Manual de Procedimiento Atb Who

Manual de Procedimientos
Sensibilidad a los antimicrobianos en Salmonella, Shigella y E. coli
2008
AUTORES Bioq. Fernando Pastern Bioq. Marcelo Galas
Dto. Bacteriologa Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas A.N.L.I.S. Dr. Carlos G. Malbrn Centro Regional de Referencia WHO-Global Salm Surv para Amrica del Sur.
Sensibilidad a los antimicrobianos

Las pruebas de sensibilidad deben realizarse sobre microorganismos asociados a infecciones cuando su sensibilidad no se pueda predecir a partir de su identificacin. La determinacin de la sensibilidad est indicada en los casos en que el microorganismo causal de la infeccin pertenezca a una especie
capaz de exhibir resistencia a los antibiticos de uso clnico. Los mecanismos de resistencia a los agentes antimicrobianos incluyen: produccin de enzimas inactivantes, alteraciones en el sitio de accin y modificaciones en el ingreso o el eflujo de las drogas. Para los microorganismos que posean sensibilidad antibitica predecible se recomienda la aplicacin de la terapia emprica adecuada. Las pruebas de sensibilidad tambin son importantes en estudios de epidemiologa de la resistencia y de nuevos agentes antimicrobianos. Para realizar pruebas de sensibilidad e identificacin se debe partir de un cultivo primario en medio slido y se debe procesar colonias aisladas de cada tipo de microorganismo que pueda tener rol patgeno. No se deben realizar pruebas de sensibilidad sobre mezclas de diferentes tipos de microorganismos, ni sobre el material clnico sin procesar, excepto para emergencias clnicas donde la coloracin de Gram sugiera la presencia de un slo patgeno. Cuando la prueba de sensibilidad haya sido realizada a partir del material clnico, se debe informar como resultado preliminar y se debe repetir utilizando la metodologa estandarizada. No es aconsejable la realizacin de pruebas de sensibilidad cuando no es clara la naturaleza de la infeccin y la muestra contiene flora normal o polimicrobiana, en la cual el o los microorganismos aislados probablemente tengan poca relacin con el proceso infeccioso. En estos casos los resultados obtenidos pueden conducir a errores en el tratamiento.
1. Difusin por discos

INTRODUCCION La metodologa empleada en la actualidad para la determinacin de la sensibilidad a los antimicrobianos es el producto de importantes esfuerzos internacionales que, desde hace ms de tres dcadas, estn enfocados a estandarizar la tcnica. Un comit de expertos de la OMS y grupos colaborativos internacionales dirigidos por Ericsson y Sherris sugirieron recomendaciones que fueron seguidas por la mayor parte de los pases europeos. Sin embargo, la falta de un acuerdo general sobre los puntos de corte para la interpretacin de estas pruebas contina siendo un tema de discusin a nivel internacional. Europa est dividida en varias regiones de influencia con diferentes recomendaciones para la determinacin de sensibilidad antimicrobiana: Grupo Sueco de Referencia en Antimicrobianos, el Sistema DIN, el de los pases bajos, la Sociedad Britnica de Antimicrobianos, la Sociedad Francesa de Microbiologa y el Comit de Estandarizacin de Laboratorios Clnicos (ex NCCLS, hoy denominado CLSI). En la mayora de los pases de Latinoamrica se siguen las pautas del CLSI, en algunos casos, con pocas modificaciones. El siguiente es un resumen de la metodologa referida habitualmente como "Mtodo de la OMS", que no difiere substancialmente del conocido "Kirby-Bauer". El documento que se ha tomado como base es el M2 A9 del Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI, del ao 2006 y las Tablas de interpretacin corresponden al suplemento M100 S17 del ao 2007. El mtodo recomendado por el Subcomittee on Antimicrobial Susceptibility Testing del CLSI se basa en los estudios de Bauer y colaboradores (1). Esta metodologa est descrita detalladamente y cuenta con Tablas de interpretacin que estn respaldadas por una gran cantidad de datos clnicos y de laboratorio. La modificacin de doble capa de Barry, Garca y Thrupp (2) es un mtodo alternativo que demostr datos comparables de los dimetros de las zonas de inhibicin, con precisin similar al del CLSI y con una correlacin satisfactoria con la CIM. Este mtodo es una alternativa aceptable para la estandarizacin del inculo en las pruebas de sensibilidad de bacterias de rpido crecimiento, como S. aureus, Enterobacterias y P. aeruginosa. El mtodo de doble capa en agar no es aplicable a las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos de microorganismos con requerimientos nutricionales especiales como Streptococcus spp., Haemophilus spp., etc. Las Tablas para la interpretacin de los dimetros de inhibicin recomendadas por el CLSI (M100S17) se pueden utilizar para cualquiera de las dos metodologas descritas. La difusin con discos es una metodologa muy sencilla pero requiere un estricto control de calidad interno de cada uno de los pasos y los insumos que intervienen en su realizacin. El control de calidad interno de las pruebas de sensibilidad por difusin es un requisito indispensable para validar los resultados de los aislamientos clnicos. En muchos casos, variaciones pequeas en la calidad de los reactivos o en algunos detalles metodolgicos, se traducen en resultados totalmente distintos a los reales. El American Type Culture Collection (ATCC, USA) dispone de todas las cepas patrones necesarias para llevar a cabo este proceso.
Indicaciones para la realizacion de las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos
Las pruebas de sensibilidad contribuyen a orientar el tratamiento antimicrobiano de los procesos infecciosos. No es necesario realizar pruebas de sensibilidad en aquellos casos en los que la identificacin del microorganismo es suficiente para predecir la sensibilidad a los antimicrobianos (por ejemplo S. pyogenes vs penicilina). Las pruebas de sensibilidad pueden ser necesarias cuando, a pesar de conocerse la sensibilidad del germen a drogas altamente efectivas, el paciente no puede recibir dicha medicacin. El antibiograma tambin puede ser indicado con fines epidemiolgicos y en el estudio de nuevos antibiticos. Las pruebas de sensibilidad se deben realizar a partir de una cepa aislada. No se debera realizar el antibiograma en forma directa a partir del material clnico, excepto en las emergencias clnicas donde la coloracin directa de Gram sugiere cultivo monobacteriano. En este caso, debe repetirse luego usando la metodologa estandarizada. En el caso particular de Salmonella sp., Shigella spp y Escherichia coli aisladas de materia fecal se ha descrito resistencia a todos los antibiticos tiles para su tratamiento. Este hecho determina la necesidad de realizar pruebas de sensibilidad en todos los casos. Estos patogenos producen fundamentalmente diarreas pero su capacidad invasiva le confiere la posibilidad de hacer infecciones sistmicas. El tratamiento antimicrobiano en cada una de estas situaciones clnicas es muy distinto y por lo tanto tambin lo es la eleccin de los antibiticos a ensayar en el antibiograma.
Principios del mtodo El principio del mtodo involucra la aplicacin de una cantidad determinada de antimicrobiano en un reservorio (disco de papel, pastillas con drogas en estado cristalino, etc.) en la superficie del agar sobre la cual se ha distribuido un inculo del microorganismo en cuestin; se formar as, por difusin, un gradiente de concentracin de antimicrobiano alrededor del reservorio y la sensibilidad del microorganismo estar indicada por el tamao de la zona de inhibicin del crecimiento bacteriano. El dimetro obtenido depender no slo de la sensibilidad del microorganismo y la carga del disco, sino tambin del espesor de la capa de agar Mueller Hinton, su pH y composicin, de la capacidad de difusin de la droga en ese medio, de la temperatura y atmsfera de incubacin, de la velocidad de duplicacin bacteriana, del tamao del inculo y la fase de crecimiento de la bacteria, etc. Todas estas son las variables ms importantes que afectan el resultado del antibiograma. Una vez colocado el disco en la superficie del agar, la difusin del antibitico que contiene comienza instantneamente y sigue hasta alcanzarse un gradiente continuo de concentraciones alrededor del reservorio. Este gradiente se alcanza aproximadamente a las 6 hs. El tamao de la zona de inhibicin depender del equilibrio entre la difusin del antibitico y la velocidad de crecimiento del microorganismo. Las recomendaciones del CLSI son: colocar los discos dentro de los 15 minutos de inoculada la placa y proceder a la incubacin de la misma dentro de los 15 minutos posteriores a la colocacin de los discos. Cualquier variacin en estos tiempos ocasionar un desplazamiento del equilibrio antes mencionado que se traduce en errores en el tamao de la zona de inhibicin. Como la difusin del disco comienza instantneamente despus de apoyado sobre el agar, estos nunca deben levantarse para cambiarlos de lugar en el antibiograma porque seguramente ya no tendrn la carga de antibitico original. Para que los resultados sean confiables los procedimientos debern ser controlados cuidadosamente y las Tablas de interpretacin tendrn validez nicamente cuando la metodologa utilizada en el laboratorio sea estrictamente comparable con la aplicada en la elaboracin de dichas Tablas.
