NATURALEZA MOLECULAR DEL GEN Y DEL GENOMA

Viviana Sabbatino- Andrea Lassalle- Gladys Glvez- Silvia Mrquez

INTRODUCCIN
Desde que el hombre se ha dedicado al cultivo o ha criado animales, resulta obvio que cada semilla o cada vulo fecundado ha de contener un plan o diseo para el desarrollo del organismo. En la poca moderna, la ciencia de la gentica se desarroll alrededor de la premisa de que existen unos elementos invisibles portadores de informacin, denominados genes, que son distribuidos a las clulas hijas cuando la clula madre se divide. Por consiguiente, antes de dividirse una clula debe de hacer una copia de sus genes para poder ceder a sus clulas hijas una coleccin completa de ellos. Los genes de los espermatozoides y de los vulos transmiten la informacin gentica de una generacin a la siguiente. Hacia finales del siglo XIX, los bilogos haban reconocido ya que los transportadores de la informacin hereditaria eran los cromosomas que resultan visibles en el ncleo cuando una clula comienza a dividirse. Pero la evidencia de que es el ADN de estos cromosomas la sustancia de la que estn formados los genes, se obtuvo mucho ms tarde a partir de estudios sobre microorganismos. Hasta entonces se haba credo que slo las protenas presentaban una complejidad conformacional suficiente como para ser portadoras de la informacin gentica. El modelo del ADN propuesto por Watson y Crick en 1953 brind una explicacin satisfactoria de la forma en que pueden operar los procesos relacionados con una molcula depositaria de la informacin gentica: el almacenamiento de informacin, su replicacin, su expresin, la mutacin y la recombinacin. El presente captulo tratar acerca de la naturaleza de los genes y su expresin en dos pasos: la transcripcin y la traduccin; asimismo nos ocuparemos de los mecanismos de regulacin que controlan la expresin gentica.

EL CONCEPTO DE GEN
El genoma es el conjunto de genes de una especie. Pero qu es un gen?. En principio es una unidad informativa discreta, responsable de una caracterstica transmisible, vg. el color de ojos, la textura de la semilla, la longitud del tallo. Este es el concepto mendeliano del gen, acuado en el siglo XIX, cuando an se desconoca su verdadera naturaleza qumica. Esta definicin del gen sigue siendo til en determinado contexto, con la salvedad de que hoy identificamos a dicha unidad de informacin con un fragmento de ADN localizado en determinado lugar de un cromosoma. Una segunda concepcin del gen surgi cuando los genetistas demostraron de forma concluyente que los genes especifican la estructura de las protenas individuales. A principios de los aos 1950 se lleg a conocer la secuencia de aminocidos de la protena insulina y se descubri que cada protena consiste en una secuencia de aminocidos tpica, de la cual, se supuso, dependeran sus propiedades. Al mismo tiempo se correlacionaron mutaciones (alteraciones en la secuencia de nucletidos del ADN) con alteraciones de la secuencia de aminocidos en las protenas. Result evidente que la secuencia del ADN especifica, mediante algn cdigo, la secuencia proteica. Un gen es, entonces, una secuencia de ADN con la informacin necesaria para la sntesis de una protena particular. Dado que el ADN es una molcula relativamente inerte, su informacin se expresa indirectamente, a travs de otras molculas. El ADN dirige la sntesis de protenas y stas determinan las caractersticas fsicas y qumicas de la clula. Como ya adelantramos, las instrucciones genticas contenidas en el ADN se expresan en dos pasos. El primero de ellos, la transcripcin, consiste en la sntesis de ARN a partir del ADN. El ARN contiene toda la informacin de la secuencia de bases del ADN de la que ha sido copiado. El segundo paso de la expresin gentica es la traduccin, momento en el cual el ARN ejecuta las instrucciones recibidas cristalizndolas en la sntesis de una protena especfica. Existen diversos tipos de ARN: el ARNm (mensajero), el ARNr (ribosmico), el ARNt (de transferencia) y los ARN pequeos. De todos ellos, tan slo el ARNm es portador de informacin acerca de la secuencia aminoacdica de una protena; sin embargo todos ellos son transcriptos de ADN. Por lo tanto, resulta necesario revisar la segunda definicin del gen. Hoy se acepta que un gen es una secuencia de ADN transcripta que genera un producto con funcin celular especfica. Cabe aclarar, no obstante, que esta definicin no es completamente satisfactoria, en la medida en que existen regiones reguladoras de los genes, que no se transcriben, y otras regiones (llamadas intrones) que se transcriben pero se eliminan sin cumplir ninguna funcin aparente.

LA ORGANIZACIN DEL GENOMA

Con la excepcin de ciertos virus, que contienen un genoma de ARN, el resto de los genomas utiliza el ADN como depositario de la informacin gentica.

Sin embargo, debemos sealar algunas diferencias significativas en cuanto a la organizacin del genoma en procariontes y eucariontes. En primer lugar, el ADN procarionte se presenta como una nica molcula circular, en tanto el ADN eucarionte es de estructura lineal. Adems las clulas eucariotas poseen usualmente ms de una molcula de ADN en sus ncleos. Cada molcula corresponde a un cromosoma, cuyo nmero es constante para todas las clulas de una misma especie (con excepcin de las gametas). El ADN eucarionte, por otro lado, se halla asociado ntimamente a diferentes protenas, entre las cuales las histonas juegan el papel ms importante en lo que respecta al empaquetamiento del ADN. Esta asociacin a histonas no se verifica en el ADN procarionte, por lo cual se lo ha denominado ADN desnudo. En las clulas eucariotas los cromosomas estn confinados en el compartimiento nuclear, donde tiene lugar la transcripcin, mientras que la traduccin se localiza en el citoplasma; por lo tanto, ambos procesos se encuentran separados espacial y temporalmente. Esto permite que los transcriptos de ARN experimenten en el ncleo un proceso de maduracin previo a la traduccin. En las clulas procariotas, donde no existe la envoltura nuclear, el ADN est en contacto directo con el citosol, y los procesos de transcripcin y traduccin no se hallan separados en espacio ni en tiempo. Los ARNs no son sometidos a modificaciones postranscripcionales. Los eucariontes tienen genomas mucho ms grandes que los procariontes. Aunque el valor C (cantidad haploide de ADN de una especie) es muy variable entre los mismos eucariontes (ver tabla 1), es siempre notablemente mayor que el de los procariontes. No necesariamente un mayor valor C refleja una mayor complejidad gentica (vase en tabla 11.1 valores de Salamandra y Homo sapiens). En los procariontes se da una mxima economa de informacin: en casi todos los casos cada cromosoma contiene una sola copia de cualquier gen particular, y, con excepcin de las secuencias reguladoras y sealadoras, prcticamente se expresa todo el ADN. En cambio, en toda clula eucariota parecera haber un gran exceso de ADN, o por lo menos de ADN cuyas funciones se desconocen por completo. Por ejemplo, la estimacin del ADN innecesario en los seres humanos llega a ser tan elevada como el 95% del genoma.

EL CDIGO GENTICO

Hemos visto que los genes son segmentos de ADN situados en los cromosomas, que se comportan como unidades de transcripcin. Hemos sealado tambin que muchos de los ARN transcriptos son productos celulares finales con funcin propia (al margen de las modificaciones postranscripcionales que requieran para completar su maduracin), es decir que, en alguna medida, la transcripcin es un paso terminal de la expresin de ciertos genes. Sin embargo, sabemos que muchos otros genes contienen la informacin necesaria para especificar la secuencia de aminocidos de las tantas protenas que una clula es capaz de sintetizar. En estos casos, la transcripcin es tan slo el primer paso de la expresin gentica. Los ARN obtenidos, ARN mensajeros, son, como su nombre lo indica, meros transportadores de informacin que an debe ser decodificada, informacin que debe traducirse en la sntesis de una protena. La traduccin es el segundo paso de la expresin gentica.

