. Estos juegan un rol muy importante en la replicacin y mantenimiento de los cromosomas.Lostelmerosfueronreconocidoscomoestructurasdistintivasyaquelos cromosomas rotoseranaltamenteinestables enlasclulaseucariotas,implicandoque se requieren secuencias especficas en los extremos cromosmicos normales. Esto fue subsecuentementedemostradoenexperimentosenlosquelostelmerosdelprotozoo Tetrahymena fueron agregados a los extremos de molculas lineales del ADN de plsmidosdelevaduras.LaadicindeestassecuenciasdeADNtelomricolespermitea estos plsmidos replicarse como molculas similares a cromosomas lineales en levaduras, demostrando directamente que los telmeros son necesarios para la replicacindemolculaslinearesdeADN. Las secuencias lineales de ADN de varios eucariotas son similares, consistiendo de repeticionesdeADNdesecuenciasimplequecontienengruposderesiduosdeGsobre unahebra(Tabla1). TABLA1:ADNSTELOMRICOS ORGANISMOS LEVADURAS Saccharomysescereviceae Schizosaccharomycespombe PROTOZOOS Tetrahymena Dictyostelium VEGETALES Arabidopsis MAMFEROS Homosapienssapiens
REPETICINDESECUENCIASTELOMRICAS G13AT G25TTAC GGGGTT G18 AGGGTTT AGGGTT
Porejemplo,lasecuenciaderepeticionesdetelmerosenhumanosyotrosmamferos esAGGGTT,ylasrepeticionesenTetrahymenaesGGGGTT,Estassecuenciasserepiten cientosamilesdevecescomprendiendovariasquilobasesyfinalizanconunasalientede ADN de hebra simple. Los resultados ms recientes sugieren que las secuencias 226

telomricas repetidas de ADN forman lazos en los extremos de los cromosomas,
protegindolosdesudegradacin(Figura). Los telmeros juegan un rol crtico en la replicacin de los extremos de las molculas linealesdeADN.LaADNpolimerasaescapazdeextenderunacadenadeADNcreciente pero no puede iniciar la cadena en el extremo de una molcula de ADN lineal. En consecuencia,losextremosdeloscromosomaslinealesnopuedenserreplicadosporla accinnormaldelaADNpolimerasa.Esteproblemahasidosolucionadoporlaevolucin de un mecanismo especial que involucra la actividad de la transcriptasa reversa para replicarlassecuenciasdeADNtelomricas.Elmantenimientodetelmerospareceser un factor importante en la determinacin de vida y la capacidad reproductiva de las clulas. As, los estudios de los telmeros y las telomerasas prometen la provisin de nuevosconocimientosenenvejecimientoycncer.
227
CAPTULO NOVENO:
Replicacin Celular en Eucariotas
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Compendio de Biologa Celular y Molecular # Ao 2009 REPLICACINDELADNENEUCARIOTAS Lareplicacinesunprocesosemiconservativoenelquecadahebraparentalactacomo molde para la sntesis de una nueva hebra hija complementaria. La enzima central involucrada es la ADN polimerasa, que cataliza la incorporacin de
desoxirribonucletidostrifosfato5(dNTPs)paralaformacindelacadenacrecientede ADN. Sin embargo, el proceso es mucho ms complejo que una simple reaccin enzimtica, ya que se requieren otras protenas y mecanismos de correccin para asegurar la adecuada replicacin con la baja frecuencia de errores necesarios para la reproduccincelular.Esporello,quesonnecesariasprotenasadicionalesysecuencias especficas de ADN para iniciar la replicacin y para la copia de los extremos de los cromosomaseucariticos. ADNPOLIMERASAS EstasenzimasfuerondescubiertasporA.Kornbergen1956.LaprimeraADNpolimerasa purificada en E. coli, se denomin ADN polimerasa I. Posteriormente se aislaron dos ADN polimerasas (denominadas II y III). Las polimerasas I y III son las realmente necesariasparalareplicacindelasE.coli. Lasclulaseucariotasposeen5ADNspolimerasas,asaber:, , , y . La ADNpolimerasa seencuentraenlasmitocondriasyesresponsabledelareplicacin delADNmitocondrial.Lasotrascuatroestnlocalizadasenelncleo.Laspolimerasas, y sonlasmsactivasenlasclulasendivisinylapolimerasa esmsactivaen clulas que no se estn dividiendo, sugiriendo una funcin en la reparacin del ADN daado. Enlaseucariotaslaspolimerasas y parecensersuficientesparalareplicacintanto invitro,comoinvivoenlevadurasmientrasqueelroldelapolimerasa andebeser determinado. PropiedadesfundamentalesdelasADNspolimerasas: Las ADN polimerasas slo sintetizan ADN en la direccin 53 agregando los 229
dNTPalgrupohidroxilo3deunacadenacrecientedeADN. LasADNpolimerasasslopuedenagregarunnuevodesoxirribonucletidoauna nueva hebra, cuyo ltimo nucletido est unido por un puente hidrgeno al nucletidocomplementariodela hebramolde.Nopuedeniniciarlasntesisde novo catalizando la polimerizacin de dNTPs libres. En este sentido las ADN polimerasassondiferentesalasARNpolimerasas.
LAHORQUILLADEREPLICACIN J.CairnsfueelprimeroenanalizarelprocesodereplicacinenexperimentosconE.coli, usando timidina radiomarcada. Las molculas de ADN poseen dos horquillas de replicacin,yporcadahorquilladehebraparentalseparada,sesintetizandosnuevas hebrasdeADN.Estorepresentabaunproblema,yaquelasdoshebrascorrenensentido antiparaleloylaADNpolimerasaslocatalizalapolimerizacindedNTPsenladireccin 5a3.Esteenigmafueresueltoporexperimentosquemuestranqueslounahebrade ADN se sintetiza en forma continua mientras que la otra lo hace como piezas discontinuas pequeas que se sintetizan en direccin opuesta al movimiento de la horquilla de replicacin. Estas pequeas hebras de ADN sintetizadas (denominadas Fragmentos de Okazaki) se unen por la accin de la ADN ligasa, formando una nueva hebra de ADN intacta. La hebra que se sintetiza continuamente se denomina la hebra lderoconductorayaquesuelongacinenladireccindelmovimientodelahorquilla dereplicacin,exponeelmoldeusadoparalasntesisdelosfragmentosdeOkazaki(la hebra rezagada). Pese a que el descubrimiento de la sntesis discontinua de la hebra rezagadapermitipostularunmecanismoparalaelongacindelasdoshebrasdeADN en la horquilla de replicacin, permaneci obscura otra cuestin: ya que la ADN polimerasa requiere de un cebador y no puede iniciarse la sntesis de novo, cmo se inicia la sntesis de los fragmentos de Okazaki? La respuesta es que los fragmentos cortosdeARNactancomoprimersparalareplicacindeADN.Encontrastealasntesis de ADN, la sntesis de ARN puede iniciar la sntesis de novo, y una enzima llamada primasa sintetiza fragmentos cortos de ARN (de tres a diez nucletidos de longitud) complementarios a la hebra molde rezagada en la horquilla de replicacin. As, los fragmentosdeOkazakisonsintetizadosvalaextensindeestosprimersdeARNporla 230

ADN polimerasa. Una consecuencia importante es que estos ARNs contienen uniones
ADN ARN lo que provee una evidencia crtica para el rol de los primers ARN en la replicacindelADN. ParaformarlahebradeADNrezagadacontinua,losprimersdebenserremovidosdelos fragmentosdeOkazakiysereemplazanconADN. EnE.colilosprimersdeARNseremuevenconlaaccincombinadadelaARNasaH,una enzima que degrada el ARN de los hbridos ADNARN y la polimerasa I que posee actividaddeexonucleasaquepuedehidrolizarADN(oARN)tantoenladireccin3a5 como5a3.EneucariotaselroldelapolimerasaIesrealizadoporotrasexonucleasas, removiendoprimersylasinterrupcionesentrelosfragmentosdeOkazakisellenanpor la accin de la polimerasa. Como en procariotas, los fragmentos de ADN se unen mediantelaADNligasa. En las clulas eucariotas se requieren dos polimerasas para realizar la tarea de la polimerasaIIIdeprocariotas.Lapolimerasaseencuentraformandouncomplejocon laprimasayambasparecenactuarconjuntamenteparasintetizarloscortosfragmentos de ARNADN durante la sntesis de la hebra rezagada. La polimerasa luego puede sintetizar ambas hebras actuando en la extensin de los primers inicialmente sintetizados por el complejo primasapolimerasa. Adicionalmente la polimerasa puede tomar el lugar de la polimerasa I en el llenado de las interrupciones entre los fragmentosdeOkazakiluegodelaremocindelosprimersdeARN. Adems de las polimerasas y la primasa, otras enzimas actan en la horquilla de replicacin.UnaclasedeprotenasseunealaADNpolimerasaprovocandosuuninal ADNpatrndetalmaneraquecontinelasntesisdeunanuevahebradeADN.Tantola ADNpolimerasaIIIdeE.colicomolaADNpolimerasadeeucariotasestnasociadasa dos tipos de protenas accesorias [slidingclamp proteins {protenas abrazaderas de deslizamiento} & clamp loading proteins {protenas abrazaderas de montaje}] que acoplanlapolimerasasobreelprimerymantienensuasociacinestableconelmolde. OtrasprotenasprovocaneldesenrollamientoelADNyestabilizanlasregionesdehebra simple. Las helicasas son enzimas que catalizan el desenrollamiento de la doble hebra 231

del ADN parental acoplado a la hidrlisis del ATP, adelantndose a la horquilla de
replicacin Las protenas de unin a ADN de hebra simple, [FACTOR DE REPLICACIN A (RFA) de eucariotas]estabilizanluegola hebradesenrollada mantenindoloenformaextendida paraserreplicadoporlasADNpolimerasas. ConformeseproduceeldesenrollamientodelADNparental,elADNpordelantedela horquilladereplicacinesforzadoarotar.Estarotacinpodracausarquelasmolculas deADNcircularseretuerzansobresmismos,bloqueandosureplicacin.Esteproblema es solucionado por las topoisomerasas, enzimas que catalizan la ruptura y la reunin reversibledelahebradeADN.Haydostiposdetopoisomerasas:lastopoisomerasastipo I rompen slo una hebra de ADN, las topoisomerasas tipo II introducen rupturas simultneas en ambas hebras. Las rupturas introducidas por las topoisomerasas I y II actancomopivotequepermitenalasdoshebrasdeADNmolderotarlibrementeuna alrededor de la otra sin que se produzca retorcimiento del ADN por delante de la horquilla. Aunque los cromosomas eucariotas estn compuestos por ADN lineal, su replicacin tambin requiere topoisomerasas, de otra forma los cromosomas tendran querotarcontinuamentedurantesusntesis. Las enzimas involucradas en la replicacin de ADN actan en forma coordinada para sintetizar ambas hebras de ADN (lder y rezagada) simultneamenteen la horquilla de replicacin. Esta tarea es realizada por la formacin de dmeros de ADN polimerasa (polimerasa III en E. coli o polimerasa en eucariotas), cada una de ellas con sus respectivasprotenasaccesorias.Unamolculadepolimerasaactaenlasntesisdela hebra lder mientras la otra lo hace sobre la hebra rezagada. Se cree que la hebra rezagada molde forma un lazo en la horquilla de replicacin de tal manera que la subunidad de la sntesis sobre esta hebra se mueve en la misma direccin que la otra subunidad,queestsintetizandolahebralder. ElOrigenylaIniciacindelProcesodeReplicacin: LareplicacintantodelADNprocariotacomoeleucariotacomienzanenunasecuencia nica llamada origen dereplicacin, que acta como sitio de uninespecfico paralas 232

protenasqueinicianelproceso.ElprimerorigendefinidofueeldeE.coli,enelqueel
anlisisgenticoindicquelareplicacinsiemprecomienzaenunsitiodelcromosoma bacteriano.ElorigendeE.coliconsistede245paresdebasesdelasecuenciadeADN, elementosqueactancomositiosdeunindelasprotenasqueiniciansureplicacin.El paso clave, es la unin de una protena, a secuencias especficas de ADN dentro del origen. La protena iniciadora comienza a desenrollar el origen del ADN y recluta a las otrasprotenasinvolucradasenlasntesisdeADN.Lahelicasaylasprotenasdeunina ADN de hebra simple actan luego continuando el desenrollamiento y exponiendo el moldedeADN,ylaprimasainicialasntesisdelahebralder. Aunque en las bacterias es suficiente un origen de replicacin, en los genomas eucariotasesnecesarioqueseproduzcanmltiplessitiosdereplicacin.Losorgenesde replicacinenlasclulasdemamferosestnespaciadoscada50a300kbaselgenoma humanotienecercade30.000orgenesdereplicacin. Losorgenesdereplicacinmejorestudiadossonlosdelaslevaduras.Lassecuenciasse denominanARSs(delingls:autonomouslyreplicatingsequences),LoselementosARSs funcionalescomprendencercade100paresdebases,incluyendouncentrode11pares debasescomnadiferentesARSs.Estasecuenciacentroesesencialparalafuncinde losARSyseencontrqueeselsitiodeunindeuncomplejoprotenicollamadoORC (del ingls: origin replication complex) que es requerido para la iniciacin de la replicacin del ADN. El complejo ORC parece reclutar a otras protenas (incluyendo la ADNhelicasa)enelorigeneiniciandoelprocesodereplicacin. TelmerosyTelomerasas:Replicacinenelextremodeloscromosomas YaquelaADNpolimerasasloextiendeprimersenladireccin5a3,estasenzimasson incapaces de extender los extremos 5 de las molculas lineales de ADN. En consecuencia, se requieren mecanismos especiales para replicar las secuencias terminales de los cromosomas lineales de las clulas eucariotas. Estas secuencias (telmeros) son repeticiones en tndem de molculas de ADN simple. Ellas son replicadasporlaaccindeunaenzimanicadenominadatelomerasa,queescapazde mantenerlostelmeroscatalizandosusntesisenlaausenciadeunADNmolde. La telomerasa es una transcriptasa reversa, un tipo de ADN polimerasa descubierta 233

originalmenteenretrovirusquesintetizanADNapartirdeunmoldedeARN.Unhecho
importanteesquelatelomerasaportasupropioARNmolde,queescomplementarioa lassecuenciastelomricasrepetitivas comoparte deloscomplejosenzimticos. Eluso de estos ARN como molde, permite a la telomerasa generar mltiples copias de las secuencias repetitivas manteniendo as telmeros en ausencia de un molde de ADN convencionalparadirigirsusntesis. El mecanismo de accin de la telomerasa fue dilucidado en 1985 por Carol Greider y Elizabeth Blackburn estudiando el protozoo Tetrahymena. La telomerasa de TetrahymenaestformandouncomplejoconunprimerdeARNde159nucletidosde extensinqueincluyelasecuencia3AACCCCAAC5Estasecuenciaescomplementaria a la secuencia telomrica repetitiva de Tetrahymena (5 CCGGGG 3) y acta como molde del ADN telomrico. El uso de este ARN como molde permite a la telomerasa extenderelextremo3delADNcromosmicoporunaunidadderepeticinmsallde su longitud original. La hebra complementaria puede ser luego sintetizada por el complejopolimerasaprimasausandoelcebado(priming)convencionalconARN.La remocin de los primers ARN lleva a una saliente de los extremos 3 del ADN cromosmicoelquepuedeformarlazosenlosextremosdeloscromosomaseucariotas. Latelomerasahasidoidentificadaenunagranvariedaddeeucariotas,ylosgenesque codifican el ARN de la telomerasa han sido clonados en Tetrahyemena, levaduras, ratones y humanos. En cada caso, la ARN telomerasa contiene secuencias complementarias con las secuencias repetitivas de estos organismos. Sin embargo, la introduccindegenesdeARNstelomerasasmutantesenlevadurashamostradoresultar en alteraciones correspondientes de las secuencias de las repeticiones telomricas. Demostrando directamente la funcin de la telomerasa en el mantenimiento de los extremosdeloscromosomaseucariticos.
234
CAPTULO DCIMO:
Transcripcin en Clulas Eucariotas
235

TRANSCRIPCINENCLULASEUCARIOTAS
Adiferenciadelosprocariontes,losorganismoseucariontesposeenncleo,porloque losprocesosbiolgicosquetienenlugarenlaclulavanaestarcompartimentalizados. Porejemplo,lareplicacinyreparacindelADNtendrnlugarenelncleo,lugardonde estecidonucleicoestprotegido.Latranscripcin,portanto,tambintendrlugaren elncleocelular.Sinembargo,lasntesisdeprotenastienelugarenelcitoplasma.Por otra parte, las clulas eucariotas sufren el proceso de diferenciacin mediante el cual cadatejidourganoestarformadoporclulasespecializadas.Portodoloanterior,es de esperar que haya grandes diferencias entre la sntesis de los ARN procariotas y los eucariotas,comosucedeenrealidad. CARACTERSTICAS GENERALES DE LAS POLIMERASAS EUCARIOTAS Adiferenciadelosorganismosprocariotasquesintetizanlostrestiposdemolculasde ARN mediante una sola enzima, la ARN polimerasa ADN dependiente, los eucariontes poseen tres tipos de polimerasas, tambin ADN dependientes para transcribir los tres tipos de genes de clase I, II y III. Las polimerasas eucariotas se conocen como ARN polimerasaI,IIyIIIyrecibieronestosnombresdebidoasuordendeelucin.Lastresse pueden diferenciar entre s por su reaccin ante la amanitina (Tabla 1). La amanitina es un octapptido bicclico que acta como un inhibidor diferencial de la transcripcin,muytilparadiferenciarentrelastrespolimerasas. TABLA 1: C ARACTERSTICASDELASPOLIMERASASEUCARIOTAS Enzima ARNPI ARNPII ARNPIII Localizacin Nucleolo Nucleoplasma Nucleoplasma Actividad Polimersica 5070% 2040% ~10% Sensibilidad amanitina Ninguna Alta Especficade especie
Una caracterstica de las tres enzimas es que su producto, en cada caso, necesita ser procesado o modificado para tornarse funcional, por lo que la ARNPI sintetizar pre ARN ribosomales, la ARNPII producir los ARNhn (ARN heterogeneos nucleares) que despus de varios procesos de modificacin postranscripcional darn los ARN mensajerosqueservirndemoldeenlasntesisdeprotenas.Estaenzimaestambinla 236

encargada de sintetizar los ARNnpq (ARN nucleares pequeos) U1, U2, U4 y U5. Estos
ARNs, unidos a protenas, formarn las ribonucleoprotenas (RNP) que tomarn parte activa en el proceso de modificacin postranscripcional conocido como splicing o empalme. T ODAS
LAS
ARN
POLIMERASAS EUCARIOTAS SON GRANDES PROTENAS EN FORMA DE
AGREGADOSDE 500 K D AO MS . G ENERALMENTETIENENDE 8 A 14 SUBUNIDADES . L AENZIMA PURA PUEDE LLEVAR A CABO LA TRANSCRIPCIN DEL ARN EN DEPENDENCIA DEL MOLDE , PERO NO PUEDE INICIARLA DE FORMA SELECTIVA EN LOS PROMOTORES . N INGUNA DE LAS ENZIMAS EUCARIOTAS SE HA PODIDO RECONSTRUIR A PARTIR DE SUS SUBUNIDADES PURAS , LO CUAL POR SUPUESTOHACEPENSARSITODASLASSUBUNIDADESSONESENCIALES .
E L
NICO CASO EN EL CUAL TODAS LAS SUBUNIDADES SE HAN DEFINIDO A NIVEL DE LA
CARACTERIZACIN DE SUS GENES ES EN EL CASO DE S. CEREVISIAE , EN LA CUAL SE NECESITAN DE
10 A 11 SUBUNIDADES PARA LLEVAR A CABO LA TRANSCRIPCIN . L AS TRES SUBUNIDADES

MAYORES DE LA ENZIMA ARN POLIMERASA II DE S. CEREVISIAE TIENEN HOMOLOGA CON LAS SUBUNIDADES DE LA
ARN
POLIMERASA BACTERIANA .
L AS
DOS MAYORES PROBABLEMENTE
CONTENGAN EL SITIO CATALTICO .
T RES DE LAS SUBUNIDADES RESTANTES SON COMUNES A
TODASLAS ARN POLIMERASAS , OSEA , SONTAMBINCOMPONENTESDELAS ARN POLIMERASAS
I Y III. L AS ACTIVIDADES DE LA ARN POLIMERASA DE LAS MITOCONDRIAS Y LOS CLOROPLASTOS

SON MENORES Y SE ASEMEJAN A LA ARN POLIMERASA BACTERIANA MS QUE A CUALQUIERA DE LASENZIMASNUCLEARES .
Una caracterstica diferencial de las polimerasas eucariotas es que para transcribir el ADN no se fijan directamente, sino que lo hacen mediante factores proteicos adicionales. Las protenas necesarias para la iniciacin de la transcripcin pero que no formanpartedelaARNpolimerasacomotal,sedefinencomofactoresdetranscripcin. Muchos factores de transcripcin actan reconociendo sitios activos en cis que se clasifican como parte de los promotores o como amplificadores (enhancers). Sin embargo,launinalADNnoeselnicomediodeaccindeunfactordetranscripcin. Unfactorpuedetantoreconoceraotrofactor,comoalaARNpolimerasa,opuedeestar incorporadoenuncomplejodeiniciacinsolamenteenpresenciadeotrasprotenas.La ltima prueba para sermiembro del aparato de transcripcin es funcional: la protena 237

tendr que ser absolutamente necesaria para que ocurra la transcripcin en un
promotor o grupo de promotores especficos. Por lo tanto, in vivo, la polimerasa eucariota reconoce un complejo formado por ADN y protenas y son las interacciones protenaprotena las que priman en las reacciones donde ellas intervienen. Aunque existenexcepciones,engeneral,mltiplespolimerasastranscribensimultneamenteel mismogenysuvelocidaddesntesisesdeaproximadamenteunARNcada10segundos. ALGUNASCARACTERSTICASDELATRANSCRIPCINENEUCARIONTES UnadiferenciasignificativaenlatranscripcindelosARNmeucariotasyprocariotases quelainiciacinenunpromotoreucariota,implicaunagrancantidaddefactoresquese unenaunagranvariedaddeelementosqueactanencis.Elpromotorsedefinecomola regin que contiene todos estos sitios de unin, es decir, que puede llevar a cabo la transcripcinconunaeficiencianormalyconuncontroladecuado.As,lacaracterstica msimportantequedefinealpromotordelARNmeucariotaeslalocalizacindesitios deuninparalosfactoresdetranscripcin.LapropiaARNpolimerasaseunealrededor del punto de inicio pero no hace contacto directo con la regin anterior al punto de iniciacin es decir, con el promotor. Por el contrario, los promotores bacterianos se definen en gran medida, en trminos del sitio de unin de la ARN polimerasa en la vecindadinmediatadelpuntodeinicio.Otrassecuenciascercanasregulanalpromotor, perogeneralmenteseconsiderandiferentesdeste. El proceso de transcripcin es similar en eucariontes y procariontes; ambos tienen etapas comunes y cada una de stas ocurre segn reacciones anlogas. Sin embargo, estos procesos se diferenciantambin enel sitio de sntesis decada molculade ARN como ya hemos visto. Tambin se diferencian, como se ha dicho, en que los ARN eucariotas deben ser modificados postranscripcionalmente para ser funcionales. El grado de complejidad de la maquinaria de transcripcin tambin difiere, siendo ms compleja en los eucariontes. Estas diferencias se deben al mayor tamao del genoma eucariota y a su organizacin en una estructura ordenada conocida con el nombre de cromatina. Latranscripcinnoescompatibleconlaestructuraempaquetadadelacromatinaenlos cromosomas metafsicos. El proceso slo ocurre cuando la cromatina est en su 238

conformacinde"cuentasdecollar"(10nm).Elcromosomadebeestarextendidocomo
en la interfase para que los genes puedan transcribirse. La funcin esencial de los cromosomasesservirdematrizparalasntesisdeARNpueseslanicaformaenquela informacinalmacenadaenelADNpuedesertilparalaclula. Enclulasdemamferossloel1%delADNserARNfuncional.Estaselectividadseda endosnivelesyaqueslounapartedelADNsetranscribeparaformarARNsnuclearesy porqueslounapequeaproporcindelassecuenciasdelosARNsnuclearessobrevive lasetapasdemaduracindelARNqueprecedeneltrnsitodelARNalcitoplasma. TRANSCRIPCINDELOSGENESDECLASEI CARACTERSTICASDELAARNPOLIMERASAI Losgenes quecodificanlosARNrdelas dos subunidades grandesyeldela subunidad pequea del ribosoma (ARNs: 18S, 5,8S y 2528S) se transcriben como un nico precursorpolicistrnicoenesemismoorden.Estosgenessonmuynumerosos,variando entre 10 a 50.000 por clula y no contienen nucleosomas. En la mayora de los eucariontes, los genes de ARNr se encuentran formando agrupaciones de 100 a 500 repeticiones. Las unidades que se repiten estn separadas entre s por secuencias espaciadoras intergnicas que pueden tener desde 2 hasta ms de 30 kb. Estos genes son transcriptos por la ARNPI en el nucleolo. En el nucleolo tambin se encuentran topoisomerasas,unaseriedeprotenasespecficas,ARN5S,snRNPsylosARNrencurso demaduracin.Lamaduracinylatranscripcinsonsimultneas.Unaclulaeucariota tiene ~40.000 molculas de ARNPI, las que parecen exageradas para transcribir 100 genes,peroelprecursordelARNresgrande(6.000a15.000nucletidos)y~50ARNPI pueden transcribir simultneamente el gen de los ARNr. La transcripcin de los genes ribosomalesduraalrededordetresminutos. PromotordelaARNPI ElpromotordelaARNpolimerasaIsehacaracterizadoenclulashumanasenlascuales est formado por una secuencia bipartita en la regin anterior al punto de inicio. El promotorcentralocorerodeaelpuntodeinicioextendindosedesde45hasta+20,y essuficienteparainiciarlatranscripcin.Sinembargo,sueficienciaseaumentamucho
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graciasalelementodecontrolanterior(UCE:UpstreamControlElement).
TRANSCRIPCINDELOSGENESDECLASEIII CARACTERSTICASDELARNAPOLIMERASAIII LaARNPIIIesunamolculacomplejaquepresentaalrededorde15subunidadesyuna masa total de 650 kDa. Es la polimerasa encargada de transcribir ARN pequeos no codificantes,ARNtsyelARNr5S.Llevaacaboalrededordel10%delatranscripcinde los genes eucariotas. Al igual que las otras dos polimerasas eucariotas, la ARNPIII tambin requiere de factores de transcripcin. Los ARN transcriptos por la ARNPIII tienenlaparticularidaddequenoestnmodificadosenelextremo5'ysubaseterminal escasisiempreunapurina,enelARN5ScasisiempreunaG. PromotordelaARNPIII LaARNpolimerasaIIIreconocedosclasesgeneralesdepromotoresquesonreconocidos dediferentesmaneraspordiferentesgruposdefactores.Lospromotoresdelosgenes delARNr5SylosdelosARNtsoninternos,estnubicadosdespusdelpuntodeinicio (downstream). Los promotores de los genes del ARNnpq (small nuclear RNA) estn situadospordelantedelpuntodeinicio(upstream)enlamaneramsconvencionalde otros promotores. En ambos casos, los elementos individuales necesarios para que funcioneelpromotorconsistenexclusivamenteensecuenciasquesonreconocidaspor factoresdetranscripcin,queasuvez,dirigenlaunindelaARNpolimerasa. Haydostiposdepromotoresinternos.Cadaunocontieneunaestructurabipartitaenla cual dos elementos conformados por secuencias cortas estn separados por una secuencia variable. El tipo 1 tiene una secuencia llamada caja A separada de otra llamadacajaC,yeltipo2unacajaAseparadadeunacajaB.Ladistanciaentrelascajas AyBenunpromotordetipo2puedevariarmuchoperolascajasgeneralmentenose puedenacercarmuchounaalaotrasineliminarsufuncin. Lareginanterioralpuntodeiniciotieneunrolmsimportanteenlaterceraclasede promotor de la ARN polimerasa III. Hay tres elementos anteriores que tambin se encuentran en los promotores de los genes que codifican a los ARNnpq que se transcribenporlaARNpolimerasaII.LosgenesdealgunosARNnpqssetranscribenpor 240