Fundamentos para la interpretacion de las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos por el metodo de difusion Para cada antimicrobiano se establecen "concentraciones crticas" o "puntos de corte" que permiten separar a los microorganismos en tres categoras, sensibles, resistentes o de sensibilidad intermedia. Estas categoras se establecen para cada bacteria frente a cada antibitico comparando la CIM en cada caso con los puntos de corte establecidos. *Sensible: Un microorganismo se considera "sensible" a un antibitico cuando se puede esperar que una infeccin causada por el mismo responda al tratamiento con dicho frmaco a la dosis recomendada. *Resistente: este trmino indica que no es probable que la infeccin causada por el microorganismo responda al antibitico en cuestin, cualesquiera que sean la dosis y la localizacin de la infeccin.
*La categora sensibilidad intermedia se aplica a dos situaciones. Por un lado, se incluyen en ella las cepas con sensibilidad disminuida a un antibitico que puede utilizarse con xito, para el tratamiento en dosis ms altas, por ser poco txico o porque se concentra en el foco de infeccin (por ejemplo, antibiticos -lactmicos o quinolonas en la orina). En esta categora se incluyen asimismo las cepas de "sensibilidad intermedia" a antibiticos que, por ser ms txicos, no puede usarse en dosis ms altas. En este caso, la categora intermedia sirve como una zona de transicin entre las cepas sensibles y las resistentes y previene pequeos errores causados por factores tcnicos. Muchas veces un resultado intermedio requiere la definicin de la sensibilidad mediante el uso de un mtodo cuantitativo como la CIM. La decisin definitiva sobre el uso de un determinado antibitico y sobre la dosificacin del mismo no slo depende de los resultados de las pruebas de sensibilidad sino tambin de la interpretacin de las mismas por el equipo de salud. Tambin habr que tener en cuenta otros factores como el rol patognico del microorganismo, los efectos secundarios y las propiedades farmacocinticas del medicamento, su penetracin a los diferentes sitios de infeccin y el estado inmunitario del husped, etc.
Seleccion de los agentes antimicrobianos para las pruebas de sensibilidad La seleccin de los agentes antimicrobianos apropiados para la prueba de difusin, es una decisin de cada laboratorio clnico en consulta con el cuerpo mdico, el comit de farmacia y el comit de enfermedades infecciosas. Para la seleccin de los antimicrobianos a ensayar en las pruebas de sensibilidad se deben tener en cuenta las siguientes consideraciones: eficacia clnica, prevalencia de resistencia, costo, indicaciones del FDA, recomendaciones consenso para drogas de primera eleccin y alternativos. Se pueden obtener resultados incorrectos (sensibilidad in vitro, falla teraputica in vivo) cuando se ensayan determinados agentes antimicrobianos con ciertos microorganismos. Algunos ejemplos de estas combinaciones incluyen: cefalosporinas de 1ra. y 2da. generacin y aminoglucsidos frente a Salmonella spp. y Shigella spp. Por ello se resume las drogas con actividad frente a Salmonella y Shigella spp.: Aminopenicilinas (Ampicilina) Trimetoprima/sulfametoxazol Quinolonas fluoradas (ciprofloxacina o norfloxacina) Fosfomicina Tetraciclinas (Tetraciclina) Cloranfenicol (slo para aislamientos de infeccin sistmica de Salmonella) Nitrofuranos (solo para aislamientos de Shigella) Cefalosporinas de tercera generacin (cefotaxima/ceftriaxona solo para aislamientos de infeccin sistmica) Otras drogas inapropiadas para tratamiento de diarreas pueden ser probadas para proveer datos taxonmicos o informacin epidemiolgica (como es el caso de la gentamicina). Sin embargo, tales resultados debern estar disponibles slo para el laboratorio o para el comit de control de infecciones. El ensayo de algunas drogas es muy til como indicador de la presencia de mecanismos de resistencia de difcil deteccin. Son ejemplos de estos casos: cido nalidixico para detectar sensibilidad disminuida a las fluorquinolonas y ceftacidima o el disco de amoxicilina/ ac. clavulnico a 30 mm del disco de una cefalosporina de tercera generacin o disco de cefpodoxima como detectores de -lactamasas de espectro extendido (Famiglietti A, et al. Consensus for antimicrobial susceptibility testing for Enterobacteriaceae. Subcommittee on Antimicrobials, SADEBAC (Argentinian Society of Clinical Bacteriology), Argentinian Association of Microbiology. Rev Argent Microbiol. 2005 Jan-Mar;37(1):57-66.). Una ventaja adicional del disco de cefpodoxima es su alta sensibilidad para detectar cepas de Salmonella y/o Shigella productoras de ampC plasmidicos (Rapoport etr al, CMY-2 type -lactamase finally emerging in Argentina, aceptado para publicacion en Int. J. Antimicrob. Agents) Para la realizacin de una adecuada prueba de sensibilidad, el nmero de agentes probados debe ser limitado. En general, deber incluir slo un representante de cada grupo de drogas relacionadas que tengan muy similar actividad y para las cuales la interpretacin podra ser la misma.
MATERIALES Equipos Ansas para inocular tipo loop (1-10 l) Pinzas Mechero tipo Bunsen Regla o calibre Pipetas Pasteur plsticas descartables
Soluciones, reactivos y medios de cultivo Solucin fisiolgica estril, 3 ml en tubos Caldo apropiado (tripteina soja (soya) u otro) esteril ,4 5 ml en tubos Placas con agar Mueller Hinton (profundidad del agar de 4 mm ) Discos de antibiticos Estndar de turbidez equivalente al 0.5 de la escala de Mc Farland
Preparacin del Agar Mueller Hinton
Comentarios tericos
(1) Prepar el agar M. Hinton a partir de la base deshidratada de acuerdo a las recomendaciones del fabricante. (2) Inmediatamente despus de esterilizar dejar enfriar en bao de agua hasta 45-50C.
De los medios disponibles se considera al agar MHinton como el mejor para las pruebas de sensibilidad de rutina dado que: Muestra buena reproducibilidad lote a lote en las pruebas de sensibilidad. Contiene bajo nivel de inhibidores de sulfonamidas, trimetoprima y tetraciclina. Es adecuado para el desarrollo de la mayora de las bacterias patgenas. Existen suficientes datos recopilados que avalan la experiencia de las pruebas de sensibilidad realizadas en este medio. Aunque el agar M. Hinton es generalmente confiable para las pruebas de sensibilidad, los resultados obtenidos con algunos lotes pueden, en ocasiones, variar significativamente. Si un lote de medio no sustenta el adecuado crecimiento de los microorganismos probados, los halos obtenidos en las pruebas por difusin podran ser mayores quedando fuera de los lmites de control de calidad, conduciendo a resultados errneos.
(3) Dispensar el medio en las placas de Petri de fondo plano hasta un nivel aproximado de 4 mm. Esto corresponde a 60 - 70 ml de medio para placas de 150 mm. de dimetro y 25 a 30 ml. para las de 100 mm. de dimetro interno.
Se ha demostrado que con volmenes mayores o menores de agar, la prueba pierde reproducibilidad ya que pequeas variaciones tienen efectos significativos. Placas de espesores menores a los 4 mm producirn zonas de inhibicin ms grandes a las esperadas pudiendo ocasionar falsa sensibilidad al momento de interpretar los halos obtenidos. El fenmeno opuesto se obtendr con espesores mayores a los 4 mm. Controle la profundidad de entre 2 a 5 placas del total del lote preparado. Para medir la profundidad introduzca dentro del agar un elemento fino, estril, marcado en 3 y 5 mm de uno de sus extremos. El rango de profundidad aceptado para la prueba de difusin es de 3 a 5 mm. Antes de colocar el medio en la placa de petri debe asegurarse que la mesada donde est trabajando est perfectamente nivelada. De no ser as, el agar en las placas quedar inclinado conduciendo a errores por la heterogeneidad del espesor del mismo. Las placas almacenadas en bolsas de plstico tienen un perodo de uso de hasta 70 das.