Fig. 11.1 - Flujo de informacin gentica

De qu manera la estructura de una molcula de ARNm lleva implcita la informacin para construir una protena? La informacin reside en la secuencia de bases y est escrita en un cdigo propio al que llamamos cdigo gentico. Muchas de las caractersticas del cdigo gentico fueron anticipadas en forma terica a partir del descubrimiento del ARNm. Pero en el ao 1961, Nirenberg y Matthaei desarrollaron una tcnica que abri el camino para que en los siguientes cuatro aos el cdigo gentico fuera enteramente descifrado. Podemos pensar al cdigo gentico como un idioma. Los idiomas utilizan una cierta cantidad de letras, stas se combinan para formar palabras, y cada palabra tiene un significado, designa a un objeto particular. En el cdigo gentico estn presentes todos estos elementos: las letras son las 4 bases que forman las cadenas de ARN (A, U, C, G); las palabras son siempre agrupaciones de 3 letras o tripletes de bases, llamadas codones en la molcula del ARNm, y los objetos designados por dichas palabras son cada uno de los 20 aminocidos que componen las protenas. Por qu las palabras-codones se forman con 3 bases? Si cada palabra constara de 1 base, habra 4 palabras, y si se formara con 2, las palabras posibles seran 16. En ninguno de los casos alcanzaran para designar a todos los aminocidos. Pero se pueden obtener 64 combinaciones diferentes si las bases se combinan de a 3; 64 codones son ms que suficientes para nombrar a los 20 aminocidos. Cul es la funcin de los 44 codones restantes? As como en cada idioma existen palabras distintas con un mismo significado, el cdigo gentico emplea codones diferentes para nombrar a un mismo aminocido. La mayora de los aminocidos estn codificados por ms de 1 codn: existen codones sinnimos. La presencia de codones sinnimos en el cdigo gentico habla de una degeneracin, caracterstica que, lejos de resultar desventajosa, reporta a las clulas sus beneficios. Los codones sinnimos son muy similares entre s, por lo tanto la sustitucin de una sola base en un codn frecuentemente da por resultado otro codn que especifica al

mismo aminocido. Por otra parte, aminocidos de propiedades semejantes son codificados por codones semejantes. Si en una protena se reemplaza un aminocido hidrfobo por otro de iguales caractersticas a consecuencia de una mutacin, las chances de que el cambio sea viable son mayores. Esta flexibilidad del cdigo no debe confundirse con ambigedad: el cdigo no es ambiguo, en tanto cada codn especifica a uno y slo a un aminocido. As no da lugar a error en el momento de ser traducido. Los codones que codifican aminocidos suman en total 61. Los 3 codones que no especifican ningn aminocido, UGA, UAG y UAA, actan como seales de terminacin en la traduccin o sntesis de protenas. Son llamados codones de terminacin o stop. La tabla del cdigo que se halla a continuacin es vlida para los seres vivos ms diversos: el hombre, las bacterias, las levaduras, las plantas. El cdigo gentico es universal, lo cual da prueba de que todos los organismos comparten un mismo origen. Una de las contadas excepciones a la universalidad del cdigo es el ADN mitocondrial, en el cual algunos codones son ledos de manera diferente. TABLA 11.2 - Cdigo gentico SEGUNDA LETRA U UUU fenilalanina UUC fenilalanina U UUA leucina UUG leucina CUU leucina CUC leucina C PRIMERA LETRA CUA leucina CUG leucina AUU isoleucina AUC isoleucina A AUA isoleucina AUG metionina GUU valina G GUC valina C UCU serina UCC serina UCA serina UCG serina CCU prolina CCC prolina CCA prolina CCG prolina ACU treonina ACC treonina ACA treonina ACG treonina A UAU tirosina UAC tirosina UAA stop UAG stop CAU histidina CAC histidina G UGU cistena UGC cistena UGA stop UGG triptfano CGU arginina CGC arginina U C A G U C A G U C A G U C TERCERA LETRA

CAA glutamina CGA arginina CAG glutamina AAU asparagina AAC asparagina AAA lisina AAG lisina CGG arginina AGU serina AGC serina AGA arginina AGG arginina GGU glicina GGC glicina

GCU alanina GAU aspartato GCC alanina GAC aspartato

GUA valina GUG valina EL MARCO DE LECTURA

GCA alanina GAA glutamato GCG alanina GAG glutamato

GGA glicina GGG glicina

A G

De qu manera se leen los codones durante la sntesis proteica? Consideremos la siguiente secuencia de bases de un ARNm: 5-----GUUCCCAUA----3 Si comenzamos la lectura en la G situada hacia el extremo 5, este mensaje podra ser traducido como una secuencia de tres aminocidos (las palabras del cdigo se leen de corrido, sin ningn signo de puntuacin entre ellas): Valina - prolina - isoleucina Cul sera la traduccin del mensaje si en cambio la lectura se iniciara en la primera U desde el extremo 5? fenilalanina - prolina Con este simple ejemplo resulta evidente que el sitio de inicio de la traduccin es de importancia capital para la correcta traduccin del mensaje. Qu determina que la lectura comience en el sitio correcto? Los ARNm portan un codn, el AUG (codifica metionina), que es interpretado por los ribosomas como codn de iniciacin. Este codn da el marco o cuadro de lectura que ser empleado de all en ms. En adelante, el ribosoma se desplazar a lo largo del ARNm en bloques consecutivos de tres bases, garantizando la lectura de los codones apropiados. Las mutaciones que implican ganancia o prdida de un nucletido resultan ms destructivas que las sustituciones, pues al modificar el marco de lectura, alteran por completo el mensaje. Por ltimo hemos de sealar que el cdigo es ledo sin solapamiento. Esto significa que cada nucletido del mensaje es utilizado como componente de un solo codn (aunque nuevamente existen excepciones).

Fig. 11.2 - Solapamiento del cdigo

Caractersticas del Cdigo Gentico

El cdigo gentico consta de 64 codones o tripletes de bases.61 codones codifican aminocidos. 3 codones funcionan como seales de terminacin. El cdigo no es ambiguo, pues cada codn especifica a un solo aminocido. El cdigo es degenerado, ya que un aminocido puede estar codificado por diferentes codones. Es universal, debido a que sus mensajes son interpretados de la misma forma por todos los organismos. Utiliza un marco de lectura establecido al inicio de la traduccin y no lo modifica. No se produce solapamiento de codones.

EL PROCESO DE LA TRANSCRIPCIN
La transcripcin consiste en la sntesis de ARN a partir de un molde de ADN. A continuacin realizaremos una descripcin general del proceso de transcripcin tomando en cuenta los aspectos comunes a la sntesis de los distintos tipos de ARN. La transcripcin, tanto en clulas procariotas como eucariotas, involucra la participacin de una enzima ARN polimerasa ADN dependiente. sta sintetiza una cadena de ARN cuyos inicio, terminacin y secuencia de bases vienen determinados por el propio gen. El primer paso de la transcripcin es la unin de la enzima ARN polimerasa a una regin del gen llamada promotor. El promotor es una secuencia especfica de bases con alta afinidad por la enzima, por lo que proporciona a la misma su sitio de unin al ADN. Es asimismo una seal que indica cul cadena se ha de transcribir. La transcripcin es asimtrica, pues usualmente slo se transcribe una de las dos cadenas que forman cada gen. La cadena que acta como plantilla es la cadena molde, negativa o no codificante; la hebra no transcripta, complementaria de la anterior, se denomina antimolde, positiva o codificante. La ARN polimerasa se desplaza sobre la cadena molde, recorrindola en direccin 3 => 5 o ro abajo y transcribindola a partir del nucletido que el promotor seala como punto de

inicio de la transcripcin. Este nucletido se nombra +1 y los siguientes, ro abajo, siguen la numeracin correlativa (+2, +3, etc.). Partiendo desde el punto de inicio en la direccin contraria, es decir ro o corriente arriba, los nucletidos se numeran 1, -2, etc. La ARN polimerasa slo puede desplazarse y transcribir si previamente la doble hlice sufre un desenrollamiento y fusin (separacin de las cadenas complementarias por ruptura de los puentes de hidrgeno entre las bases). La misma enzima cataliza ambos procesos, generando hacia el extremo 3 unaburbuja de transcripcin, un tramo de aproximadamente 12 nucletidos de longitud, en el cual las cadenas permanecen desapareadas. La burbuja de transcripcin aparenta avanzar ro abajo junto con la enzima, pues a medida que progresa la fusin por delante de ella, la doble hlice se recompone por detrs. La formacin de la burbuja causa una supertorsin o superenrollamiento de la doble hlice en los sectores ubicados hacia el extremo 5 del molde. Este fenmeno es corregido por la accin de una enzima topoisomerasa I.

Fig. 11.3 - Burbuja de transcripcin

Cuando el molde ya ha sido desapareado en la burbuja de transcripcin y expone sus bases, stas son reconocidas por la ARN polimerasa. A medida que la enzima lee la plantilla, coloca junto a cada base de la misma el ribonucletido trifosfato portador de la base complementaria. A los desoxirribonucletidos de A, T, C y G se le aparean, respectivamente, los ribonucletidos de U (recordemos que el ARN no contiene T), A, G y C mediante puentes de hidrgeno. Una vez ubicados los dos primeros ribonucletidos, la enzima cataliza la formacin del puente fosfodister entre ambos, inicindose la cadena de ARN.

Fig. 11.4 - Direccin de la transcripcin

El enlace fosfodister se produce entre el hidroxilo en posicin 3 del primer nucletido y el grupo fosfato interno, en posicin 5, del segundo. Un grupo pirofosfato de este ltimo es liberado como producto y escindido rpidamente en dos fosfatos por la accin de una pirofosfatasa. Dicha ruptura es tan exergnica que la reaccin inversa se torna prcticamente imposible. As, desde el punto de vista termodinmico, se favorece la sntesis de la nueva cadena. Por lo tanto, son los mismos sustratos los que, por estar trifosfatados, aportan la energa necesaria para su polimerizacin.

Fig. 11.5 - Incorporacin de ribonucletidos en el extremo 3' de ARN

Este procedimiento se repite tantas veces como nucletidos contenga el molde, de tal manera que el ARN va creciendo en forma antiparalela a aqul, es decir, desde su extremo 5 (el que qued libre en el primer nucletido) hasta su extremo 3 (que quedar libre en el ltimo nucletido aadido). La direccin de la sntesis del ARN es 5 => 3. Siempre los nucletidos recin incorporados al ARN forman una hlice corta ARN-ADN con su plantilla. Esta hlice hbrida es transitoria, pues conforme el polmero se alarga por su extremo 3, el extremo 5 se separa del molde, el cual vuelve a emparejarse con su hebra de ADN complementaria. La transcripcin concluye cuando la ARN polimerasa alcanza una seal (una secuencia especfica de bases del ADN) que acta como seal de terminacin.