RNA polimerasa II, mientras que otros se transcriben por la ARN polimerasa III. Los la
elementos anteriores funcionan de manera similar en los promotores de estas dos polimerasas.UnelementoTATAconfiereespecificidadsegneltipodepolimerasa. TRANSCRIPCINDELOSGENESDECLASEII LAARNPOLIMERASAII La ARN polimerasa II tiene ~10 subunidades con una masa de ~500 kDa. La ARN polimerasaIInopuedeiniciarlatranscripcinporssolaydependecompletamentede factores auxiliares de la transcripcin. La enzima, conjuntamente con estos factores constituye el aparato bsico de transcripcin, requerido para transcribir cualquier promotor. Lasubunidad mayordelaARNPII poseeunaestructuranica queno seencuentraen ningunaotrapolimerasa;setratadeundominiopococomnenelextremocarboxlico delasubunidadmayor.EstaestructurasellamaCTD(carboxyterminaldomain)yest constituidaporrepeticionesentndemdelasecuenciaconsensoheptapeptdicatyrser protreoserproser. La estructura es fosforilable pero no se conoce el porqu, ni su funcin.Existenevidenciasqueindicanquecadaciclodetranscripcinestasociadocon lafosforilacinreversibledeCTD.Noobstante,sehadiseadounmodelogeneralenel cuallasinteraccionesdelaARNPIIconelpromotorestnmediadas,almenosenparte, por la interaccin de CTD con los componentes del complejo de preiniciacin. La estructuraCTDesindispensableparalaviabilidadcelular. ElpromotorylosfactoresproteicosdelaARNpolimerasaII El primer punto para considerar la organizacin del promotor es definir un promotor "genrico"queserlasecuenciamscortaenlacuallaARNpolimerasaIIpuedeiniciar la transcripcin y caracterizar las subunidades de la enzima y los factores de transcripcin que se necesitan para reconocerlo. Un promotor genrico puede, en principio,expresarseencualquierclula:nodependedesecuenciascuyousoestbajo controlespecficodeltejido.LasprotenasaccesoriasquerequierelaARNpolimerasaII parainiciarenestepromotor,definenlosfactoresgeneralesdetranscripcinimplicados enlamecnicadeuninalADNylainiciacindelatranscripcin.
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nmero de factores que pueden actuar conjuntamente con la ARN polimerasa II es El
muygrande.Sehandivididoentresgrupos: LosfactoresgeneralesserequierenparaeliniciodelasntesisdelARNentodos lospromotores.EllosseunenconlaARNpolimerasaparaformaruncomplejoque rodeaelpuntodeinicio,ydeterminanelsitiodeiniciacin.Losfactoresgenerales, conjuntamente con la ARN polimerasa, constituyen el aparato bsico de transcripcin. Los factores anteriores (upstream) son protenas de unin al ADN que reconocen elementos consenso, cortos y especficos que se encuentran antes del puntodeinicio.Laactividaddeestosfactoresnoesregulada;sonomnipresentes,es decirsiempreestnpresentesentodaslasclulas.Tambinactansobrecualquier promotor que contenga los sitios adecuados de unin al ADN. Estos factores aumentan la eficiencia de la iniciacin, y se necesitan para que un promotor funcioneenunniveladecuado.Elgrupoexactodefactoresnecesariosparalatotal expresindelgenescaractersticodecualquierpromotorespecfico. Losfactoresinduciblesfuncionandelamismamanerageneralquelosfactores anteriores,perotienenunpapelregulador.Sesintetizanoactivanenmomentoso entejidosespecficos,ysonportanto,responsablesdelcontroldelospatronesde transcripcin en tiempo y espacio. Las secuencias a las cuales se unen se llaman elementosrespuesta. LosfactoresgeneralessedescribencomoTFIIX,dondelaXesunaletraqueidentificael factorindividual.Unpromotorgenricofuncionasloamuybajaeficiencia;senecesitan factoresanterioresadicionalesparaalcanzarunadecuadoniveldefuncionamiento.Los factores anteriores y los inducibles no se describen sistemticamente, sino que tienen nombrescasualesquereflejansushistoriasdeidentificacin. La mayora de los promotores tienen una secuencia llamada la caja TATA, localizada generalmente ~25 pb antes del punto de inicio. Constituye el nico elemento del promotor antes del punto de inicio que posee una localizacin relativamente fija respecto al punto de iniciacin de la transcripcin. La secuencia consenso de 8 pb consiste enteramente de pares de bases AT (en dos posiciones la orientacin es 242

variable), y slo en unos pocos casos conocidos es un par GC. La caja TATA tiende a
estar rodeada de secuencias ricas en GC, las que se cree pueden ser un factor que influya en su funcin. Posee un alto grado de homologa con la secuencia 10 de los promotores bacterianos. De hecho, podra pasar por uno de ellos excepto porque la localizacinesenlaposicin25enlugardeseren10. LassustitucionesdeunasolabaseenlacajaTATAactandisminuyendofuertementela actividaddelpromotor(mutacionesbajas).Algunasmutacionesinviertenlaorientacin deunparAT,demaneraquelacomposicindebasessolamentenoessuficientepara su funcionamiento. Por tanto, la caja TATA es un elemento cuyo comportamiento es anlogo al concepto de promotor bacteriano: una secuencia corta, bien definida, colocada justo antes del punto de inicio, que es necesaria para la transcripcin. Los pocospromotoresquenocontienenelelementoTATAsellamanpromotorescarentes decajaTATA. MecanismodeensamblajedelcomplejodeiniciacindelaARNpolimerasaII El primer paso en la formacin del complejo de preiniciacin en un promotor que contengaunacajaTATAeslaunindelfactorTFIIDaunareginqueseextiendeenla direccin5'(upstream)delasecuenciaTATA.TFIIDcontienedostiposdecomponentes: laprotenadeuninaTATA(TBP)(TATAbindingprotein)queesunapequeaprotena de~30kDay~11TAFs(TBPassociatedfactors),factoresasociadosaTBPconunamasa total tpica de ~800 kDa. TFIID es el nico responsable del reconocimiento de un promotorporlaARNpolimerasaII. TBP es el primer factor que hace contacto con un promotor de clase II y a veces se considera como un "factor de compromiso" ya que en efecto, determina que un promotorsetranscriba.DebidoaquelacajaTATAestsituadaaunadistanciafijadel sitiodeinicio,sureconocimientoesimportantepara"situar"alasARNpolimerasas.El factorTBPesrequeridoparainiciarlatranscripcinporpartedecualquieradelastres ARN polimerasas eucariotas. En cada caso, la TBP constituye una subunidad de algn factordetranscripcinqueseunealADNenlavecindaddelsitiodeinicio.TBPseune directamentealacajaTATAcuandostaestpresente,yenlospromotorescarentesde cajaTATAseubicacercadelsitiodeinicioporotrosmedios. 243

iniciacin requiere que los factores de transcripcin acten en un orden definido, La
peronoexclusivoparaformaruncomplejoalcualsehadeunirlaARNpolimerasa.Se puede conocer la serie de eventos que tiene lugar, por el aumento del tamao del complejoproteicoasociadoalADN.AmedidaquecadafactorTFIIseunealcomplejo,se cubreuntramomsdelADN.LaARNpolimerasaseincorporaenunaetapamstarda. Elrestodelosfactoresdetranscripcininvolucradosenelcomplejodeiniciacintiene cada uno su rol determinado. Despus de la unin de TFIID, los factores generales de transcripcindelaARNPIIseencargandeensamblarelaparatobsicodetranscripcin enelpromotorycasitodosseliberarncuandolaARNPIIcomiencelaelongacin. El proceso general de la iniciacin es similar al catalizado por la ARN polimerasa bacteriana.LaunindelaARNpolimerasagenerauncomplejocerradoqueseconvierte posteriormenteencomplejoabiertocuandolascadenasdeADNsehanseparado.Enla reaccin bacteriana, la formacin delcomplejo abierto completa el cambio estructural necesario del ADN. Una diferencia en la reaccin eucariota es que se necesita ms desenrollamientodelmoldedespusdeestaetapa. LospromotoresdelaARNpolimerasaIItienenelementosdesecuenciascortas El promotor de la ARN polimerasa II tiene dos tipos de regiones. El propio sitio de iniciacin se identifica por el Inr y/o la caja TATA cercana. Conjuntamente con los factores generales de transcripcin, la ARNpolimerasa II forma un complejo de iniciacin que rodea el punto de inicio, tal y como se ha descrito. La eficiencia y la especificidad con las cuales se reconoce el promotor dependen, sin embargo, de secuencias cortas, situadas ms lejos en direccin 5' (upstream), que son reconocidas por factores anteriores o factores inducibles. Estas secuencias y los factores que las reconocenpuedensercomunes,yencontrarseenunaampliavariedaddepromotores,o puedenserespecficasymuyparticularespararealizarlatranscripcinenuntiempoo lugarrestringido.Usualmenteestassecuenciasestnubicadas~100pbantesdelpunto deinicio,peroavecesestnmuchomsdistantes.Losfactoresdeuninaestossitios puedeninfluirenlaformacindelcomplejodeiniciacinencualquieradesusdiversas etapas. La mayora de las mutaciones en estas secuencias no afectan la habilidad del promotorparainiciarlatranscripcin. 244

UnadelassecuenciasanterioreseslacajaCAAT.Nombradaporsusecuenciaconsenso,
fueunodelosprimeroselementoscomunesendescribirse.Casisiempreestlocalizada cercade80,peropuedefuncionaradistanciasquevaranconsiderablementedelpunto de inicio. Funciona en ambas direcciones. Su susceptibilidad a las mutaciones sugiere que la caja CAAT juega un fuerte papel en la determinacin de la eficiencia del promotor. No parece jugar un rol directo en la especificidad del promotor, pero su inclusin aumenta la fortaleza de ste. La caja GC contiene la secuencia GGGCGG y tambinesvariableencuantoasuposicinrespectoalsitiodeinicio.Amenudoexisten mltiplescopiasenelpromotor,ypuedenubicarseencualquierorientacin.Estambin uncomponenterelativamentecomndelpromotor. Una gran variedad de elementos puede contribuir a la funcin del promotor, pero ninguno es esencial para todos los promotores. Los elementos anteriores son reconocidos por factores de transcripcin que interactan con el complejo bsico de transcripcin con el fin de determinar la eficiencia con la cual se va a utilizar ese promotor. Los elementos encontrados en cualquier promotor difieren en nmero, localizacinyorientacin.Ningnelementoescomnatodoslospromotores.Unode los enigmas de la organizacin de los promotores es que el promotor comunica informacindireccional(latranscripcinprocedesolamenteenladireccin3'),perolas cajasGCyCAATpuedenfuncionarencualquierorientacin(aunquesussecuenciasson asimtricas). Se asume que los factores que estn ms o menos omnipresentes en todos los promotoresestndisponiblesacualquierpromotorquetengaunacopiadelelemento que reconocen. Esta posibilidad comn diferencia los factores anteriores de los inducibles.LoselementosenlacategoraupstreamincluyenlacajaCAAT,lacajaGCyel octmero. Todos los promotores probablemente necesiten uno o ms de estos elementosparapoderfuncionareficientemente. Hasta aqu se ha considerado al promotor como una regin aislada, responsable de la unin de la ARN polimerasa. Pero los promotores eucariotas no necesariamente funcionanporssolos.Almenosenalgunoscasos,laactividaddeunpromotoraumenta enormemente por la presencia de un amplificador o enhancer, que consiste en otro 245

grupo de elementos pero localizado a una distancia variable de los que hasta ahora
hemos contemplado que estaran formando parte del propio promotor. Los amplificadoresylosfactoresinduciblesseestudiarncondetalleenlaregulacindela expresingnicaeneucariontes. TERMINACINDELATRANSCRIPCINENEUCARIOTAS La unidad de transcripcin eucariota generalmente contiene un solo gen, y la terminacin tiene lugar ms all del final de la regin codificadora. An cuando quisiramos definir el mecanismo de terminacin, ste carece de la importancia reguladoraqueseaplicaalossistemasprocariotas.LasARNpolimerasasIyIIIterminan en secuencias discretas en reacciones definidas, pero el modo de terminacin por la ARNpolimerasaIIannosehaclarificadototalmentente.Elprocesodegeneracindel extremo 3' de un ARNm no es un evento de terminacin como tal, sino que es el resultadodeunareaccindecorteeneltranscriptoprimario. MODIFICACIONESPOSTRANSCRIPCIONALES LosARNeucariotassonsintetizadosenformadeprecursoresquetendrnquesufrirun procesodemodificacinparapoderserfuncionales.LosARNmprocariotasnonecesitan modificarse despus de ser sintetizados y constituyen secuencias lineales respecto al genapartirdelcualsesintetizaron.Esdecir,soncompletamentecomplementarios.En cuantoalosARNryARNtprocariotas,lasmodificacionesquesufrensonsencillaspues tienen que ver con los cortes que sufrir el precursor largo en el cual estn incluidas ambas especies. Sin embargo, los ARNm, los ARNr y ARNt eucariotas, que son sintetizados en el ncleo y nucleolo de la clula y posteriormente utilizados en el citoplasma,debensufrirprocesosdemodificacinmuchomscomplejos,noslopara ser funcionales sino para poder pasar a travs de los pequeos poros nucleares al citoplasma. MODIFICACIONESDELARNM MODIFICACINENELEXTREMO5'OCAP5' Elextremo5'delARNmsemodificaenelncleoeucariota(peronoenlasmitocondrias nienloscloroplastos).Lasreaccionesdemodificacinsonprobablementecomunesen 246

todos los eucariontes. La transcripcin comienza con un nuclesido trifosfato (casi
siempreunapurina,AoG).Elprimernucletidoretienesugrupo5'trifosfatoyformael enlacefosfodisterhabitualdesdesuposicin3'alaposicin5'delsiguientenucletido. Cuando el ARNm maduro es sometido a tratamiento in vitro con enzimas que deben degradarloennucletidosindividuales,elextremo5'noproduceelnuclesidotrifosfato esperado.Ensulugar,contienedosnucletidosconectadosporunenlace5'5'trifosfato y tambin contiene grupos metilo. La base terminal es siempre una guanina que ser aadidaalARNoriginaldespusdelatranscripcin. La adicin de la G en el extremo 5' est catalizada por una enzima de localizacin nuclear, la guanidil transferasa. La reaccin ocurre imediatamente al comienzo de la transcripcinynoesposibledetectarmsquetrazasdelextremo5'trifosfatooriginal enelARNnuclear.Lareaccintotalsepuederepresentarcomounacondensacinentre GTPyeltrifosfato5'terminaloriginaldelARNm. El nuevo residuo G aadido al extremo del ARN est ubicado en orientacin contraria respecto a todos los otros nucletidos. Esta estructura se llama cap o capuchn. Es el sustratodevarioseventosdemetilacin.Lostiposdiferentestiposdecapssedistinguen porlacantidaddemetilacionesqueocurren: Laprimerametilacinocurreentodosloseucariontesyconsisteenlaadicindeun grupometiloenlaposicin7deunaguaninaterminal.Uncapqueposeeestenico grupometiloseconocecomocap0.Hastaaqullegalareaccinenloseucariontes unicelulares. La enzima responsable de esta modificacin se llama guanina7 metiltransferasa. El siguiente paso es la adicin de otro grupo metilo, a la posicin 2'O de la penltima base (que verdaderamente era la primera base original del transcripto antes de las modificaciones). Esta reaccin est catalizada por otra enzima (2'O metiltransferasa). Un cap con dos grupos metilo se llama cap 1. Este es el tipo predominantedecapentodosloseucariontesexceptolosorganismosunicelulares. Enunapequeaminoradeloscasoseneucariontessuperiores,seaadeotrogrupo metiloalasegundabase.Estosloocurrecuandoesaposicinestocupadaporuna adenina; la reaccin implica la adicin de un grupo metilo en la posicin N6. La 247
enzima responsableacta solamente en un sustrato de adenosina que ya tiene un grupometiloenlaposicin2'O. En algunas especies, se aade un grupo metilo a la tercera base del ARNm que ya tienesucap.ElsustratodeestareaccineselARNmcap1queyatienedosgrupos metilo.Lamodificacindelatercerabasees siempreunametilacinen2'Ode la ribosa. Este cap se denomina cap2 y generalmente representa menos del 1015% deltotaldeARNmsconcaps.
En una poblacin de ARNms eucariotas, todas las molculas tienen cap. Las proporciones de los diferentes tipos de cap son caractersticas de un organismo especfico.NosesabesilaestructuradeunARNmespecficoesinvariableopuedetener msdeuntipodecap.Ademsdelametilacinysolamenteeneucariontessuperiores, ocurre una baja frecuencia de metilacin interna en el ARNm. Esto se lleva a cabo mediantelageneracinderesiduosN6metiladeninaconunafrecuenciadealrededorde una modificacin por cada 1000 bases. Hay 12 metiladeninas en un ARNm tpico de eucariontes superiores, aunque su presencia no es obligatoria, ya que algunos ARNms nopresentanninguna. Modificacindelextremo3'ocolaPoli(A) La mayorade losARNms eucariotas tienen una secuenciade cido poliadenlicoen el extremo3'.EstetramoterminalderesiduosAsedescribeamenudocomocoladePoli (A) y el ARNm con estas caractersticas se llama poli(A)+. La secuencia poli(A) no est codificada en el ADN, sino que se aade al ARNm en el ncleo despus de la transcripcin.Laadicindepoli(A)estcatalizadaporlaenzimapoli(A)polimerasa,la cualaade~200residuosdeAalextremo3'OHlibredelARNm.Lacolapoli(A)tantodel ARN nuclear como del ARNm est asociada a una protena, la protena de unin a poli(A) (PABP: poly(A)binding protein). Formas similares de esta protena se pueden encontrarenmuchoseucariontes.UnmonmerodePABPde~70kDaseunecada1020 basesdelacolapoli(A).Portantounacaractersticacomnenmuchosolamayorade loseucariontesesqueelextremo3'delARNmconsisteenunahileradepoli(A)unidaa unaprotenadegranmasa. Culeselpapeldepoli(A)?Apesardemuchassugerenciasenreferenciaaquestale 248

confiereestabilidadalARNm,nohasidoposibledemostrarenformacontundenteuna
correlacin sistemtica entre la presencia o longitud de poli(A) y la supervivencia del ARNm,aunquelaescisindelacolapoli(A)precedeladegradacindealgunosARNms. LaestabilidaddelARNmpuedeestarconectadaconpoli(A),aunquequedapordefinirsu relacin. Lapresenciadepoli(A)tieneunaconsecuenciaprcticaimportante.Lareginpoli(A)del ARNm puede aparearse con el oligonucletido (U) o el oligonucletido (dT); y esta reaccin puede utilizarse para aislar poli(A)+ mRNA. La tcnica ms conveniente es inmovilizareloligonucletido(UodT)enunsoporteslido.Entonces,cuandoseaplicaa la columna una poblacin de RNA, slo se retienen los mRNA poli(A)+. Se puede eluir tratandolacolumnaconunasolucinquerompalosenlacesparaliberarelARN. La nica desventaja de este procedimiento es que asla todos los ARN que contienen poli(A). Si se utiliza el ARN de toda una clula se retendr, por ejemplo, tanto el ARN poli(A)+nuclearcomocitoplasmtico. Casi todos los ARNms celulares poseen poli(A)+. Una excepcin significativa seran los ARNms que codifican a las histonas (un componente estructural fundamental del materialcromosmico).EstosARNmscarecendetodaocasitodalafraccinpoli(A)+.La importanciadelaausenciadepoli(A)enlosARNmsdehistonasnoestclara,ynoexiste ningnaspectoespecficodesufuncinparaelcualstoaparezcacomonecesario. M ECANISMODEGENERACINDELEXTREMO 3 DEL ARN M Losextremos3delosARNmssegeneranporcorteseguidodepoliadenilacin.LaARN polimerasa transcribe hasta despus del sitio correspondiente al extremo 3 y algunas secuenciasenelARNsonreconocidascomoblancoparaelcorteendonucleoltico.Una caracterstica comn de todos los ARNms de eucariontes superiores (pero no de las levaduras),eslapresenciadelasecuenciaAAUAAAenlaregincomprendidaentre11y 30nucletidosantesdelsitiodeadicindepoli(A)+.Lasecuenciaestmuyconservaday sloocasionalmentedifiereentansolounabase.Ladelecinomutacindelhexmero AAUAAAimpidelaformacindelextremo3poliadenilado.Lasealesnecesariatanto paraelcortecomoparalapoliadenilacin. Lageneracindelaestructura3terminalrequieredeunaendonucleasaparacortarel 249

ARN,una poli(A)polimerasa(PAP)parasintetizarlacolapoli(A),yun componentede
especificidad (CPSF) que reconoce la secuencia AAUAAA y dirige otras actividades. La reaccindepoliadenilacintienedosetapas: 1. Se aade una secuencia corta de oligo(A) de ~10 residuos al extremo 3. Esta reaccinestotalmentedependientedelasecuenciaAAUAAA,ylapoli(A)polimerasa lallevaacabobajoladireccindelfactordeespecificidad. 2. Lacolaoligo(A)seextiendehastaformarunresiduode~200adeninas.Estareaccin requiereotrofactordeestimulacinquereconocelacolaoligo(A)ydirigealapoli(A) polimerasa especficamente para que extienda el extremo 3 de una secuencia de poli(A). La longitud de la cola poliadenilada est controlada por la PABP (polyA binding protein) la que, de alguna forma, limita la accin de la poli(A) polimerasa para que aada ~200 residuos de adenina. El lmite pudiera ser la acumulacin de unamasacrticadePABPenlacadenapoliadenilada.PABPsiguesiendodespus,un componentedelARNmysurolexactoenelmetabolismonoseconoce. ELEMPALME(SPLICING)NUCLEAR Losgenesinterrumpidosseencuentranentodoslostiposdeorganismo,demaneraque lafacilidaddereconstituirsecuenciascodificadorasintactasesunrequerimientocomn. Los genes interrumpidos representan una proporcin menor de los genes de los eucariontes inferiores mientras que la gran mayora de los genes en genomas de eucariontessuperioresestninterrumpidos.Losgenesvaranampliamentedeacuerdo conelnmeroylongituddelosintrones,peroungentpicodeunmamferotiene78 exonesdistribuidosen~16pb?.Losexonessonrelativamentecortos(~100200pb)y losintronessonrelativamentelargos(~1kb). La discrepancia entre la organizacin interrumpida del gen y la organizacin ininterrumpidadesuARNmrequieredeuncambioenelARNentrelatranscripcinyla traduccin. El transcrito primario tiene la misma organizacin del gen, y a veces se le llama preARNm. La separacin de los intrones del preARNm produce un mensajero tpicode~2.2kb.Elprocesomedianteelcualseseparanlosintronessellamaempalme (splicing) del ARN. Una de las primeras claves referentes a la naturaleza de la discrepancia en tamao entre los genes nucleares y sus productos en los eucariontes 250

superioressehallenlaspropiedadesdelARNnuclear.Sutamaopromedioesmucho
mayorqueeldelARNm,esmuyinestableytieneunacomplejidaddesecuenciamucho mayor. A partir de su gran tamao se le llam ARN nuclear heterogneo (hnRNA: heterogenous nuclear RNA). La poblacin de ARNnh, caracterizada en estos primeros experimentos, incluye la poblacin de los preARNm. Los ARNnh se encuentran asociadosaprotenasformandopartculasllamadasribonucleoprotenas. El empalme ocurre en el ncleo, junto con las otras modificaciones que sufre el ARN recinsintetizado.Eltranscritoobtienesucapenelextremo5',pierdesusintronesyse poliadenila en el extremo 3'. Entonces el ARN se transporta a travs de los poros nucleareshaciaelcitoplasmadondeestardisponibleparasertraducido. Sehanpodidoidentificarvariostiposdesistemasdeemaplme: LosintronesseseparandelosARNsnuclearesenloseucariontessuperioresporun sistemaquereconocesolamentesecuenciasconsensocortasconservadasenloslmites exnintrn y dentro de los intrones. Esta reaccin necesita un gran aparato de empalme,quetomalaformadeunconjuntodeprotenasyderibonucleoprotenasque funcionacomoungrancomplejodepartculas(elempalmosoma). LaescisindealgunosintronesesunapropiedadautnomadelpropioARN.Existen dosgruposdeintronesconestacapacidadendiversaslocalizaciones.Cadaunoformaun tipo caracterstico de estructura secundaria. Las secuencias de un grupo se relacionan con las de los intrones nucleares. La facilidad del ARN para demostrar actividades enzimticas tambin se demuestra en la autoescisin de los ARNs viroides y en la actividadcatalticadelaARNasaP. LaseparacindelosintronesenlosprecursoresdelosARNtnuclearesenlevaduras implicaactividadesenzimticascuyaactividadconelsustratoseparecealdelasenzimas procesadorasdelARNtyaqueunacaractersticacrticaeslaconformacindelprecursor ARNt. En el empalme se emplean dos tipos fundamentales de mecanismo. Todos los exones excepto los de los preARNts nucleares se empalman mediante reacciones de transesterificacin, aunque el componente cataltico y otrosinvolucrados son distintos encadacaso.LosintronesdelpreARNtnuclearseseparanporcorteyligazn.Muchos 251

los intrones con capacidad autnoma de empalmar son mviles, es decir, tiene la de
facilidaddeinsertarcopiasennuevaslocalizaciones.Porloqueesprobablequehayan sido originados mediante insercin en genes ya existentes. An es un enigma si los intronesdelosgenesnuclearesdeloseucariontessuperioresseoriginaronporinsercin osifueronpartedelaconstruccinoriginaldelgen.Pareceinevitablequelosintrones de los genes del preARNt nuclear se hayan originado por insercin en genes ya existentes. L OSSITIOSDEEMPALME Paracomprenderloseventosmolecularesimplicadosenelsplicingnucleardeintrones, hayqueconsiderarla naturalezadelos sitiosdeempalme,losdoslmitesexnintrn que incluyen los sitios de rompimiento y reunin. Cuando se compara la secuencia nucleotdica del ARNm con la del gen estructural se pueden determinar las uniones entre exones e intrones. No hay otra homologa o complementariedad entre los dos extremos de un intrn. Sin embargo las uniones tienen secuencias consenso bien conservadas, aunque bastante cortas. Es posible asignar un extremo especfico a cada intrnsegnlaconservacindelasunionesexnintrn.Sepuedenalineartodospara conformarlasiguientesecuenciaconsenso: Sitio5' Sitio3'
ExnA64G73G100T100A62A68G84T63...............12PyNC65A100G100NExn Intrn Enesteyenotroscasos,seescribesolamentelasecuenciadelacadenadeDNAquees idntica a la del producto RNA. Los subndices indican el porcentaje en que ocurre la base especificada (o el tipo de base) en cada posicin consenso. Se observa una gran conservacin solamente inmediatamente dentro del intrn en las supuestas uniones. EstoidentificalasecuenciadeunintrngenricocomoGT......AG. Debido a que el intrn as definido comienza con el dinucletido GT y termina con el dinucletidoAG,lasunionessedescribenamenudocomoquecumplenlareglaGTAG. (Las verdaderas secuencias en el ARN son por supuesto GUAG). Ver fig. 10.1. Ntese quelosdossitiostienendiferentessecuenciasyasdefinenlosextremosdelintrnde 252