(4) Las placas que no se usan en el da pueden mantenerse en refrigerador (2-8 C.). (5) Las placas con ms de 7 das de preparacin no son adecuadas para las pruebas de sensibilidad salvo que sean envueltas en bolsas de plstico para evitar la desecacin, de lo contrario debern controlarse con los microorganismos de referencia (6) Debe controlarse la esterilidad de una muestra representativa de cada lote incubando 24 horas o
ms a 30-35 C. Luego descar esas muestras. No deber observarse crecimiento de colonias bacterianas o micticas. Para verificar la esterilidad del medio, tome una muestra equivalente al 5-10% del total del lote producido. Ignorar cualquier contaminacin espordica; ej. una fraccin de medio. Descartar el lote completo, si el nivel de contaminacin es significativo (>10% del medio controlado).
pH: El agar Mueller Hinton debe tener un pH 7,2 7,4 a temperatura ambiente y debe determinarse despus de su solidificacin.
El pH para cada lote debe ser controlado cuando se prepara cada lote de medio. Si el pH est por debajo de 7,2, ciertas drogas (por ej. aminoglucsidos, quinolonas y macrlidos) parecern menos activas; mientras otras (p ej. tetraciclinas) parecern tener mayor actividad. Si el pH es demasiado alto se observarn los efectos opuestos. Ver Tabla 1 Si el pH est muy alejado del rango aceptable debe controlarse el procedimiento de la preparacin del medio.
Es ideal el uso de electrodos de superficie, pero tambin resulta satisfactoria la determinacin del pH del macerado de una alcuota solidificada de agar, suficiente para que el bulbo del electrodo quede totalmente sumergido. Las correcciones necesarias se deben realizar por el agregado de NaOH 1M o HCl 1M
El mtodo a utilizar depender del tipo de equipo disponible en cada laboratorio Debe asegurarse que el electrodo de superficie est adecuadamente calibrado.
El agregado de grandes volmenes de estas soluciones para correccion del pH puede alterar el contenido de sales del medio.
Humedad: Si justo al momento de usar las placas hay exceso de humedad en la superficie, stas se deben colocar a 35C durante 10 - 30 min hasta que desaparezcan las gotas de humedad superficiales.
Las placas debern estar hmedas pero no mostrar gotas sobre la superficie del medio ya que distorsionarn las zonas de inhibicin.
Efecto de la Timina o Timidina: Para evaluar cada lote de Mueller Hinton en su contenido de Timidina se debe ensayar el Enterococcus faecalis ATCC 29212 o ATCC 33186 frente al disco de trimetoprima / sulfametoxazol. Un medio satisfactorio mostrar un halo de inhibicin claro y definido de 20 mm o ms. En caso que se observe una zona de inhibicin < 20 mm podr procederse al agregado de timidina fosforilasa o sangre lisada de caballo.
Los medios que contienen excesiva cantidad de timina o timidina pueden revertir los efectos inhibitorios de las sulfonamidas y trimetoprima, produciendo as zonas ms pequeas, menos ntidas o sin halo lo cual puede dar como resultado un informe de falsa resistencia.
La timidina fosforilasa ya sea en su forma pura (aislada) o contenida en la sangre lisada de caballo eliminar los excesos de timidina presentes en el medio. Este procedimiento mejorar la nitidez de los halos y la confiabilidad de las pruebas de sensibilidad para sulfonamidas y trimetoprima frente a patgenos comunes.
Un agar Mueller Hinton con elevado contenido de timina o timidina no podr ser utilizado para el ensayo de trimetoprima, sulfonamidas o la combinacin de ambas drogas pero podr utilizarse para ensayar la actividad de cualquier otro antimicrobiano.
Efectos por variacin en la composicin de cationes divalentes. Las pruebas de control de cadidad interno realizadas con cada lote de agar M. Hinton deben estar de acuerdo con los rangos de dimetros sugeridos para las correspondientes cepas ATCC (ver Control de Calidad). Los resultados de las pruebas con las cepas patrones deben ser cuidadosamente observados para detectar cualquier valor aberrante debido a la composicin de cationes del medio de cultivo.
La variacin en cationes divalentes principalmente Ca++ y Mg++ afectarn los resultados con tetraciclina, colistn y aminoglucsidos sobre todo frente a P. aeruginosa. Un excesivo contenido de cationes reducir la zona de inhibicin, mientras que bajas concentraciones de cationes resultarn en zonas de inhibicin mayores que las esperadas. Un exceso de zinc podra reducir las zonas de inhibicin de los carbapenems Los rangos aceptables son los siguientes (Mtodo de absorcin atmica o equivalente): Ca++ = 20 -25 mg/L; Mg++ = 10 -12.5 mg/L.
Aspecto: Antes de su utilizacin, se debe controlar que los medios de cultivo no presenten evidencia de: - Decoloracin - Deshidratacin - Rotura del agar - Volumen insuficiente - Heterogeneidad del espesor de la capa de agar - Otros signos de deterioro
Descartar los medios que presenten alguna de estas caractersticas
Tabla1 Variacin de la actividad de diferentes antimicrobianos con el cambio del pH Se incluyen tambin antibiticos sin actividad frente a Salmonella y Shiegella spp. AUMENTO DE LA ACTIVIDAD pH cido Amoxicilina Amplicilina Carbenicilina Cloxacilina Piperacilina Tetraciclina Doxiciclina Minociclina Nitrofurantoina pH alcalino Amicacina Netilmicina Estreptomicina Tobramicina Claritromicina Eritromicina Ac. Nalidixico Quinolonas Fluoradas
DISMINUCION DE LA ACTIVIDAD pH cido Azitromicina Claritromicina
Clindamicina Metronidazol
CAMBIOS EN LA ACTIVIDAD CON EL AUMENTO O DISMINUCION DEL pH Penicilina Cefalotina Cefalexina Cefoperazona Ceftazidima Ceftriaxona Cloranfenicol Polimixina B Sulfonamidas Trimetoprima
Conservacin de los discos
Comentarios tericos
Los discos deben mantenerse refrigerados a 2 8C (si van a ser utilizados en los siguientes 7 das) o en congelador (freezer) a -14 C o menos (para conservacin a largo plazo).
Para mantener su potencia, todos los discos deben mantenerse en congelador (freezer) especialmente los que contienen drogas de la familia de los lactmicos. Slo los discos que se estn usando diariamente pueden permanecer en el refrigerador Este proceso evita la condensacin que podra ocurrir cuando la humedad ambiente alcanza los frascos fros. La mayora de las drogas antibacterianas son ms sensibles a la exposicin a un ambiente hmedo que a temperaturas templadas. Los antimicrobianos ms afectados por los problemas de conservacin son, en general, los -lactmicos y dentro de esta familia, los carbapenemes (meropenem e imipenem), oxacilina, cefaclor, las combinaciones de lactmicos con inhibidores de -lactamasas (amoxicilina/ac. clavulnico, ampicilina/sulbactam, ticarcilina/ac. clavulnico, cefoperazona/sulbactam y piperacilina/tazobactam) son los ms lbiles.
Los discos deben guardarse en contenedores hermticos con desecante y ser sacados del refrigerador o congelador (freezer) 1 2 horas antes de su uso a fin de lograr un equilibrio en la temperatura antes de ser abiertos los frascos o contenedores
Cuando el indicador del desecante usado (por ej. gel de slice) cambia de color debe interpretarse como un exceso de humedad y reemplazarse.
Patrn de turbidez
Comentarios tericos
Para estandarizar la densidad del inculo se usa una suspensin de sulfato de bario como estndar
Una turbidez equivalente al 0.5 de Mc Farland representa aproximadamente 108 UFC/ml para
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de turbidez (0.5 de la escala de Mc Farland).
bacterias de rpido crecimiento. La estandarizacin de inculo es esencial ya que el tamao de la zona de inhibicin es muy dependiente de la densidad del inculo utilizado.
Preparar dicho estndar agregando 0,5 ml de BaCl2 0,048M (1,175% P/V BaCl2.2H2O) a 99,5 ml de H2SO4, 0,18 M (0,36 N) (1% V/V). Verificar la densidad correcta del estndar usando un espectrofotmetro. La absorbancia a 625 nm debe ser 0,08 a 0,10, para el estndar 0,5 de Mc Farland. (Ver Tabla 2) Distribuir en 4-6 ml dentro de tubos similares a los usados para la preparacin de los inculos de las cepas clnicas y mantener guardados a temperatura ambiente y al abrigo de la luz. Inmediatamente despus de su preparacin, los tubos se deben sellar hermticamente para evitar la evaporacin y concentracin de la suspensin. Agitar vigorosamente con vortex o manualmente el estndar antes de su uso para lograr una turbidez homognea. Reemplazar o verificar la confiabilidad de los estndares mensualmente. Descartar los estndares, que presenten alguna evidencia de evaporacin. Esto pude controlarse marcando los tubos en el momento de la preparacin con una marca a la altura del menisco. Si la evaporacin es evidente, descartar los tubos. Recordar que los patrones de turbidez de SO4Ba tienen una vida til de aproximadamente un ao. Luego de transcurrido este tiempo deben ser reemplazados por un nuevo lote.