El producto obtenido, un ARN transcripto primario, resulta una copia complementaria y antiparalela de una regin del gen comprendida entre el punto de inicio y la seal de terminacin.

Fig. 11.6- ARN en distintos estadios de transcripcin sobreel mismo gen El transcripto primario repite la direccin y la secuencia (excepto porque lleva U en vez de T) de la hebra no copiada o antimolde, lo que justifica que a esta ltima se apliquen las denominaciones de hebra positiva o codificante. Es la cadena convencionalmente elegida para representar un gen. Cabe aclarar que al describir la transcripcin en forma general, hemos omitido la mencin de regiones reguladoras de los genes, bajo cuyo control se encuentran los acontecimientos analizados. Este aspecto del tema ser desarrollado ms adelante en el mismo captulo. En el siguiente cuadro resumimos los requisitos de la transcripcin:

 Una molcula de ADN molde, con regin promotora, que indica el inicio de la transcripcin, con secuencia de terminacin, que marca el fin del proceso, y un segmento que ser expresado. Una enzima ARN polimerasa que:

-reconoce las secuencias sealizadoras, -abre la hlice, -lee el molde (de 3a 5), -reconoce y ubica los sustratos complementarios, -polimeriza los sustratos(de 5a 3). Cofactores enzimticos de la ARN polimerasa: Mg++ o Mn++. Sustratos: UTP, ATP, GTP Y CTP. Una fuente de energa: los mismos sustratos. Una pirofosfatasa. Una topoisomerasa I.

Fig. 11.7 - El proceso de transcripcin

A partir de distintos genes se transcriben diferentes clases de ARN: ARN mensajero(ARNm),ARN de transferencia(ARNt),ARN ribosmico(ARNr),ARN pequeos nucleares y citoplasmticos (ARNpn/ARNpc respectivamente). Si bien el proceso transcripcional es bsicamente similar en procariotas y eucariotas, existen diferencias que detallaremos a continuacin: EUCARIOTAS 1- La transcripcin es llevada a cabo por trestipos de enzima ARN polimerasa, cada una especializada en la sntesis de los distintos tipos de ARN: PROCARIOTAS 1- La transcripcin es llevada a cabo por un solo tipo de ARN polimerasa que sintetiza las diversas clases de ARN.

La ARN pol. bacteriana es un complejo proteico La ARN polimerasa I transcribe genes del ADN oligomrico constituido por cinco subunidades. nucleolar que codifican para los ARNr 45S Excepto la subunidad sigma (), el resto conforma un ncleo enzimtico. Todo el complejo constituye una holoenzima capacitada La ARN polimerasa II transcribe genes del ADN no nucleolar que codifican para todos los para leer las secuencias promotoras. ARNm y para la mayora de los ARNpn. La ARN polimerasa III transcribe genes del ADN no nucleolar que codifican para los ARNt, los ARNr 5S,los ARNpc y para el resto de losARNpn. 2- Las ARN polimerasas eucariotas no se unen al ADN molde en su sitio promotor si no estn presentes protenas denominadas factores basales de transcripcin. Estos son especficos de cada polimerasa y se encuentran en todos los tipos celulares. Las clulas eucariotas tambin cuentan con factores de transcripcin especficos los cuales relacionan a los factores basales con las regiones reguladoras de un gen. Los factores especficos controlan la tasa de transcripcin de los genes. Cada tejido presenta una combinacin particular de los mismos. 3- Cada ARN polimerasa reconoce una secuencia particular de nucletidos o seal para la transcripcin ,que es diferente para cada enzima. Por ejemplo la ARN polimerasa II, que trasncribe los genes que codifican para ARNm, reconoce varias secuencias de nucletidos en el promotor, entre las cuales se encuentran las secuencias llamadas caja TATA o caja Hogness-Goldberg, caja CAAT y GC. stas secuencias se encuentran "ro arriba" respecto del punto de inicio de la transcripcin. El reconocimiento de dichas secuencias por parte de la ARN polimerasa II y los factores basales 2- Si bien la ARN polimerasa bacteriana norequiere de factores de transcripcin, se considera a la subunidad s como un factor de inicio de la transcripcin, ya que el ncleo enzimtico despojado de la subunidad s no puede por s mismo leer adecuadamente las secuencias promotoras y efectuar la transcripcin.

3- La ARN polimerasa bacteriana tambin reconoce secuencias consenso indispensables para la unin de la holoenzima y la sealizacin del punto de inicio. Una de las secuencias ms conocidas es la caja TATAAT o caja Pribnowy TTGACA, ubicadas siempre ro arriba del punto de inicio de la transcripcin. -35 -10 +1 5' -----TTGACA----TATAAT----inicio--3' Promotor procariota

de transcripcin son prerequisitos para iniciar la copia del gen. Cabe destacar que las secuencias consenso que reconocen las distintas ARN polimerasas y sus correspondientes factores basales difieren en composicin y ubicacin dentro del gen, esto significa que no siempre se localizan delante del promotor. CAAT--GGGCCGGG--GGGCCGGG-TATA--inico Promotor eucariota Resumiendo, las principales diferencias en la transcripcin en clulas procariotas y eucariotas: Existe una sola ARN polimerasa procariota y tres ARN polimerasas eucariotas.

La ARN polimerasa procariota no requiere factores de transcripcin. Las eucariotas requieren la presencia de factores de transcripcin basales y su actividad es regulada por factores de transcripcin especficos. Las secuencias sealizadoras son diferentes.

LA MAQUINARIA TRADUCCIONAL
La traduccin implica el funcionamiento coordinado de un gran nmero de molculas entre las que se encuentran los distintos tipos de ARN. Una vez transcriptos cada ARN sufre una serie de modificaciones cuyas caractersticas difieren segn hablemos de clulas procariotas y eucariotas. Describiremos cada ARN en general y luego sus variantes en ambos tipos celulares.

ARNm (MENSAJERO)
Los ARNm son molculas lineales de cadena simple en donde residen las instrucciones para la elaboracin de un producto proteico. Los ARNm eucariotas y procariotas son esencialmente iguales en el sentido que presentan, una vez listos para la traduccin, una secuencia continua de codones que se extienden desde el principio al fin del mensaje gentico dictando con exactitud la secuencia lineal de aminocidos de una cadena polipeptdica en particular. Esta secuencia se lee en la direccin 5' 3'. El principio de la secuencia presenta un codn iniciador (casi siempre AUG), y el final de la secuencia o regin codificadora es un codn de terminacin o stop (UGA, UAA, UAG). Adems de la regin codificadora presenta sectores extra en los extremos 5' y 3' del mensajero denominados secuencias directora y seguidorarespectivamente. Estas regiones no se traducen en protena aun cuando forman parte del ARNm transcripto del gen.

Fig. 11.8 - Correspondencia entre las regiones del gen eucariota, su transcripto maduro y la cadena polipeptdica

Existen diferencias entre los ARNm procariota y eucariota ARNm EUCARIOTA

1- La mayora de los ARNm eucariotas presentan la secuencia del mensaje interrumpida, es decir coexisten a lo largo de la molcula sectores que codifican para la protena llamados EXONES, con secuencias intercaladas sin informacin denominadas INTRONES (Fig. 12.9).

Fig. 11.9 - Estructura en mosaico del ARNm transcripto primario eucariota

2- Los ARNm transcriptos primarios sufren una serie de modificaciones antes de salir al citoplasma como ARNm maduro. Algunos cambios consisten en el agregado de molculas en los extremos 5' y 3' llamados capping y poliadenilacin. Capping: sta es la denominacin del proceso por el cual se adiciona en el extremo 5' del ARNm una molcula de 7 metil-guanosina (un nucletido metilado) a la que se conoce como cap (del ingls, capuchn). sta molcula se agrega al ARNm naciente cuando ste alcanza, aproximadamente, los 30 nucletidos de longitud. Por ser esta modificacin simultnea a la transcripcin se la considera co-transcripcional. La cap impide la degradacin del ARNm inmaduro por nucleasas y fosfatasas nucleares. Tambin participa en la remocin de intrones y en el inicio de la traduccin.

Fig 11.10- El agregado del cap

Poliadenilacin: Este proceso consiste en el agregado de alrededor de unas 250 adenosinas o cola poli A , en el extremo 3' del ARNm. El ARNm presenta una secuencia de nucletidos especfica AAUAAA conocida como seal de poliadenilacin. Una nucleasa corta al pre-ARNm a unos 20 nucletidos despus de la seal. Una vez liberado el pre-ARNm, la enzima poliA-polimerasa le agrega las adenosinas de a una por vez. Por otra parte la ARN pol II contina transcribiendo un tramo ms del molde, para finalmente disociarse del gen. Este ltimo tramo de ARN es totalmente infructuoso, pues resulta rpidamente degradado por nucleasas y fosfatasas. Las funciones de la cola poli A son: proteger el extremo 3' de la degradacin y ayudar a los ARNm a salir del ncleo. Carecen de cola poli A los ARNm de histonas, dado que como ya se mencion, no presentan la seal de poliadenilacin. Otra excepcin la ejemplifican algunos genes que presentan ms de una seal de poliadenilacin. Cuando as ocurre, el mismo gen puede ser transcripto en dos productos diferentes, dependiendo de cul sea la seal reconocida.