forma direccional. Se nombran de izquierda a derecha a lo largo del intrn, es decir,
comolossitiosdeempalmeizquierdo(5')yelderecho(3').Avecessellamansitios donador y aceptor. Las secuencias consenso se han determinado como sitios de reconocimiento en el empalme mediante mutaciones puntuales que evitan que tenga lugarelempalmetantoinvivocomoinvitro. La regla GTAG describe los sitios de splicing de los genes nucleares de muchos eucariontes (tal vez todos). Esto implica que hay un mecanismo comn de splicing del ARN.Lossegmentosconsensonoseaplicanalosintronesdelasmitocondriasnidelos cloroplastos ni tampoco a los genes ARNt de las levaduras. Los ARNms tpicos de mamferostienenmuchosintrones.Elproblemabsicodelsplicingnuclearresultadela propia simplicidad de los sitios de splicing. Qu asegura que los pares correctos de sitios se reconozcan juntos? Los pares GUAG correspondientes deben conectarse a travs de grandes distancias (algunos intrones tienen >10 kb de largo), evitando la conexin de pares incorrectos. Nos podemos imaginar dos tipos de principios que pudieranserresponsablesdelapareamientocorrectodelossitios5'y3': PodraserunapropiedadintrnsecadelARNlacapacidaddeconectarlossitiosenlos extremosdeunintrnespecfico.Estorequeriracompararycapturarlassecuencias oestructurasespecficas. El empalmepodraseguirreglasquegaranticen queunsitio5'siempreseconecte conelprximositio3'enelARN. Ni los sitios de emplame ni las regiones circundantes tienen complementariedad de secuencia,loqueexcluyemodelosdeapareamientoentreextremosdelosintrones.Se hanhechoexperimentosqueconcluyenque: Lossitiosdesplicingsongenricos:nosonespecficosdeprecursoresindividualesde ARN,ylosprecursoresindividualesnoconfierenlainformacinespecfica(talcomo unaestructurasecundaria)quesenecesitaparaelsplicing. El aparato de splicing no es especfico de tejido; un ARN generalmente puede ser modificado adecuadamente por cualquier clula, se haya o no sintetizado en esa clula. 253

aqu una paradoja. Probablemente todos los sitios de empalme 5' y 3' le resultan He
iguales al aparato de empalme. En principio cualquier sitio 5' puede reaccionar con cualquier sitio de empalme 3'. Pero en circunstancias normales el empalme ocurre solamente entre los sitios 5' y 3' del mismo intrn. Que reglas aseguran que el reconocimientodelossitiosdeempalmeestrestringidodemaneraquesolamentelos sitios5'y3'delmismointrnsufranempalme? Se eliminan los intrones de un ARN especfico en un orden especfico? Utilizando Northern blotting se pueden identificar los ARNs nucleares que representan a los intermediarios de los cuales se han eliminado algunos intrones. En un blot de los precursoresdelARNmovomucoidehayunaseriedebandasdiscretasquesugierenque elempameocurreatravsdevasdefinidas.(SilossieteintronesdedichoARNfueran eliminados en un orden completamente aleatorio, habra ms de 300 precursores con diferentescombinacionesdeintrones,ynoveramosbandasdiscretas). Parecequenohayunavaobligatoria,yaquesepuedenencontrarintermediariosenlos cuales se han eliminado diferentes combinaciones de intrones. Sin embargo, hay evidenciasqueindicanunavaovaspreferenciales. Se puede concluir de forma general que la conformacin del ARN influye sobre la accesibilidaddelossitiosdesplicing.Amedidaqueseeliminanintronesespecficos,la conformacincambia,ynuevosparesdesitiosdesplicingsevuelvendisponibles.Perola facilidadquetieneelprecursordeeliminarsusintronesenmsdeunordensugiereque encadaetapaestarndisponiblesconformacionesalternas.Loquesestclaroesquela reaccinnoprocedesecuencialmentealolargodelprecursor.Perolaformaenquese reconocencorrectamentelosparesdesitiosdeempalmeanestpordilucidarse.
254
F IG 10.1. E MPALMEDE ARN HNENEUCARIOTAS M ECANISMODE E MPALME ( SPLICING ) Elmecanismodeempalmesehacaracterizadoinvitroutilizandosistemasenloscuales los intrones se pueden eliminar de los precursores de ARN. Los extractos nucleares pueden modificar los precursores de ARN puros, lo que demuestra que la accin del splicing no est ligada al proceso de la transcripcin. El empalme es tambin independientedeotrasmodificacionesdelARN,ypuedeocurrirleaARNsquenotienen nicap5'niestnpoliadenilados.Lareaccindeempalmesedescribeentrminosdelas especies individuales de ARN que pueden identificarse, pero debemos recordar que in vivo, las especies que contienen exones no se liberan como molculas libres sino que permanecensujetasalaparatodeempalme. En la primera etapa, se realiza un corte en el sitio 5' de empalme, separando el exn izquierdodelamolcula intrnexna laderecha.Elexnizquierdotomala formade unamolculalineal.Lamolculaintrnexnaladerechaformaunaestructurallamada lariat,enelcual,elextremo5'terminalgeneradoalfinaldelintrnseenlazamediante unenlace5'2'aunabasequeestdentrodelintrn.LabaseblancoesunaAsituadaen unasecuenciallamadasitioderamificacin.Enunasegundaetapa,elcorterealizadoen 255

elsitio3'deempalme,liberaelintrnenformadelariat,mientrasqueelexnderecho
seligalaexnizquierdo.Lasreaccionesdecorteyligamientosemuestranporseparado en las figuras con propsitos ilustrativos, pero realmente ocurren como una sola transferencia coordinada. Despus se "desramifica" el lariat para dar un intrn lineal escindidoquesedegradarpidamente. Lassecuenciasnecesariasparaelempalmesonsecuenciasconsensocortasenlossitios de empalme 5' y 3' y en el sitio de ramificacin. Se sabe que la mayor parte de la secuenciadeunintrnpuededelecionarsesinimpedirelempalme,loqueindicaqueno se necesita una conformacin especfica en el intrn (o exn). El sitio de ramificacin ofrecelosmediosmedianteloscualesseidentificaelsitio3'deempalme.Enlevaduras, estesitioestaltamenteconservado,ytienelasecuenciaconsensoUACUAAC.Elsitiode ramificacin en los eucariontes superiores no est bien conservado, pero tiene preferenciaporpurinasypirimidinasencadaposicinyretienelaAblanco. El sitio de ramificacin est ubicado de 18 a 40 nucletidos antes del sitio 3' de empalme.Lasmutacionesodelecionesdelsitioderamificacinenlevadurasimpidenel empalme.Eneucariontessuperiores,algunasrestriccionesensusecuenciatraencomo resultado la posibilidad de utilizar secuencias similares en la vecindad cuando se deleciona la rama autntica. La proximidad al sitio 3' de empalme parece ser muy importante,yaqueelsitiocrpticoestsiemprecercanoalautntico.Cuandoseutiliza una secuencia de ramificacin crptica como la anterior, el empalme transcurre normalmente,ylosexonesproducenlosmismosproductosqueeltiponativo.Elpapel del sitio de ramificacin es, por tanto, identificar el sitio 3' de empalme ms cercano comoblancoparaconectarloalsitio5'. Elenlacequeformaellariatvadesdelaposicin5'delaGinvariablequeestabaenel extremo5'delintrnhastala posicin 2'delaAinvariable enelsitioderamificacin. EstacorrespondealtercerresiduoAenlacajaUACUAACdelalevadura.Lasreacciones qumicassondetransesterificacin:dehechounenlacesetransfieredesdeunlugara otro.Elprimerpasoesunataquenucleoflicodel2'OHdelaAdelsitioderamificacin sobre el sitio 5' de splicing. En un segundo paso, el 3'OH libre del exn que fuera liberadoenlaprimerareaccinatacaahoraelenlaceenelsitio3'desplicing.Elcurso 256

realdelareaccinprobablementeimpliquecidosybasesgenerales.As,enlaprimera
reaccin,unabasegeneralquitaunprotndelextremo2'OH,yuncidogeneraldona un protn al oxgeno 3' libre del exn liberado. En la segunda reaccin tienen lugar reacciones similares. Ntese que el nmero de enlaces fosfodister est conservado. Originalmentehabadosenlaces5'3'enlossitiosdeempalmeexnintrn;unohasido sustituidoporelenlace5'3'entrelosexones,yelotrohasidosustituidoporelenlace 5'2'queformaellariat. L ASRIBONUCLEOPROTENASYLAFORMACINDELEMPALMOSOMA Los sitios de empalme 5' y 3' y la secuencia de ramificacin son reconocidos por componentesdelaparatodeempalmequeseensamblanparaformarungrancomplejo. Este complejo acerca las secuencias consenso antes de que tenga lugar la reaccin, explicandoporquunadeficienciaencualquieradelossitiospuedeevitarqueseinicie la reaccin. El complejo se ensambla secuencialmente, y los complejos de diferentes tamaos en vas de fraccionamiento pueden reconocer varios intermediarios. El empalme ocurre solamente cuando todos los componentes se han ensamblado. La reaccinimplicalaliberacindealgunoscomponentesylareorganizacindeotros. El aparato de empalme contiene protenas y ARNs. Los ARNs tienen la forma de pequeas molculas que existen como partculas de ribonucleoprotenas. Tanto el ncleocomoelcitoplasmadelasclulaseucariotascontienenmuchasespeciesdiscretas de ARNs pequeos. Ellos varan en tamao desde 100 a 300 bases en los eucariontes superiores, y se extienden en longitud hasta ~1000 bases en la levadura. Varan considerablemente en abundancia. Las especies ms abundantes han sido detectadas bioqumicamente en cantidades de 105106 molculas por clula. Otras, presentes en concentraciones demasiado bajas para poderlas detectar directamente, se han identificadomediantepruebasfuncionalesparaprocesarreaccionesenlascualesellas participan. Las especies restringidas al ncleo se llaman ARNs nucleares pequeos (snRNA: small nuclear RNAs). En su estado natural, existen como partculas ribonucleoproteicas (snRNPs). Los snRNPs implicados en el empalme, junto con algunas protenas adicionales,formanungrancomplejodepartculas,llamadoelempalmosoma.Aislados 257

vitro de los sistemas de empalme, forman partculas de ribonucleoprotenas de 50 in
60S. El empalmosoma puede formarse en etapas, a medida que los snRNPs se unen, pasando por varias etapas de "complejos preempalme". El empalmosoma es muy grande,equivalenteentamaoaunasubunidadribosomal. MADURACINDELARNREUCARIOTA La maduracin del ARNr eucariota se puede seguir en detalle debido a la velocidad relativamente lenta a la cual madura el transcripto primario a travs de etapas intermedias para dar las molculas de ARNr maduro. Las especies intermedias principales del proceso se pueden aislar de varias clulas, en las cuales se ha podido caracterizarsuvaenlosmamferos.EltranscriptoprimariodemamferosesunpreARN 45S(Fig.10.2)quecontienelassecuenciasdelosARNrs18S,5,8Sy28S,peroquetiene casieldobledelalongitudcombinadadeambos.Contiene~110gruposmetilo,losque fueron aadidos durante la transcripcin o inmediatamente despus. Casi todos ellos estn unidos a los residuos ribosa, en una gran variedad de secuencias oligonucleotdicas. Los grupos metilo se conservan durante el procesamiento del precursor, encontrandose presentes en los distintos ARNrs maduros. Hay ~39 grupos metilosoriginalesenelARNr18Smaduro;alosqueposteriormentelesernaadidos otros4enelcitoplasma.Hay~74gruposmetilo(todosoriginales)enelARNr28S.Esto sugierequelametilacinseutilizaparasealarlasregionesdeltranscritoprimarioque vanamadurarenelARNr. Se ha encontrado ms de una va de maduracin, tal y como se puede deducir de los tamaosdelasmolculas intermedias de ARN.Pero todaslas vas se puedenconciliar suponiendoqueunpequeonmerodesitiosdecortepuedeserutilizadoendiversos rdenes. Se conocen dos vas en mamferos. En cada caso, hay sitios de corte en el extremo 5' del gen 18S, dentro del espaciador entre los genes 18S y 5.8S, y en el espaciador entre las secuencias5.8S y 28S. (La secuencia5.8S se convierte en un ARN pequeoqueseasociaconelARNr28Sporapareamientodebases). Ladiferenciaentreambasvasesexclusivamenteelordenenqueseutilizanlossitiosde corte.Nosesabesiestoscortesrealmentegeneranlosextremosmadurososiloscortes liberanlosprecursoresindividualesquedespusserncortados.Loquessesabeesque 258

elpreARN45Sseasociaconprotenasinmediatamentedespusdesusntesis.Eneste
proceso interviene la RNP U3, pero en eucariontes inferiores el proceso es autocataltico.Noseconocenenzimasparticipantes.
FIG.10.2.PROCESAMIENTODEARNRENEUCARIOTAS. EL EMPALME (SPLICING) DIFERENCIAL Algunos genes son capaces de codificar ms de una protena, dependiendo de cmo el productoprimariodetranscripcinesprocesadoaARNmmaduro.Algunosprecursoresdel ARNm que contienen un gran nmero de exones pueden sufrir un proceso de empalme diferencial que da como resultado distintas molculas de ARNm, codificando protenas diferentes.Estefenmenoseconocecomoempalmediferencial.Asporejemplo,elgen de la tropomiosina I en Drosophila codifica para dos protenas musculares relacionadas, una que se expresa durante el desarrollo embrionario y otra que se encuentra en el msculo torcico de las moscas adultas. Estas protenas difieren en al menos 27 aminocidos,yelhechodequesesinteticeunauotraprotenadependedequeseelimine o no el tercer exn durante el proceso de empalme. Otros productos primarios de transcripcinquepuedensufrirempalmediferencialparagenerarprotenasdistintasson, por ejemplo, los de los genes de la fibronectina, la troponina y la cadena ligera de la miosina en la rata. Todava no se conoce la razn por la cual ciertos intrones pueden perderseonoduranteelprocesamientodelosprecursoresdelmRNA. AgunaBibliografaadicional(PedirLic.E.V.Paravani) 259
Losgenessinintronesenlassecuenciastranscribiblesproducenmenoresnivelesde mRNAnuclearycitoplasmticoyexportacinytraduccinreducida(Cullen,2003). Losgenesquecontienenintronesenelextremo5producenmayoresnivelesdeRNA maduroquelosqueposeenintronesenelextremo3(Rose,1997,2000,2002,2004; Kim,2004;Hu,2005). La presencia del intrn o el proceso de splicing no influyen en s mismos en la regulacin postranscripcional. El mecanismo de enhancer parece depender de los factoresproteicosinvolucrados(Simpson,1996). La accin enhancer de los intrones depende del tipo de promotor, secuencia y posicin de los intrones, secuencia de los exones y tipo y estado fisiolgico de las clulas(Simpson,1996). El mecanismo de splicing o la accin enhancer del intrn pueden ser influenciados porestrs(anaerbicooporpresenciademetalespesados)(Simpson,1996).
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CAPTULO UNDCIMO:
Traduccin y Sntesis de Protenas
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Traduccin
En el captulo anterior, se estudi el proceso de transcripcin observndose que el productofinaldealgunosgenesesunamolculadeARNensimismacomoocurreconel ARNtyelARNrdelosribosomas. Sinembargo,lamayoradelosgenesdelasclulasproducenmolculasdeARNqueactan comointermediariasdelasntesisdeprotenas. UnavezqueseproducelamolculadeARNmlaconversindelainformacindeARNen protenasesequivalenteaunprocesodetraduccin. Como existen slo cuatro tipos de nucletidos en el ARNm y veinte tipos diferentes de aminocidos proteicos, es fcil comprender que esta traduccin no puede realizarse con una correspondencia unoauno,entreunnucletidoenelARNyunaminocido enlas protenas. La secuencia de nucletidos de ungene a travs del ARNm, es traducida en la secuencia de aminocidosporunareglaconocidacomocdigogentico. Estecdigofuedescifradoaprincipiosdeladcadadel60.
LasecuenciadenucletidosenelARNmesledaconsecutivamenteengruposdetres.El ARN es un polmero de cuatro diferentes nucletidos, 4x4x4 (43)=64 posibles combinacionesdetresnucletidoslostripletesAAA,AUA,AUG,.etc.Sinembargo,existen slo20aminocidosproteicos.Debidoaesto,originalmentesepensquepodraocurrir que, algunos de los tripletes de los nucletidos no se usen, o bien que algunos de los nucletidosseanespecificadosparamsdeuntriplete.Lasegundaposibilidadesenefecto lacorrecta,comolodemuestraelcdigogenticocompletamentedescifradoenlafigura XX. Cada grupo de tres nucletidos se denomina codn y cada uno de ellos, puede especificartantounaminocidocomounasealdeparadadelprocesodetraduccin. Estecdigoesusadouniversalmenteentodoslosorganismosvivosdelpresente,aunque 262

sehanencontradopequeasdiferenciasenelcdigoenelADNdelasmitocondrias.Estas
ltimas tienen su propio sistema de transcripcin y sntesis de protenas que operan independientementedelrestodelaclula. En principio, una secuencia de ARN puede ser traducida en alguno, de tres diferentes marcos de lectura, dependiendo de donde comienza el proceso de decodificacin. Ver figuraXX.Sinembargo,solounodelostresposiblesmarcosdelecturaenunARNmcodifica laprotenarequerida.Sevioposteriormentecmounasealdepuntuacinalcomienzode cadaconjuntodecadademensajedeARNalcorrectomarcodelecturaalcomienzodela sntesisdeprotenas. Los codones en una molcula de ARNm no reconocen directamentealosaminocidosqueellosespecifican.Latraduccin del ARNm en protena depende de una molcula adaptadora que puedereconoceryunirtantoalcodncomoaunaminocido.Estos adaptadores se conocen como ARNs de transferencia (ARNt), los queposeenaproximadamente80nucletidosdelongitud. Como se vio anteriormente, la molcula de ARNt se pliega en una estructura tridimensional precisamente definida. Cuatro segmentos cortos del ARNt plegados son de doble hlice produciendo una molcula que semeja una hoja de trbol cuando esta se esquematiza. Por ejemplo, una secuencia 5 GCUC3 en una parte de una cadena polinucleotdica puede formar una fuerte asociacin 5GAGC3 en otra regin de la mismamolcula.LahojadetrbolsufreunplegamientoparaformarunaestructuradeL invertida compacta que se mantiene unida por puentes hidrgeno entre diferentes regiones delamolcula. Dos regiones de nucletidos no apareados situados en los dos extremos de la L invertida son crucialesparalafuncindelARNtenlasntesisdelasprotenas. 263

Una de estas regiones forma el anticodn: un conjunto de tres nucletidos consecutivos
que se aparean con el codn complementario de la molcula de ARNm. La otra es una regindehebrasimpledeARNubicadaenelextremo3delamolculadeARNtdondese anclaelaminocidoquecorrespondealcodn. Se ha indicado previamente que el cdigo gentico es redundante, esto es, que varios codones pueden especificar un aminocido. Esta redundancia podra implicar tanto que existemsdeunARNtparamuchosdelosaminocidoscuantoque,algunasmolculasde ARNt pueden aparearse con ms de un codn. En efecto, ocurren ambas cosas. Algunos aminocidos poseen ms de un ARNt y algunos ARNts requieren apareamiento complementario de slo las primeras dos posiciones del codn pudiendo tolerar un apareamientoinestable(owobble)noregidoporlasreglasdecomplementareidadantes mencionadas, en la tercera posicin (ver figura XX). Este apareamiento de bases tipo wobbleexplicaporqumuchosdeloscodonesalternativosdeunaminocidodifierenslo ensutercernucletido(verfiguraXX)Enbacteriaselapareamientodebasestipowobble permitequelos20aminocidospuedanseradaptadosalos61codonesconslo31tipos diferentesdemolculasARNt.ElnmeroexactodediferentestiposdeARNts,sinembargo, difiereenlasespecies.Porejemplo,enhumanoshay497genesARNt,peroentreellos,slo estnrepresentados48anticodonesdiferentes. LosARNtssonmodificadoscovalentementeantesdesalirdelncleo HemosvistoquelamayoradelosARNssoncovalentementealteradosantesdequeseles permita salir del ncleo y los ARNts no son una excepcin. Los ARNts eucarticos son tpicamentesintetizadoscomomolculasmslargascomoARNtsprecursoresyestosson luegoprocesadosparaproducirelARNtmaduro.Adicionalmente,algunosprecursoresde ARNts(tantobacterianoscomoeucariotas)contienenintronesquedebenserempalmados. Esta reaccin de empalme es qumicamente distinta a la del preARNm, ya que ms que generar un lazo intermediario el empalme ocurre a travs de un proceso de corte y peguecatalizadoporprotenas.Tantoelprocesodeseccionamientocomoeldeempalme requierenelARNtprecursorparaserplegadoscorrectamenteensuconfiguracindehoja de trbol. Debido a que los ARNt precursores mal plegados no sern procesados propiamente, las reacciones del seccionamiento y empalme se cree que constituyen un 264

pasodecontroldecalidadenlageneracindeARNts.
Todos los ARNts estn sujetos a una variedad de modificaciones qumicas cerca de uno cada 10 nucletidos en cada molcula de ARNt madura es unaversinalteradadeunribonucletidoestndar G, U, C, A. Se conocen 50 tipos diferentes de modificaciones de ARNt; algunas de estas son mostradas en la figura XX. Algunos de los nucletidos modificados el ms notable la inopina producida por la deaminacin de guanosina afecta la conformacin y el apareamiento de bases del anticodn y facilita el reconocimiento del codn del ARNm apropiadoporlamolculadeARNt.OtrosafectanlaadecuacinconlaqueelARNtseancla alaminocido. EnzimasespecficasacoplancadaaminocidoalamolculadeARNtapropiada Sehavistoque,paraleerelcdigogenticoen elADN,lasclulasfabricanunaseriedeARNts diferentes. Ahora consideraremos cmo cada molcula de ARNt se une a uno de los 20 aminocidos apropiado. El reconocimiento y unin del aminocido correcto, depende de enzimas denominadas aminoacilARNt
sintetasas que son las responsables de acoplar covalentementecadaaminocido,asuapropiadoconjuntodeARNt.Paralamayoradelas clulashaydiferentessintetasasparacadaaminocido(estoes,almenos20sintetasasen total); una ancla glicina, a todos los ARNts que reconocen los codones de glicina, otra anclan alanina a todos los ARNts que reconocen los codones de alanina, etc. Muchas bacteriassinembargo,tienenmenosde20sintetasasylamismaenzimasintetasapuede acoplarmsdeunaminocidoalosARNtsapropiados.Enestoscasos,unanicasintetasa colocaelaminocidoapropiadosobredostiposdiferentesdeARNts,deloscuales,slouno poseeunanticodnquesecorrespondeconelaminocidoespecfico.Posteriormente,una segunda enzima modifica qumicamente cada aminocido incorrectamente unido de tal 265

modoqueelqueaminocidomodificado,correspondealanticodnexhibidoporsuARNt
ligadocovalentemente. Lareaccincatalizadaporlasintetasaqueunealosaminocidosalextremo3delARNtes unadelasmuchasreaccionescelularesacopladasalaliberacindeenergaporhidrlisisde ATP,produciendounaunindealtaenergaentreelARNtylosaminocidos.Laenergade esta unin es usada en un estadio ulterior durante la sntesis de protenas para ligar covalentementelosaminocidosenlascadenaspolipeptdicascrecientes. Pese a que las molculas de ARNt actan como adaptadores finales en la conversin de secuencias nucleotdicas, en secuencias de aminocidos, las enzimas aminoacilARNt sintetasas,sonadaptadoresdeigualimportanciaenelprocesodedecodificacin.Estofue establecido con un ingenioso experimento en el cual un aminocido (cistena) fue qumicamenteconvertidoenunaminocidodiferente(alanina)despusqueyahabasido unidoasuARNtespecfico.Cuandoestehbridofueusadoparalasntesisdeprotenasen unsistemalibredeclulas,elaminocidoerrneofueinsertadoencadapuntoenquese us dicho ARNt. Lasclulastienen variosmecanismos de controlqueevitanestetipode errores,elexperimentodemuestraqueelcdigogenticoestraducidopordosconjuntos de adaptadores que actan secuencialmente. Cada uno de ellos se corresponde con la superficiemoleculardelaotra,congranespecificidadyessuaccincombinadaqueasocia cadasecuenciadetresnucletidosenlamolculadeARNmestoes,cadacodnconsu aminocidoparticular. LaedicinporlaARNsintetasaaseguralaadecuacindelmecanismo La accin conjunta de varios mecanismos aseguran que la ARNt sintetasa ligue el aminocido correcto a cada ARNt. La sintetasa debe primero seleccionar el aminocido correcto.Esteprocesoseefectaporunmecanismodedospasos.Primeroseleccionael aminocidocorrecto,queeselquetienelamsaltaafinidadporelbolsillodelsitioactivo de su sintetasa y por esto es favorecido sobre los otros 19 restantes. En particular, aminocidos mayores que el correcto, son efectivamente excluidos del sitio activo. Sin embargo, es muy difcil realizar la discriminacin entre dos aminocidos similares, tales comolaisoleucinaylavalina,(quedifierensloenungrupometilo),enunmecanismode reconocimientodeunnicopaso.Unsegundopasodediscriminacinocurredespusque 266

elaminocidohasidocovalentementeligadoalasintetasa,forzandoalaminocidoapasar
aunsegundobolsilloenlasintetasa,ladimensinprecisadeste,excluyeelaminocido incorrectoperopermiteelaccesodelaminocidoespecfico.Unavezqueunaminocido ingresaaestebolsillodeedicin,eshidrolizadodelAMP(odelARNtmismosielaminocil ARNt ya ha sido establecido) y liberado de la enzima. Esta edicin hidroltica, que es anloga a la edicin por la ADN polimerasa, aumenta la adecuada carga del ARNt a aproximadamenteunerroren40.000acoplamientos. La ARNt sintetasa debe tambin reconocer el conjunto correcto de ARNts y la complementariedad qumica y estructural entre la sintetasa y el ARNt permiten sensar variascaractersticasdelARNt.LamayoradelasARNtsintetasasreconocendirectamente la concordancia entre el anticodn del ARNt; estas sintetasas contienen tres bolsillos de unin de nucletidos adyacentes, cada uno de los cuales es complementario en forma y cargaalnucletidoenelanticodn.Paraotrassintetasaseslasecuenciadenucletidosdel tallo aceptor la que resulta determinante para el reconocimiento. Sin embargo, en la mayoradeloscasoslosnucletidossonledosenvariasposicionesporlasintetasa. Losaminocidossonagregadosalextremocarboxilodelacadenapolipeptdicacreciente Lareaccinfundamentaldelasntesisdeprotenaseslaformacindeunauninpeptdica entreel grupo carboxilo alfinal de unacadenapolipeptdicacrecienteyungrupoamino libredeunaminocidoqueseincorpora.Consecuentemente,unaprotenaessintetizada desde su extremo Nterminal a su extremo Cterminal. A travs del proceso global, el extremo creciente de una cadena polipeptdica permanece activado por su anclaje covalente a una molcula de ARNt (una molcula de peptidilARNt). Este ligamiento covalente de alta energa se rompe durante cada adicin pero es inmediatamente reemplazado por el ligamiento idntico en el ltimo aminocido que se agrega. De esta forma, cada aminocido agregado posee la energa de activacin para la adicin del siguienteaminocido,msquelaenergaparasupropiaadicin,estoconstituyedeuntipo depolimerizacinheadgrowthcomosedescribeenlafiguraXX. ElmensajedelARNesdecodificadoenlosribosomas LasntesisdeprotenasesguiadaporlainformacinqueposeenlasmolculasdeARNm. Para mantener el correcto marco de lectura y para asegurar la exactitud del proceso 267