Tabla 2 Preparacin de los estndares de Mc Farland Estndar No 0.5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Volumen (ml) BaCl2 (1,175 %) H2SO4 (1 %) 0.5 99.5 1.0 99.0 2.0 98.0 3.0 97.0 4.0 96.0 5.0 95.0 6.0 94.0 7.0 93.0 8.0 92.0 9.0 91.0 10.0 90.0 Equivalente en No de bacterias/ml (x108) 1.5 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30
PROCEDIMIENTO
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Da 1 a) Preparacin del inoculo A partir de 4 5 colonias bien aisladas y de igual morfologa en un medio de aislamiento primario preparar una suspensin en 4 5 ml de un caldo apropiado (tripteina soja (soya) u otro) tocando la parte superior de cada colonia.
Comentarios tericos
Las pruebas de sensibilidad se deben realizar a partir de una cepa aislada. Se debera evitar realizar el antibiograma en forma directa a partir del material clnico, excepto en las emergencias clnicas donde la coloracin directa de Gram sugiere naturaleza monobacteriana. En este caso, debe repetirse luego usando la metodologa estandarizada.
Para esta operacin se puede utilizar ansa o hisopo. Incubar el tubo de cultivo a 35-37 C hasta que se alcance o exceda la turbidez del estndar equivalente al 0,5 de Mc Farland (2 - 4 h). Alternativamente el inculo puede ser obtenido directamente a partir de colonias seleccionadas de una placa de cultivo no selectivo, de no ms de 18 a 24 horas de incubacin. Proceder a ajustar directamente el inoculo (paso siguiente) sin incubacin previa. Cuando se prueban discos de trimetoprimasulfametoxazol con este mtodo de preparacin del inoculo de colonia aislada sin incubacion previa en medio liquido, pueden arrastrarse sustancias antagnicas que producen un crecimiento con aspecto de niebla dentro de la zona del halo de inhibicin.
b) Estandarizacin del inculo Ajustar la densidad de los cultivos que se encuentran en fase logartmica, con solucin salina o caldo, por comparacin visual hasta turbidez equivalente al tubo 0,5 de la escala de Mc. Farland. Para facilitar este procedimiento, mire los tubos contra un fondo blanco con una lnea negra como contraste. Importante: agitar muy bien el estndar de turbidez antes de proceder a la comparacin Una turbidez equivalente al 0.5 de Mc Farland representa aproximadamente 108 UFC/ml para bacterias de rpido crecimiento. La estandarizacin de inculo es esencial ya que el tamao de la zona de inhibicin depende de la densidad del inculo. Para la interpretacin de las pruebas de sensibilidad con las tablas recomendadas por el CLSI se requiere un inculo confluente.
Utilizar para esta operacin las pipetas Pasteur descartables y transferir unas gotas a un tubo con solucin fisiolgica estril.
Nunca utilice inculos no estandarizados para el hisopado de las placas. Evitar extremos en la densidad del inculo. Los excesos o defectos en la densidad del inculo producen cambios muy grandes en los resultados finales del ensayo
c) Siembra de las placas Dentro de los 15 minutos despus de ajustado el inculo, inocular las placas de Mueller Hinton con un hisopo estril. Para evitar el sobrecrecimiento del inculo bacteriano no excederse de los 15 minutos
Presionar el hisopo contra las paredes del tubo a fin de escurrir el exceso de inculo. Sembrar la superficie seca del Mueller Hinton por hisopado en tres direcciones para asegurar una Resultados reproducibles y confiables requieren una distribucin homognea del inculo en las
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completa y homognea distribucin del inculo.
placas.
Esperar de 3 a 5 minutos, pero no ms de 15 min. antes de aplicar los discos para que el exceso de humedad superficial producido por la inoculacin sea completamente absorbido
d) Colocacin de los discos Colocar los discos sobre la superficie del agar con pinza estril aplicando una ligera presin a una distancia no menor a 24 mm desde un centro al otro. La distancia al borde de la placa al disco no debe ser menor de 14 mm Debido a que todas las drogas difunden casi instantneamente, un disco no debe ser removido una vez que tom contacto con la superficie del agar. Si el disco es desplazado del lugar donde tom contacto con el agar, la carga de antibitico del mismo ser menor que la estandarizada, por lo que se observara una tendencia a la falsa resistencia.
No deben colocarse ms de 5 discos por placa de 90 mm o 12 en placa de 150 mm. La colocacin de los discos se realizar segn figura 1
e) Incubacin de las placas Llevar las placas a la estufa dentro de los 15 minutos posteriores a la colocacin de los discos. Estas se deben incubar invertidas, a 35oC2 por 16 a 18 horas y en ambiente aerbico.
Figura 1 Esquema sugerido para la colocacin de los discos
CIP
NIT
FOS
AMP
TET
CTX
CHL
TMS
GEN
Placa 1
NAL
Placa 2
CIP: ciprofloxacina; NIT: nitrofurantona; CTX: cefotaxima; GEN: gentamicina; TET: tetraciclina; FOS: fosfomicina; AMP: ampicilina; TMS: trimetoprima/sulfametoxazol; NAL: cido nalidxico, CHL: cloranfenicol. Este esquema tiene en cuenta el tamao de las zonas de inhibicin usuales que producen los distintos antibiticos frente a Salmonella y Shigella spp. y est diseado de manera de evitar la superposicin de las zonas de inhibicin producidas.
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Da 2 f) Lectura de las placas e interpretacin de resultados Examinar y verificar la pureza del inculo
Comentarios tericos
Las pruebas de sensibilidad deben ser realizadas de cultivos puros. Si se produjera contaminacin durante la realizacin del ensayo puede ser fcilmente detectado examinando la placa del antibiograma. Las zonas de inhibicin debern ser uniformemente circulares y el desarrollo confluente. La presencia de colonias aisladas indica un inculo bacteriano de densidad inferior al estandarizado. Se deber repetir la prueba. Lo mismo si el inculo bacteriano fuere ms denso que el recomendado. En algunas oportunidades en el antibiograma, entre discos ubicados cercanos unos de otros puede producirse alguna distorsin de las zonas de inhibicin (por ejemplo antagonismo, sinergia, induccin y/o inhibicin) y estas zonas de inhibicin no se presentarn por ende uniformemente circulares. Esta valiosa informacin adicional no deber considerarse en la lectura de la zona de inhibicin pero provee importante informacin adicional sobre posible identidad bacteriana, mecanismos de resistencia, etc. Colonias mayores creciendo dentro de la zona de inhibicin debern ser subcultivadas, identificadas nuevamente y reevaluadas en cuanto a su sensibilidad a los antimicrobianos.
Examinar y verificar que el crecimiento sea confluente.
Si las placas fueron satisfactoriamente hisopadas y el inculo fue el correcto, las zonas de inhibicin sern uniformemente circulares
Medir los dimetros de las zonas de inhibicin. Para la lectura de los halos se deber tener en cuenta el rea que no muestre desarrollo obvio a ojo desnudo, no incluyendo velo de crecimiento o colonias muy pequeas que puedan ser detectadas slo con mucha dificultad en el borde de la zona de inhibicin. Cuando se prueban discos de trimetoprima/sulfametoxazol no considerar en la lectura un crecimiento del 20% o menos del desarrollo total.
Este fenmeno ocurre por que pueden arrastrarse sustancias antagnicas de la actividad de esta combinacin de drogas que determinan un crecimiento con aspecto de niebla dentro de la zona de inhibicin real. Las interpretaciones de los dimetros de las zonas de inhibicin son provistas por CLSI. Estas tablas de interpretacin fueron obtenidas utilizando un inculo estandarizado que da como resultado un crecimiento confluente. Los puntos de corte para la interpretacin de cada droga se deducen del anlisis de regresin lineal resultante de mltiples determinaciones de un amplio nmero de aislamientos mediante el mtodo de referencia (CIM) y la difusin por discos. El documento del CLSI M100-S17 no incluye puntos de corte para enterobacterias frente a fosfomicina. En este caso los puntos de corte se pueden obtener de otras normas (por ej. Sociedad Francesa de Microbiologa). Del mismo modo, el uso de pruebas de tamizaje para la presencia de BLEE surge de la epidemiologia de Argentina con
Los tamaos de las zonas de inhibicin sern interpretados con las Tabla 2A. Los organismos se informarn sensibles, intermedios o resistentes al antimicrobiano ensayado segn corresponda.