Fig. 11.11 - El agregado de la cola poli A

Otra modificacin significativa afecta a la secuencia codificadora, que sufre un acortamiento producto de la eliminacin de los intrones, quedando como producto final los exones empalmados en secuencia continua. Este tipo de procesamiento se llama empalme (splicing) y fue descubierto en 1977. Para que se lleve a cabo este tipo de maduracin del pre-ARNm se necesita una batera de ribonucleoprotenas nucleares: las RNPpn ( snRNP, del ingls, small nuclear ribonucleoprotein). Estas partculas ricas en uridinas y diversas protenas se denominan U 1, U2, U4, U5, U6 y se combinan de a una por vez en los extremos de cada intrn (lindantes a sendos exones). El complejo resultante del ensamblado de las distintas RPNpn se denomina espliceosoma. La actividad enzimtica residira en los ARNpn del espliceosoma. stos seran los responsables de reconocer las secuencias sealizadoras de corte, escindir a los intrones y empalmar a los exones entre ellos, produciendo una molcula de ARNm maduro.

Mecanismo molecular del splicing

El corte de intrones y el empalme de exones deben ser muy exacto, pues de lo contrario un error pequeo, causara un corrimiento del marco de lectura del ARNm. Los intrones son clivados del transcripto primario por las RNPpn que reconocen cortas secuencias conservadas dentro del intrn y en los lmites con los exones. Estas secuencias, muy similares en todos los intrones estudiados, son:

Secuencia GU en el extremo 5' o sitio dador Secuencia AG en el extremo 3' del intrn o sitio aceptor

Secuencias conocida como sitio de ramificacin que se localiza en el interior del intrn

Estas secuencias participan en las reacciones de clivado y empalme que ocurren en dos etapas: En la primer etapa, una RNPpn reconoce al sitio dador y otra se enlaza al sitio de ramificacin. El extremo 5' es clivado y ligado a un nucletido(A) del sitio de ramificacin. En la segunda etapa, se da el reconocimiento del extremo 3 por parte de otra RNPpn y se produce el corte en el extremo 3' del intrn, seguido por el empalme de los dos exones. As se libera el ARNm maduro del espliceosoma. El intrn queda eliminado en forma de lazo y ser degradado posteriormente en el ncleo.

Fig. 11.12 - Accin del espliceosoma

Como citramos anteriormente, la presencia del capuchn en el extremo 5' es requerida para que las RNPpn trabajen, no as la cola poli A. 3- Los ARNm maduros son monocistrnicos, es decir el sector codificador dicta la secuencia para una sola cadena polipeptdica.

Fig. 11.13 - Estructura de la molcula de ARNm maduro eucariota

ARNm PROCARIOTA 1-Los ARNm procariotas presentan las secuencias codificadoras continuas, pues carecen de intrones. 2-No sufren modificaciones post-transcripcionales. 3-Muchos ARNm procariotas son policistrnicos, es decir que una sola molcula de ARNm contiene informacin para varias protenas. Este ARNm contiene codones para la terminacin y para la iniciacin de la traduccin entre las secciones codificadoras de protenas, de modo que se traduce como varias molculas de protena distintas.

Fig. 11.14 - Estructura de la molcula de ARNm procariota

ARNt (TRANSFERENCIA)
Los ARNt son molculas "adaptadoras" ya que interactan por un lado con la cadena polinucleotdica (ARNm) y por el otro con los aminocidos que formarn parte de la cadena polipeptdica, as alinean a los aminocidos siguiendo el orden de los codones del ARNm. Cada ARN t es una molcula de 70 a 93 ribonuclotidos. Enlaces puente hidrgeno entre sus bases repliegan la molcula dando origen a una disposicin espacial en forma de trbol (Fig.11.15). Cada brazo presenta una zona de doble cadena y un asa o bucle de cadena simple

sin apareamiento de bases. Interacciones posteriores doblan la estructura de trbol formando una "ele". Por qu existen 64 codones y aproximadamente 31 ARNt, si en la naturaleza hay 20 aminocidos ?
Existen 64 combinaciones posibles en que las 4 bases pueden ordenarse en tripletes o codones. De ellos, 3 son codones stop. Los 61 tipos restantes codifican para los 20 aminocidos, existiendo para varios de ellos codones sinnimos (ver tabla 11.2). Los anticodones de los ARNt reconocen a los codones del ARNm, sin embargo no hay 61 tipos distintos de ARNt porque no se requiere la complementaridad exacta entre los 3 nucletidos del codn y el anticodn. En muchos casos, mientras coincidan las 2 primeras bases del codn, hay suficiente "balanceo"en la tercera posicin para permitir el acoplamiento con ms de un tipo de nucletido en el anticodn, de manera que existen aproximadamente 31 tipos de ARNt.

Por ejemplo el aminocido fenilalanina es codificado por dos codones sinnimo: UUU / UUC. Sin embargo un solo anticodn AAG puede complementarse indistintamente con UUU y UUC, realizando el trabajo de llevar a la fenilalanina al ribosoma para ser incorporada a la cadena polipeptdica en formacin .

Todos los ARNt presentan un porcentaje significativo de bases poco frecuentes que surgen por modificacin post-transcripcional de los cuatro ribonucletidos estndar A, G, C y U (Fig. 11.16).

Fig. 11.15 - Estructura del ARNt

Fig. 11.16 - Bases raras en el ARNt

En esta molcula se distinguen bsicamente dos extremos: En el extremo 3' o extremo aceptor de la molcula se encuentra el trinucletido CCA que representa el sitio de unin donde se liga el aminocido. Esta unin es catalizada por una enzima aminoacil ARNt sintetasa especfica y apropiada para cada uno de los 20 aminocidos. En el otro extremo de la "ele" se localiza un triplete de nucletidos conocido como anticodn, cuya secuencia vara en cada tipo de ARNt. Cada anticodn es

complementario de un codn del ARNm, aunque podra acoplarse a ms de un codn (sinnimo). Por lo hasta aqu expuesto, podemos concluir que el ARNt debe poseer varias propiedades especficas:

Debe ser reconocido por una aminoacil ARNt sintetasa que lo una al aminocido correcto. Debe tener una regin que acte como sitio de unin para el aminocido.

Debe tener una secuencia complementaria (anticodn) especfica para el codn del ARNm correcto. Las modificaciones que sufren los pre-ARNt son semejantes en procariotas y en eucariotas en cuanto en ambos se producen escisiones y modificaciones qumicas, por ejemplo se elimina un dinucletido 3' del precursor y se agrega el triplete CCA a los ARNt que no poseen todava esta secuencia terminal. Tambin aparecen bases raras (Fig.11.16) por modificacin enzimtica de nucletidos estndar del ARNt precursor. Algunos genes para ARNt presentan un intrn que interrumpe la secuencia codificadora, l cual es removido post-transcripcin. (Fig.11.17)

Fig. 11.17 - Intrn en el ARNt

ARNr (RIBOSMICO)
Los ARNr, junto a protenas, son los componentes de los RIBOSOMAS. Los ribosomas y los ARNt intervienen en la traduccin de la informacin codificada en el ARNm por lo cual los primeros son considerados fbricas de protenas. Cada ribosoma consta de dos subunidades: la subunidad MAYOR y la subunidad MENOR (Fig. 11.18)

Fig. 11.18 - Modelo tridimensional del ribosoma bacteriano visto desde distintos ngulos

La subunidad mayor contiene una depresin en una de sus superficies, en la cual se ajusta la subunidad menor. El ARNm se inserta en el surco formado entre las superficies de contacto de las subunidades. (Fig. 11.19). Dentro de cada ribosoma hay dos huecos llamados sitios A (AMINOACDICO) y P (PEPTIDLICO), para el ingreso de los ARNt unidos a sus correspondientes aminocidos. (Fig. 11.20)

Fig. 11.19- Modelo de ribosoma que representa la ubicacin tentativa del ARNm y de la protena naciente

Fig. 11.20- Sitios aminoacdico y peptidlico del ribosoma

Las subunidades ribosmicas trabajan conjuntamente para la sntesis proteica. La subunidad menor aloja al ARNm sobre el cual se acomodan los ARNt para que puedan unirse los aminocidos que transportan. La subunidad mayor cataliza la unin peptdica de los aminocidos gracias a la accin de la peptidil transferasa ( enzima que forma parte de la estructura de esta subunidad). [1] Si bien cumplen idntica funcin, los ribosomas procariotas y eucariotas se diferencian en su tamao, coeficiente de sedimentacin [2] , y en el tipo y nmero de molculas de ARNr y protenas que los forman:

Fig. 11.21- Comparacin de las estructuraas de los ribosomas procariotas y eucariotas Todos los ARNr procariotas y eucariotas sufren modificaciones post-transcripcin. En eucariotas los ARNr 18S; 5,8S y 28S son transcriptos de un mismo gen que codifica para un pre-ARNr 45S. La sntesis del este transcripto primario se realiza en la zona fibrilar del nuclolo a partir de la ARN pol I. Una vez obtenido el largo transcripto primario, se eliminan las secuencias espaciadoras(tramos de ARN intiles para integrar la estructura ribosmica), las que sern degradadas por enzimas. Las secuencias resultantes utilizables de ARNr (28S, 18S y 5,8S) son metiladas y junto con ARNr 5S extranucleolar, se ensamblan a protenas importadas del citoplasma para conformar la subunidades ribosmicas (Fig. 11.22).