(aproximadamente1errorcada10.000aminocidos),lasntesisdeprotenasserealizaen
los ribosomas, una compleja mquina cataltica constituda por mas de 50 protenas (las protenas ribosomales) y varias molculas de ARN ribosomales (ARNrs). Una clula eucariota tpica, contiene millones de ribosomas en su citoplasma. Como se vio previamente las subunidades de los ribosomas son ensambladas en el nuclolo por la asociacindeARNrsrecintranscriptosymodificadosconprotenasribosomales,lasque sehantransportadohaciaelncleodesdeelcitoplasma.Lasdossubunidadesribosomales luegosonexportadasalcitoplasmadondeserealizalasntesisdeprotenas. Los ribosomas de las clulas eucariotas y procariotas son muy similares en el diseo y funcin. Ambos estn compuestos de una unidad mayor y una unidad menor que se ajustanmutuamenteparaformarunribosomacompletoconunamasadevariosmillones dedaltons.LasubunidadmenorproveedelmarcodetrabajoenelcualelARNtpuedeser adecuadamente alineado con los codones del ARNm, mientras que la subunidad mayor cataliza la formacin de la unin peptdica que une los aminocidos en la cadena polipeptdica. Cuando no se estan sintetizando activamente las protenas, las dos subunidades del ribosoma se mantienen separadas. Las subunidades se mantienen unidas sobre una molcula de ARNm, usualmente cerca de su extremo 5, para iniciar la sntesis de una protena. El ARNm es luego traccionado a travs del ribosoma; conforme sus codones encuentran los sitios activos, la secuencia de nucletidos del ARNm es traducida en una secuenciadeaminocidosusandoelARNtcomomolculaadaptadoraparaelagregadode cadaunodelosaminocidosenlasecuenciacorrectaalextremodelacadenapolipeptdica creciente. Cuando se encuentra un codn de parada, el ribosoma libera la protena finalizada,susdossubunidadesseseparannuevamente,Estassubunidadespuedenluego serusadasparacomenzarlasntesisdeotrasprotenassobreotramolculadeARNm. Losribosomasoperanconunaremarcableeficiencia:unribosomadeunaclulaeucariota agrega aproximadamente dos aminocidos por segundo en una cadena polipeptdica; mientrasquelosribosomasdelasclulasprocariticasagregancercade20aminocidos porsegundo. LosribosomascontienencuatrositiosdeuninparalasmolculasdeARN:unodeestos 268

sitiosestdestinadoalaunindelARNmylostresrestantes(denominadossitioA;sitioP;
yelsitioE)sonparalosARNts.UnamolculadeARNtcalzaestrechamenteenlossitiosAo P,slosisuanticodnseapareaconlasbasescomplementariasdelcodn(admitiendoel wobble)sobreelARNmqueestunidoalribosoma.LossitiosAyPestnsuficientemente cercademodotalquepermitenquedosmolculasdeARNtseanforzadasaaparearsecon codonesadyacentesdemolculasdeARNm.Estacaractersticadelosribosomasmantiene elmarcodelecturacorrectosobrelamolculadeARNm. Una vez que se inicia la sntesis de las protenas, cada nuevo aminocido se agrega a la cadena que se est elongando en un ciclo de reacciones que consiste de tres pasos principales.Estadescripcindelprocesodeelongacindelacadena,comienzaenunpunto enelcualalgunosaminocidossiemprehansidoligadosyexisteunamolculadeARNten elsitioPsobreelribosoma,unidocovalentementealextremodelpolipptidocreciente.En el paso (1), un ARNt portando el siguiente aminocido en la cadena se une al sitio A ribosomal formando pares de bases con el codn en el ARNm all posicionado, de esta manera, los sitios P y A contienen ARNts adyacentes unidos. En el paso (2) el extremo carboxilodelacadenapolipeptdicaseliberadelARNtdelsitioP(porrupturadelaunin dealtaenergaentreelARNtysuaminocido)yunidoalgrupoaminolibredelaminocido ligadoalARNtenelsitioA,formandounanuevauninpeptdica.Estareaccincentralde lasntesisdeprotenasescatalizadaporlaactividadcatalticadeunapeptidiltransferasa contenida en la subuinidad ribosomal mayor. Esta reaccin va acompaada por varios cambiosconformacionalesenelribosoma,elcualcambialosdosARNtshacialossitiosEy Pdelasubunidadmayor.Enelpaso3otraseriedecambiosconformacionalesmuevenel ARNm exactamente 3 nucletidos a travs de los ribosomas y reubican a los ribosomas para que estn preparados para recibir el siguiente aminoaciloARNt. El paso 1 es luego repetidoconunnuevoaminoaciloARNtingresanteyassucesivamente. Este ciclo de tres pasos es repetido cada vez que un aminocido se agrega a la cadena polipeptdica,ylacadenacreceporlaadicindeaminocidosasuextremocarboxilohasta queseencuentrauncodndeterminacin. Losfactoresdeelongacinconducenelprocesodetraduccin ElciclobsicodeelongacinmostradoenlafiguraXXtieneunacaractersticaadicionalque 269

hace al proceso de traduccin, especialmente eficiente y preciso. Dos factores de
elongacin (EFTu y EFG) ingresan y salen del ribosoma durante cada ciclo, cada uno hidroliza GTP a GDP, sufriendo cambios conformacionales en el proceso. Bajo ciertas condiciones, los ribosomas pueden realizar sntesis de protenas sin la ayuda de los factoresdeelongacinylahidrlisisdeGTPperoestasntesiseslentaypocoeficientee imprecisa. El proceso es acelerado enormemente por el acoplamiento de cambios conformacionalesenlosfactoresdeelongacinydelosribosomas.Aunqueestoscambios conformacionales de los ribosomas no son comprendidos en detalle algunos de estos cambiosinvolucranrearreglossimilaresaaquellosqueocurrenelempalmosoma.Losciclos deasociacindelosfactoresdeelongacin,hidrlisisdeGTPyladisociacinqueasegura que los cambios conformacionales ocurran en la direccin forward y la traduccin procedeaseficientemente. Adicionalmente, para ayudar el movimiento de traduccin forward, se cree que EFTu incrementalaprecisindelatraduccinmonitoreandolainteraccininicialentreelARNt cargadoyuncodn.ElARNtcargadoingresaalribosomaunidoalEFTuGTP.Apesarquela unindefactordeelongacinpermiteelapareamientoyunindelcodnyelanticodn, previene que el aminocido se incorpore a la cadena polipeptdica creciente. El reconocimientodelcodninicial,sinembargo,disparaelfactordeelongacinhidrolizando suGTP(aGDP+Pi),comoresultadodeesto,elfactorsedisociadelribosomasinelARNt, permitiendoquelasntesiscontine.Elfactordeelongacinintroduceunacortademora entre el apareamiento de las bases codn anticodn y la elongacin de la cadena polipeptdica;estademorapermitelaeliminacindeARNtsincorrectamenteunidosantes dequeseproduzcalaelongacindelacadenapolipeptdica.Laprimerademorasedebeal tiemporequeridoporlahidrlisisdelGTP.LatasadelahidrlisisdeGTPporelEFTues msrpidacuandoelapareamientocodnanticodnescorrecto,quecuandosteesun apareamiento incorrecto, consecuentemente una molcula de ARNt incorrectamente unidaposeeunaventanadeoportunidadesparadisociarsedelosribosomasmslarga.En otras palabras, la hidrlisis de GTP capta selectivamente la unin de ARNt correcta. Una segundademoraocurreentreladisociacindeEFTuyelacomodamientocompletodela ARNtenelsitioAdelosribosomas.Aunqueesteintervalosecreequeeselmismoparalos ARNts incorrecta o correctamente unidos, dado que los primeros forman un menor 270

nmerounionespuentehidrgenocodnanticodnqueloscorrectamenteapareados,son
ms fciles de disociarse durante este perodo. Estas dos demoras introducidas por el factordeelongacinprovocanquelamayoradelasmolculasdeARNtincorrectamente unidas (as como tambin un nmero significativo de molculas correctamente unidas) dejenlosribosomassinserusadosparalasntesisdeprotenas.As,estemecanismodedos pasos es responsable del 99,99% de la precisin de los ribosomas en la traduccin de protenas. Recientes descubrimientos indican que el EFTu podra tener un rol adicional en el incrementodelaprecisindelatraduccin.Yahemosdiscutidopreviamenteelrolclavede las aminoacil sintetasas en el preciso encaje de los aminocidos al ARNt. Como la forma unida de GTP a EFTu acompaa a las aminoacilARNts a los ribosomas, aparentemente realiza un doble chequeo para la adecuada correspondencia entre los aminocidos y el ARNt, rechazando a aquellos que estn mal apareados. El cmo se realiza esto, no est completamentecomprendidoperosecreequedebeinvolucraratodolaenergadeunin entreelEFTuyelaminoacilARNt.Deacuerdoaestaidea,lacorrectacoincidenciatiene una afinidad estrechamente definida por EFTu y un coincidencia incorrecta tanto puede ser muy dbil o muy fuerte. As el EFTu parece discriminar crudamente entre muchas diferentescombinacionesdeaminocidosARNt,permitiendoselectivamentequesololas correctasingresenalribosoma. Elribosomaesunaribozima ElribosomaesunaestructuramuygrandeycomplejacompuestadedosterciosARNyun terciodeprotenas.Ladeterminacindelaestructuratridimensionaldesussubunidades menor y mayor en el ao 2000, confirm la evidencia temprana que el ARNr y no las protenas es el responsables de toda la estructura de los ribosomas, su capacidad para posicionar a los ARNts sobre el ARNm y su capacidad cataltica en la formacin de las unionespeptdicascovalentes.As,losARNsribosomalessonestructurastridimensionales, altamente compactas, precisamente plegadas que forman el corazn de los ribosomas y asimismodeterminansuforma. En marcado contraste con la posicin central del ARNr, las protenas ribosomales generalmente estn localizadas sobre la superficie y completan las interrupciones y los 271

plieguesdelosARNsplegados,Algunasdeestasprotenascontienendominiosglobulares
sobrelasuperficiedelosribosomasqueenvansusextensionesalasregionesdecadenas polipeptdicasquepenetrancortasdistanciasenorificiosenelcoredeARN.Elprincipalrol delasprotenasribosomalespareceserlaestabilizacindelcoredeARNpermitiendolos cambios en la conformacin del ARNr, necesarios para que el ARN catalice la sntesis de protenas. NoslolostressitiosdeuninparalosARNts(lossitiosA,PyE)sobrelosribosomasse forman principalmente por los ARNs ribosomales, sino que los sitios catalticos para la formacindeunionespeptdicassonclaramenteprovistosporelARN23Sdeprocariotaso 28S de eucariotas, con el aminocido ms cercano, localizado 1,8 nm ms all. Este sitio catalticopeptidiltransferasabasadoenARN,essimilarenmuchosaspectosalencontrado enalgunasprotenas;esteesunbolsilloaltamenteestructuradoqueorientaprecisamente los dos reactivos (la cadena peptdica creciente y el aminoacilARNt) y provee un grupo funcional como para actuar en la catlisis de cido base. En este caso, aparentemente acta un anillo de la base nitrogenada adenina, en lugar de una cadena lateral aminoacdica, como la de la histidina. La capacidad de una molcula de ARN para actuar comouncatalizadorfueinicialmentesorprendentepuessecreaqueelARNcarecadelos grupos dadores o aceptores de electrones apropiados. Aunque el pK de los anillos de nitrgenodelaadeninaesusualmentealrededorde3,5,laestructuratridimensionalyla distribucin de cargas del sitio activo del ARN 23S fuerza el pK de sta aparentemente crticaadenina,creandoaslaactividadenzimtica. Las molculas de ARN que poseen actividad cataltica son conocidas como ribozimas. La capacidaddelasmolculasdeARNparaactuarcomocatalizadoresdeunaampliavariedad de reacciones diferentes, podra significar que esta molcula fue clave en la evolucin tempranadelasclulasvivas.Actualmentesecreequeexistenbuenasrazonesparapensar que el ARN, ms que las protenas, actu como catalizador primitivo para las clulas vivientes. Esto podra explicar el por qu el mecanismo de sntesis de protenas pudo evolucionarenlossistemasbiolgicosapartircasiexclusivamentedelosribosomas. Las secuencias nucleotdicas en el ARNm sealizan dnde comienza la sntesis de protenas 272

Lainiciacinyterminacindelprocesodetraduccinocurreapesardelasvariacionesenel
ciclo de elongacin descripto previamente. El sitio en el cual la sntesis de protenas comienza sobre la hebra de ARNm es especialmente crucial, ya que en el conjunto de marcos de lectura para la longitud total del mensaje, un error de un nucletido puede causar que cada codn subsiguiente en el mensaje sea mal ledo, de tal forma que la protenanoseafuncionaloexhibaunasecuenciadeaminocidosdistorsionada. Elpasodeiniciacinestambindegranimportanciayaqueparalamayoradelosgeneses elltimopasoenelcuallaclulapuededecidirsielARNmseronotraducidoylaprotena sintetizada;latasadeiniciacindeterminaaslatasaalacuallaprotenasesintetiza. La traduccin de un ARNm comienza con el codn AUG, y se requiere un ARNt especial para iniciar la traduccin. Este ARNt iniciador siempre lleva el aminocido metionina (en bacterias,seusaunaformamodificadadelametionina:laformilmetionina)detalmanera quetodanuevaprotenatienealametioninacomoelprimeraminocidoensuextremoN terminal, que es el que sintetiza primero. Esta metionina, usualmente se remueve ms tardeporunaproteasaespecfica.ElARNtiniciadortieneunasecuencianucleotdica(que estacopladaalametionina)esprimerocargadoalasubunidadpequeaconunaprotena adicionaldenominadafactordeiniciacineucariticooeIFs.DetodoslosaminoacilARNt presentes en la clula, slo el iniciador cargado con metionina es capaz de unirse fuertementealasubunidadmenordelosribosomassinqueseencuentretodoelribosoma completo.Acontinuacin,lasubunidadmenordelosribosomasunidaalextremodeuna molculadeARNmqueesreconocidaporsucapuchn5ysusdosfactoresdeiniciacin unidoseIF4E(queestdirectamenteunidoalcapuchn)yeleIF4G.Lasubunidadmenorde losribosomasluegosemuevede5a3alolargodelARNm,buscandoelprimerAUG.Este movimientoesfacilitadoporfactoresdeiniciacinadicionalesqueactancomohelicasas ATPdependientes,permitiendoquelasubunidadmenorbarraalolargodelaestructura secundariadelARN.Enel90%delosARNms,latraduccincomienzaconelprimerAUG encontradoporlasubunidadpequea.Enestepunto,losfactoresdeiniciacinsedisocian de la subunidad menor de los ribosomas para que se complete el ensamble de los ribosomas.ElARNtiniciadorestahoraunidoenelsitioPdelosribosomasdejandolibreel sitioA.Lasntesisdeprotenasestaslistaparacomenzarconlaadicindelasiguiente
273

molculaaminoacilARNt.
Los nucletidos que rodean inmediatamente el sitio de inicioen elARNmde eucariotas influencianlaeficienciadelreconocimientodeAUGduranteelprocesodebarridoanterior. Si este sitio de reconocimiento es muy diferente de la secuencia consenso la subunidad ribosomaldebarridopuedeignorarelprimercodnAUGenelARNmysaltaalsegundoo tercercodnAUG.Lasclulasusualmenteusanestefenmenoconocidocomobarridode goteoparaproducirdosomsprotenas,difiriendoensuNterminal,apartirdelamisma molculadeARNm.Estolepermiteaalgunosgenesproducirlamismaprotenaconosin unasecuenciasealensuextremoNterminal,detalmaneraquelaprotenapuedeser dirigidaadoscompartimientosdiferentesenlaclula. El mecanismo para seleccionar un codn de inicio en bacterias es diferente. Los ARNms bacterianosnoposeencapuchn5queleindiquealosribosomasdondecomienzaelsitio de comienzo de la traduccin. En lugar de eso, cada ARNm bacteriano posee un sitio de unin a los ribosomas conocido como secuencia de ShineDalgano, est localizada unos pocos nucletidos corriente arriba del sitio AUG que es el punto donde comienza la traduccin. Esta secuencia de nucletidos, con el consenso 5AGGAGGU3, posee bases complementarias con la molcula 16S del ARNr de la subunidad ribosmica pequea y posicionaalcodndeiniciacinAUGenelribosoma.Unconjuntodefactoresdeiniciacin delatraduccinorquestanestainteraccin,ascomotambinelsubsiguienteensamblede lasubunidadribosmicagrandeparacompletarelribosoma. A diferencia de los ribosomas eucariticos, un ribosoma bacteriano puede asimismo ensamblarse directamente sobre un codn de iniciacin ubicado en el interior de una molculadeARNm,tanlargacomoelsitiodeuninprecedeporvariosnucletidos.Como resultado,elARNmbacterianoesamenudopolisistrnicoestoes,codificavariasprotenas diferentes,cadaunadelascualessetraducedelamismamolculadeARNm.Encontraste elARNmeucaritico,generalmenteslocodificaunaprotena. Elcodndeparadamarcaelfinaldelatraduccin Elfinaldeunaprotenaessealadoporlapresenciadeunodetrescodones(UAA,UAG,o UGA) llamados tambin codones de parada o stop. Estos no son reconocidos por ningn ARNt y no especifican un aminocido pero sealizan a los ribosomas para que finalice la 274

traduccin.Lasprotenasconocidascomofactoresliberadoresseunenalosribosomascon
el codn stop posicionado en el sitio A y esta unin fuerza a la peptidiltransferasa en el ribosomaacatalizar laadicindeuna molculadeaguaal peptidilARNt,enlugardeun aminocido.Estareaccinliberaelextremocarboxilodelacadenapolipeptdicacreciente desuanclajeaunamolculadeARNtyenfuncindequeesteanclajenormalmenteporta la cadena polipeptdica creciente, es inmediatamente liberada hacia el citoplasma. El ribosoma libera luego al ARNm y las subunidades se separan, hasta encontrar otra molculadeARNmparacomenzarunnuevociclodesntesisdeprotena. Losfactoresdeliberacinproveenundramticoejemplodelmimetismomolecular,donde un tipo de molcula recuerda la forma de una molcula no relacionada. En este caso la estructura tridimensional de los factores de liberacin (constituidos totalmente por protenas)recuerdaencuantoa forma ydistribucin de cargas a unamolculade ARNt. Estemimetismodecargayforma,permitealosfactoresdeliberacinentrarenelsitioA delosribosomasyprovocanlafinalizacindelatraduccin. Durantelatraduccin,elpolipptidonacientesemueveatravsdeunlargotnelacuoso (~10 nm x 1,5 nm) en la subunidad grande de los ribosomas. La pared de este tnel, principalmente ARNr 23S, esta compuesta de pequeos parches hidrofbicos embebidos en una mas extensa superficie hidroflica. Esta estructura debido a que no es complementaria a ninguna estructura peptdica, provee una cobertura tipo Tefln a travsdelacual,unacadenapolipeptdicapuededeslizarsefcilmente.Ladimensindel tnelsugierequelasprotenasnacientessonfundamentalmentenoestructuradascuando pasanporlosribosomas,aunquealgunashlicespuedenformarseantesdedejaraltnel delribosoma. Lasprotenassonsintetizadassobrepolirribosomas Lasntesisdelamayoradelasprotenasseproduceentreaproximadamente20segundos varios minutos. Pero an durante este corto perodo de tiempo tienen lugar mltiples iniciaciones sobre cada molcula de ARNm iniciada. Conforme se ha traducido suficiente ARNm sobre el ribosoma precedente y la secuencia nucleotdica emerge de ste, el extremo5escapturadoporunnuevoribosoma.LasmolculasdeARNmqueestansiendo traducidas se encuentran a menudo formando polirribosomas (tambin conocidas como 275

polisomas). Estos son grandes ensambles citoplasmticos constitudos por vatrios
ribosomasespaciadoscada~80nucletidosalolargo deunamolculasimpledeARNm. Estas mltiples iniciaciones significan que pueden fabricarse muchas ms molculas de protenasenuntiempodado,quesicadaunodebiesecompletarseantesdequecomience lasntesisdelaprximamolcula. Tanto bacterias como eucariotas utilizan polisomas y ambos emplean estrategias adicionalesparaacelerarlatasadesntesisdeprotenas.DebidoaqueelARNmbacteriano norequiereprocesamientoyesaccesiblealosribosomasmientrasestsiendosintetizado, los ribosomas pueden anclarse al extremo libre de la molcula de ARNm y comenzar a traducirse an antes de que la transcripcin se haya completado. En eucariotas los extremos 3 y 5 del ARNm se encuentran interactuando, por lo tanto, tan rpidamente como se disocia el ribosoma, sus dos subunidades estn en ptimas condiciones para reiniciarlatraduccinenlamismamolculadeARNm. Mecanismosdecontroldecalidadoperanenmuchosestadiosdelatraduccin La traduccin por los ribosomas es un compromiso entre precisin y velocidad. Se ha observado que la precisin de la traduccin (un error por cada 104 aminocidos unidos) requiereunademoradetiempocadavezqueseagregaunnuevoaminocidoalacadena polipeptdica, produciendo una overall velocidad de traduccin de 20 aminocidos incorporadosporsegundoenbacterias.Bacteriasmutantesconunaalteracinespecfica en su subunidad ribosmica menor traducen el ARNm en protenas con una precisin considerablemente mas alta que esto, sin embargo, la velocidad es tan lenta que las bacteriassonraramentecapacesdesobrevivir. Se ha observado que la precisin de la sntesis de las protenas requiere del gasto de energalibre;estoesdeesperarseyaquesiempredebepagarseunporcadaincrementoen elordendelasclulas.Enlamayoradelasclulas,lasntesisdeprotenasconsumems energaqueningnotroprocesobiosinttico.Serompenalmenoscuatrounionesfosfato dealtaenerga,porcadanuevoenlacepeptdicoformado:dossonconsumidosenlacarga deunamolculadeARNtconunaminocido,ydosmsconducenlospasosenelciclode reaccionesqueocurrensobreelribosomadurantelasntesismisma.Adicionalmente,cada vezqueunaminocidoequivocadoseinsertaenlacadena,seconsumeenergaextraylo 276

mismoocurrecadavezqueunARNterrneoingresaalribosoma,disparandolahidrlisis
de GTP y es rechazado. Para ser efectivo, este mecanismo de lectura de prueba debe tambin remover una fraccin apreciable de interacciones correctas; por esta razn, son anmscostososenenergaqueloquetericamentepodracalcularse. Otrosmecanismosdecontroldecalidad,aseguranqueunamolculadeARNmeucaritico est completo antes que los ribosomas comiencen a traducirla. Los ARNm rotos o incompletamenteprocesadospodranserdainosparalaclulaopodranproducirse.En eucariotassehavistoquelaproduccindeARNmnosloinvolucralatranscripcinsino tambinunaseriedeelaboradospasosdeprocesamientoquesellevanacaboenelncleo, yslocuandoelARNmestcompleto,estransportadoalcitosolparasertraducido.Una molcula de ARNm que estaba intacta en el ncleo puede romperse en el citosol. Para evitarlatraduccindelasmolculasdeARNmtantoelcapuchn5ylacola3poliAson reconocidos por el aparato de iniciacin de la traduccin, antes de que la traduccin comience. Las bacterias solucionan este problema de ARNm incompletos en una va enteramente diferentes. No solo no existen seales en el extremo 3 de los ARNm bacterianos, sino tambin,latraduccinamenudocomienzaantesdequelasntesisdelostranscriptosha sidocompletada.CundoelribosomabacterianotraduceelextremodeunARNincompleto, un ARN especial, denominado ARNtm ingresa al sitio A del ribosoma y es traducido; agregandounmarcadorespecialde11aminocidosenelextremocarboxilodelaprotena truncadaquesealizaaproteasasparaqueladegraden. Existenvariacionesmenoresencdigosgenticosestndar Como se discuti antes, el cdigo gentico se aplica a las tres ramificaciones ms importantesdelavida,proveyendodeunaevidenciaimportanteparaelorigencomnde toda la vida sobre la tierra. Aunque raras, existen excepciones para este cdigo. Por ejemplo,Candidaalbicans,elmaspersistentepatgenofngicodeloshumanostraduceel codn CUG como serina mientras que todos los otros organismos lo traducen como leucina.Lasmitocondrias(quetienensupropiogenomaycodificanmuchodesuaparato transcripcional)tambinmuestranvariasdesviacionesdelcdigoestndar.Porejemplo,en lasmitocondriasAUAestraducidacomometioninamientrasqueenelcitosoldelaclula 277

estraducidocomoisoleucina.
Eltipodedesviacinenelcdigogenticodiscutidoantesesdeltipohardwired.Untipo diferentede variacinalgunasveces denominada recodificacin traduccionalocurreen muchasclulas.Enestecaso,otrainformacindesecuenciasnucleotdicaspresentesenun ARNmpuedencambiarelsignificadodelcdigogenticoenunsitioparticulardelANm.El cdigo gentico estndar permite a las clulas fabricar las protenas usando slo 20 aminocidos.Sinembargo,bacterias,arqueasyeucariotasdisponendeunvigsimoprimer aminocido que puede ser incorporado directamente en una cadena polipeptdica crecienteatravsdelprocesollamadorecodificacintraduccional.LaSelenocistenaquees un aminocido esencial para varias enzimas, contiene un tomo de selenio en lugar del azufre de la cistena. La selenocistena se produce a partir de una serina anclada a una molculaparticulardeARNtqueseapareaconelcodnUGA,uncodnquenormalmente se usa como stop de la traduccin. Los ARNms para las protenas en las que la selenocistena debe ser insertada en el codn UGA poseen una secuencia nucleotdica adicionalenlascercanasdelARNmquecausanesteeventoderecodificacin,(verFig.677 Albert). Otra forma de recodificacin es el cambio de marco traduccional (translational frameshifting). Este tipo de recodificacin es comnmente usado por retrovirus, un gran grupodeviruseucariticos,enloscualessepermitequemsdeunaprotenasesinteticea partir de una molcula de ARNm. Estos virus fabrican tanto las protenas de la cpside (protenas Gag) y las transcriptasa reversa y la integrasa (protenas Pol). Tales virus necesitanmscopiasdelasprotenasGagquedelasPol,yrealizanesteajustecuantitativo codificando los genes pol justo antes que los genes gag pero en un marco de lectura diferente.Uncodnstopalfinaldelasecuenciacodificantedelosgenesgagpuedenser salteadosporuncambiodemarcotraduccionalintencionalqueocurrecorrientearribade l.EstecambiodelmarcodelecturaocurreenuncodnparticularenelARNmyrequiere deunasecuenciasealderecodificacinquepareceserunacaractersticaestructuraldela secuenciadeARNcorrientedebajodeestesitio. Muchosinhibidoresdelasntesisdeprotenasprocariticassonusadoscomoantibiticos Muchosdelosantibiticosmsefectivosusadosenmedicinasoncomponentesfabricados 278

porloshongosqueactancomoinhibidoresdelasntesisdeprotenas.Algunasdeestas
drogasexplotanlasdiferenciasestructuralesyfuncionalesqueexistenentrelosribosomas bacterianos y los eucarioticos, interfiriendo diferencialmente con la funcin de los ribosomas bacterianos. As, algunos de estos componentes pueden ser tomados en altas dosis sin causar toxicidad en humanos. Debido a que diferentes antibiticos se unen a diferentes regiones de los ribosomas bacterianos, ellos inhiben diferentes pasos del proceso de sntesis. Algunos de los ms comunes son usados tambien en estudios de biologa celular. Algunos inhiben la sntesis de protenas en eucariotas y por lo tanto no puedenusarsecomoantibiticos. El cloranfenicol, por ejemplo, inhibe la sntesis de protenas slo en los ribosomas mitocondriales,(yencloroplastosenplantas)reflejandoelprobableorigenprocarioticode estas organelas. La cicloheximida en contraste, afecta solo los ribosomas citoslicos. La puromicinaesespecialmenteinteresanteyaqueesunanlogoestructuraldeunamolcula deARNtligadaaunaminocidoyesotroejemplodemimetismomolecular.Elribosoma engaadoporlamolculaylaincorporacovalentementealextremocarboxilodelacadena polipeptdicacreciente,cuasandolaprematurafinalizacinyliberacindelpolipptido.La puromicinainhibetantolasntesisdeprotenasdeeucariotascomodeprocariotas. Lasprotenascomienzanaplegarseauncuandoestnsiendosintetizadas El proceso de expresin gnica no termina cuando el cdigo gentico se ha usado para sintetizarunasecuenciadeaminocidos.Parasertilestepolipptidodebeplegarseensu conformacin tridimensional nica, unir todo pequeo cofactor requerido para su actividad, ser apropiadamente modificado por protenas cinasas, u otras enzimas modificadoras de protenas, y ensamblarse correctamente con las otras subunidades proteicasconlascualesellasfuncionan. La informacin necesaria para los pasos de maduracin proteica listados antes es finalmente contenida en la secuencia de aminocidos ligados que el ribosoma produce cuando el traduce una molcula de ARNm en una cadena polipeptdica. Cuando una protenasepliegaenunaestructuracompacta,lamayoradelosresiduoshidrofbicosse encierranenelcoreinterior.Adicionalmente,grannmerodeinteraccionesnocovalentes se producen entre varias partes de la molcula. Es la suma de todos estos arreglos 279