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reportes de presencia de estas enzimas en estos patogenos (Andres P. et al. Int J Antimicrob Agents. 2005 Jun;25(6):501-7. Extended-spectrum -lactamases in Shigella flexneri from Argentina: first report of TOHO-1 outside Japan) g) Informe de los resultados Utilizar la planilla para el registro de los resultados
CONTROL DE CALIDAD Propsito El objetivo de un programa de control de calidad interno es el monitoreo de: La exactitud y precisin de los procedimientos para realizar las pruebas de sensibilidad. La calidad de los reactivos usados en las pruebas. El desempeo de las personas que llevan a cabo los ensayos y la lectura de los resultados. Estos objetivos son alcanzados principalmente por la utilizacin de cepas de referencia seleccionadas por su estabilidad gentica y por su utilidad en los mtodos a ser controlados. Cepas Control Para controlar la precisin y la exactitud de las pruebas de difusin, se deben obtener de una fuente confiable las siguientes cepas patrones para control de calidad: E. coli ATCC 25922 P. aeruginosa ATCC 27853 S. aureus ATCC 25923 E. faecalis ATCC 29212 E. coli ATCC 35218 K. pneumoniae ATCC 700603 E. coli ATCC 35218 productor de -lactamasa se recomienda solamente para el control de calidad de los discos que contengan la combinacin "-lactmico/Inhibidor de -lactamasa", entre estos inhibidores se encuentran: cido clavulnico, sulbactam y tazobactam. Cuando se prueben rutinariamente sulfonamidas, trimetoprima trimetoprima-sulfametoxazol, debe controlarse, para cada lote nuevo de Mueller Hinton, los niveles de timina timidina. Para ello debe utilizarse E. faecalis ATCC 29212 33186. Las siguiente Tabla muestran algunas de las cepas utilizadas ms comnmente en el control de calidad interno, los factores a evaluar y algunas de sus caractersticas.
Tabla 3. Microorganismos sugeridos para el control de calidad de las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos Cepa Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 - Factores a evaluar: Propiedades - Concentracin de cationes: Aumento de resistencia a aminoglucsidos cuando aumenta la concentracin de calcio y magnesio.
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- pH: Aumento de resistencia a aminoglucsidos cuando el pH del medio disminuye. No subcultivar, se seleccionan mutantes resistentes a las penicilinas activas frente a Pseudomonas spp Frente a un doble halo alrededor del disco de imipenem, cambiar el lote de Mueller Hinton. Escherichia coli ATCC 25922 Escherichia coli ATCC 35218 Staphylococcus aureus ATCC 25923 Enterococcus faecalis ATCC 29212 - Calidad de la prueba de sensibilidad - Mide la carga de inhibidores de -lactamasas de los discos para antibiograma. Probar slo frente a combinaciones de antibiticos -lactmicos e inhibidores de -lactamasas como ampicilina/sulbactama, amoxicilina/cido clavulnico, ticarcilina/ cido clavulnico, etc. - Calidad de la prueba de sensibilidad - Concentracin de timidina: Este compuesto interfiere con la actividad de trimetoprima y de sulfametoxazol.
Las cepas patrones para el control de calidad se deben probar y mantener de la siguiente manera: Las cepas de control de calidad se deben probar por la tcnica estandarizada de difusin en agar descrita anteriormente. Los antibiticos a ensayar deben ser los mismos que se utilizan para los aislamientos clnicos. Las cepas de control de calidad de trabajo se deben conservar a 4 - 8C en agar tripticasa de soja (soya) (no exigentes o fastidiosas) y se deben subcultivar semanalmente. Si las quiere almacenar por tiempo prolongado, puede hacerlo de la siguiente manera: mantenga los cultivos a -20 C menos (p ej.: Nitrgeno lquido) en medios adecuados (p ej.: 10-15 % de glicerol en caldo Tripticasa - Soja (Soya), caldo al 50 % de Suero fetal bovino, en sangre de oveja defibrinada en leche descremada) o en estado liofilizado minimizando de esta manera el riesgo de alterar su sensibilidad a los antibiticos. Los cultivos de trabajo deben ser reemplazados por lo menos una vez al mes a partir de cultivos congelados, liofilizados o comerciales. Antes de su utilizacin, las cepas patrones se deben sembrar sobre una placa de agar con el fin de obtener colonias aisladas. Los inculos para realizar los ensayos de sensibilidad con las cepas de referencia se deben preparar siguiendo las mismas indicaciones que se utilizan para los aislamientos clnicos ya sea permitiendo que el cultivo alcance fase logartmica o bien resuspender colonias provenientes de una placa de 18-24 h de incubacin. Las cepas de control de calidad pueden ser utilizadas para ensayar la precisin y la exactitud de las pruebas de sensibilidad hasta tanto no presenten un cambio significativo en los dimetros de las zonas de inhibicin que no puedan ser atribuidos a fallas metodolgicas o de calidad de los reactivos. Si aparecen resultados inexplicables que sugieran un cambio en la sensibilidad propia del microorganismo, se debe obtener un nuevo cultivo a partir de las cepas almacenadas.
Parmetros que se evaluan con las cepas de referencia para el control de calidad
A) Potencia de los antimicrobianos B) Medios de cultivo
Parmetros que NO se evaluan eficientemente con las cepas de referencia para el control de calidad
A) Problemas concernientes al antimicrobiano en las pruebas de sensibilidad (por ej. discos, pocillos o tubos: vacos, secos, sobre o subcargados).
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1. pH 2. Cationes Ca++ y Mg++ 3. Contenido de timidina 4. Factores de crecimiento, composicin del medio 5. Profundidad del agar para la prueba de difusin por discos C) Condiciones de incubacin (temperatura y atmsfera) D) Inculo y tcnica de inoculacin. E) Contaminacin de los medios de cultivo. F) Funcionamiento del instrumental. G) Medida del punto final
B) Contaminacin espordica de los medios de cultivo. C) Mal funcionamiento instrumental. momentneo del
D) Presencia de NaCl en los caldos para la prueba de oxacilina para Staphylococcus spp. E) Lectura subjetiva de puntos finales poco definidos (pej. halos de inhibicin difusos). F) Interpretacin de resultados, uso de criterios apropiados de interpretacin. G) Errores de transcripcin. H) Errores tcnicos individuales.
Son numerosos los factores que pueden dar como resultado una alteracin en el tamao final de las zonas de inhibicin. Las causas probables de algunas de ellas se indican a continuacin.
Efecto observado con las cepas de referencia

Agrandamiento general de las zonas de inhibicin
Causas probables
Bajo inculo Volumen insuficiente del medio de cultivo Sobrecarga de los discos
Disminucin general de las zonas de inhibicin
Alto inculo Volumen excesivo del medio de cultivo Inactivacin de la droga de los discos Discos vencidos
Trimetoprima-Sulfametoxasol, disminucin del tamao de la zona y/o aparicin de colonias internas
Exceso de timidina en el medio de cultivo. Se corrige con el agregado (5%V/V) de sangre lisada de caballo, rica en timidina fosforilasa.
Tetraciclinas, quinolonas fluoradas, colistina o aminoglucsidos - Disminucin de las zonas, especialmente frente a Pseudomonas aeruginosa
-Exceso del contenido de cationes divalentes: Ca++ y Mg++
- Aumento de las zonas
- Escaso contenido de cationes divalentes
Aminoglucsidos, macrlidos - Disminucin de las zonas
pH menor a 7,2
Penicilinas y tetraciclinas - Aumento de las zonas
pH menor a 7,2
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Frecuencia de Realizacin de las pruebas de control de calidad con las cepas de referencia Frecuencia de las pruebas Cada vez que se introduce un nuevo lote de discos de antimicrobianos a la rutina, este se debe ensayar con las cepas patrn de control de calidad apropiadas. Las cepas patrn de control de calidad se deben probar semanalmente y cada vez que se cambie cualquier reactivo que intervenga en la realizacin de las pruebas de sensibilidad; los discos de antibitico a ensayar deben ser los mismos que se utilizan de rutina para los aislamientos clnicos Comentario En general se acepta que en una serie de pruebas uno de cada veinte ensayos consecutivos de control de calidad est fuera de los rangos establecidos. Si aparece ms de un resultado fuera de dichos rangos, se deben tomar medidas correctivas. Cuando un ensayo d como resultado halos de inhibicin que estn fuera del rango aceptable, se deben tomar medidas correctivas. Si la desviacin se puede atribuir a un error obvio, como por ejemplo discos o cepas de control anmalos, contaminacin de la cepa control o atmsfera de incubacin incorrecta, se debe repetir la prueba de control de calidad.