Fig. 11.22 - Procesamiento de los ARN 45S

Las subunidades ribosmicas en distintos estadios de ensamblaje, se localizan en la periferia del nuclolo, conformando la zona granular del mismo. Finalmente, las subunidades ribosmicas por separado y antes de completar sus respectivos ensambles, son exportadas al citoplasma a travs del complejo del poro, concluyendo el procesamiento de cada subunidad en el citosol. Respecto del ARNr 5S no transcripto en el nuclolo, una vez sintetizado se incorpora al resto de los componentes para conformar la subunidad mayor del ribosoma (Fig.11.23).

Fig. 11.23 - Ensamblaje de subunidades ribosmicas

LOS ARN PEQUEOS

Los ARN pequeos forman complejos con protenas especficas dando lugar a la formacin de partculas ribonucleoproteicas (RNP). Las RNP localizadas en el ncleo se denominan RNPpn: partcula ribonucleoproteica pequea ( sn RNP/s: small -pequea- /n: nuclear-RNP:ribonucleoproteica). Varios RNPpn conocidos como U1 a U6 participan en el procesamiento de los ARNm. Estas partculas forman un complejo multienzimtico denominado espliceosoma, encargado de realizar cortes y empalmes en los ARNm transcritos primarios (splicing) . Las RNP localizadas en citoplasma se denominan RNPpc: partcula ribonucleoproteica pequea citoplasmtica (scRNP/s: small/ c:cytosolic-citosol-/RNP:ribonucleoproteica). La funcin ms conocida de cualquier RNPpc es la que desempea el complejo ARN /protenas que componen la partcula dereconocimiento de la seal o SRP. Estas partculas participan en el reconocimiento de secuencias especficas de las protenas de secrecin, membranares y lisosomales, deteniendo su traduccin hasta que el ribosoma en donde se estn

sintetizando se contacte con la membrana del retculo endoplasmtico granular, en donde finalizan su traduccin.

EL PROCESO DE LA TRADUCCIN O SNTESIS PROTEICA

La sntesis proteica consiste en la traduccin de la informacin codificada en la secuencia de nucletidos del ARNm, en la secuencia correspondiente de aminocidos en una cadena polipeptdica. La sntesis proteica se lleva a cabo en los RIBOSOMAS y si bien en esencia es un proceso similar en todos los organismos, la maquinaria traduccional es ms compleja en eucariotas. La sntesis proteica incluye las siguientes etapas: 1. ACTIVACIN DE LOS AMINOCIDOS O AMINOACILACIN 2. TRADUCCIN DEL ARNm 1. ACTIVACIN DE LOS AMINOCIDOS Antes de la traduccin cada ARNt se engancha a su aminocido especfico. Esta reaccin de aminoacilacin es catalizada por las enzimas aminoacil ARNt sintetasas. Existen 20 tipos distintos de enzimas, una para cada aminocido. El proceso de aminoacilacin ocurre en dos etapas: a- En la primera fase se utiliza la energa de la hidrlisis del ATP para unir cada aminocido a un AMP, con un enlace de alta energa. Esta reaccin da origen a un complejo intermediario denominado aminoacil- AMP:

Fig. 11.24 - Etapa 1 de la aminoacilacin

b- Sin abandonar la enzima, se transfiere el aminocido del complejo aminoacil-AMP al ARNt especfico, con lo cual se origina la molcula final:AMINOACIL -ARNt

Fig. 11.25 - Etapa 2 de la aminoacilacin

En resumen, la aminoacilacin o activacin de los aminocidos tiene dos funciones :

1- proporcionar el primer paso en la traduccin del mensaje gentico a una secuencia de aminocidos ; 2- activar al aminocido antes de incorporarlo a la protena. El enlace entre el ARNt y el aminocido libera al hidrolizarse la energa necesaria para propulsar la formacin del enlace peptdico durante la traduccin. 2. TRADUCCIN El mecanismo por el cual se traduce el mensaje del ARNm puede describirse en tres etapas: Iniciacin Elongacin Terminacin En todas las fases se requiere la presencia de un complejo sistema de protenas citoplasmticas conocidas como factores de iniciacin, factores de elongacin y factores de terminacin respectivamente. Dichos factores son diferentes en procariotas y eucariotas aunque sus funciones son semejantes.

INICIACIN DE LA TRADUCCIN
etapa se renen los componentes que constituyen el complejo de iniciacin, disparador de la sntesis proteica. El complejo est compuesto por una molcula de ARNm, una subunidad mayor, una subunidad menor, el ARNt iniciador (cargado con metionina en eucariotas y con N-formilmetionina en procariotas) y factores proteicos de iniciacin (IF) . En esta Dicho complejo comienza a formarse cuando se acoplan a la subunidad menor el ARNm y el aminoacil ~ARNt iniciador. No est claro cual de las dos molculas se une primero la subunidad menor, pero ambas deben estar presentes antes que la subunidad mayor cierre el complejo originando un ribosoma completo y funcional (Fig. 11.26). La posible secuencia de acontecimientos durante la iniciacin de la traduccin en eucariotas es: 1. El aminoacil~ARNt iniciador se une a la subunidad menor, con gasto de GTP.

2. El ARNm se acopla a la subunidad menor , para lo cual debe ser previamente reconocida la cap y los nucletidos contiguos en el extremo 5' del mensaje.

3. La subunidad menor se desliza sobre el ARNm hasta localizar al codn de iniciacin AUG. Este modelo de seleccin propuesto para eucariotas difiere del modelo de emparejamiento descripto para procariotas, por el cual el acoplamiento de bases codnanticodn iniciador se producira por un emparejamiento de bases que preceden a AUG del ARNm con el extremo 3'del ARNr de la subunidad menor. 4. Una vez localizado y acoplado el anticodn al codn AUG del mensaje se establece la pauta de lectura correcta para el resto de los codones que contenga la regin codificadora del ARNm. 5. Finalmente se acopla la subunidad mayor, quedando el aminoacil ~ARNt iniciador en el sitio P del ribosoma. Como todas las cadenas polipeptdicas han sido iniciadas por un ARNt iniciador, todas las protenas recin sintetizadas tienen metionina (o N-formilmetionina en bacterias) como residuo amino terminal. En ambos casos la metionina inicial es eliminada por una aminopeptidasa especfica.

Fig. 11.26 - Fases de la etapa de iniciacin de la sntesis proteica

Cabe destacar que en eucariotas, en cuanto se han reconocido la cap y los nucletidos aledaos que preceden a AUG en el extremo 5' del mensaje, ningn otro codn AUG del ARNm ser utilizado como lugar de iniciacin, por lo tanto de cada molcula de ARNm se sintetiza una sola cadena proteica. Los ARNm eucariotas son monocistrnicos. (Fig. 11.13 ). En procariotas, dado que la secuencia de iniciacin puede aparecer varias veces a lo largo del mensaje, pueden originarse varias cadenas polipeptdicas a partir de un ARNm. La mayora de los ARNm procariotas son policistrnicos. (Fig. 11.14 ). En conclusin, tres clases de interacciones determinan el inicio de la sntesis proteica: Reconocimiento del codn de iniciacin AUG en la subunidad menor del ribosoma Acoplamiento de bases del codn AUG con el ARNt iniciador Acoplamiento de la subunidad mayor del ribosoma cerrando el complejo de iniciacin

Las principales diferencias en la iniciacin de la traduccin en procariotas y eucariotas son: Eucariotas Procariotas

Modelo de seleccin:

Modelo de emparejamiento:

La subunidad menor se desliza sobre el ARNm El acoplamiento de bases codn-anticodn

hasta localizar al codn de iniciacin.

iniciador se producira por un emparejamiento de bases que preceden a AUG del ARNm con el extremo 3' del ARNr 16S de la subunidad menor. El ARNt iniciador transporta metionina formilada (N-formilmetionina).

El ARNt iniciador transporta metionina.

Se requiere la presencia de cap en el extremo No existe cap. 5'. La secuencia de iniciacin aparece una vez a lo La secuencia de iniciacin puede aparecer varias largo del mensaje (ARNm monocistrnico). veces a lo largo del mensaje(ARNm policistrnico). Participan factores de iniciacin eIF (e= eucariota;I=iniciacin;F=factor) especficos de este tipo celular Participan factores de iniciacin IF(I=iniciacin; F=factor) especficos de este tipo celular.

ELONGACIN DE LA CADENA POLIPEPTDICA

El proceso de elongacin o crecimiento de la protena puede resumirse en tres etapas:

6.