energticamentefavorablesloquedeterminaelpatrndelplegamientofinaldelacadena
polipeptdicacomolaconformacindelamenorenergalibre. Atravsdemuchosmillonesdeaosdetiempoevolutivo,lasecuenciadeaminocidosde cadaprotenahasidoseleccionadanosloporlaconformacinqueadoptasinotambin por su capacidad para plegarse rpidamente conforme la cadena polipeptdica sale del ribosoma,comenzandoporsuextremoNterminal.Losexperimentoshandemostradoque unavezqueundominoproteicoenunaprotenamultidominoemergedelosribosomas, ellosformanunaestructuracompactaquecontienelamayoradelasestructurasecundaria final(hlicesyhojas)dentrodeunospocossegundos,alinendoseenlaformacorrecta enformagruesa.Paramuchosdominiosprotecos,estaestructurainusualmenteabiertay flexible, que se denomina molten globule, es el punto inicial por el que ocurre un relativamentelentoprocesoenelqueseproducenmuchosajustesdelascadenaslaterales hastaqueseformalaestructuracorrecta.Sinembargo,yaquealosribosomasdemoran variosminutosensintetizarunaprotenadetamaopromedio,unagranpartedelproceso de plegamiento se completa en el tiempo que el ribosoma libera el extremo carboxilo terminaldeunaprotena. Laschaperonasayudanaguiarelplegamientodemuchasprotenas Elplegamientodemuchasprotenasserealizamseficientementeporunaclaseespecial de protenas llamadas chaperonas moleculares. Estas ltimas son muy tiles para las clulaspueshayunavariedaddediferentespatronesquepuedentomarseparaconvertir una estructura de molten globule de una protena en su forma funcional. Para muchas protenasalgunosdelosintermediariosformadosalolargodeestavapodranagregarsey quedar fuera de la va de muerte sin la intervencin de una chaperona que reforma el procesodeplegamiento. Laschaperonasmolecularesfueronprimeroidentificadasenbacteriascuandomutantesde E.colifallaronenpermitirqueelbacterifagolambdaserepliqueenellos. Estas clulas mutantes producen versiones levemente alteradas de la maquinaria de chaperonasycomoresultadodeesto,sondefectuosasenpasosespecficosdelensamble de las protenas virales. Las chaperonas moleculares se incluyen en el grupo de las protenasdechoquetrmico(heatshockproteins:hsp)debidoaqueellassonsintetizados 280

engrandescantidadescuandolasclulassonsometidosbrevementeaaltastemperaturas
(por ejemplo, a 42 C para clulas que normalmente viven a 37 C). Esto refleja la operacin de un sistema de feedback en respuesta a cualquier mal plegamiento de protenas (como las que se producen a altas temperaturas) aumentando la sntesis de protenaschaperonasqueayudanaestasprotenasareplegarse. Lasclulaseucariotastienenalmenosdosfamiliasprincipalesdechaperonasmoleculares conocidas como las protenas hsp60 y la hsp70. Diferentes miembros de las familias funcionanendiferentesorganelas.Porejemplo,enlasmitocondriascontienensuspropias molculashsp60yhsp70 quesondistintasalasque funcionan enel citosol yunahsp70 especial (denominada BIP) que ayuda a plegar a las protenas en el retculo endoplasmtico. Lasprotenassemejantesalahsp60yhsp70trabajanconsupropioconjuntodeprotenas asociadascuandocooperanenelplegamientodeotrasprotenas.Estascompartenafinidad por los segmentos hidrofbicos sobre protenas incompletamente formadas e hidrolizan ATP,amenudolauninyliberacindesuprotenaconcadaciclodehidrlisisdeATP.En otrosentido,losdostiposdeprotenashspfuncionanenformadiferente.Lamaquinaria hsp70actatempranamenteenlavidademuchasprotenas,uniendounatiradecercade sieteaminocidoshidrofbicosantesquelasprotenasdejenlosribosomas.Encontraste, lasprotenashsp60formanunaestructuraconformadebarrilqueactaposteriormente en la vida de las protenas, despus que la protena ha sido completamente sintetizada. Este tipode chaperonas formaunacmara de aislamientoenlacuallas protenasmal plegadas son direccionadas, previniendo su agregacin y proveyndole un ambiente favorableenelcualintentarreplegarlo. Las regiones hidrofbicas proveen seales crticas para el control de calidad de las protenas Si se agregan aminocidos radioactivos a clulas por perodos de tiempo breves, las protenas recin sintetizadas pueden ser seguidas conforme maduran en su forma funcionalfinal.Estetipodeexperimentospermitenmostrarquelasprotenashsp70actan primerocuandolaprotenaanestsiendosintetizadaenelribosoma,yquelasprotenas semejantesalahsp60estnllamadasajugarunrolposteriormenteenelplegamientode 281

lasprotenas.Sinembargo,losmismosexperimentosrevelanquesolounsubconjuntode
protenasrecientementesintetizadasestaninvolucradas:quizas20%detodaslasprotenas con la hsp70 y 10% con las hsp60. Como son seleccionadas estas protenas para este replegamientocatalizadoporATP? Antes de responder esta pregunta, es necesario hacer una pausa para considerar los hechos posttraduccionales de las protenas ms ampliamente. Una protena que tiene segmentos de aminocidos hidrofbicos sobre la superficie es anormal: ha fallado en su correctoplegamientodespusdedejarlosribosomas,sufreunaccidentepermaneciendo sin plegar o falla en encontrar una subunidad partner en una protena compleja. Una protenaasnosloesnoutilizable,sinoquepuedeserdaina.Muchasprotenasconuna regin hidrofbica expuesta pueden formar grandes agregados que precipitan. En raros casosestosagregadosformanocausanenfermedadesseverasenhumanos.Sinembargo, enlamayoradelasclulasexistenmecanismosdecontrolqueprevienentalesdesastres. Con lo discutido en el prrafo anterior no debe sorprenderse que en las clulas hayan evolucionado mecanismos elaborados que reconocen y remueven los segmentos hidrofbicos en las protenas. Dos de estos mecanismos dependen de las chaperonas unindose a los segmentos hidrofbicos y dndole a las protenas una segunda oportunidaddeplegamiento.Almismotiempo,alcubrirlossegmentoshidrofbicosestas chaperonasprevienentransitoriamentelaagregacindelasprotenas.Lasprotenasquese pliegan correctamente muy rpidamente no muestran tales parches hidrofbicos y son salteadasporlaschaperonas. Cuandoelintentodereplegarcorrectamenteunaprotenafalla,entraenjuegountercer mecanismo para destruir completamente la protena mediante protelisis. El patrn proteolticocomienzaconelreconocimientodeunparchehidrofbicosobrelasuperficie de las protenas y finaliza con la liberacin de la protena entera a una mquina de destruccinproteicaconocidacomoproteosoma.Estemecanismodependedeunsistema defabricaciondeprotenasconocidocomoelproteosomaquetambinllevaadelanteotras funcionesdestruyendoprotenasnormalesseleccionadas. El proteasoma degrada una fraccin substancial de protenas recien sintetizadas en la clula 282

Lasclulasremuevenrpidamentelasfallasdesusistemadetraduccin.Losexperimentos
recintes sugieren que un tercio de los polipptidos recin sintetizados son seleccionados parasudegradacincomoresultadodelprocesodecontroldecalidadproteica.Elaparato de descarte final en eucariotas es el proteasoma, una proteasa ATP dependiente que constituyecercadel1%delasprotenascelulares.Presentesenmuchascopiasdispersasa travsdelcitosolyelncleo,elproteosomatambinapuntaalasprotenasdelRE:aquellas protenasquefallanenplegarseoensamblarsecorrectamentedespusdeingresaralRE son detectadas por un sistema de supervivencia del RE que los retranslocaliza hacia el citosolparasudegradacin. Cadaproteosomaconsistedeuncilindrohuecocentral(elcore20Sproteosoma)formado pormltiplessubunidadesproteicasqueseensamblancomounapilacilndricadecuatro anillos heptamricos. Algunas de estas subunidades son distintas proteasas cuyos sitios activosestndispuestoshacialacmarainternadelcilindro.Cadaextremodelcilindroest normalmenteasociadoconungrancomplejo(elcap19S)quecontieneaproximadamente 20polipptidosdiferentes.Lasubunidadcapincluyealmenosseisprotenasquehidrolizan ATP; localizados cerca del borde del cilindro estas ATPasas se unen a las protenas no plegadas para digerirlas, movindolas al interior de la cmara para proceder a su protelisis.Unapropiedadcrucialdelproteosoma,yunaraznparalacomplejidaddesu diseoeslaprocesividaddesumecanismo:encontrasteconunasimpleproteasaquecliva unacadenapolipeptdicasubstrato,elproteosomamantieneelsubstratocompletounido, hastaqueescompletamenteconvertidoenpptidoscortos. El cap 19S acta como una compuerta regulada a la entrada de la cmara proteoltica, siendotambinresponsabledelaunindeunaprotenablancoalproteosoma.Conpocas excepciones,elproteosomaactasobreprotenasquehansidoespecficamentemarcadas para la destruccin por anclaje covalente de mltiples copias de una pequea protena denominada ubiquitina. sta molcula existe tanto en las clulas libres como ligadas covalentementeaunaampliavariedaddeprotenasintracelulares.Paralamayoradeestas protenas,estesealamientoconlaubiquitinaresultaensudestruccinporelproteosoma. UnelaboradosistemaUbiquitinaconjugadomarcaalasprotenasparasudestruccin La ubiquitina es preparada para su conjugacin a otras protenas por la enzima ATP 283

dependiente activadora de ubiquitina (E1), la que crea una ubiquitina activada que es
transferidaaunconjuntodeenzimasconjugadasaubiquitina(E2).LaenzimaE2actaen conjuntoconunaprotenaaccesoria(E3)EnelcomplejoE2E3llamadoligasaubiquitina,el componenteE3uneasealesdedegradacinespecficaensubstratosproteicos,ayudando alaE2paraformarunacadenademultiubiquitinaligadaaunalisinadelsubstratoproteico. Enestacadena,elresiduoCterminaldecadaubiquitinaesligadoaunalisinaespecficade la molcula de ubiquitina precedente, produciendo una serie lineal ubiquitinaubiquitina conjugada. Esta cadena multiubiquitina sobre una protena target es reconocida por un receptorespecficoenelproteosoma. Hayalrededorde30enzimasE2estructuralmentesimilaresperodiferentesenmamferosy cientos de diferentes protenas E3 que forman complejos con enzimas E2 especficas. El sistema ubiquitina proteosoma consiste as de muchos patrones proteolticos diferentes, pero organizados de forma similar, que tienen en comn la enzima E1 al top y el proteosoma en el extremo final, difiriendo por la composicin de sus ligasas E2E3 ubiquitinayfactoresasociados.Distintasubiquitinaligasasreconocendiferentessealesde degradacin,yasimismo,marcanparaladegradacinadistintossubconjuntosdeprotenas intracelularesquecompartenestasseales. Protenas mal plegadas o desnaturalizadas, as como protenas conteniendo grupos oxidados u otros aminocidos anormales son reconocidos y destruidos debido a que las protenasanormalestiendenapresentarsobresusuperficiesecuenciasdeaminocidoso motivos conformacionales que son reconocidos por seales de degradacin por un conjunto de molculas E3 en el sistema proteosomaubiquitina; estas secuencias deben, por supuesto, estar encriptadas y ser inaccesibles en la contraparte normal de estas protenas. Sin embargo, un patrn proteoltico que reconoce y destruye protenas anormales debe ser capaz de distinguir entre protenas completadas que tienen conformacioneserroneasylosmuchospolipptidoscrecientessobrelosribosomas,(as como los polipptidos liberados de los ribosomas) que an no han completado su conformacin plegada normal. Esto no es un problema trivial del sistema ubiquitina proteosomapudedestruiralgunasprotenasnacientesnoporseranormalessinoporque exponen transitoriamente seales de degradacin que son encriptadas en su estado
284

maduro(plegado).
Muchasprotenassoncontroladaspordestruccinregulada Unafuncindelosmecanismosproteolticos,comosehadescripto,esreconoceryeliminar protenas anormales o mal plegadas. Otra funcin de estos patrones proteolticos es conferir vidas medias cortas a protenas especficas normales cuya concentracin debe cambiar rpidamente cuando se alteran los estados de una clula. Algunas de estas protenas de corta vida, son rpidamente degradadas todo el tiempo, mientras muchas otrassoncondicionalmentedecortavida,estoes,ellassonmetablicamenteestablesbajo ciertas condiciones, pero se tornan inestables con cambios en el estado celular. Por ejemplo, las ciclinas mitticas son de larga vida a travs del ciclo celular hasta su sbita degradacinalfinaldelamitosis. Seconocenunavariedaddemecanismos,(figura688A),porejemplo,laactividaddeuna ubiquitinaligasa es activada tanto por la fosforilacin de la E3 o por una transicin alostricaenunaprotenaE3causadaporsuuninamolculasespecficas.Porejemplo,el complejo promotor de anafase (APC) es una ligasa ubiquitina multisubunidad que es activada por la adicin de una subunidad cellcycletimed en la mitosis. La APC activada luego,causaladegradacindeciclinasmitticasyotrosvariosreguladoresdelatransicin metafaseanafase. Alternativamente,enrespuestatantoasealesintracelularesoasealesdelambiente,una sealdedegradacinpuedesercreadaenunaprotenacausandosurpidaubiquitinacin ydestruccinporelproteosoma.Unavacomnparacreartalsealesfosforilarunsitio especfico sobre una protena que desenmascara una seal que comnmente est escondida.Otravaparadesenmascararunasealesporladisociacindeunasubunidad proteica.Finalmente,poderosassealesdedegradacinpuedensercreadasporunsimple clivaje de una unin peptdica, creando un nuevo extremo amino que es reconocido por unaE3especficacomounresiduoNterminaldesestabilizado(figura688B). El tipo de seal de degradacin Nterminal se origina en la regla Nterminal, la que relaciona la vida media de una protena in vivo a la identidad de su residuo Nterminal. Existen12residuosdesestabilizantesenlaregladelextremoNdelalevaduraS.cerevisiae (Arg,Lys,His,Phe,Leu,TrpTyr,Glu,Asn,Ile,AspyGln).LosresiduosdesestabilizantesN 285

terminalessonreconocidosporunaubiquitinaligasaespecialqueestconservadadesde
levadurasahumanos. Como se vio todas las protenas son inicialmente sintetizadas compartiendo el residuo metionina(oformilmetioninaenbacterias),queesunresiduoestabilizanteenlareglaN terminal.Proteasasespecialesllamadasmetioninaaminopeptidasas,amenudoremueven elresiduoNterminal,peroestosloseproducesielsegundoaminocidoestambinun residuo estabilizante en la regla Nterminal de las levaduras. Asimismo, inicialmente no estabaclarocmooperabalareglaNterminalinvivo.Sinembargo,recientementeseha descubiertoqueunasubunidaddelacohesina,uncomplejoproteicoquemantienealas cromtides hermanas juntas, es clivada por una proteasa sitioespecfica en la transicin metafaseanafase.Esteclivajereguladoporelciclocelular,permitelaseparacindelas cromtidas hermanasy llevaalafinalizacindela mitosis.ElfragmentoCterminaldela subunidadclivadacomparteunaargininaNterminal,unresiduodestabilizanteenlaregla Nterminal. Las clulas mutantes que carecen del patrn de la regla Nterminal, exhiben unafrecuenciaincrementadadedaoscromosmicospresumiblementedebidoaquelas fallasenladegradacindeestosfragmentosdelasubunidaddelacohesinainterfierencon laformacindenuevoscomplejoscromtidasasociadasconcohesinasenelsiguienteciclo celular. Las protenas anormalmente plegadas pueden agregarse causando patologas humanas destructivas Cuandotodosloscontrolesdecalidaddelasprotenascelularesfallan,tiendenaformarse grandes agregados proteicos en las clulas afectadas (ver figuras 685). Algunos de estos agregados,aladsorbermacromolculascrticassobreellas,puedendaarseveramentey an causar muerte celular. Los agregados proteicos liberados desde las clulas muertas, tiendenaacumularseenlamatrizextracelularquerodeaalasclulasenlostejidos,enlos casosextremoscausadaosdelostejidos.Debidoaqueelcerebroestcompuestodeuna altamente organizada coleccin de clulas nerviosas, este es un tejido altamente vulnerable. No debe sorprender que los agregados proteicos causen primariamente enfermedades neurodegenerativas. Entre estas se destacan las enfermedades de Huntington y Alzheimer esta ltimacausante de la demencia relacionada con la edad en 286

msde20millonesdepersonasenelmundo.
Paraqueuntipoproteicoparticulardeagregadosobreviva,crezcaydaeunorganismo, estedebeseraltamenteresistentealaprotelisistantodentro,comofueradelaclula. Muchosdelosagregadosdeprotenasquecausanproblemasformanfibrillasconstruidas desdeunaseriedecadenaspolipeptdicasqueformanapilamientosdelminasdehojas. Estosfilamentosentrecruzadostiendenaserresistentesalaprotelisis.Estaresistencia explica porque estas estructuras son observadas en muchos de los desrdenes neurolgicos causados por agregados proteicos que producen depsitos anormalmente teidosconocidoscomoamiloideos. Una variedad particular de estas enfermedades han alcanzado especial notoriedad. Estas sonlasenfermedadesprion.AdiferenciadelasenfermedadesdeHuntingtonoAlzheimer, lasenfermedadesprion,puedentransmitirsedeunorganismoaotro,poringestindeun organismoconprionporotro.Unconjuntodeenfermedadesllamadasscrapieencabras, enfermedaddeCreutzfeldtJacobenhumanosyencelofataespongiformebovinaenvacas soncausadasporunagregadomalplegadodeprotenasllamadoPrP(porprotenaprion). La PrP normalmente se localiza sobre la superficie externa de la membrana plasmtica, muy prominentemente en neuronas. Su funcin normal no se conoce. Sin embargo, PrP tiene la propiedad de convertirse en una muy especial conformacin anormal. Esta conformacin,nosoloformafilamentosentrecruzados,resistentesaproteasas,sinoque es infecciosa, debido a que convierte a las formas normales en las patolgicas. Esta propiedad crea un lazo de retroalimentacin positiva que propaga la forma anormal denominada PrP*,quepuedepropagarserpidamentedeclula en clula enelcerebro, causandolamuertedeanimalesyhumanos.Puedeserdainocomeranimalescontejidos conteniendoPrP*,comosehavistoconlapropagacindelaenfermedaddelavacalocade vacasahumanosenGranBretaa. Afortunadamente en ausencia de PrP* es extraordinariamente difcil convertir PrP a su forma anormal. Aunque muy pocas protenas tienen la capacidad de plegarse errneamente en una conformacin infecciosa, una transformacin similar ha sido descubierta que causa una misteriosa herencia por protenas observadas en clulas de levaduras. 287

HaymuchospasosintermediosentreelADNaprotenas
Sehaobservadoenesteapuntequeserequierenmuchostiposdiferentesdereacciones qumicas para que se produzca el correcto plegamiento de una protena en una clula desdelainformacincontenidaenungen.Laeficienciadelplegamientodelasprotenas depende de la eficiencia con que se realiza cada uno de estos pasos. Cada uno de estos pasospuedeserreguladoporlasclulas,peroesenlainiciacindelatranscripcinesel mscomnparaunaclulaenlaregulacindelaexpresindecadaunodelosgenes.Esto tienesentidoyaquelaregulacinmseficienteparalaexpresindeungenesbloqueando leprimerpasolatranscripcindesusecuenciadeADNenunamolculadeARN. REGULACINDELATRADUCCIN Aunquelatranscripcineselnivelprimariodecontroldelaexpresingnica,tantolas clulas eucariotas como las procariotas poseen mecanismos de control durante la traduccin del ARNm. Uno de los mecanismos de control traduccional es la unin de protenasrepresorasquebloqueanlatraduccindelARNm. Uno de los ejemplos mejor conocido en las clulas eucariticas es la regulacin de la sntesisdeferritina,unaprotenaquesealmacenaenelinteriordelaclula. La traduccin de la ferritina esta regulada por la presencia de hierro. Cuanto ms abundanteeslaprovisindehierro,msferritinaseproduce. La protena represora regula el proceso, ya que en ausencia de hierro se une a una secuencia del ARNm denominada IRE (iron response elements) en la porcin no traducibledelextremo5delARNmdelaferritina. Enpresenciadehierro,elrepresornoseunealareginIREdelARNmylatraduccinse efectanormalmente. EsinteresantenotarquelaregulacindelatraduccindelARNmparaferritinaessimilar alaregulacindelARNmdelreceptordelatransferrina. EnesecasolaestabilidaddelmRNAdelreceptordetransferrinaesreguladaporlaunin alareginIREdelareginnotraducibledelaporcin3`. 288

LamismaprotenauneadiferentesregionesIREdelosARNmdeferritinaydelreceptor
detransferrina. Sin embargo, las consecuencias de la unin a los diferentes IRE son muy distintas. La uninalaregin3delARNmdelreceptorprotegeelARNmdesudegradacinmsque inhibirsutraduccin. Estosdiferentesefectos,presumiblementedevienendelasdistintasregionesenlasque est localizado el IRE. Para funcionar como un sitio de represin, el IRE debe estar localizadodentrodelos70nucletidosdelcapdelARNmdelaferritina,sugiriendoque launindelaprotenaalIREbloquealatraduccinporinterferenciadelreconocimiento y la unin del cap por la subunidad S40 del ribosoma. Mientras que al ARNm del receptor de la transferrina la unin de la protena lo protege de la degradacin por ARNasas. Otro mecanismo de regulacin traduccional en eucariotas que resulta de un efecto global sobre toda la actividad traduccional, involucra la modulacin de la actividad de factoresdeiniciacin,particularmenteeleIF2. El eIF3 (formando un complejo con GTP) se une al iniciador metionilo del ARNt, para llevarlo hasta el ribosoma. La subsecuente liberacin de eIF2 va acompaada de hidrlisisdel GTP,dejandoaleIF2 comouncomplejoGDPinactivo. Paraparticiparen otrociclodeiniciacin,elcomplejoeIF2/GTPdebeserregeneradoporelintercambio deuninGDPporGTP.EsteintercambioesmediadoporotrofactoreIF2B. La regulacin de eIF2 provee de un punto de control crtico en clulas eucariotas. En particular, eIF2 puede ser fosforilado por protenaquinasas regulatorias. Esta fosforilacinbloqueaelintercambiodeGDPunidoaGTP,inhibiendoaslainiciacinde latraduccin.Estafosforilacinocurreporejemploenlosreticulocitosencargadosdela sntesisdehemoglobina. LatraduccindeARNmparaglobinaestcontroladaporladisponibilidadgruposheme, elARNmestraducido,slosihayadecuadohemedisponible.Enausenciadehemeuna protenaquinasaquefosforilaaeIF2seactivayastodalatraduccinseinhibe. 289

Un mecanismo similar de ha encontrado en otros tipos celulares, particularmente en
clulasinfectadasporvirus,enlasquelasntesisdelaprotenaviralesinhibidaporel interferon. OtrosestudioshanimplicadoaleIF4E,queseunealaregin5capdelosARNmscomo unaregulacintraduccionaldeprotenas.Porejemplolahormonainsulina,estimulala sntesisdeprotenasenadipocitosyclulasmusculares.Esteefectodelainsulinaestara mediado,almenosenparte,porlafosforilacindeprotenasasociadasconelIF4E,lo queresultaraenlatasadeiniciacintraduccional. La regulacin traduccional es particularmente importante durante el desarrollo embrionariotemprano.Comosehadiscutidopreviamente,unavariedaddeARNmsse almacenan en los oocitos en forma no traducible, el proceso de traduccin se activa luego de la fertilizacin o an ms tardamente. Este mecanismo de regulacin traduccionalestcontroladoporlapoliadenilacindelARNmsdelosoocitos. Muchos ARNms no traducidos son almacenados en los oocitos con colas de poliA de aproximadamente20nucletidos.EstosARNmssonrecuperadosportraduccinenlas etapasadecuadasdeldesarrollo,poralargamientodesuscolaspoliAavarioscientosde nucletidos.Adems,latraduccindealgunosARNmsduranteeldesarrollopareceser reguladaporprotenasrepresorasqueseunenasecuenciasespecficasensusregiones 3notraducibles.EstasprotenasregulatoriaspuedentambindirigirARNmsaregiones especficas del huevo o del embrin, permitiendo la sntesis localizada de la protena codificadaduranteeldesarrolloembrionario. Plegamientoyprocesamientodeprotenas Elprocesodetraduccin,completaelflujodeinformacingenticadentrodelaclula. La secuencia de ADN se ha convertido ahora en una cadena polipeptdica de aminocidos. Sin embargo, la sntesis de un polipptido no es equivalente a la produccin de una protena funcional. Para ser utilizables, los polipptidos deben adems plegarse adoptando distintas conformaciones tridimensionales y en muchos casos cadenas polipetdicas mltiples deben ensamblarse en un complejo funcional. Adems,muchasprotenassufrenmodificacionesmsprofundas,incluyendoelclivajey 290

laadicincovalentedecarbohidratosolpidos,quesoncrticosparalacorrectafuncin
ylocalizacindelasprotenasdentrodelaclula. CHAPERONASYPLEGAMIENTODELASPROTENAS Lasconformacionestridimensionalesdelasprotenasresultandeinteraccionesentrelas cadenas laterales de sus aminocidos. El clsico principio de plegamiento proteico es quetodalainformacinrequeridaparaadoptarlacorrectainformacintridimensional estdadaporlasecuenciadesusaminocidos.Estofueinicialmenteestablecidoporlos experimentos de Anfinsen quien demostr que la RNAsa desnaturalizada puede replegarseinvitroasuconformacinactiva. El plegamiento proteico parece ser as un proceso de autoensamble que no requiere factores celulares adicionales. Estudios ms recientes, sin embargo, han demostrado queestonoesunadescripcinadecuadadelplegamientoproteicodentrodelaclula, mediadoporlasactividadesdeotrasprotenas. Las protenas que facilitan el plegamiento de otras protenas son llamadaschaperonas moleculares. EltrminochaperonasfueoriginalmenteusadoporLaskeyparadescribirunaprotena (nucleoplasmina) que se requiere para el ensamble de histonas y DNA. Las nucleoplasminasseunenalashistonasymedianelensambleennucleosomas,perolas nucleoplasminas no son incorporadas a la estructura final del nucleosoma. Las chaperonasactanascomocatalizadoresquefacilitanelensamblesinformarpartedel complejoensamblado.Estudiossubsecuenteshanextendidoelconceptoincluyendoa lasprotenasquemedianunavariedaddeotrosprocesosdeensamble. Esimportantenotarquelaschaperonasnollevaninformacinadicionalrequeridapara elplegamientodelospolipptidosensucorrectasconformacinespacial. Laschaperonascatalizanelplegamientodelasprotenasasistiendosupropioensamble. Laschaperonasparecenfuncionarunindoseyestabilizandoelpolipptidonoplegadoo parcialmenteplegado. Enausenciadechaperonas,estospolipptidosnoplegadosoincompletamenteplegados 291