Si dicha desviacin no se puede atribuir a un error obvio, se debe continuar con los controles de calidad diariamente hasta detectar la fuente de error y documentar la solucin del problema.
La obtencin de resultados aceptables con las cepas de control de calidad no garantiza que los resultados obtenidos con los aislamientos clnicos sean correctos. Cuando se obtienen resultados de sensibilidad atpicos en un aislamiento clnico se debe repetir la prueba y/o confirmar la tipificacin del mismo. En la Tabla 4 se presentan las resistencias naturales de las enterobacterias ms comunes en la clnica diaria. Estas resistencias muchas veces puede ayudar al bacterilogo a confirmar o no la identificacin bacteriana. Cabe destacar que todos estos microorganismos pueden tener adems resistencias adquiridas a varios de los antimicrobianos para los cuales las cepas salvajes son sensibles.
Resistencias inusuales Por otra parte se debe tener en cuenta que la resistencia a algunos antibiticos en determinados microorganismos es sumamente inusual y debe, por lo tanto, repetirse. Si dicha resistencia se confirma, el aislamiento debe derivarse a un centro de referencia para su confirmacin y caracterizacin del mecanismo involucrado. Algunos ejemplos de estas combinaciones microorganismo-droga incluyen resistencia a: carbapenemes en cualquier enterobacteria. cefalosporinas de tercera generacin en Shigella spp. cefpodoxima en Salmonella o Shigella spp. quinolonas fluoradas en Shigella spp. o Salmonella spp.
La deteccin temprana de este tipo de cepas permitir dar la voz de alarma y de esa manera elaborar estrategias para evitar su diseminacin. Cada laboratorio debera desarrollar sus propias reglas para detectar las posibles fallas en las pruebas de sensibilidad y proceder as a su correccin.
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Tabla 4 Resistencias naturales en el gnero enterobacterias

Organismo Citrobacter koserib Citrobacter freundii Enterobacter aerogenes y E. cloacae Enterobacter agglomerans E. coli Klebsiella spp. Morganella morganii Proteus mirabilis Proteus vulgaris y P. penneri Providencia spp. Salmonella spp. Serratia spp. Shigella spp. AMP Rc Rc R
c
GEN AMP/ CAR MEZ CPG FOX CTG CFP IMP TOB AKN CHL SUL TIC PIP NET S-R S-R S-R S-R S S-R S-R S S-R S-R S R S R S S S S Rc S S S S S S S S S S S S S-R S S S S S S S S-R R R S-R S S Rc S R R
c
TE T S S S S S S S Rc R R
c
SXT CIP NAL NTI POL S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S R S S S S S S S S S Rc Rc R R

c
S R R S-R S S S-R S S S-R S S-R S
S S S S S S S S S S S S S
S S S S S S Rc Rc R R
c
S-R S Rc Rc S R R
c
S R
c
S R
c
S R S
S R
c
S R
c
a Abreviaturas: S, sensible; R, resistente; S-R, sensible o resistente; AMP, ampicilina; AMP/SUL, ampicilina/sulbactam; CAR, carbenicilina; TIC, ticarcilina; MEZ, mezlocilina; PIP, piperacilina; CPG, cefalosporinas de primera generacin; FOX, cefoxitina; CTG, cefalosporinas de tercera generacin; CFP, cefoperazona; IMP, imipenem; GEN, gentamicina; TOB, tobramicina; NET, netilmicina; AKN, amicacina; CHL, cloranfenicol; TET, tetraciclina; SXT, trimetoprima/sulfametoxazol; CIP, ciprofloxacina; NAL, cido nalidxico; NTI, nitrofurnatoina; POL, polimixina. b Ex C. diversus c Muy inusual encontrar aislamientos sensibles a esta droga.
LIMITACIONES DEL METODO DE DIFUSION POR DISCOS Grupos de microorganismos donde se puede aplicar la prueba de difusin por discos El mtodo de difusin descripto en este documento ha sido estandarizado para patgenos de rpido desarrollo. Resultados incorrectos Se pueden obtener resultados incorrectos cuando se ensayan determinados agentes antimicrobianos con ciertos microorganismos. Algunos ejemplos de estas combinaciones incluyen: cefalosporinas de 1ra. y 2da. generacin y aminoglucsidos con Salmonella spp y Shigella spp. En estos casos si se ensaya alguna de las drogas enumeradas el resultado de stas no deber incluirse en el informe al mdico. Esto se debe a que pueden inducir a errores en la eleccin del tratamiento (falsa sensibilidad) Emergencia de resistencia Algunos agentes antimicrobianos estn asociados con la emergencia de resistencia durante terapias prolongadas. Ms an, aislamientos inicialmente sensibles podran transformarse en resistentes dentro de los tres a cuatro das de haberse iniciado la terapia antimicrobiana
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Planilla - Registro de Resultados: Prueba de Difusin por discos E. coli ATCC 25922
Antimicrobiano
Cepa
Cepa
Cepa
Cepa
Dimetro S,I, Dimetro S,I, Dimetro S,I, Dimetro S,I, Dimetro Rang mm R mm R mm R Mm R mm o Ampicilina Trimtoprimasulfametoxazol 16-22
24-32
Acido nalidixico*
22-28
Cloranfenicol
21-27
Fosfomicina
Nitrofurantoina
20-25
Cefotaxima**
29-35
Gentamicina
19-26
Tetraciclina
18-25
Ciprofloxacina*
* Resistencia a Acido nlidixico indica generalmente sensibilidad disminuida a ciprofloxacina. Es importante que esta sensibilidad disminuida sea informada al equipo medico ya que se han descrito fallas de tratamiento en infecciones por Salmonella spp. con estas caractersticas (CLSI). Si se detectara un aislamiento de Salmonella spp. o Shigella spp. con sensibilidad disminuida o resistencia, confirmar el hallazgo y enviarlo a un centro de referenci para su estudio. ** Las cefalosporinas de tercera generacin se deben informar nicamente frente a aislamientos causantes de infecciones sistmicas. Descartar previamente presencia de BLEE: Cefpodoxima se puede incorporar como prueba de tamizaje de -lactamasas de espectro extendido y resistencia a cefalosporinas de tercera generacin. En caso de presentarse resistencia a esta droga (halos < 17mm) se debe confirmar la presencia de BLEE mediante el ensayo de CTX y CAZ con el disco de AMC entre ambos o en paralelo con los discos de cefotaxima/ac. clav (CTC) y ceftazidima/ac. clav (CAC). Para la sospecha de BLEE en Salmonella spp y Shigella spp., utilizar los puntos de corte especiales recomendados por CLSI para E. coli, Klebsiella spp. y P. mirabilis frente a CTX y CAZ. Evaluar en un segundo paso tambin la sensibilidad a cefoxitina con el objetivo de diferenciar la resistencia a cefpodoxima mediada por BLEE de la mediada por enzimas tipo AMP-C plasmdico.
30-40
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2. Mtodos de Dilucin
INTRODUCCION Las tcnicas de dilucin en caldo o agar, se pueden utilizar para medir cuantitativamente la actividad "in vitro" de un antimicrobiano frente a un cultivo bacteriano. Estos mtodos se basan en la preparacin de una serie de tubos o placas con caldo o agar, respectivamente, a los cuales se les agrega el antibitico (ATB) en distintas concentraciones. Luego se inoculan cada uno de los tubos o placas con una suspensin estandarizada del microorganismo en estudio. Las pruebas se examinan despus de incubar 18 a 24 hs. a 35C y se determina la concentracin inhibitoria mnima (CIM) del antimicrobiano frente al microorganismo ensayado. El resultado final no ende significativamente de la metodologa empleada. Por ello, para obtener valores reproducibles intra e interlaboratorios, cada detalle tcnico debe ser cuidadosamente controlado. Las bases para la realizacin de estas metodologas derivan, en gran parte, de la informacin generada por un estudio colaborativo internacional (1). Aunque estos mtodos son referenciales, algunos son lo suficientemente prcticos para ser desarrollados tanto en los laboratorios clnicos como en los de investigacin. Existen tambin sistemas comerciales que se basan, al menos en parte, en los mismos conceptos y dan resultados equivalentes a los obtenidos con las tcnicas descriptas en este documento... El documento que se ha tomado como base es el M7 A7 del Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI) del ao 2006. Las Tablas de interpretacin corresponden al suplemento M100 S17 del ao 2007. Las tcnicas que se describen en este documento fueron diseadas para ensayar bacterias de fcil desarrollo despus de 18 - 20 hs. de incubacin en medio M. Hinton sin suplementos.