Una molcula de aminoacil~ARNt ingresa al sitio A vacante del ribosoma (adyacente al sitio P que est ocupado) acoplndose por complementaridad de bases al segundo codn del ARNm expuesto en ese lugar. Esta reaccin requiere la intervencin de un factor de elongacin y GTP. (Fig. 11.27)

7.

El aminocido iniciador se desacopla del ARNt del sitio P, liberando energa que se utiliza en la formacin del enlace peptdico entre los dos aminocidos alineados (reaccionan el carboxilo del primer aminocido con el grupo amino del segundo aminocido). Esta reaccin es catalizada por unapeptidil transferasa integrante de la subunidad mayor. Como consecuencia de esta reaccin el ARNt iniciador del sitio P queda sin aminocido y el dipptido resultante queda enganchado al ARNt del sitio A (peptidil ARNt).

8.

El nuevo peptidil ARNt del lugar A es translocado al lugar P cuando el ribosoma se desplaza tres nucletidos a lo largo de la molcula de ARNm. Esta etapa requiere energa y la presencia del un factor de elongacin. Como parte del proceso de translocacin la molcula libre de ARNt que se ha generado en el sitio P se libera del ribosoma, puesto que su lugar pasa a ser ocupado por el peptidil ARNt. As el sitio A, que se halla desocupado, puede aceptar una nueva molcula de aminoacil~ARNt, con lo cual se vuelven a iniciar los pasos anteriormente analizados.

Fig. 11.27 - Fases de la etapa de la elongacin de la sntesis proteica

Resumiendo, el ciclo de elongacin de la sntesis se caracteriza por: La unin del aminoacil-ARNt (reconocido por el codn) La formacin del enlace peptdico La translocacin del ribosoma

TERMINACIN DE LA SNTESIS PROTEICA

9.

La finalizacin de la sntesis proteica ocurre ante la llegada, al sitio A del ribosoma, de uno de los tres codones stop o de terminacin: UGA, UAG, UAA. stos son reconocidos por un factor de terminacin. La asociacin del codn stop con dicho factor modifica la actividad de la peptidil transferasa, la que adiciona agua al peptidil - ARNt en lugar de un nuevo aminocido.

10.

Como consecuencia de esta reaccin el polipptido se desacopla del ARNt, liberndose en el citoplasma. El ARNm se desacopla del ribosoma y se disocian las dos subunidades, las cuales podrn volverse a ensamblar sobre otra molcula de ARNm reinicindose el proceso de traduccin.

Fig. 11.28 - Fases de la etapa de terminacin de la sntesis proteica

Los acontecimientos que caracterizan a la terminacin de la sntesis son : El reconocimiento del codn stop

La disociacin de las subunidades ribosmicas,el ARNm y la cadena polipeptdica.

EL COSTO ENERGTICO DE LA SNTESIS PROTEICA

La sntesis proteica requiere ms energa que cualquier otro proceso anablico. Para formar cada enlace peptdico se consumen tres enlaces de alta energa:

uno en la activacin del aminocido; otro en la unin del aminoacil ~ARNt a la subunidad menor del ribosoma; el tercero en la translocacin del ribosoma.

POLIRRIBOSOMAS En cuanto un ribosoma ha traducido una secuencia de aminocidos suficientemente larga como para dejar libre el extremo 5' del ARNm, un nuevo ribosoma puede iniciar la traduccin. Al grupo de ribosomas que traducen simultneamente el mismo mensaje se lo denomina polirribosoma o polisoma. Los ribosomas en esta unidad estructural operan independientemente sintetizando una cadena polipeptdica completa.

Fig. 11.29 - Esquema de un polisoma

DIFERENCIAS EN LA TRADUCCIN EN PROCARIOTAS Y EUCARIOTAS

En eucariotas la envoltura nuclear y la maduracin que sufren los ARNm impiden su traduccin inmediata. El ARNm es "ledo" despus de que haya abandonado el ncleo a travs de los poros nucleares. La traduccin es por lo tanto post-transcripcional.

Fig. 11.30 - Transcripcin, maduracin y traduccin en eucariotas

Fig. 11.31 - Transcripcin y traduccin en procariotas

En procariotas la traduccin es simultnea a la transcripcin, esto es, mientras se est terminando de transcribir el extremo 3', el extremo 5' libre del ARNm se asocia a un ribosoma y al ARNt iniciador comenzando la traduccin. LA FIDELIDAD DE LA TRADUCCIN La precisin en la incorporacin de los aminocidos en la secuencia apropiada durante la sntesis proteica, depende bsicamente de dos mecanismos: La unin del aminocido a su ARNt correspondiente o aminoacilacin. En esta etapa la actividad correctora de las enzimas aminoacil - ARNt sintetasa minimizan los errores en la seleccin del aminocido correcto. Muchas enzimas tienen dos sitios activos distintos, uno que lleva a cabo la reaccin de carga, y otro que reconoce un aminocido incorrecto que se haya colocado en el ARNt y lo libera por hidrlisis. El apareamiento de bases codn - anticodn, donde una equivocacin en la correspondencia de nucletidos dara como resultado la incorporacin del aminocido incorrecto. En este punto de control participa un factor de elongacin que forma un complejo con el aminoacil ARNt y el GTP; este complejo y no el ARNt libre es el que se une al codn correspondiente en el ARNm. Recin despus del correcto apareamiento codn anticodn, el factor se disocia posibilitando la unin del aminocido a la cadena polipeptdica. Este retraso en la unin del aminocido posibilita que se elimine el ARNt incorrecto, antes que el residuo aminoacdico que transporta pueda enlazarse a la protena en crecimiento.

REGULACIN DE LA EXPRESIN GENTICA Regulacin en procariotas: el opern

Las clulas procariotas pueden regular de varias formas la cantidad de protenas que van a ser sintetizadas. No obstante se considera que la expresin gnica est regulada principalmente a nivel de la transcripcin . La mayora de los procariotas, tales como Esclerichia coli, estn expuestos a una gran variedad de condiciones en su medio y exhiben una notable capacidad para adaptarse a las mismas, esto es consecuencia de una gran habilidad para regular la expresin de genes especficos que codifican aquellas molculas que responden a los estmulos de su entorno. As, esta capacidad de un organismo para regular la expresin de sus genes incrementa su aptitud para crecer y dejar progenie en cualquier tipo de condiciones ambientales. La sntesis de transcriptos de genes y protenas requiere un considerable gasto de energa. Si se "apaga" la expresin de estos genes (cuando sus productos no son necesarios). Un organismo puede evitar gastar energa o utilizarla en vas metablicas de molculas que maximicen la tasa de crecimiento en su medio circundante. Cules son los mecanismos por los cuales estos organismos regulan la expresin de genes en respuesta a cambios en el ambiente?

En bacterias, los genes que codifican para la sntesis de enzimas que participan en una va metablica, se agrupan en el cromosoma en un complejo denominado OPERN. Todos los genes del opern actan como unidades coordinadas mediante un mecanismo de control descripto por primera vez por Jacob y Monod en 1961. Un opern tpico consta de: Genes estructurales :son los genes que codifican para las enzimas de la va metablica. Tienen la particularidad de situarse prximos entre s, de manera tal que son transcriptos en una sola molcula de ARNm policistrnico. Cuando ste se traduce se obtienen las diferentes enzimas de la va metablica. Promotor: como analizramos anteriormente, es la secuencia de nucletidos del ADN en donde se une la ARN polimerasa para iniciar la transcripcin. Operador : es una secuencia de nucletidos que se interpone entre el promotor y los genes estructurales, en donde se inserta una protena reguladora denominada protena

represora.

La protena represora es codificada por el gen regulador, localizado en una regin distinta del cromosoma bacteriano, aguas arriba del sitio operador.

Fig. 11.32 - Esquema de los componentes de un opern

Uno de los ejemplos de opern ms conocido es el opern lac. Este es un conjunto de genes que intervienen en la utilizacin de la lactosa, por parte de la bacteria, como fuente de energa. Las tres enzimas que intervienen en la va de degradacin de la lactosa son: la enzima permeasa , la beta galactosidadsa y la transacetilasa. El opern lac est formado por tres genes estructurales dispuestos en serie(z, y, a). La trasncripcin de estos genes da origen a una molcula de ARNm que codifica para la tres enzimas que participan de la misma va metablica. En ausencia de lactosa el represor se enlaza al operador e impide a la ARN polimerasa insertarse en el sitio promotor con lo cual se interrumpe la transcripcin (Fig. 11.33) . El represor ejerce su influencia mediante control negativo, puesto su interaccin con el ADN inhibe la expresin del opern.

Fig. 11.33 - El opern lac inhibido

En presencia de lactosa, este disacrido se une a la protena represora, provocndole un cambio conformacional e incapacitndola para unirse al ADN del operador. En estas condiciones, se transcriben los genes estructurales, apareciendo en el citosol las enzimas que degradarn a la lactosa. En este ejemplo de opern el represor solo puede unirse al operador en ausencia del inductor (Fig.11.34).