soninestablesenelinteriordelaclulafrecuentementeplegndoseincorrectamenteo
agregndoseencomplejosinsolubles. Un buen ejemplo es provisto por las chaperonas que se unen a la cadena naciente cuando an est siendo sintetizada, previniendo el plegamiento incorrecto o agregndoseencomplejosinsolubles. Unbuenejemploesprovistoporlaschaperonasqueseunenalacadenapolipeptdica nacientecuandoanestsiendosintetizado,previniendoelplegamientoincorrectoola agregacin de la porcin aminoterminal antes que la cadena est finalizada. Presumiblemente,estainteraccinesparticularmenteimportanteparaprotenasenlas que el extremo carboxilo (el ltimo en ser sintetizado) es requerido para el correcto plegadodelextremoamino.Entalcaso,launinalaschaperonasestabilizalaporcin amino terminal en una conformacin no plegada hasta que el resto de la cadena polipetdica es sintetizada y completada y pueden plegarse correctamente. Las chaperonas tambin estabilizan las cadenas polipeptdicas no plegadas durante su transporte hacialas organelassubcelularesporejemplo,durantesutransferenciade protenashacialasmitocondriasdesdeelcitosol. Las protenas son transportadas a travs de la membrana mitocondrial en conformacionesparcialmentenoplegadasqueestnestabilizadasporlaschaperonasen elcitosol.Laschaperonasdentrodelasmitocondriasluegofacilitanlatransferenciadela cadenapoliptdicaatravsdelamembranaysusubsecuenteplegamientodentrodelas organelas.Adems,laschaperonasestninvolucradasenelensamble delasprotenas que consisten de mltiples cadenas polipeptdicas en el ensamble de las estructuras macromoleculares(porejemplolanucloplasmina)yenlaregulacindeladegradacin deprotenas. Muchas de las protenas ahora conocidas como chaperonas moleculares, fueron inicialmenteidentificadasheatshockproteins,ungrupodeprotenasexpresadasenlas clulasqueestnsujetasatemperaturaselevadasuotrasformasdeestrsambiental. Las heat shock proteins (abreviadas como Hsp) estn altamente conservadas tanto en clulas procariotas como eucariotas, se cree que estabilizan y facilitan el repliegue de 292

protenasquehansidoparcialmentedesnaturalizadoscomoresultadodelaexposicina
temperaturaselevadas.Sinembargo,muchosmiembrosdelafamiliadelasHspqueson expresadas y tienen funciones esenciales bajo condiciones de crecimiento normales. Estas protenas sirven como chaperonas moleculares que se necesitan para los plegamientos polipetdicos y se transportan bajo condiciones normales as como tambinenclulassujetasalestrsambiental.LasprotenasdechoquetrmicoHsp70y Hsp60 conforman una familia particularmente importante en los patrones e plegamiento proteico tanto en clulas eucariotas como procariotas. Las protenas de ambas familias funcionan unindose a regiones no plegadas durante la traduccin as como tambin durante el transporte de los polipptidos hacia una variedad de compartimentos subcelulares como mitocondrias y el retculo endoplasmtico. Estas protenas unen a cortos segmentos (de 6 a 7 ac.) de polipptidos no plegados, previniendolaagregacin. La familia de las Hsp60 (tambin llamadas chaperoninas) facilitan el plegamiento de protenasensuconformacinnativa.Cadachaperoninaconsistede14subunidadesde aproximadamente 60 da cada una de las cuales estn arregladas en dos anillos que forman una doble rosca. Los polipptidos no plegados son aislados del citosol encapsulados en el interior del cilindro. En este ambiente, proteico aislado el plegamiento se produce mientras la agregacin de segmentos de las cadenas polipeptdicasesprevenidaporsuuninalaschaperoninas.Launindelospolipptidos no plegados a las chaperoninas es una reaccin reversible que est acoplada a la hidrlisisdelATPcomofuentedeenerga.LahidrlisisdelATPconduceasamltiples rondasdeliberacinyreuninderegionesnoplegadasalaschaperoninas,permitiendo alospolipptidosplegarsegradualmenteenlaconformacincorrecta. En algunos casos, miembros de las familias Hsp60 y 70 se ha encontrado que actan conjuntamente en forma secuencial durante el transporte de protenas hacia las mitocondriasyduranteelplegamientodesntesisrecinsintetizadasenE.coli.Primero unachaperonaHsp70estabilizacadenaspolipeptdicasnacienteshastaquesecompleta la sntesisdelaprotena.Lacadenapolipeptdicanoplegadasetransfiereluegoauna chaperonina Hsp60, en la que tiene lugar el plegamiento proteico, produciendo una 293

correctamenteplegadaconsuconformacintridimensionalfuncional.Losmiembrosde
las familias Hsp70 y 60 se encuentran en el citosol y las organelas subcelulares mitocondrias)declulaseucariotasascomotambinenbacterias.Laaccinsecuencial de Hsp70 y 60 parecen representar un patrn general de plegamiento proteico. Una alternativa involucra la accin secuencial de Hsp70 y Hsp90 aunque an no se comprendebienelroldestaltima. ENZIMASYPLEGAMIENTOPROTEICO Adems de las chaperonas que facilitan el plegamiento proteico y estabilizan los intermediariosparcialmenteplegados,lasclulasposeenalmenosdostiposdeenzimas que catalizan el plegamiento proteico por ruptura de las uniones covalentes y su remodelacin. La formacin de puentes disulfuro entre residuos cistena es importante en la estabilizacindeestructurasplegadasdemuchasprotenas. Laproteindisulfideisomerasecatalizalarupturayremodelacindeestospuentes.Para protenas que contienen mltiples residuos cistena, la PDI juega un rol clave promoviendo intercambios entre disulfuros apareados, permitiendo a las protenas alcanzar el patrn de puentes disulfuro que es compatible con su conformacin establementeplegada. Lospuentesdisulfuroestngeneralmenterestringidosaprotenassecrecinyaalgunas protenas de membrana debido a que el citosol contiene agentes reductores que mantienelosresiduosdecistenaensuformareducida,previniendoaslaformacinde puentes disulfuro SS. En las clulas eucariotas los puentes disulfuro se forman el retculoendoplasmticoenelquesemantieneelambienteoxidante.Consistenteconel rol de los puentes disulfuro en la estabilizacin de las protenas de secrecin en diferentestiposcelulares. La segunda enzima que juega un rol en el plegamiento de protenas cataliza la isomerizacindepuentespeptdicasqueinvolucraresiduosProlina. La Prolina es un aminocido inusual en el que el equilibrio entre la conformacin 294

peptdica trans o cis de la unin peptdica que precede los residuos de Prolina est
levemente en favor de la forma trans. La isomerizacin entre las configuraciones cis y trans de las uniones peptdicas prolil, que podra de otra forma constituir el paso limitante en el plegamiento proteico es catalizado por la enzima peptidil prolil isomerasa.Estaenzimaestampliamentedistribuidatantoenclulasprocariotascomo eucariotas y puede catalizar el replegamiento de al menos algunas protenas. Sin embargo,susubstratofisiolgicamenteimportanteysuroldentrodelasclulasnoha sidoandeterminado. CLIVAJEPROTEICO El clivaje de las cadenas polipeptdicas (protelisis) es un paso importante en la maduracin de muchas protenas. Un ejemplo simple es la remocin del iniciador metionina de la regin amino de muchos polipeptdicos que ocurre rpidamente despusquelaporcinaminoterminaldemuchospolipptidoscrecientesemergendel ribosoma.Los gruposqumicos adicionales talescomo los grupos acetilo o lascadenas decidosgrasos,sonagregadosluegoalosresiduosaminoterminales. Las modificaciones proteolticas de la regin amino terminal puede jugar un rol importante en la translocacin de muchas protenas a travs de las membranas, incluyendo protenas de secrecin tanto en bacterias como en eucariotas, as como protenas destinadas a la membrana plasmtica, a lisosomas, mitocondrias y cloroplastos de clulas eucariotas. Estas protenas son dirigidas hacia su objetivo por secuencias amino terminales. Que son removidos por clivaje proteoltico cuando la protena atraviesa la membrana. Por ejemplo, las secuencias seal amino terminales, usualmente de aproximadamente 20 ac. (usualmente hidrofbicos) se dirige hacia la membrana plasmtica como protenas secretorias en bacterias o hacia el RE en eucariotas,mientraslatraduccinprogresa. La secuencia seal se inserta en la membrana conforme emerge de los ribosomas. El resto de la cadena polipeptdica pasa a travs del canal de la membrana mientras se producelatraduccin.Lasecuenciasealesluegoclivadaporproteasasespecficasdela membrana(peptidasasseal)ylaprotenamaduraesliberada.Enclulaseucariotasla translocacinde cadenaspolipeptdicascrecienteshacia el REesel primer pasoenlas 295

protenas para secrecin, para la incorporacin a membrana o en lisosomas. En otras
instancias importantes de clivaje proteoltico se forman enzimas activas u hormonas activas(porejemploinsulina,ANF,etc.) Esinteresantenotarquelasprotenassemuchosvirusanimalessederivandelclivajede grandesprecursores.UnejemploparticularmenteimportanteloconstituyeelHIV. En la replicacin del HIV una proteasa codificada por el virus cliva polipptidos precursoresqueformanlasprotenasvirales.Debidoasurolclaveenlareplicacinviral laproteasaHIV(ademasdesurolcomotranscriptasareversa)esunblancoimportante en el desarrollo de drogas a usar en el tratamiento del AIDS. Por ejemplo, los inhibidoeres de proteasas estn entre los agentes ms efectivos disponibles para el tratamientodeestaenfermedad. GLICOSILACIN Muchas protenas, particularmente en las clulas eucariotas, son modificadas por la adicin de carbohidratos, un proceso llamado glicosilacin. Las protenas glicosiladas usualmente son secretadas o localizadas en la superficie celular, aunque algunas protenasdelamembrananuclearydelcitosolestnglicosiladas. Las porciones de H de C. de las glicoprotenas juegan importantes roles en el plegamientodelasprotenasenelRE,eneltargetingdeprotenasparalaliberacide stas al compartimento intracelular apropiado y como sitios de reconocimiento en las interaccionesclulaclula. LasglicoprotenassonclasificadascomoNligadasuOligadas,dependiendodelsitiodel ligamiento de la cadena lateral de carbohidratos. En las glicoprotenas Oligadas, el tomodeoxgenolateraldeserinaotreoninasonelsitiodeunindeloscarbohidratos. Los azcares, que se unen directamente a estas posiciones son usualmente: N acetilglucosaminaoNacetilgalactosaminarespectivamente. Muchas glicoprotenas en clulas en clulas eucariotas se destinan tanto para la secrecin como para la incorporacin en la membrana plasmtica. Estas protenas usualmenteson transferidas al RE antes que la traduccin sehaya completado (conel 296

clivaje de una secuencia seal) mientras su traduccin se encuentra en progreso. La
glicosilacintambin seiniciaenelRE antes quelatraduccinsehayacompletado. El primerpasoeslatransferenciadeunoligosacridocomnconsistiendode14residuos deazcares:2Nacetilglucosamina,3glucosasy9manosas,aunresiduoasparagina.El oligosacrido es ensamblado dentro del retculo endoplasmtico en un transportador lipdico (dolicol phosphate). Esto es luego transferido como una unidad intacta a una asparagina aceptora (Asp) dentro de la secuencia Asp_X_Thr, donde X es todo aminocidodistintodeProlina.EnelprocesamientosiguienteeloligosacridoNligado es luego modificado en el aparato de Golgi, al que son transferidos las glicoprotenas desde el RE. Estas modificaciones incluyen tanto la remocin y adicin de residuos carbohidratoconformelasglicoprotenassontransportadasalGolgi.Losoligosacridos Nligadosdediferentesglicoprotenassonprocesadascondistintoalcance,dependiendo tanto de las enzimas presentes en diferentes clulas y a la accesibilidad de los oligosacridos a las enzimas que catalizan su modificacin. Las glicoprotenas con oligosacridos no tienen nuevos azcares agregados a ellos en el Golgi. Los oligosacridos relativamente simples de estas glicoprotenas se denominan oligosacridos ricos en manosa, debido a la alta proporcin de ste azcar, similar al oligosacrido comn originalmente en el RE. En contraste, las glicoprotenas con oligosacridos accesibles son procesados mas extensivamente, resultando en la formacindeunavariedaddeoligosacridoscomplejos. Los oligosacridos Oligados son tambin procesados dentro del aparato de Golgi. En contraste,losoligosacridosOligadossonformadosporlaadicindeunazcarporvez yusualmenteconsistedeslounospocosresiduos.Muchasprotenascitoplamticasy nucleares, incluyendo una variedad de factores de transcripcin, tambin son modificados por la adicin de residuos simples de Nacetilglucosamina Oligados, catalizadosporunsistemaenzimticodiferente.Sinembargo,elroldeloscarbohidratos en la funcin de estas glicoprotenas citoplasmticas y nucleares no son an comprendidas. A NCLAJEDE L PIDOS Algunas protenas en clulas eucariotas son modificadas por el anclaje de lpidos a la 297

cadena polipeptdica. Tales modificaciones, frecuentemente permiten anclar las
protenasalamembranaplasmticaconlaqueloslpidoshidrofbicossoncapacesde interactuar.Enlasclulaseucarioticasexistentrestiposdiferentesdeadicioneslipdicas: Nmiristoilacin,prenilacinypalmitoilacin.Estasprotenasestnasociadasconlafase citoslicadelaMP.Uncuartotipodemodificacin,laadicindeglicolpidos,juegaun rol importante en el anclaje de algunas protenas de la superficie celular a la fase extracelulardelasmembranasplasmticas. En algunas protenas un cido graso es anclado a la porcin amino de la cadena polipeptdicacrecientedurantelatraduccin.Enesteproceso,llamadoNmiristoilacin, el c. mirstico (un cido graso de 14 carbonos) es anclado a un residuo glicina N terminal (Fig.). La glicina es usualmente el segundo aminocido incorporado en una cadena polipeptdica; el iniciador metionina es removido por protelisis antes de la adicin del cido graso. Muchas protenas que son modificadas por Nmiristoilacin estnasociadasconlafaseinternadelamembranaplasmtica,yelroldelcidograso enestaasociacinhasidoclaramentedemostradaporanlisisdeprotenasmutantesen elcuallaglicinaNterminalescambiadaporunaalanina.Estasubstitucinprevienela miristoilacin y bloquea la funcin de las protenas mutantes inhibiendo su asociacin conlamembrana. Loslpidospuedentambinserancladosalascadenaslateralesdelosresiduoscistena, treonina, y serina. Un ejemplo importante de este tipo de modificacin es la prenilacin, en la que tipos especficos de lpidos (grupos prenilo) son anclados a los tomosdeazufredelacadenalateraldelosresiduosdecistenalocalizadoscercadela porcin cterminal de la cadena polipeptdica. Muchas protenas asociadas a la membranaplasmticainvolucradasenelcontroldelcrecimientoydiferenciacincelular son modificadas de esta forma, incluyendo la protena del oncogene Ras que es la responsabledelcrecimientoincontrolabledemuchostiposdecncer.Laprenilacinde estasprotenasocurreentrespasos,Primeroelgrupopreniloesagregadoaunacistena localizada tres aminocidos del extremo carboxilo terminal de la cadena polipeptdica. Los grupos prenilo agregados en esta reaccin son tanto farnesilo (de 15 Carbonos) o geranilgeranilode20tomosdecarbono.Losaminocidosquelesiguenalacistenason
298

luego removidos quedando la cistena en la porcin carboxilo terminal. Finalmente un
grupometiloesagregadoenelgrupocarboxilodelresiduocistenaCterminal. Elsignificadobiolgicodelaprenilacinestindicadoporelhechoquelamutacindela cistena crtica, bloquea la asociacin a la membrana y la funcin de la protena Ras. Debido a que la farnestilacin es una modificacin relativamente rara de las protenas celulares, se ha estimulado la posibilidad que inhibiendo la enzima clave (farnesil transferasa)podraproveerdeunaherramientavaliosaeneldesarrollodedrogaspara eltratamientodecnceresqueinvolucrenalasprotenasRas. Enuntercertipodemodificacineslapalotoilacin,enlaqueelcidopalmtico(de16 carbonosesagregadoalossulfurosdelascadenaslateralesdelosresiduosdecistena internos.Similaralosdosprocesosdescriptosanteriormente,lapalmitoilacintieneuna rol importante en la asociacin de algunas protenas con la fase citoslica de la membranaplasmtica. Finalmente,loslpidosunidosaoligosacridos(glucolpidos)sonagregadosalosgrupos carboxiloterminalesdealgunasprotenas,dondesirvencomoanclajeparafijar las
protenasalafaseexternadelamembranaplasmtica.Debidoaquelosglucolpidosen general contienen fosfatidilinositol usualmente se los denomina glucosilfosfatidil inositoloancladoresGPI,(Fig.X).LasporcionesdeoligosacridosdelosancladoresGPI sonligadasalosgruposcarboxiloterminalesdelascadenaspolipeptdicas.Lacabezadel grupoinositoldelfosfatidilinositolestaligadoaloligosacrido,aselcarbohidratosirve comounpuenteentrelaprotenayelcidograsodelfosfolpido.LosancladoresGPIson sintetizadosyagregadosalasprotenascomounidadespreensambladasdentrodelRE. Suadicinvaacompaadaposelclivajedeunpptidodeaproximadamente20ac.De laregincarboxiloterminaldelacadenapolipeptdica.Laprotenamodificadaesluego transportadahastalasuperficiedelaclula,dondeloscidosgrasosdelosancladores GPIactanmediandosuanclajealamembranaplasmtica. REGULACINDELAFUNCINDELASPROTENAS Unafuncincrticadelasprotenasessuactividadcomoenzimas,laquecatalizancasi todas las reacciones biolgicas. LA regulacin de la actividad enzimtica juega un rol 299

claveen el gobierno del comportamientocelular.Estoserealizaenparte a nivelde la
expresin gnica que determina la cantidad de toda enzima sintetizada por la clula. Otro nivel de control se obtiene por regulacin de la funcin de las protenas que permite a la clula regular no slo la cantidad sino tambin la actividad de sus constituyentes proteicos. La regulacin de las actividades de algunas de las protenas involucradas en la transcripcin y traduccin ha sido previamente discutida, se discutirn a continuacin los tres mecanismos generales por los que se controla la actividaddelasprotenascelulares. Regulacinporpequeasmolculas La mayoradelasenzimas son controladas porcambios en su conformacin, que a la postrealteransuactividadcataltica.Enmuchoscasostalescambiosconformacionales resultandelaunindepequeasmolculastalescomoac.onucletidos,queregulan laactividadenzimtica.Estetipoderegulacincomnmenteesresponsabledelcontrol delasvasmetablicasporinhibicindelfeedback.Porejemplo,losproductosfinalesde muchas vas biosintticas, (por ej., aminocidos) inhiben las enzimas que catalizan el primer paso en su sntesis, asegurando as, un suministro adecuado del producto mientrasseprevienelasntesisdelascantidadesexcedentarias.(Fig.X). Lainhibicindelfeedbackesunejemploderegulacinalostricaenelqueunamolcula seuneaunsitioenzimticodiferentedelsitiocataltico(allo=otro;steric=sitio).La unindeunamolculareguladoratalalteralaconformacindelaprotenacambiando asimismolaformadelsitiocataltico,afectandosuactividad(Fig.X).Unodelasenzimas alostricas mejor estudiadas es la aspartato transcarbamilasa, que cataliza el primer pasodelasntesisdelosnucletidospirimidnicosyesreguladaporinhibicinfeedback por citidina trifosfato (CTP). La aspartato transcarbamilasa consiste de 12 cadenas polipeptdicas diferentes: seis subunidades catalticas y seis regulatorias. La unin de CTP a la subunidad reguladora induce un rearreglo mayor de las posiciones de las subunidades,inhibiendoasimismolaactividadenzimtica(Fig.). Muchos factores de transcripcin son tambin regulados por la unin de pequeas molculas.Porejemplo,launindelactosaounmetabolitoalrepresorE.colilacinduce 300

cambios conformacionales que previenen la unin al DNA. En clulas eucariotas, las
hormonas esteroides controlan la expresin gnica de forma similar por unin a protenastranscripcionalesregulatorias. La regulacin de los factores de traduccin como EFTu por unin de GTP ilustra otro mecanismocomnporelquesecontrolalaactividaddelasprotenasintracelulares.En este caso, las formas unidas a GTP son inactivas. Muchas protenas celulares son reguladasenformasimilarporunindeGTPoGDP.Estasprotenasincluyenlaprotena deloncogenRas,quehasidomuyestudiadoporsurolenelcontroldelaproliferacin celularyenelcncerhumano.ElanlisiscristalogrficoderayosXdeestasprotenases particularmenteinteresanteyaquerevelasutilesdiferenciasconformacionalesentrelas formas inactivas unidas a GDP y las activas unidas a GTP (Fig. ). Estas pequeas diferenciasenlaconformacinproteicadeterminansiRas(enlaformaactivaunidaa GTP) puede interactuar con su molcula target, actuando en el sealamiento de la divisincelular.Laimportanciadeesassutilesdiferenciasenlaconformacinproteicaes dramticamente ilustrada por el hecho que la mutacin en el gen ras contribuye al desarrollo de cerca de 15% de los cnceres humanos. Tales mutaciones alteran la estructuradelasprotenasRasdetalformaqueellastrabanlaconformacinGTPunida ylasealdeladivisincelular,conduciendoalcrecimientodescontroladodelasclulas cancerosas. En contraste, las protenas Ras normales alternan entre la las conformacionesunidasaGDPyGTP,deformatalqueslosonactivasporhormonasy factores de crecimiento que normalmente controlan la proliferacin celular en organismosmulticelulares. Fosforilacindeprotenas Losejemplosdiscutidosenlaseccinprecedenteinvolucranasociacionesnocovalentes de protenas con pequeas molculas activadoras o inhibidoras. Ya que no forman uniones covalentes, la unin de estas molculas reguladoras a las protenas es reversible,permitiendoalaclulapararesponderrpidamenteacambiosambientales. La actividad de muchas protenas, sin embargo, est tambin regulada por modificaciones covalentes. Un ejemplo de este tipo de regulacin es la activacin de algunas enzimas por clivaje proteoltico de los precursores inactivos. Como se not 301

previamente, las enzimas digestivas y las protenas de coagulacin sangunea son
reguladas por este mecanismo. Aunque la protelisis es irreversible, sin embargo, provee de un medio de control la actividad enzimtica ms que las protenas el encendido y apagado en respuesta de cambios en el ambiente. En contraste, otras modificacionescovalentesparticularmentelafosforilacinsonreversiblesyfuncionan como lo hace la regulacin alostrica. Tanto para activar como revertir una amplia variedaddeprotenascelularesenrespuestaasealesambientales. La fosforilacin de protenas es catalizada por protena quinasas, la mayora de las cualestransfierengruposfosfatodelATPalosgruposhidroxilodelascadenaslaterales delosresiduosserina,treoninaytirosina(Fig.).Lamayoradelasprotenaquinasas fosforilantantoresiduosserinaytreoninaotirosina.Sellamanprotenaserina/treonina quinasasoprotenatirosinaquinasas,respectivamente.Lafosforilacindelasprotenas esrevertidaporlasfosfatasasdeprotenas,quecatalizanlahidrlisisdelosresiduosde aminocidos fosforilados. Similar a las protenas cinasas, la mayora de las protena fosfatasassonespecficastantoparaserinacomoparatreoninaoparatirosina,aunque algunasfosfatasasdeprotenasreconocenlostresfosfoaminocidos. Laaccincombinadadelasprotenascinasasylasfosfatasasprotenasactanmediando lafosforilacinreversibledelamayoradelasprotenascelulares.Frecuentemente,las protenas quinasas funcionan como componentes de las vas de traduccin de seales enlascualesunaquinasaactivaaunasegundaquinasa,queasuvezactasobreotra quinasa. La accin secuencial de una serie de protena quinasas puede transmitir una seal recibida en la superficie celular para actuar sobre protenas dentro de la clula, resultando en cambios en el comportamiento celular n respuesta a los estmulos ambientales. El prototipo de las acciones de las protenas cinasas proviene de los estudios del metabolismodelglucgenodeEdFisheryEdKrebsen1955.Enlasclulasmusculares las hormona epinefrina (adrenalina) seala la ruptura del glucgeno a glucosa 1 fosfato, proveyendo de energa para el incremento de la actividad muscular. Esta reaccin es catalizada por la enzima glicgeno fosforilasa, que es regulada por una protenaquinasa(figura).Laepinefrinaseuneaunreceptordelasuperficiecelularque 302

disparalaconversindeATPenAMPcqueseuneyactivaunaprotenaquinasallamada
protena quinasa dependiente de AMPc. Esta quinasa fosforila y activa una segunda protena quinasa llamada fosforilasa quinasa. Esta a su vez activa la glucgeno fosforilasa,llevandoalaproduccindeglucgeno.Lafosforilacinactivantedeambas fosforilasa quinasa y glucgeno fosforilasa puede ser revertida por fosfatasas especficas,removindoseaselestmuloinicial(epinefrina)einhibiendolarupturadel glucgeno. El patrn de sealamiento que conduce a la activacin de la glicgeno fosforilasa es iniciadoporlaunindepequeasmolculasalasuperficiecelularalasuperficiecelular laepinefrinauniendoasureceptoryelAMPcunealaprotenadependientedeAMPc. La seal es luego transmitida a su target intracelular por la accin secuencial de protenasquinasas.Unpatrndesealamientosimilarenelquelasprotenasquinasasy lasfosfatasasjueganunrolcentral,estninvolucradasenlaregulacindecasitodoslos comportamientos de las clulas eucariticas. Aberraciones en este patrn, frecuentemente involucran a anormalidades de protena quinasas son tambin responsables de muchas enfermedades asociadas con la regulacin impropia del crecimientoydiferenciacincelular,particularmenteeldesarrollodelcncer. InteraccionesProtenaProtena Muchas protenas consisten de mltiples subunidades, cada una de las cuales es una cadenapolipeptdicaindependiente.Enalgunasprotenaslassubunidadessonidnticas, otras protenas estn compuestas por dos o ms polipptidos diferentes. En ambos casos las interacciones entre las cadenas polipeptdicas son importantes en la regulacindelaactividadproteica.Laimportanciadeestasinteraccionesesevidenteen muchas enzimas alostricas, tales como la aspartato transcarbamilasa, en la que el bindingdeunamolculareguladoraalteralaconformacindelaprotenacambiandolas interaccionesentresubunidades. Muchas otras enzimas son similarmente reguladas por la interaccin protena protena. Un buen ejemplo la protena quinasa dependiente del AMPc que est compuesta por dos subunidades regulatorias y dos subunidades catalticas. En este estado,laenzimaesinactiva;lasubunidadreguladorainhibelaactividadenzimticade 303