Indicaciones para realizar la prueba sensibilidad a los antimicrobianos por el metodo de CIM La realizacin de una CIM esta justificada en las siguientes situaciones 1. Ausencia de metodologa ms sencilla por ejemplo, mtodo de difusin 2. Falta de estandarizacin 3. Uso de nuevos antibiticos 4. Falla inesperada de tratamiento 5. Perfiles inusuales (confirmacin) 6. Para vigilancia cuantitativa de la resistencia a los antimicrobianos 7. Infecciones severas que requieran la realizacin de pruebas bactericidas tales como poder bactericida del suero, velocidad bactericida del suero, curva de muerte (endocarditis no respondedoras a la terapia, uso de esquemas no convencionales, bacteriemias y meningitis en inmunocomprometidos, osteomielitis crnicas, bsqueda de actividad sinrgica) El valor de CIM obtenido por el mtodo de dilucin, orienta al medico tratante sobre que concentracin de antibitico necesita alcanzarse en el sitio de infeccin para inhibir el desarrollo del microorganismo infectante. La CIM, sin embargo, no representa un valor absoluto. La CIM real puede estar entre la menor concentracin de antibitico que inhibe al microorganismo y la siguiente dilucin inmediatamente inferior donde se observa desarrollo del mismo. Si por ejemplo, fueran probadas diluciones al medio y se determina una CIM de 16 g/ml, el verdadero valor podra estar entre 16 y 8 g/ml. Debe tenerse en cuenta que a pesar de realizar las pruebas de dilucin bajo condiciones cuidadosamente controladas, no siempre se obtienen los mismos resultados. Generalmente, la reproducibilidad de esta prueba es de +/- 1 dilucin. La metodologa ms comn para la determinacin de La CIM es la que utiliza diluciones seriadas al medio (por ej. 1, 2, 4, 8,16 g/ml, etc.). Tambin existen otros esquemas de dilucin, que utilizan unas pocas concentraciones (hasta dos), concentraciones "Breakpoint" o que agregan concentraciones entre las que se ensayan normalmente (por ej. 4, 6, 8, 12, 16 g/ml) Los resultados de estos mtodos alternativos pueden ser igualmente tiles; sin embargo, a veces son ms difciles de controlar. Cuando se produce inhibicin del crecimiento con la menor concentracin utilizada, el verdadero valor de la CIM no se puede determinar exactamente y debe informarse como igual o menor que dicha concentracin. Cuando se ensayan concentraciones adicionales entre las usuales y la CIM es una de esas concentraciones intermedias, la interpretacin de la prueba se debe hacer despus de redondear el valor a la prxima superior dilucin al medio del esquema normal (por ej. Una CIM de 6 g/ml se debe redondear a 8 g/ml y luego proceder a interpretar).
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Cuando se informa al mdico el resultado de la CIM, el valor debe ser acompaado por su correspondiente interpretacin (por ej. SENSIBLE, INTERMEDIO o RESISTENTE) que se obtiene aplicando los criterios enumerados en las Tablas del CLSI. Cuando las CIMs se realizan con 4 o menos concentraciones consecutivas, o con concentraciones no consecutivas, se debe informar la correspondiente interpretacin. Si se desea se puede informar adems el rango de CIM ensayado
Eleccion del numero de concentraciones a ensayar Las concentraciones a ensayar para un determinado antibitico, en general, deberan determinarse de acuerdo a los puntos de corte que se enumeran en la Tabla 2A del documento M100-S17del CLSI, pero el nmero final de concentraciones deber ser elegido por quien realiza la prueba. Se recomienda elegir el rango de concentraciones de manera tal que incluya el rango de CIM de al menos una cepa patrn de control de calidad. La eleccin del rango deber considerar los siguientes puntos: 1. CIM usual de la combinacin germen/droga (CIM50 y 90), 2. Break point de sensibilidad y resistencia y 3. Rango aceptable de al menos una de las cepas ATCC ensayadas en paralelo con la/s cepa/s incgnita/s (Tabla 3A del documento M100-S17 del CLSI)
2.1 Dilucin en agar

La dilucin en agar es un mtodo bien establecido para la determinacin de la sensibilidad a los antimicrobianos (3,4). El agente antimicrobiano se incorpora dentro del medio con agar, de manera tal que cada placa contenga una concentracin de antibitico diferente. Los inculos estandarizados de los distintos microorganismos se pueden aplicar rpida y simultneamente sobre la superficie del agar utilizando un replicador de Steers (5). La mayora de los replicadores existentes transfieren de 25 a 36 inculos a la vez por cada placa. La preparacin, propiedades y control del agar M. Hinton y los estndares de turbidez se describen en detalle para el mtodo de difusin. Para la dilucin en agar valen los mismos considerandos descripto ut supra MATERIALES Equipos Estndar de turbidez equivalente al 0.5 de la escala de Mc Farland Ansas para inocular tipo loop (1-10 l) Mechero tipo Bunsen Placas de Petri (9 cm de dimetro) Pipetas Pasteur plsticas descartables Pipetas de 0.1 ml (podrn utilizarse pipetas automticas) Pipetas de 1 ml Pipetas de 5 ml Micropipetas hasta 1000l Bao termostatizado (50-55 oC) Replicador tipo Stern
Soluciones, reactivos y medios de cultivo Solucin fisiolgica estril, 3 ml en tubos 13X100 mm (para la preparacin del inculo estandarizado) Tubos con 0.9 ml de caldo o solucin fisiolgica estril (para la dilucin 1/10 del inculo) Placas de agar nutritivo (9 cm de dimetro) Gradilla de 11 tubos 13x100mm con 3 ml de agua destilada (para la dilucin del ATB) 19 tubos con 19 ml de agar Mueller Hinton Placas de Petri con Agar Mueller Hinton que contengan diluciones del ATB Patrn de turbidez equivalente al 0.5 Mc Farland Antimicrobianos de potencia conocida
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PROCEDIMIENTO Comentarios tericos
Da 1 a) Preparacin de las diluciones del antibitico Las figuras 2 a 9 muestran los pasos secuenciales para la preparacin de las diluciones de los antibioticos comnmente utilizados para Salmonella y Shigella
Los antibiticos estndar o de referencia se pueden obtener directamente del laboratorio productor o de otras fuentes comerciales. No se recomienda la utilizacin de las preparaciones para aplicacin parenteral. La eleccin de la rangos deber tener en consideracin la epidemiologa local
A modo de ejemplo se indican en la Tabla 5 columna 2 los rangos sugeridos para distintos atb con actividad frente a Samonella
Para las pruebas de sensibilidad se debe conocer el lote, la potencia (generalmente expresada en g/ml, % UI/mg de polvo) y la fecha de vencimiento de los antimicrobianos de referencia
El almacenamiento de la droga debe hacerse segn las recomendaciones del laboratorio productor, o a una temperatura igual o menor a 20C en un desecador (preferiblemente con vaco) provisto de algn material desecante como gel de slice o cloruro de calcio. Cuando se saca el desecador del freezer se debe esperar que tome temperatura ambiente antes de abrirlo para evitar que el agua de condensacin humedezca las drogas. Las tertraciclinas debern protegerse al abrigo de la luz.