Fig. 11.34 - El opern lac activado

El opern lac es un ejemplo de opern inducible, es decir aquel en el cual la presencia de una sustancia especfica (en este caso la lactosa) induce la transcripcin de los genes estructurales. El opern lac tambin se encuentra bajo control positivo. Este efecto se da cuando en el medio hay glucosa, as la bacteria metaboliza este monosacrido ignorando cualquier otra fuente de carbono disponible. Cuanto menor es la concentracin de glucosa en el medio, mayor es la concentracin de AMPc , el cual tiene influencia en el "encendido" del opern lac. El AMPc acta unindose a una protena fijadora de AMPc denominada CAP (protena activadora de catabolitos). Cuando la concentracin de este complejo es alta (pues el medio

contiene poca glucosa), el CAP-AMPc se fija a un sitio especfico del promotor lac, aumentando la afinidad de la regin promotora para la ARN polimerasa, lo que estimula la transcripcin del opern (Fig. 11.35).

Fig. 11.35 - Control positivo CAP-AMPc

Por lo expuesto concluimos que: Para que se exprese el opern lac deben darse dos condiciones en el medio: que est presente la lactosa y que la concentracin intracelular de glucosa sea baja.

Existen otros tipos de operones en bacterias, como por ejemplo el opern triptofano, el que se caracteriza por ser un opern reprimible. El opern triptofano consiste en cinco genes estructurales que codifican para las enzimas involucradas en la biosntesis del aminocido triptofano. Dichos genes se agrupan en una

unidad de transcripcin con un solo promotor y un operador. Un gen regulador se localiza fuera del opern y codifica para la sntesis de una protena represora. Esta protena difiere del represor lac en que se sintetiza en forma inactiva siendo incapaz de unirse al operador. En ausencia de triptfano, la ARN polimerasa se une al promotor y transcribe los genes estructurales en un ARNm policistrnico. Esto es posible pues el represor inactivo no logra unirse por si solo al operador (Fig. 11.36).

Fig. 11.36 - El opern triptfano activado

En presencia de triptfano en el medio circundante, el aminocido (molcula denominada corepresor) se une a la protena represora constituyendo elcomplejo represor/co-represor. Dicho complejo reconoce a la zona operadora a la que se fija, impidiendo a la ARN polimerasa transcribir los genes estructurales (Fig. 11.37).

Fig. 11.37 - El opern triptfano inhibido

Con este mecanismo de regulacin la bacteria ahorra energa sintetizando triptfano solamente cuando esta sustancia esencial en su crecimiento, est ausente en el medio ambiente.

COMPARACIN ENTRE EL OPERN LAC Y EL OPERN TRIPTFANO OPERN LAC OPERN TRIPTFANO

Opern inducible, se expresa en presencia de Opern reprimible, se expresa en ausencia de lactosa. triptfano. La lactosa es el inductor El represor se sintetiza en forma activa. Acta solo Sus enzima participan en un va catablica El triptfano es el co-represor El represor se sintetiza en forma inactiva. Acta en presencia del co-represor Sus enzima participan en una va anablica

REGULACIN EN EUCARIOTAS
Las clulas eucariotas presentan estrategias ms complejas que las bacterias para regular la actividad de sus genes. Los organismos eucariotas pluricelulares poseen el mismo genoma en todas sus clulas, sin embargo los distintos tipos celulares se diferencian entre s porque fabrican y acumulan distintos ARNm y por lo tanto distintas protenas . Por qu si el gen para la hemoglobina est presente en el genoma de una clula epitelial, no se encuentra esta protena ni su ARNm en el citoplasma de este tipo celular?. Cmo logran las clulas epiteliales mantener "apagado" el gen para la hemoglobina? . Para responder a estas preguntas debemos tener en cuenta no solo que el genoma eucariota es ms complejo que el procariota, sino que existen ms niveles en dnde ejercer el control de la expresin gnica. Cada etapa en el flujo de informacin propuesto por el dogma de la biologa molecular: "ADN ARN PROTENAS" puede ser regulada.

Si bien los mecanismos ms importantes de control son los que actan a nivel transcripcional, es importante destacar que pueden producirse regulaciones durante el procesamiento o maduracin del ARNm o bien controlando: su pasaje a citoplasma o su supervivencia en el citosol. En algunos casos los controles actan a nivel traduccional o regulando la actividad de la protena.

Desarrollaremos particularmente, aquellos mecanismos que operan a nivel transcripcional es decir en el comienzo de la sntesis del ARNm ya que actan sobre las secuencias reguladoras del gen.

Fig. 11.38 - Niveles de control de la expresin gnica

CONTROL TRANSCRIPCIONAL A) Los factores de transcripcin y la expresin gentica:

Para la transcripcin de un gen eucariota se requiere: Una secuencia promotora o promotor: secuencias de nucletidos necesarias para la fijacin de la ARN polimerasa. Secuencias reguladoras: existen dos tipos

Intensificadoras (del ingls, enhancers):secuencias que estimulan la transcripcin y cuya localizacin puede ser a miles de nucletidos de distancia "ro arriba o abajo" del promotor. Silenciadoras (del ingls silencers) : secuencias que inhiben la transcripcin. Tambin pueden hallarse muy distantes del promotor. Factores basales de transcripcin: complejo proteico que interacciona con el sitio promotor. Son esenciales para la transcripcin pero no pueden aumentar o disminuir su ritmo. De esto se encargan: Factores especficos de la transcripcin: complejo de protenas reguladoras que pueden ser activadoras o represoras. Protenas activadoras : interaccionan con las secuencias intensificadoras del gen. Protenas represoras: interactan con las secuencias silenciadoras del gen.

Estas protenas reguladoras interactan con regiones especficas del surco mayor del ADN que corresponden a las zonas reguladoras del gen. La geometra de la molcula, y los diseos caractersticos de los factores de transcripcin (Fig. 11.39), posibilitan dichas interacciones las que se producen por uniones no covalentes del tipo puente hidrgeno, uniones inicas e hidrofbicas.

Fig. 11.39 - Ejemplos de diseos de factores de transcripcin

Para comprender el mecanismo por el cual los factores de transcripcin regulan la expresin de un gen eucariota, consideremos una analoga propuesta por Robert Tjian3 : " si el promotor fuese el encendido de un coche, los intensificadores seran el acelerador y los silenciadores los frenos, as las protenas activadoras pisaran el acelerador y las represoras pisaran el freno". Entonces, la transcripcin de un gen depende de la actividad conjunta de los factores de transcripcin unidos a las secuencias reguladoras. Cada gen tiene una combinacin particular de intensificadores y silenciadores. Dos genes distintos pueden compartir idnticas secuencias intensificadoras y silenciadoras, pero no existen dos genes que posean la misma combinacin de estas secuencias reguladoras. Las diferencias entre los distintos tipos celulares que comparten el mismo genoma se deben a que cada clula transcribe y expresa distintas protenas. Esto es consecuencia de que cada tipo celular contiene conjuntos de protenas reguladoras de la expresin de diferentes genes. Cmo logran los activadores y silenciadores regular la transcripcin si se encuentran a mucha distancia del promotor del gen ? La unin de los factores al sitio promotor provoca un cambio conformacional que pliega al ADN entre las secuencias reguladoras y promotora, formando un asa. Este plegamiento permite contactar a los factores especficos ,unidos a las regiones reguladoras con una o ms protenas "blanco" asociadas al complejo de transcripcin basal. Cuando esto ocurre, se estimula la transcripcin por parte de la ARN polimerasa la que se desplaza copiando la regin codificadora del gen.

As como los factores de transcripcin se asocian a las secuencias reguladoras, tambin se disocian. Dice Alberto Kornblihtt4: Debilidad, reversibilidad y especificidad de unin son

caractersticas primordiales de las interacciones entre molculas para producir efectos biolgicos. Una complicada red de interacciones entre macromolculas, principalmente del tipo ADN-protena y protena-protena, es la que enciende diferencialmente los genes en los distintos tipos celulares.

Fig. 11.40 - Interaccin entre los factores de transcripcin basales y especficos

B) La estructura de la cromatina y la expresin gentica

En cada tipo celular solo se expresan determinados conjuntos de genes mientras el resto del genoma se mantiene "silencioso". Se supone que el grado de compactacin de la cromatina desempea un importante papel en la expresin gnica. Existen dos tipos de cromatina: la eucromatina, transcripcionalmente activa, ms desplegada y la heterocromatina, transcripcionalmente inactiva, ms condensada. La transcripcin solo ocurre cuando el ADN est desplegado. Por lo tanto, las regiones de cromatina condensada y dispersa varan segn el tipo celular, reflejando, segn se cree, la sntesis de protenas diferentes por distintos tipos celulares, es decir: el gen para la hemoglobina estara en estado heterocromtico en la clula epitelial y por lo tanto no disponible para su expresin.

C) El grado de metilacin y la expresin gentica

En algunos eucariotas la presencia de grupos metilo (CH 3) en el gen afecta su expresin. La metilacin ocurre en la citosinas que forman parte del dinucletido -CG- dentro de secuencias especficas, con frecuencia localizadas dentro o prximas a la zona reguladora del gen. No todos los lugares CG estn metilados. La mayora de los genes que no se expresan estn metilados, mientras que en otra clula en donde esos genes se expresan se advierte una disminucin de sus niveles de metilacin. Por ejemplo, en las clulas de mujeres, el cromosoma X condensado (el corpsculo de Barr) presenta alto grado de metilacin en los CG de los promotores de los genes que porta, inactivando as esta parte del genoma.