subunidad cataltica. La enzima es activada por AMPc, que se une a la subunidad la
reguladora e induce cambios conformacionales y conducen a la disociacin del complejo; las subunidades catalticas libres son enzimticamente, protenas quinasas activas.ElAMPc actaascomounreguladoralostricoalterandolasinteraccionesde protenaprotena. Lasprotenasreguladorastranscripcionalesconstituyenotroejemploimportantedelas interacciones protena protena. Muchos factores de transcripcin de eucariotas funcionancomoactivadoresorepresoresvainteraccionesproteicasconcomponentes de la maquinaria general de transcripcin. Las interacciones protena protena que pueden ser ellas mismas reguladas por la unin de pequeas molculas y la fosforilacin,jueganrolescrticosenelcontroldiferentesaspectosdelcomportamiento celular.
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CAPTULO DUODCIMO:
El Ciclo Celular
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CicloCelular
Laprogresindelasclulasatravsdelciclodedivisinesreguladaporsealesinternas quecoordinanymonitoreanvariosprocesosquetienenlugardurantediferentesfases delciclocelular. Unejemplodelaregulacindelcicloporseales extracelularesloproveeelefectode losfactoresdecrecimientoenlaproliferacindelasclulasanimales. Adems,diferentesprocesoscelularescomoelcrecimiento,lareplicacindelADNyla mitosisdebensercoordinadosdurantelaprogresindelciclocelular. Estoocurreporunaseriedepuntosdecontrolqueregulanelprogresoatravsdevarias fasesdelciclocelular. EnmuchostiposcelularesunpuntoregulatoriodelciclocelularocurrealfinaldelG1y controla la progresin desde G1 a S. Este punto regulatorio fue primero definido por estudios en Saccaromyces cerevisiae) donde se lo denomin: START. Una vez que las clulas hanpasadoel punto START, estnconminadas a entrar enla fase S y sufrir un ciclodedivisincelular.Sinembargo,elpasajeatravsdelpuntoSTARTesunevento altamente regulado en el ciclo celular de levaduras, controlado por seales externas comoladisponibilidaddenutrientes,ascomoporeltamaocelularporejemplosilas levaduras son sometidas a una privacin de nutrientes, arrestan su ciclo celular en el puntoSTARTyentranenunestadodequiescencia.As,elpuntoSTARTrepresentaun puntodedecisinenelquelacluladeterminasihaysuficientesnutrientesdisponibles parasoportarlaprogresinatravsdelciclodedivisin. Los factores polipeptdicos que sealizan el acoplamiento de las levaduras tambin arrestan el ciclo en el punto START. Permitiendo que las clulas haploides se fusionen conotrasenlugardeentrarenlafaseS. Ademsdeactuarcomounpuntodemonitoreodesealesextracelulares,STARTesel punto en el cual el crecimiento celular es coordinado con la replicacin del ADN y la divisincelular.
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Laimportanciadeestaregulacinesparticularmenteevidente,enlevadurasgemantes
en las que se producen clulas hijas de tamaos muy diferentes, una clula madre de grantamaoyunaclulahijapequea.Paramanteneruntamaoconstante,laclula hijadebecrecermsquelaclulamadreantesdedividirseellamisma.As,eltamao celular debe ser monitoreado para coordinar la dimensin celular as como el crecimiento,conotroseventosdelciclocelular. Estaregulacinsellevaacaboporunmecanismodecontrolquerequierequecadauna de las clulas alcance un tamao mnimo antes de pasar el punto START. En consecuencia,laclulahijamspequeaconsumemstiempoenG1ydebecrecerms quelaclulamadre. Laproliferacindelamayoradelasclulasanimalesesreguladadeunmodosimilaren la fase G1 del ciclo celular. En particular, un punto de decisin en la fase G1 tarda denominado punto de restriccin en las clulas animales, funciona anlogamente al puntoSTARTdelaslevaduras.Sinembargo,encontrasteconlaslevaduras,elpasajede las clulas animales a travs del ciclo es regulado por factores de crecimiento extracelulares que sealizan la proliferacin celular ms que por la disponibilidad de nutrientes. En presencia de factores de crecimiento adecuados, las clulas pasan el punto de restriccin y entran en la fase S y el resto del ciclo. Si no hay factores de crecimientoenG1laprogresinatravsdelciclosedetieneenelpuntoderestriccin, llamadoG0enelquepuedenpermanecerporlargosperodosdetiemposinproliferar. Las clulas en G0 son metablicamente activas, aunque su crecimiento cesa y poseen unatasareducidadesntesisdeprotenas. Por ejemplo los fibroblastos de la piel se encuentran en estado G0 hasta que son estimuladosadividirsecuandosonrequeridosparareparareldaoproducidoporuna herida. La proliferacin de estas clulas es disparada por factores de crecimiento derivados de las plaquetas (PDGF), los que se liberan de las plaquetas sanguneas durantelacoagulacinysealizanlaproliferacincelulardefibroblastosenlavecindad deltejidoinjuriado. ApesardequelamayoradelasclulassonreguladasenG1,algunoscicloscelularesson 307

reguladosenG2.EsteeselcasodeSchizosaccaromycespombequeencontrasteconS.
cerevisiae,suciclocelularesreguladoprincipalmenteenG2controlandolatransicinde G2 a M, que es el principal punto en el que el se chequea el tamao celular y la disponibilidaddenutrientes. En las clulas animales, el principal ejemplo en el que se realiza el control del ciclo celularenelpuntoG2eseldelosoocitosdevertebrados.EstospermanecenenG2por largos perodos de tiempo (varias dcadas en humanos) hasta que su progresin a la faseMesdisparadaporlaestimulacinhormonal. PuntosdeChequeodelCicloCelular Ademsdeloscontrolesqueregulanlaprogresinenrespuestaaltamaocelularyalas seales extracelulares, como los nutrientes y los factores de crecimiento, los eventos quetienenlugardurantelosdiferentesestadiosdebensercoordinadosunosconotros de tal forma que ocurran en el orden apropiado. Por ejemplo resulta crtico que las clulas no comiencen la mitosis hasta que la replicacin del genoma no se haya completado. Siestoocurriese,podra darseunadivisincelular catastrfica,enlacul las clulas hijas fallan en heredar copias de completas del material gentico. En la mayora de las clulas, esta coordinacin entre diferentes fases de del ciclo celular dependedeunsistemadechequeoycontrolesdefeedbackqueprevienenlaentradade laclulaenlasiguientefasedelciclocelular,siloseventosdelafaseprecedentenose hancompletado. Variospuntosdechequeoaseguranqueloscromosomasdaadosonoreplicadospasen alasclulashijas.UnodelospuntosdechequeomasdefinidosocurreenG2ypreviene la iniciacin de mitosis hasta que la replicacin del ADN se completa. Este punto de chequeo en G2 realiza el sensado del ADN no replicado, el cual genera una seal que lleva al arresto del ciclo celular. La operacin del punto de chequeo en G2 previene la iniciacindelafaseM,porloquelasclulaspermanecenenesteestadiohastaqueel genomasereplicacompletamente.Sloluegoseremuevelainhibicin,permitiendoala clula iniciar la mitosis y distribuir los cromosomas completamente replicados a las clulashijas. 308

Laprogresinatravsdelciclocelularestambinarrestadaenelpuntodechequeoen
G2,enrespuestaaldaocelular,comoelqueporejemploocurreporlairradiacin.Este arresto permite a las clulas que el ADN sea reparado. Los estudios de levaduras mutanteshanmostradoqueelpuntodechequeoenG2esinducidotantopordaodel ADNcomoporADNnoreplicado,porloquesededucequelassealesdelarrestodel ciclocelularocurrenporvassimilares. El dao del ADN no slo arresta el ciclo celular en G2, sino que tambin ralentiza la progresinatravsdelafaseSarrestandoalasclulasenlafaseG1.Estearrestopuede permitir la reparacin antes del ingreso a la fase S donde el ADN daado podra ser replicado.Enlasclulasdemamferos,elarrestoenelpuntodechequeoG1esmediado por la accin de una protena conocida como p53 que es rpidamente inducida en respuestaalADNdaado.Unhechoaltamentesugestivoesqueelgenquecodificap53 se encuentra frecuentemente mutado en los cnceres humanos. La prdida de la funcindep53comoresultadodeestamutacinimpideelarrestoenG1enrespuestaal daodelADN,porloqueelADNdaadoesreplicadoypasaalasclulashijasenlugar deserreparado.EsteADNdaadoheredado,resultaenunaumentodelafrecuenciade mutaciones y la inestabilidad del genoma celular, que posteriormente contribuye al desarrollo del cncer. Las mutaciones en el gen p53 son una de las alteraciones ms comunes en cnceres humanos, ilustrando la importancia de la regulacin del ciclo celularenlavidadelosorganismosmulticelulares.Otropuntoimportantedelchequeo quemantienelaintegridaddelgenomaocurrehaciaelfinaldelamitosis.Estechequeo monitoreaelalineamientodeloscromosomasenelhusomittico,asegurandoquese hayandistribuidoenlasclulashijas.Porejemplo,lafalladelalineamientodeunooms cromosomascausaelarrestodelamitosisenmetafase.Comoresultadodeestepunto dechequeo,loscromosomasnoseseparanhastaqueuncomplementodecromosomas completonoseorganizaparasudistribucinencadaclulahija. AcoplamientodelaFaseSalafaseM ElpuntodechequeoenG2previenelainiciacindelamitosis,previoaquesecomplete la fase S, asegurando que el ADN incompletamente replicado no se distribuya en las clulashijas.Igualmenteimportanteesqueseasegurequeelgenomaslosereplique 309

unasolavezporcadaciclocelular.As,unavezqueelADNsehareplicadodebenexistir
mecanismos de control que impidan que una clula en G2 reingrese en la fase S y bloquee la iniciacin de otra rueda de replicacin hasta que se haya producido la mitosis. Ladilucidacininicialdeestemecanismoprovienedelosestudiosdefusindeclulas dePotuRao&RobertJohnsonen1971.Estosinvestigadoresaislaronclulasendistintas fasesdelcicloyluegofusionaronestasclulasformandohbridos. Cuando se fusionaron clulas en G1 clulas en fase S el ncleo de las clulas en G1 comenzasintetizarADN.AssededujoqueelcitoplasmadelaclulaenfaseSdeba contener algn/os factor/es que promovan la sntesis de ADN en el ncleo G1. FusionandolasclulasenG2conclulasenfaseS,elncleoG2esincapazdeiniciarla sntesisdeADNanenpresenciadeuncitoplasmadeunaclulaenfaseS. El mecanismo molecular que restringe la replicacin del ADN celular en la fase G2 involucralaactividaddeunafamiliadeprotenasllamadasMCMseunenalahebrade ADN en conjuncin las protenas del complejo de origen de replicacin (ORC). Las protenas MCM actan como factores de licenciamiento que permiten que se inicie la replicacin. Su unin a ADN es regulada durante el ciclo celular de tal manera que las protenas MCM slo son capaces de unirse a los orgenes de replicacin en la fase G1 permitiendoalasclulasqueelADNserepliquealiniciarseenlafaseS.Unavezquese produce la iniciacin, las protenas MCM son desplazadas del origen de replicacin nuevamentehastaquelaclulapaseatravsdelamitosisyentrealafaseG1otravez enelsiguienteciclocelular. Uno de los desarrollos ms excitantes de la dcada ha sido la dilucidacin de los mecanismos moleculares que controlan la progresin del ciclo celular en eucariotas. Estos progresos en el conocimiento se han basado en la convergencia de resultados obtenidos en organismos tan diversos como levaduras, erizos de mar, ranas y mamferos.Estosestudioshanreveladoqueelciclocelulardetodosloseucariotasest controlado por un conjunto de protenas quinasas muy conservadas que son las responsablesdedispararlasprincipalestransicionesdelciclocelular. 310

MPFunDmerodeCdc2yCiclinas
Tres experimentos diferentes contribuyeron a la identificacin de las molculas claves delaregulacindelciclocelular. 1Estudiossobreoocitosderana: Estos oocitos estn arrestados en la fase G2 de la meiosis, la estimulacin hormonal disparaelingresodestosalafaseM. En 1971, Y. Masui & C. Markert y D. Smith & R. Eckert encontraron que los oocitos arrestados en G2 podan ingresar en M si se les inyectaba citoplasma de oocitos hormonalmente estimulados. As, se concluy que la presencia de un factor citoplasmticopresenteenlos oocitos hormonalmenteestimuladoserael responsable delatransicindeG2aMenlosoocitosnoexpuestos.Estefactorsedenominfactor promotordelamaduracin(MPF).Estudiosposterioresdemostraronqueestefactorno estrestringidoalosoocitossinoquetambinseencuentraenlasclulassomticas.Se concluyelMPFesunfactorgeneralqueactaenlapromocindelatransicindelas clulasdeG2aM. 2estudiossobrelaregulacindelciclocelularenelanlisisgenticodelevaduras: Enladcadadel70,L.Hartwellycolaboradores,trabajandosobrelalevaduragemante, S. cerevisiae identificaron mutantes sensibles a la temperatura deficientes en la progresinatravsdelciclocelular.Estosmutantes(denominadoscdcporcelldivision cicle mutants) se caracterizan por sufrir arresto del crecimiento celular en puntos especficosdelciclo.Porejemplo,elmutantecdc28provocaelarrestodelciclocelular enelpuntoSTARTindicandoquelaprotenaCdc28esrequeridaparapasarestepunto crticoenG1. Una coleccin de mutantes del ciclo celular fue aislada en la levadura de fisin Schizosaccaromyces pombe por P. Nurse y colaboradores. Estos mutantes, incluyen a cdc2quearrestaelciclocelularenG2yG1.DeberecordarsequelatransicindeG2aM eselprincipalpuntoderegulacindelciclocelulardeS.pombe.
311

Estudios posteriores demostraron que cdc28 y cdc2 son genes funcionalmente
homlogos,requeridosparaelpasajeatravsdeSTART(deG1aS)yparalaentradaala mitosis (G2 a M) en ambas especies. Para evitar confusiones de nomenclatura se denominaralaprotenacodificadaporambosgenesCdc2. Los estudios de clonado molecular permitieron determinar que cdc2 codifica una protena quinasa, constituyendo la primera indicacin que la fosforilacin de las protenasactaenlaregulacindelciclocelular. Posteriormente,sedescubriungenrelacionadoacdc2enhumanosloqueconstituy una dramtica demostracin de la conservacin de la actividad de esta protena en la regulacindelciclocelulardeloseucariotas. 3estudiosenembrionesdeerizodemar: Estudios convergentes en la identificacin del MPF y de gentica de levaduras emergieron de los estudios de la sntesis de protenas en embriones de erizo de mar. Luegodelafertilizacinestosembrionessufrenunaseriededivisionescelularesrpidas. Unaseriedeestudios,utilizandoinhibidoresdelasntesisdeprotenasrevelaronquela entradaenlafaseMdelasclulasembrionariasrequierenuevasntesisdeprotenas. En 1983, T. Hunt y colaboradores identificaron dos protenas que exhiben un patrn peridicodeacumulacinydegradacinenembrionesdeerizoyalmejasdemar.Estos autoresdeterminaron quelasprotenas seacumulan eninterfase yluegose degradan rpidamentehaciaelfinaldelamitosis. HuntllamaestasprotenasciclinasAyBsugiriendoquepodraninfluirenlainduccin delamitosis. El sustento directo a esta hiptesis fue provisto por Ruderman et al. (1988) cuando demostraron que la inyeccin de Ciclina A en oocitos de rana era suficiente para dispararlatransicindeG2aM. Estasaproximacionesindependientesconvergieronen1988,conlosexperimentosdeJ. MallerycolaboradoresquienespurificaronelMPFdehuevosderana.Lacaracterizacin 312

moleculardelMPFenvarioslaboratoriosmostrqueestereguladorfilogenticamente
conservado del ciclo celular, est compuesto por dos subunidades claves: la protena quinasa:Cdc2ylaCiclinaB.LaCiclinaBesunasubunidadreguladorarequeridaparala actividadcatalticadelaprotenaquinasaCdc2,loqueresultconsistenteconlanocin de que, la actividad de la MPF, es controlada por la acumulacin y degradacin de la ciclinaBdurantelaprogresindelciclocelular. UnavariedaddeestudioshanconfirmadoesteroldeciclinaBascomolaregulacinde MPFporfosforilacinydesfosforilacindelCdc2.Enlasclulasdemamferos,lasntesis deciclinaBcomienzaenlafaseS.LuegolaciclinaBseacumulayformacomplejoscon Cdc2atravsdelafaseSyG2.Conformeestoscomplejosseforman,Cdc2esfosforilada endosposicionesregulatoriascrticas.Una deestasfosforilacionesocurreentreonina 161 y es requerida para la actividad de protena quinasa de Cdc2. La segunda es una fosforilacin de la tyr15 y la thr14 en vertebrados. La fosforilacin de tyr15 es catalizada por una protena quinasa llamada Wee1, inhibiendo la actividad de Cdc2 y llevandoalaacumulacindelcomplejoCdc2/ciclinaBinactivoatravsdelafaseSyG2. LatransicindeG2aMseproduceporlaactivacindelcomplejoCdc2/ciclinaBcomo resultado de la desfosforilacin de los residuos Tyr15 y Thr14 por una protena fosfatasadenominadaCdc25. Una vez activada la protena quinasa Cdc2 fosforila una variedad de protenas blanco queinicianlafaseM.AdemslaactividaddelaCdc2disparalaprotelisisdelaciclinaB, que ocurre como resultado de la protelisis mediada por ubiquitina. Esta destruccin proteoltica de la ciclina B inactiva luego la Cdc2 y lleva a la clula a la salida de la mitosis,sufrircitocinesisyretornaralainterfase. FamiliadelasCiclinasylasQuinasasDependientesdeCiclinas(CdKs) Luego del descubrimiento de la ciclina B y de la Cdc2 y con la dilucidacin del rol que stascumplen,lasinvestigacionesdemostraronqueellassonpartedeunagranfamilia de molculas de protenas relacionadas, cuyos diferentes miembros controlan la progresinatravsdedistintasfasesdelciclo. Comosevioantes,laCdc2controlaelpasajeatravsdelpuntoSTARTascomotambin 313

laentradaenmitosisdelaslevaduras.LaCdc2tambincontrolaelpasajedeG2aMen
asociacinconotrotipodeciclinasmitticasdeltipoB(Clb1,Clb2,Clb3yClb4).Elpasaje atravsdelpuntoSTARTsinembargo,escontroladoporunaclasediferentedeciclinas denominadasciclinasG1oClns.LuegolasCdc2seasociancondistintostiposdeciclina tipoB(Clb5yClb6),lasqueserequierenparalaprogresinatravsdelafaseS,Estas asociacionesdeCdc2condistintostiposdeciclinasByG1inducenalasCdc2afosforilar distintasprotenassubstratocomolasrequeridasparalaprogresinatravsdelasfases especficasdelciclocelular. Elciclocelulardeeucariotassuperioresescontroladonoslopormltiplesciclinassino tambin por mltiples protenas quinasas relacionadas a las Cdc2. Estas protenas quinasas son conocidas Cdks (Cyclin dependent kinases). Como la Cdc2 fue el primer miembroconocidoseladenomina:Cdk1. Estas mltiples Cdks se asocian con ciclinas especficas conduciendo la progresin a travs de distintos estadios del ciclo celular. Por ejemplo la progresin de G1 a S es reguladoprincipalmenteporCdk2yCdk4(yenalgunasclulasCdk6)enasociacincon lasciclinasDyE.LoscomplejosdeCdk4yCdk6conlasciclinastipoD(D1,D2,D3)juegan unpapelcrticoenlaprogresinatravsdelpuntoderestriccinenG1.LaciclinaEse expresa ms tarde en G1 y los complejos Cdk2 / ciclina E son requeridos para la transicin de G1 a S y la iniciacin de la sntesis de ADN. Los complejos de Cdk2 con ciclinaAfuncionanatravsdelafaseS.Comosehadiscutido,latransicindeG2aMes luegoconducidaporcomplejosdeCdc2conciclinaB. LaactividaddelasCdksdurantelaprogresindelciclocelularesreguladaporalmenos 4 mecanismos moleculares. Como se ha discutido para la Cdc2, el primer nivel de regulacininvolucralaasociacindeCdksconsusciclinasparteners.As,lainformacin decomplejosespecficosCdks/ciclinas,escontroladaporlasntesisydegradacinde ciclinas. Segundo,laactivacindeloscomplejosdeCdk/ciclina,requierendelafosforilacinde un residuotreonina(thr)delaCdk, situadoaproximadamenteenlaposicin 160. Esta fosforilacin activante de Cdk es catalizada por una enzima denominada CAK (Cdk 314

activating kinase) los cuales pueden ellos mismos estar compuestos de un Cdk (Cdk7)
formandocomplejosconlaciclinaH.Estoscomplejosestnasociadosconelfactorde transcripcinTFIIH,elqueesrequeridoparalainiciacindelaARNpolimerasaII.Esto hace pensar que este miembro de la familia de la Cdk podra participar en la transcripcinascomoenlaregulacindelciclocelular. EncontrasteconlafosforilacinactivadaporCAK,eltercermecanismoderegulacinde la Cdk involucra la fosforilacin inhibitoria catalizada por la protena Wee1 de los residuostirosinacercanosalextremoNterminaldelaCdk.Enparticular,tantolaCdc2 como la Cdk2 son inhibidos en vertebrados por la fosforilacin de la tirosina 15 y la treonina 14 adyacente. Estas Cdks son luego activadas por desfosforilacin de estos residuospormiembrosdelasprotenasfosfatasasdelafamiliadelasCdc25.Ademsde laregulacinporfosforilacin,lasCdkspuedensercontroladasporlaunindeprotenas inhibitorias denominadas Cdks inhibitors o CKIs a los complejos Cdk / ciclinas. En los mamferoshay dos familiasdeCKIslasresponsablesde regularlosdistintosmiembros de Cdk / ciclinas. Los miembros de la familia de Cip/Kip regulan todos estados de progresinatravsdelasfasesG1ySinhibiendoloscomplejosCdk2,Cdk4yCdk6con las ciclinas A, D y E. En contraste los miembros de la familia Ink4 CKIs son especficos paraloscomplejosCdk4yCdk6conlasCiclinasD,porloqueelInk4CKIssloregulala progresinatravsdelpuntoderestriccinenG1.EnlevadurasdiferentesCKIsregulan distintos estados en la progresin del ciclo celular por inhibicin especfica de los complejosdeCdk/ciclinas.Elefectocombinadodeestosmltiplesmodosderegulacin Cdkesresponsableporelcontroldelaprogresindelciclocelulartantoenrespuestaa los controles de chequeo como a una gran variedad de estmulos extracelulares que regulanlaproliferacincelular. LoseventosdelaFaseM LafaseMeselperododecambiosmsdramticosdelciclocelular,involucrandouna reorganizacindevirtualmentetodosloscomponentescelulares.Durantelamitosislos cromosomas se condensan, la cubierta nuclear desaparece, el citoesqueleto se reorganiza para formar el huso mittico y los cromosomas se mueven hacia polos opuestos. La segregacin de los cromosomas es luego seguida de la divisin del 315

citoplasma:citocinesis.Alfinaldelamitosiselprocesoesrevertido:loscromosomasse
descondensanylacubiertanuclearsereformaalrededordeloscromosomashijos.El proceso es controlado por la fosforilacin y desfosforilacin reversible de protenas nuclearesresultantesdelaaccindelaprotenaquinasaCdc2queesunreguladorclave delamitosisentodaslasclulaseucariotas. Disolucindelamembrananuclear Enlamayoradelasclulaseldesensambledelamembrananuclearmarcaelcomienzo de la mitosis. Sin embargo, esto no es una caracterstica universal ya que algunos organismoseucariotas unicelulares,comoporejemplolaslevaduras,sufrenlallamada mitosis cerrada en la que la cubierta nuclear permanece intacta. En este caso los cromosomas migran a los polos opuestos del ncleo que luego se divide en dos. Las clulasdeloseucariotassuperiores,sinembargo,usualmentesufrenmitosisabiertaslas quesecaracterizanporlarupturadelacubiertanuclear.Loscromosomashijosmigran luegoalospolosopuestosdelhusomitticoyelnuevoncleoserearmaalrededorde ellos. Eldesensambledelacubiertanuclear,esparaleloaunprocesosimilaralqueleocurreal RE,involucracambiosenlostrescomponentes:lasmembranasnuclearessefragmentan formando vesculas, los complejos de poro se disocian y la lmina nuclear se despolimeriza. La lmina nuclear compuesta de protenas filamentosas denominadas lminas,laqueescatalizadaporlaprotenaquinasaCdc2(yotrasprotenasquinasas). En paralelo con la disolucin de la lmina nuclear la membrana nuclear se fragmenta formandovesculas.LaslminastipoB(1y2)permanecenasociadasalasvesculas,pero las tipo A y C se liberan como dmeros al citosol. Esta diferencia se debe a que las lminas tipo B se encuentran modificadas por la adicin de lpidos (grupos prenilo), mientras que los grupos prenilo Cterminales de las lminas A y C son removidos por protelisisluegodesuincorporacinalalmina. Enlamitosistambinsonfosforiladasvariasprotenasintegralesdemembranalocual es un proceso clave para la formacin de vesculas as como para la disociacin de la
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membrananuclear,loscromosomasylalminanuclear.
Condensacindeloscromosomas
Elotrocambioimportanteenlaestructuradelncleomitticoeslacondensacindelos cromosomas.Lacromatinainterfsicayaestempaquetadaformandolosnucleosomas losqueasuvezformanlasfibrasde30nm,debenempaquetarseunas1.000vecespara formarloscromosomasmitticoscompactos. Elmecanismodelacondensacincromosmicanoestancomprendido.Aunqueseha vistoquelahistonaH1essubstratodelaCdc2yestfosforiladaenlamayorpartedelas clulas mitticas. Sin embargo, experimentos recientes han mostrado que la fosforilacin de la H1 no es un requisito para la condensacin de los cromosomas mitticos. En contraste se ha visto que la fosforilacin de la H3 es requerida para la condensacincromosmicaenlamitosis. Estudios recientes han identificado complejos proteicos llamados condensinas que jueganunrolimportanteenlacondensacin delos cromosomas.Lascondensinasson requeridasparalacondensacindeloscromosomasenextractosdelasclulasmitticas yparecenactuarenvolviendoADNalrededordeellas.Lascondensinassonactivadasy fosforiladas por la protena quinasa Cdc2 proveyendo una unin directa entre la activacindelaCdc2ylacondensacindeloscromosomasmitticos. Estadiosdelamitosis Lamitosiscumplelafuncindedistribuirloscromosomasduplicadosdemodotalque cadanuevaclulaobtenga una dotacincompleta decromosomas. Lacapacidaddela clula para llevar a cabo esta distribucin depende del estado condensado de los cromosomasdurantelamitosisydelensambledemicrotbulosdeldenominadohuso. En losestadios tempranos de la mitosis, cada uno de los cromosomas consiste endos copias idnticas, llamadas cromtides, que se mantienen juntas por sus centrmeros. Simultneamente se organiza el huso, cuya formacin se inicia a partir de los centrosomas. Tanto en las clulas animales como en las vegetales, el entramado del huso est 317

formadoporfibrasqueseextiendendesdelospolosalecuadordelaclula.Otrasfibras
estnunidasalascromtidesalniveldeloscinetocoros,estructurasproteicasasociadas conloscentrmeros.Laprofasefinalizaconladesintegracindelaenvolturanucleary ladesaparicindelosnuclolos. Durante la metafase, los pares de cromtides, dirigidos por las fibras del huso, se mueven hacia el centro de la clula. Al final de la metafase se disponen en el plano ecuatorial.Durantelaanafaseseseparanlascromtideshermanas,ycadacromtide ahorauncromosomaindependientesemueveaunpoloopuesto. Durante la telofase se forma una envoltura nuclear alrededor de cada grupo de cromosomas. El huso comienza a desintegrarse, los cromosomas se desenrollan y una vezmsseextiendenyaparecendifusos. MPFyelprogresodelaMetafase La mitosis involucra cambios dramticos que llevan a una reorganizacin de la clula. EstoseventossoniniciadosporelcomplejoformadoporCdc2/ciclinaB(MPF).Parece ser que la MPF no slo acta como regulador maestro de la fase M, fosforilando y activando otras protenas quinasas corriente abajo sino que acta directamente fosforilando y activando a algunas de las protenas estructurales involucradas en esta reorganizacincelular. Lacondensacindelacromatinainterfsicaesuneventoclaveenmitosisyaqueresulta crtico para permitir a los cromosomas moverse a lo largo del huso mittico sin rompersenienredarse.Duranteestaetapalacromatinanosetranscribe.Apesardela importanciadelevento,noconocemoscompletamentenilaestructuranielmecanismo molecularinvolucradoenlacondensacinmetafsicadeloscromosomas. La Cdc2 fosforila la protena GM130 (Golgi Matrix 130) impidiendo la coalescencia de vesculasylaformacindelaparatodeGolgi.TambinlaCdc2fosforilaalasprotenas asociadas a microtbulos aumentando su inestabilidad. Tambin fosforila una serie de MAPKoaquinasasactivadasporlaMPF. ProtelisiseinactivacindelMPF:anafaseytelofase Unavezquelaclulaharealizadoelchequeodelalineamientodeloscromosomasenla 318

metafase,laclulaprocedeainiciarlaanafaseyacompletarlamitosis.Laprogresinde
metafase a anafase resulta de la protelisis mediada por ubiquitina, de las protenas regulatorias claves. Esta est disparada por la activacin de una ligasa de ubiquitina denominadacomplejopromotordelaanafase.Laactivacindelcomplejopromotorde laanafaseesinducidoporelpropioMPFalcomienzodelamitosisporloquestaesla responsablededispararsupropiadestruccin.Elcomplejopromotordelaanafase,sin embargo, permanece inhibido hasta que la clula pasa el chequeo de la metafase, despus del cual la activacin del sistema de degradacin de la ubiquitina lleva a la transicin de la metafase a la anafase. El comienzo de la anafase resulta de la degradacin de una protena denominada Scc1, un componente de un complejo de protenas denominadas cohesinas que mantienen la conexin entre las cromtidas hermanas mientras estas estn alineadas en la placa metafsica. La degradacin de la Scc1 no es catalizada directamente por el complejo activador de la anafase, sino que stedegradaunaprotenaregulatoriadenominadaPds1.Ladegradacindesa,activa otraprotenallamadaEsp1laquellevaalaprotelisisdelacohesinaScc1queconduce a la separacin de las cromtidas hermanas permitiendo que estas se dirijan hacia los polosopuestosdelhusomittico.Laseparacindeloscromosomasdurantelaanafase procedecomoresultadodevariasprotenamotorasasociadasalhusomittico. Laotraprotenaclavequeresultaserblancodelaubiquitinizacinydegradacinesla ciclina B, la que conduce a la inactivacin de la MPF, la que es requerida para que la clula salga del proceso mittico. Muchos de los cambios que se producen en esta transicin son la reversa de los que ocurren en la entrada en la mitosis inducida por MPF.LainactivacindeMPFtambindisparalacitocinesis. Citocinesis Laculminacindelamitosisesengeneralacompaadaporlacitocinesis.Lacitocinesis usualmente comienza en la anafase, y es disparada por la inactivacin de la MPF coordinandoladivisinnuclearycitoplasmticadelaclula. La citocinesis es la divisin del citoplasma y difiere significativamente en las clulas vegetales y en las animales. En las clulas animales, durante la telofase temprana la membrana comienza a constreirse alrededor de la circunferencia de la clula, en el 319

plano ecuatorial del huso. La constriccin se produce por la contraccin de un anillo
compuestoprincipalmenteporfilamentosdeactinaymiosinaelanillocontrctilque seencuentraunidoalacaracitoplasmticadelamembranacelular.Elanillocontrctil acta en la membrana de la clula materna, a la altura de su lnea media, estrangulndolahastaqueseseparanlasdosclulashijas. En las clulas vegetales, una serie de vesculas divide al citoplasma en la lnea media. Estasvesculas,sonproducidasporloscomplejosdeGolgiycontienenpolisacridos.Las vesculas migran hacia el plano ecuatorial, transportadas por los microtbulos remanentes del huso mittico; finalmente se fusionan y forman una estructura plana limitada por membrana, la placa celular. A medida que se agregan ms vesculas, los bordesdelaplacaencrecimientosefusionanconlamembranadelaclulayseforma unacapadepolisacridosentrelasdosclulashijas,completndosesuseparacin.Esta capaseimpregnaconpectinasyformafinalmentelalaminillamedia.Cadanuevaclula construye,as,supropiaparedcelular,depositandocelulosayotrospolisacridossobre lasuperficieexternadesumembranacelular. Cuandosecompletaladivisincelular,sehanproducidodosclulashijas,mspequeas quelaclulamaterna,peroindistinguiblesdestaencualquierotroaspecto. Apoptosis Enlaformacindeunindividuo,lamuertecelularoapoptosisestanimportantecomola divisincelular.Lamayoradelasclulasfabricanlasprotenasqueformanpartedeuna maquinaria para su propia destruccin. Esta maquinaria letal est compuesta por enzimas capaces de degradar protenas (proteasas) cuya activacin produce, directa o indirectamente,cambioscelularescaractersticos.Lasclulasqueentranenapoptosisse encogen y se separan de sus vecinas; luego las membranas celulares se ondulan y se forman burbujas en su superficie; la cromatina se condensa y los cromosomas se fragmentan; finalmente, las clulas se dividen en numerosas vesculas, los cuerpos apoptticos,quesernengullidasporclulasvecinas. Las enzimas involucradas en el proceso de apoptosis permanecen normalmente inactivas en las clulas, respondiendo a estrictos mecanismos de control. Los 320

mecanismosdecontrolsonlosresponsablesdeactivarlamaquinarialetalenmomentos
particulares de la vida de la clula, respondiendo a seales externas o internas. Cualquier alteracin en estos mecanismos de control puede tener consecuencias nefastasparaelorganismo,creandoestadospatolgicosproducidostantoporlaprdida declulasnormalescomoporlasobrevidadeclulasquedeberanentrarenapoptosis. Cuando unaclulamuere por dao o envenenamiento, proceso denominado necrosis, normalmente se hincha y explota, derramando su contenido en el entorno. Como consecuencia,seproduceunainflamacinquereclutaleucocitos,yquepuedelesionar eltejidonormalquelacircunda.Laapoptosis,adiferenciadelanecrosis,esuntipode muerte activa, que requiere gasto de energa por parte de la clula y es un proceso ordenadoenelquenosedesarrollaunprocesoinflamatorio. Elmecanismoesdiferenteparalasplantassuperiores. ELCONTROLDELAPROLIFERACINCELULARYELCNCER Lacapacidaddeproliferarenformadescontroladaestrelacionadaconlaacumulacin deciertoscambiosenlaclula.Elcncereselresultadodeunaseriedemodificaciones accidentales en el material gentico que trae como consecuencia la alteracin del comportamientonormaldelaclula.Existengenesquecontribuyenaoriginaruncncer los cuales, en sus versiones normales, estn relacionados con el control del crecimiento y la sobrevida de la clula. Entre ellos, los protooncogenes estimulan la proliferacincelularylosgenessupresoresdetumores,lainhiben.Laversinalterada de un protooncogen se denomina oncogen (del griego onkos, tumor) y puede ser responsable, por ejemplo, del aumento desmedido de una protena estimuladora del crecimiento.Porotraparte,laversinalteradadeungensupresorpuederesultarenla prdidadeunaprotenainhibidoradelcrecimientoodeunaprotenaactivadoradela muerteprogramada. En ambos casos, la presencia de estos genes alterados conduce a la proliferacin descontroladadelasclulasqueseencuentraenelorigendetodocncer. Mientras las clulas tumorales quedan restringidas a una masa nica, se dice que el 321

tumoresbenigno.Untumorbenignopuedeproseguirsucrecimientosininvadireltejido
circundante;puedetambindetenersucrecimientooreducirse.Enmuchasocasiones, esposibleremoverloquirrgicamenteylograrasunacuracompleta. Una caracterstica clave de las clulas cancerosas es que, a diferencia de las clulas normales, tienen la capacidad de emigrar, invadir nuevos tejidos y establecer nuevas colonias.Esteprocesosedenominametstasis.Untumorqueadquiereestacapacidad pasaasermalignoycausafrecuentementelamuerte. MEIOSISYREPRODUCCINSEXUAL La reproduccin sexual requiere, en general, de dos progenitores y siempre involucra dos hechos: la fecundacin y la meiosis. La fecundacin es el medio por el cual las dotaciones genticas de ambos progenitores se renen y forman una nueva identidad gentica,ladelaprogenie.Lameiosisesuntipoespecialdedivisinnuclearenelque seredistribuyenloscromosomasyseproducenclulasquetienenunnmerohaploide decromosomas(n).Lafecundacinrestableceelnmerodiploide(2n).Enorganismos conreproduccinsexual,lahaploidayladiploidasesucedenalolargodelosciclosde vida. Cadaunadelasclulashaploidesproducidaspormeiosiscontieneuncomplejonicode cromosomas,debidoalentrecruzamientoyalasegregacinalazardeloscromosomas. Deestamanera,lameiosisesunafuentedevariabilidadenladescendencia. Losacontecimientosquetienenlugardurantelameiosisseasemejanalosdelamitosis, procesodereproduccinenelcualelmaterialgenticoelADNsereparteenpartes igualesentredosnuevasclulashijas.Existenimportantesdiferenciasentrelosprocesos de mitosis y meiosis. Durante la meiosis, cada ncleo diploide se divide dos veces, produciendountotaldecuatroncleos.Sinembargo,loscromosomasseduplicanslo una vez, antes de la primera divisin nuclear. Por lo tanto, cada uno de los cuatro ncleos producidos contiene la mitad del nmero de cromosomas presentes en el ncleo original. A diferencia de lo que ocurre en la meiosis, en la mitosis, luego de la duplicacindeloscromosomas,cadancleodedivideslounavez.Enconsecuencia,el
322

nmerodecromosomassemantieneinvariable.
Debido al fenmeno del entrecruzamiento y al de segregacin al azar de los cromosomas,durantelameiosisserecombinaelmaterialgenticodelosprogenitores, loquenoocurreenlamitosis. La mitosis puede ocurrir en clulas haploides o diploides, mientras que la meiosis ocurresolamenteenclulasconunnmerodiploide(opoliploide)decromosomas. La meiosis ocurre en diferentes momentos del ciclo vital, segn en que especie se produzca.Aunquelameiosisenlosanimalesproducegametos,enlasplantasproduce esporas. Una espora es una clula reproductora haploide que, a diferencia de un gameto,puedeproducirunorganismohaploidesinhabersefusionadopreviamentecon otraclula.Sinembargo,conlaformacindegametosyesporaspormeiosis,seobtiene elmismoresultado:enalgnmomentodelciclovitaldeunorganismoquesereproduce sexualmente,sereduceladotacindiploidedecromosomasaladotacinhaploide. LASFASESDELAMEIOSIS LAMEIOSIS,UNTIPOESPECIALDEDIVISINNUCLEAR Consisteendosdivisionesnuclearessucesivas,designadasconvencionalmentemeiosisI y meiosis II. Durante este proceso de divisin se redistribuyen los cromosomas y se producenclulasquetienenunnmerohaploidedecromosomas(n). Durantelainterfasequeprecedealameiosis,loscromosomasseduplican.Enlaprofase Idelameiosis,loscromosomashomlogosseaparean. Un homlogo de cada par proviene de un progenitor, y el otro homlogo, del otro progenitor. Cada homlogo consta de dos cromtides hermanas idnticas, que se mantienenunidasporelcentrmero.Mientrasloshomlogosestnapareados,ocurre entreelloselentrecruzamiento(crossingover),dandocomoresultadoelintercambiode materialcromosmico. Al finalizar la meiosis I, los cromosomas homlogos se separan. Se producen dos ncleos,cadaunoconunnmerohaploidedecromosomas.Cadacromosoma,asuvez, 323

estformadopordoscromtides.Losncleospuedenpasarporunperododeinterfase,
pero el material cromosmico no se duplica. En la segunda etapa de la meiosis, la meiosisII,lascromtideshermanasdecadacromosomaseseparan,comosifueseuna mitosis. CUANDOLOSDOSNCLEOSSEDIVIDEN,SEFORMANCUATROCLULASHAPLOIDES.A) PARDECROMOSOMAS
HOMLOGOS ANTES DE LA MEIOSIS. UN MIEMBRO DEL PAR PROVIENE DE UN PROGENITOR Y EL OTRO MIEMBRO PROVIENE DE OTRO PROGENITOR.
CADA
CROMOSOMA EST DUPLICADO Y CONTIENE DOS
CROMTIDES HERMANAS. B) DURANTE LA PROFASE I DE LA MEIOSIS, LOS CROMOSOMAS HOMLOGOS SE DISPONEN DE A PARES SE APAREAN. CADA PAR HOMLOGO EST FORMADO POR CUATRO CROMTIDES POR LO QUE TAMBIN SE CONOCE COMO TTRADA (DEL GRIEGO, TETRA QUE SIGNIFICA "CUATRO"). ENTRE LASCROMTIDESDELOSDOSCROMOSOMASHOMLOGOSSEPRODUCEELENTRECRUZAMIENTO,ESDECIR,EL INTERCAMBIODESEGMENTOSCROMOSMICOS. LOSCROMOSOMASHOMLOGOSPERMANECENASOCIADOS EN LOS PUNTOS DE ENTRECRUZAMIENTO O QUIASMAS HASTA EL FINAL DE LA PROFASE I. C) LUEGO, LOS CROMOSOMAS COMIENZAN A SEPARARSE. COMO SE PUEDE VER, LAS CROMTIDES HERMANAS DE CADA HOMLOGO YA NO SON COMPLETAMENTE IDNTICAS; EL ENTRECRUZAMIENTO DA COMO RESULTADO UNA RECOMBINACINDELMATERIALGENTICODELOSDOSHOMLOGOS.REPRESENTACINDELASFASESDELA MEIOSISENUNACLULAVEGETALCUYONMERODIPLOIDEES2N=8(N=4).
HAPLOIDAYDIPLOIDA Cada organismo tiene un nmero de cromosomas caracterstico de su especie. Sin embargo, en la mayora de las plantas y animales conocidos, las clulas sexuales, o gametos, tienen exactamente la mitad del nmero de cromosomas que las clulas somticas del organismo. El nmero de cromosomas de los gametos se conoce como nmero haploide, y en las clulas somticas, como nmero diploide. Las clulas que tienenmsdedosdotacionescromosmicassedenominanpoliploides. Utilizandounanotacinabreviada,elnmerohaploidesedesignacomonyelnmero diploide como 2n. Cuando un espermatozoide fecunda a un vulo, los dos ncleos haploides se fusionan, n+ n=2n, yelnmerodiploide se restablece. La cluladiploide producidaporlafusindedosgametosseconocecomocigoto. Entodacluladiploide,cadacromosomatienesupareja.Estosparesdecromosomasse 324

conocencomopareshomlogos.Losdosseasemejanentamaoyformaytambinen
el tipo de informacin hereditaria que contienen. Uno de los cromosomas homlogos proviene del gameto de uno de los progenitores y su pareja, del gameto del otro progenitor.Despusdelafecundacin,amboshomlogosseencuentranpresentesenel cigoto. En la meiosis, la dotacin cromosmica diploide, que contiene los dos homlogos de cadapar,sereduceaunadotacinhaploide,quecontienesolamenteunhomlogode cadapar.As,lameiosiscompensalosefectosdelafecundacin. ElprocesodeMeiosis
El apareamiento de los cromosomas homlogos despus de la replicacin del ADN no sloesuneventoclavequesubrayalasegregacinmeiticasinoquetambinpermitela recombinacin entre cromosomas de origen paternal y maternal. El apareamiento crtico de cromosomas homlogos tiene lugar durante una extendida profase de la meiosis I que se divide en cinco estadios: leptotene, zigotene, paquitene, diplotene y diacinesis, en base a la morfologa de los cromosomas. La asociacin inicial de los cromosomas homlogos se cree que se produce mediada por apareamiento de bases entre hebras de ADN complementarias durante el estadio leptotene antes que la cromatina se torne altamente condensada. Laestrecha relacin entre los cromosomas homlogos(sinapsis)comienzaduranteelestadiozigotene.Duranteesteestadio,una estructura proteica, tipo cierre relmpago, denominada complejo sinaptonemal se forma a lo largo de los cromosomas apareados. Este complejo, compuesto por un elemento central, los elementos laterales, mantiene los cromosomas homlogos estrechamenteasociadosyalineadosunosconotrosatravsdelestadiopaquitene,que puedepersistirporvariosdas.Larecombinacinentreloscromosomashomlogosse completa durante su asociacin en el estadio paquitene, mantenindose los cromosomas ligados en los sitios en los que se ha producido el entrecruzamiento (crossingover) en las zonas donde se producen los quiasmata. El complejo sinaptonemal desaparece en el estadio diplotene y los cromosomas homlogos se separan a lo largo de su longitud. Sin embargo, ellos permanecen asociados en las regionesderecombinacinoquiasmata,loqueescrticoparasucorrectoalineamiento 325

enlametafase.Enesteestadiocadaparcromosmico (llamadobivalente)consistede
cuatrocromtidasunidasenlosquiasmata.Ladiacinesis,elestadiofinaldelaprofaseI, representa el estadio de transicin a la metafase I durante la cual los cromosomas se tornancompletamentecondensados. EnlametafaseIloscromosomassealineansobreelhuso.Encontrasteconlamitosis, los cinetocoros de las cromtides hermanas se ubican adyacentes unos con otros y orientados en la misma direccin, mientras que los cinetocoros de los cromosomas homlogos apuntan hacia los polos opuestos. Consecuentemente, los microtbulos de cada uno de cada mismo polo se unen a las cromtides hermanas, mientras que los microtbulosdelospolosopuestosseunenacadacromosomahomlogo.LaanafaseI se inicia por disrupcin de los quiasmata por los que se unen los cromosomas homlogos. Los cromosomas homlogos se separan, mientras que las cromtidas hermanas permanecen unidas por sus centrmeros. Al completarse la meiosis I cada clula hija ha adquirido un miembro de cada par homlogo consistiendo de dos cromtidashijas. La meiosis II se inicia inmediatamente despus de la citocinesis, usualmente antes de queloscromosomassehayandescondensadototalmente.EncontrasteconlameiosisI, lameiosisIIrecuerdaaunamitosisnormal.EnlametafaseII,loscromosomassealinean en el huso mittico con microtbulos de los polos opuestos del huso anclados a los cinetocorosdecromtidashermanas.Launindeloscentrmerosdelascromtidasse rompeenlaanafaseIIylascromtidashermanasseseparanhacialospolosopuestos, luegoseproducelacitocinesis,dandoclulashijashaploides. RegulacindelaMeiosisdelosoocitos
Losoocitosdevertebradoshansidomodelosparticularmentetilesparalosestudiosdel ciclocelular,enparteporsutamaoyfcilmanipulacinenellaboratorio.Porejemplo, ya hemos visto que el descubrimiento del MPF y su ulterior purificacin se realiz en estostiposcelularesdeanfibios.Lameiosisdeestosoocitoscomoladeotrasespecies es regulada en dos puntos del ciclo celular y los estudios sobre estos oocitos han ilustradonuevosmecanismosenelcontroldelciclocelular. 326

primer punto de regulacin se da en el estadio de diplotene de la primera divisin El
meitica.Losoocitospuedenpermanecerarrestadosenesteestadioporlargosperodos detiempohasta50aosenhumanos.Durantestearrestodiplotnico,losoocitos descondensan sus cromosomas y su ADN se transcribe activamente. Esta actividad transcripcionalsereflejaenelgrancrecimientodelosoocitosdurantesteperodo.Los oocitoshumanos,porejemplo,sondeaproximadamente100m(msde100vecesel tamaodetpicodeunaclulasomtica).Losoocitosderanasonanmsgrandescon un dimetro de aproximadamente 1 mm. Durante este perodo de crecimiento, los oocitosacumulanmaterialesstockqueincluyelasprotenasylosARNsnecesariospara eldesarrollotempranodelembrin. Losoocitosdelasdistintasespeciesvaranencuantoalmomentoenquesereanudala meiosis y tiene lugar la fertilizacin. En algunos animales los oocitos permanecen arrestadosendiplotenehastaquesonfertilizados,sloluegoprocedenlasmeiosisIyII hastacompletarse. Sinembargo,enlamayoradelosvertebradosincluyendoranas,ratonesyhumanos,la respuestadelameiosissedebeaestmuloshormonalesyprocedeatravsdelameiosis I previo a la fertilizacin. La divisin celular que sigue a la meiosis I es asimtrica y resulta en la produccin de un pequeo cuerpo polar y un oocito de gran tamao. El oocito luego procede a ingresar en la meiosis II, sin haber reformado el ncleo ni descondensadosuscromosomas.Lamayoradelosvertebradosmantienensusoocitos nuevamentearrestadosenlametafaseIIenlaquepermanecenhastaserfertilizados. ComolafaseMdelasclulassomticas,lameiosisdelosoocitosescontroladaporel MPF. La regulacin del MPF durante la meiosis de los oocitos muestra caractersticas nicasquesonlasresponsablesdelarrestodelosoocitosenmetafaseII.Laestimulacin hormonal de los oocitos arrestados en diplotene dispara inicialmente el reinicio de la meiosisporactivacindelMPF,comoocurraenlatransicindeG2aMenlasclulas somticas. Como en la mitosis el MPF induce la condensacin de los cromosomas, la ruptura de la envoltura nuclear y la formacin del huso. La activacin del complejo B activante de la anafase de la meiosis I luego lleva de la metafase a la anafase de la meiosisI,acompaadaporunadisminucinenlaactividaddelMPF.Sinembargo,luego 327

la citocinesis, nuevamente aumenta la actividad de la MPF y permanece en niveles de
elevados mientras el oocito es arrestado en metafase II. Un mecanismo regulatorio nicomantieneaslaactividaddelaMPFduranteelarrestoenmetafaseII,previniendo latransicinmetafaseanafaseIIquesucedenormalmentedurantelaprotelisisdela ciclinaBenlafaseMdelasclulassomticas. ElfactorresponsabledelarrestoenmetafaseIIfueprimeroidentificadoYoshioMasui& Clemet Markert en 1971, en la misma serie de experimentos que llevaron al descubrimientodelMPF.Sinembargo,enestecasoelcitoplasmadeunhuevoarrestado en metafase II se inyect en una clula embrionaria temprana que se encontraba sufriendomitosis.EstainyeccindecitofasedeoocitometafsicoIIcauselarrestode delaclulaembrionaria,enmetafase,indicandoqueelarrestometafsicoerainducido porunfactorcitoplasmticopresenteeneloocitometafsicoII.Debidoaquearrestaba elprocesomitticosedenominfactorcitosttico(CSF). Experimentos ms recientes, han identificado una protena quinasa serinatreonina conocida como Mos, la cual sera un componente esencial del CSF. La Mos es especficamentesintetizadaenlosoocitoseneltiempodefinalizacindelameiosisIy luegoesrequeridatantoparaelincrementodelaactividaddelaMPFduranteelarresto delametafaseII,comodurantelameiosisII.LaaccindelaMosresultadelaactivacin de la quinasa ERKMAP que juega un rol central en la activacin de la clula. Sin embargo,elERKjuegaunroldiferente:estefactoractivaotraprotenaquinasallamada Rsklaqueinhibelaaccindelcomplejopromotordelaanafaseyarrestalameiosisenla metafase II. Los oocitos pueden permanecer arrestados en este punto en ciclo celular meiticoporvariosdasaguardandolafertilizacin. MEIOSISYREPRODUCCINSEXUAL La reproduccin sexual requiere, en general, de dos progenitores y siempre involucra dos hechos: la fecundacin y la meiosis. La fecundacin es el medio por el cual las dotaciones genticas de ambos progenitores se renen y forman una nueva identidad gentica,ladelaprogenie.Lameiosisesuntipoespecialdedivisinnuclearenelque seredistribuyenloscromosomasyseproducenclulasquetienenunnmerohaploide 328

decromosomas(n).Lafecundacinrestableceelnmerodiploide(2n).Enorganismos
conreproduccinsexual,lahaploidayladiploidasesucedenalolargodelosciclosde vida. Cadaunadelasclulashaploidesproducidaspormeiosiscontieneuncomplejonicode cromosomas,debidoalentrecruzamientoyalasegregacinalazardeloscromosomas. Deestamanera,lameiosisesunafuentedevariabilidadenladescendencia. Losacontecimientosquetienenlugardurantelameiosisseasemejanalosdelamitosis, procesodereproduccinenelcualelmaterialgenticoelADNsereparteenpartes igualesentredosnuevasclulashijas.Existenimportantesdiferenciasentrelosprocesos de mitosis y meiosis. Durante la meiosis, cada ncleo diploide se divide dos veces, produciendountotaldecuatroncleos.Sinembargo,loscromosomasseduplicanslo una vez, antes de la primera divisin nuclear. Por lo tanto, cada uno de los cuatro ncleos producidos contiene la mitad del nmero de cromosomas presentes en el ncleo original. A diferencia de lo que ocurre en la meiosis, en la mitosis, luego de la duplicacindeloscromosomas,cadancleodedivideslounavez.Enconsecuencia,el nmerodecromosomassemantieneinvariable. Debido al fenmeno del entrecruzamiento y al de segregacin al azar de los cromosomas,durantelameiosisserecombinaelmaterialgenticodelosprogenitores, loquenoocurreenlamitosis. La mitosis puede ocurrir en clulas haploides o diploides, mientras que la meiosis ocurresolamenteenclulasconunnmerodiploide(opoliploide)decromosomas. La meiosis ocurre en diferentes momentos del ciclo vital, segn en que especie se produzca.Aunquelameiosisenlosanimalesproducegametos,enlasplantasproduce esporas. Una espora es una clula reproductora haploide que, a diferencia de un gameto,puedeproducirunorganismohaploidesinhabersefusionadopreviamentecon otraclula.Sinembargo,conlaformacindegametosyesporaspormeiosis,seobtiene elmismoresultado:enalgnmomentodelciclovitaldeunorganismoquesereproduce sexualmente,sereduceladotacindiploidedecromosomasaladotacinhaploide.
329

IFERENCIASENTREMITOSISYMEIOSIS D
Losacontecimientosquetienenlugardurantelameiosisseasemejanalosdelamitosis, pero una comparacin de los dos procesos muestra un buen nmero de diferencias importantes LAMEIOSISOCURREENDISTINTOSTIPOSDECICLOSVITALES Lameiosis,segnenquespecieseproduzca,ocurreendiferentesmomentosdelciclo vital. En muchos protistas y hongos, tales como el alga Chlamydomonas y el moho Neurospora,ocurreinmediatamentedespusdelafusindelasclulasfecundantes.Las clulas, habitualmente son haploides, y la meiosis restablece el nmero haploide despusdelafecundacin. En las plantas, la fase haploide tpicamente alterna con una fase diploide. En los helechos, por ejemplo, la forma ms comn y conspicua es el individuo diploide, el esporofito. Los esporofitos de los helechos producen esporas por meiosis, que habitualmenteseencuentranenlaparteinferiordesusfrondes(hojas).Estasesporas, quetienenelnmerohaploidedecromosomas,germinanyformanplantasmuchoms pequeas, los gametofitos, que tpicamente consisten slo en unas pocas capas de clulas, todas ellas haploides. Los pequeos gametofitos haploides producen gametos por mitosis;losgametossefusionanyluego desarrollanun nuevoesporofito diploide. Este proceso, en el cual una fase haploide es seguida por una fase diploide y nuevamente por otra haploide, se conoce como alternancia de generaciones. La alternancia de generaciones ocurre en todas las plantas que se reproducen sexualmente,aunquenosiempreenlamismaforma. Los seres humanos tienen el ciclo biolgico tpico de los animales en el cual los individuosdiploidesproducengametoshaploidespormeiosis,inmediatamenteantesde la fecundacin. La fecundacin de los gametos masculino y femenino restablece el nmero diploide de cromosomas. Prcticamente, todo el ciclo vital transcurre en el estadodiploide. 330

BIBLIOGRAFA
1. BiologaCelularyMoleculardeEduardoD.P.DeRobertis.(2000)DeRobertisE. M.F;HibJ.,PonzioR.EditorialElAteneo.13Edicin. 2. FundamentosdeBiologaCelularyMolecular.(1997)DeRobertisE.M.F;HibJ. EditorialElAteneo.3raEdicin. 3. TheCell.AMolecularApproach(2000).CooperG.M.ASMPress;SecondEdition. 4. MolecularBiologyoftheCell(1994)AlbertB.,BrayD.,LewisJ.,RaffM.,Roberts K.,WatsonJ.D.,GarlandPublishingInc.ThirdEdition. 5. MolecularCellBiology.(1999)Lodish,H.;Berk,A.;Zipursky,S.L.;Matsudaira,P.; Baltimore,D.;Darnell,J.E.NewYork:WHFreeman&Co;.4thedicin. 6. Biologa(1993)CurtisH.EditorialPanamericana.Bs.As.6taEdicin. 7. Biochemistry (2002) Berg, Jeremy M.; Tymoczko, John L.; and Stryer, Lubert. NewYork. 8. Genomes.(2002).Brown,T.A..Oxford,UK:BIOSScientificPublishersLtd.2da. Edicin.
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