CONTROL A NIVEL DEL PROCESAMIENTO DEL ARNm Se han descubierto formas de regulacin que implican el procesamiento del ARNm. En algunos casos un mismo gen produce una protena en un tejido y un tipo distinto de producto proteico en otro tejido. El mecanismo por el cual puede obtenerse de un mismo gen dos protenas relacionadas se denomina empalme alternativo. Este proceso consiste en unir covalentemente diferentes combinaciones de exones del pre-ARNm obtenindose dos ARNm maduros con distinta informacin y por lo tanto dos productos proteicos que difieren en uno o ms tramos de su secuencia aminoacdica.

Fig. 11.41 - Empalme alternativo

MECANISMOS DE CONTROL A NIVEL DE LA TRADUCCIN

Entre los ejemplos de mecanismos regulatorios de la traduccin o sntesis proteica, explicaremos cmo se modifica la tasa de traduccin del ARNm que codifica para la protena ferritina. Esta protena funciona capturando tomos de hierro del medio intracelular, ya que en estado libre, el hierro es txico para la clula. La traduccin del ARNm para la ferritina es regulada por una protena represora, la aconitasa, cuya actividad depende de la concentracin de hierro libre en el citosol. Cuando la concentracin intracelular de hierro es baja, la aconitasa se une a una secuencia nucleotdica especfica en el ARNm, llamada elemento de respuesta al hierro (ERH), provocando un plegamiento del mensaje a modo de bucle, que bloquea la traduccin (Fig.11.42). Cuando aumenta la concentracin de hierro en el citosol, ste se asocia a la aconitasa, la cual cambia su conformacin y pierde afinidad por el ERH. Una vez liberado el ARNm, comienza la sntesis de ferritina y su asociacin con el hierro intracelular.

Otro mecanismo importante es el control de la estabilidad del ARNm. Se conocen algunos casos en donde la integridad de la cola poli A es determinante para la supervivencia del mensaje. El acortamiento gradual de la cadena de adeninas por accin de nucleasas, reduce en algunos casos la vida media del ARNm.

Fig. 11.42 - Control de la traduccin del ARNm de la ferritina

MECANISMOS DE CONTROL DESPUS DE LA TRADUCCIN

La vida media de las protenas puede ser considerada una forma indirecta de la expresin gentica. Dos factores son determinantes de la vida media de una protena citoslica: su correcto plegamiento y la secuencia aminoacdica de su extremo aminoterminal. Desde el momento que una protena emerge del ribosoma citoslico, chaperonas moleculares de diversos tipos se unen a la cadena en sntesis, ayudndola a adquirir la conformacin nativa. Esta unin transitoria evita que las protenas recin sintetizadas alcancen espontneamente un estado de agregacin irreversible. Respecto del extremo aminoterminal, existen secuencias aminoacdicas estabilizadoras, que aseguraran una vida media prolongada y otras desestabilizadoras, las cuales favoreceran

la marcacin de las protenas en dicho extremo. Tal marcacin las conducira a su degradacin. Esto es conocido como la regla del aminoterminal. Si una protena adquiere un plegamiento anmalo, o se ha desnaturalizado, o bien su extremo aminoterminal es desestabilizante, entonces sta pasa a unproceso de ubiquitinizacin. La ubiquitinizacin consiste en la adicin de varias molculas de un polipptido bsico de 76 aminocidos, muy conservado evolutivamente: la ubiquitina. La va de la ubiquitina consta de varios pasos mediados por enzimas, que implican gasto de energa (ATP). Otra va compite con la ubiquitinizacin. Las protenas desnaturalizadas son conducidas por chaperonas moleculares hasta una chaperona oligomrica o chaperonina. stas pueden recuperar el plegamiento nativo de la protena, en tanto se unan a ella en una etapa previa o temprana de la ubiquitinizacin. En caso contrario, la protena ubiquitinizada, ser captada por un complejo enzimtico denominado proteasoma.

Fig. 11.43 - Accin de los proteasomas y chaperonas sobre las protenas citoslicas

Los proteasomas estn formados por ms de una docena de proteasas, que se organizan en cuatro anillos apilados que delimitan un cmara central. En ambos extremos de este canal,

se localizan sendos complejos regulatorios, formados por diferentes ATPasas, y varios sitios de reconocimiento de la ubiquitina. La protena ubiquitinizada es reconocida por la partcula regulatoria del proteasoma perdiendo su plegamiento por accin de las ATPasas, con gasto de energa. La protena desenrollada es translocada dentro de la cmara central, donde las proteasas la degradan. Se producen oligopptidos de aproximadamente 8 aminocidos de longitud. La partcula regulatoria libera la ubiquitina para ser nuevamente utilizada. Tanto la actividad de las chaperonas como la de los proteasomas, aunque contrarias en su accin, garantizan la calidad de las protenas presentes en el citosol.

RESUMEN DE LOS MECANISMOS DE REGULACIN GNICA EN EUCARIOTAS

Control transcripcional A- Factores de transcripcin B- Grado de condensacin de la cromatina C- Grado de metilacin Control procesamiento del ARNm Control transporte del ARNm Control traduccional Control ARNm de la degradacin Empalme alternativo Mecanismos que determinan si el ARNm maduro sale o no a citosol Mecanismos que determinan si el ARNm presente en el citosol es o no traducido del Mecanismos que determinan la supervivencia del ARNm en el citosol Mecanismos que determinan la activacin o desactivacin de una protena, como as tambin el tiempo de supervivencia de la misma.

Control de la actividad proteica

3 Robert Tjian ensea biologa celular y molecular en la Universidad de California , en Berkeley, desde 1979. 4 Alberto Kornblihtt es Doctor en Qumica y Licenciado en Biologa. Ensea Biologa Molecular en la
Facultad de Cs. Exactas y Naturales de la UBA.

AUTOEVALUACIN
1) Describa el proceso por el cual la informacin de un gen es transcripta y traducida a una cadena polipeptdica. Utilice para su descripcin los siguientes trminos: transcripcin, codn stop, anticodn, ARNt, codn, aminocido, codn iniciacin, ARNm, unin peptdica, ARN polimerasa, ribosoma, traduccin, gen.

2) La siguiente secuancia de un gen : CCAAAGGGAGCGCGGCAA, codifica para una corta cadena polipeptdica. Indique: a)la secuencia de bases del ARNm transcripto del gen b)la secuencia de aminocidos de la cadena polipeptdica resultante. (Utilice la tabla del cdigo gentico) 3) Qu sucedera en el funcionamiento del opern triptofano si se produjera: a)una mutacin en el gen regulador y la protena represora perdiera afinidad por el triptofano. b)una mutacin de la secuencia promotora y la ARNpol no puede unrsele. c)una mutacin en la secuencia operadora y el complejo represor-co-represor no puede unrsele. PREGUNTAS DE OPCIN MULTIPLE 1) Sus clulas epiteliales y musculares son diferentes porque cada clula: abcdcontiene diferentes clases de genes expresa diferentes genes contiene diferente nmero de genes ha sufrido diferentes mutaciones.

2) Cul de los siguientes mecanismos de regulacin gnica es comn en procariotas y eucariotas?: abcdel grado de condensacin del ADN la accin de protenas activadoras y represoras de genes la adicin de la cap y la cola poli A en el ARNm el sistema opern lac y triptofano

3) Es requisito para la transcripcin: abcduna ARNpol ribonuclesidos trifosfato un ADN molde todas son correctas

4) El sitio de unin de la ARN pol al molde de ADN se denomina: abcdregulador codificador operador promotor

5) Cul de los siguientes elementos participa tanto en la transcripcin procariota como eucariota?: abcdfactores de transcripcin basales ADN molde ARN pol II Factores de transcripcin especficos

6) Durante la traduccin, es caracterstico de la etapa de iniciacin el acoplamiento de: abcdel codn con el anticodn iniciador la subunidad mayor con la subunidad menor el ARNm con la subunidad menor todas son correctas

7) Cul de las siguientes enzimas participa en la activacin de los aminocidos?: abcdpeptidasa seal aminoacil ARNt sintetasa peptidil transferasa ARN polimerasa

8) En procariotas la traduccin es: abcposterior a la transcripcin y maduracin de los ARNm anterior a la transcripcin y maduracin de los ARNm simultnea a la transcripcin y maduracin de los ARNm

d-

simultnea a la transcripcin

9) Cul de la siguientes interacciones determina donde finaliza la traduccin de un mensaje?: abcdARNt y aminocido Codn stop y anticodn Codn stop y factor proteico Subunidad menor y ARNm

10) La energa necesaria para que se produzca la unin peptdica proviene de: abcduna molcula de GTP la unin del aminocido con el ARNr la unin del aminocido con el ARNt la unin del ARNt con el ARNr

11) El cdigo gentico es: abcddegenerado, ambiguo y solapado no degenerado, no ambiguo, no solapado degenerado, no ambiguo, no solapado degenerado, ambiguo, no solapado las siguientes secuencias establece un orden decreciente de

12) Cul de estructuras?: abcd-

gen- cromosoma- nucletido- codn cromosoma- gen- codn- nucletido nucletido- cromosoma- gen- codn gen- cromosoma- codn- nucletido