b) Preparacin de la Solucin de Antibitico de trabajo (SAT) Para preparar la solucin de antibitico de trabajo se debe tener presente el peso de droga activa y la concentracin ms alta del rango deseado corregido segn el volumen final requerido para el ensayo (ver Tabla 5). Se debe tener en cuenta que para la dilucin en agar cada solucin de atb preparada debe ser 20 veces ms concentrada que la deseada en la placa. Por ello para considerar la pesada a efectuar deber tenerse presente en primer lugar que la solucin de antibitico a preparar deber ser de una concentracin 20 veces superior a la del rango superior deseado (20X). (Tabla 5, columna 3) Para el caso particular de trimeptroprima/ sulfametoxazol (TMS) la solucin de antibitico a preparar deber ser de una concentracin 40 veces superior a la del rango superior deseado de cada uno de los componentes individuales (40X). (Tabla 5, columna 3) El volumen final de SAT requerido depender del esquema de dilucin a seguir En el caso propuesto en el ejemplo de la Tabla 5 las diluciones seriadas al involucran la transferencia de 3 ml de la SAT para obtener la dilucin al correspondiente (figuras 2-9) Puesto
En general los antimicrobianos se obtienen como sales. Esto significa que no todo el peso de la droga en polvo ser activo. El dato de potencia expresa la proporcin de droga activa en el total del polvo Ello es por que la solucin del antibitico se diluir 1/20 al ser incorporada al agar (1 ml de la solucin de ATB + 19 ml del agar)
Puesto que para obtener la solucion de antibiotico de trabajo (SAT) de TMS se mezclaran volmenes iguales de las soluciones de trimetoprima (TMP) y sulfametozaxol (SMZ). De esta manera ambas soluciones se diluirn 1:2, obtenindose la SAT de TMS Esquemas alternativos de dilucin de las soluciones de ATB se encuentran en la Tabla 5 del documento M100-S17 del CLSI (2002). El volumen final de SAT a preparar deber contemplar el esquema de diluciones a realizar
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que 1 ml de la SAT tambin ser necesario para preparar la primera placa del rango, se requiere un volumen de SAT superior a los 4 ml. (Tabla 5, columna 4)
El peso de droga activa de cada antibitico (Tabla 5 columna 5) (deber posteriormente corregirse con el dato de potencia) resulta de multiplicar el volumen final necesario (Tabla 5 Columna 4) por 20 veces la concentracin superior del rango de SAT (Tabla 5 Columna 3) por 20 veces el valor de la concentracin superior del rango
Tabla 5 Ejemplo de rango sugeridos y clculo de las pesadas

Concentracin de solucin a preparar (rango superior x 20) (g/ml) 5120* (256X20) 320 (16X20) 10240* (512X20) 80 (4X20) TMP: 2560 (64X40) SMZ: 48640 (1216X40) 10240* (512X20) 2560* (128X20) Volumen final necesario de solucin de ATB (ml) 5 5a 5 5a 3
b
Antibitico
Rango de diluciones (g/ml)
Peso del antibitico activo (deber posteriormente corregirse con el dato de potencia) (mg) 25,6 (5 x5120) 1.6 (5 x640) Pesar 10 veces mas 51,2 (5 x10240) 4,0 (5 x800) Pesar 10 veces mas 7,680 (3 x2560)
c c
Peso del antibitico total corregido por el dato de potencia (mg) Ver formula 1 Ver formula 1 Ver formula 1 Ver formula 1
Solvente
Fig.
Ampicilina (AMP) Cefotaxima (CTX) Cloranfenicol (CHL) Ciprofloxacina (CIP) Trimetoprima/ sulfametoxazol (TMS) Tetraciclina (TET) Gentamicina (GEN)
0.12-256 0.008-16 0.25-512 0.002-4
Agua Agua Metanol Agua TMP: metanol
2 3 4 5
0.03/5764/1216
Ver formula 1 3
b
6 SMZ: agua
145,38 (3 x48640) 51,2 (5 x10240) 12,8 (5 x2560) Ver formula 1 Ver formula 1
0.25-512 0.06-128
5 5
Metanol Agua
7 8
Estos rangos se establecieron en base a la epidemiologa de la resistencia de Argentina
* Estas soluciones representan las soluciones de antibitico de trabajo (SAT).

a: Estas soluciones requieren un paso previo (dilucin o mezcla) para convertirse en la SAT por lo que se podra prepara un volumen final menor a 5 ml (ver mas adelante). b: De esta manera ambas soluciones se diluirn 1:2, obtenindose la SAT de TMS con un volumen final superior a los 5 ml requeridos para el ensayo del ejemplo c) Clculo de la cantidad de droga activa. Para saber cual es exactamente la cantidad de droga activa hay que calcularla utilizando el dato de potencia. (EJEMPLO: que un antibitico tenga una potencia de 930 g/mg, implica que por cada miligramo de polvo pesado slo 930 g sern activos o tendrn actividad antimicrobiana) (FORMULA 1) El resultado de esta formula estima finalmente la cantidad de droga a pesar En general los antimicrobianos se obtienen como sales. Esto significa que no todo el peso de la droga en polvo ser activo.
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FORMULA 1 Peso del antibitico total: _______(colunma 5 de Tabla 5) Potencia: _________ Clculo: ________ g de droga activa (dato de potencia) --------------- 1mg droga ____ mg droga activa calculados (Tabla 5 columna 5) -------------- X= _____ g de droga a pesar
(Tabla 5 columna 6) Para pesar el antibitico a ensayar se debe hacer en balanza analtica bien calibrada, con una precisin igual o superior al dcimo de miligramo, Generalmente al realizar la pesada se obtiene un exceso o defecto de la droga activa , en tal caso se debe aplicar la frmula 2 para conocer el exacto volumen de solvente a agregar para obtener la concentracin deseada Se debe evitar pesar cantidades muy pequeas de droga ya que estas acarrean alto error Se recomienda utilizar el mtodo de doble arresto para efectuar la pesada
FORMULA 2 Clculo: Clculo del solvente necesario para obtener la concentracin deseada:
______ g de droga activa (Tabla 5 columna 3) ---------------- 1 ml

(Concentracin del antibitico en la primer placa 20X)
________ g (cantidad de droga pesada) ---------------- X=_________ ml

(Dato experimental que surge de la pesada)
(vol. de solvente para disolver la droga)
Agregar el volumen calculado del solvente apropiado (Tabla 5 columna 7)

** Asegrese de tomar todos los recaudos necesarios para el manejo de solventes distintos del agua segn indicaciones del fabricante **
El solvente a utilizar depender del tipo de droga.
En algunos casos el lmite de solubilidad del antimicrobiano slo permite preparar soluciones de concentraciones bajas
Para las drogas que no son solubles en agua (Tabla 5, columna 7), se debe proceder de la siguiente manera: 1- Use solamente la cantidad mnima del solvente (metanol, acetona, cloroformo, etc) necesaria para solubilizar la droga. 2- Diluya hasta alcanzar el volumen final calculado, con agua estril o con el buffer estril adecuado como se indica en la formula 2 .
La mayora de las soluciones preparadas en el ejemplo sern directamente las SAT con excepcin
En general cuando se preparan soluciones de antibitico, se busca obtener soluciones madres
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de CTX, CIP, TMP, SMZ que deben realizar algn paso previo antes de conseguir la SAT (ver a bajo).
stock concentradas que luego se deben diluir para alcanzar la concentracin necesaria para preparar el rango deseado En el ejemplo de la Tabla 5 se pesan diez veces mas CTX y CIP para evitar pesar cantidades muy pequeas de droga ya que estas acarrean alto error.
En el caso de CTX y CIP la SAT se obtiene diluyendo las soluciones preparadas (1/10 en el ejemplo para CTX de la Tabla 5) y para trimetoprima / sulfametoxazol se debe mezclar un volumen de cada droga para obtener la mezcla de la concentracin deseada (3 ml de c/u en el ejemplo de la Tabla 5)
d) Preparacin de las diluciones del antibitico (ver figuras 2 a 8 correspondientes a cada droga) La SAT ser en todos los casos la primera dilucin del rango (la ms concentrada). El objetivo en este paso es obtener 11 diluciones al sucesivas de la SAT. Para determinar el nmero de concentraciones a incluir en las pruebas de sensibilidad se recomienda elegir el rango de concentraciones de manera tal que incluya: los puntos de corte que se enumeran en la Tabla 2 A de CLSI (M100-S17), el rango de CIM de al menos una cepa patrn de control de calidad (Tabla 3 de CLSI M100-S17) y la CIM 50 y 90 para bacterias de caractersticas similares a las cepas incgnitas (previamente reportadas en la literatura o basadas en la experiencia previa)
Para el ejemplo de la Tabla 5, tomar una gradilla con 11 tubos conteniendo 3 ml de agua. Colocar 3 ml de la SAT en el primero de los 11 tubos y homogeneizar correctamente. Tomar 3 ml de este tubo y transferirlos al segundo tubo de la serie, homogenizar y pasar 3 ml al tercero. Repetir este procedimiento hasta el ltimo tubo. De esta manera se deben obtener, incluida la SAT, 12 diluciones consecutivas al del antibitico
Un esquema alternativo de dilucin del antibitico se puede obtener en la Tabla 5 de CLSI M100-S17
e) Colocacin del antibitico en el agar y preparacin de las placas para la CIM (ver figuras 2 a 8 correspondiente a cada droga)
Tomar 12 tubos con 19 ml de agar Mueller Hinton fundido y enfriado a 50-55 C (mantenerlos en el bao termostatizado hasta su utilizacin). De a una a la vez y empezando por la ms diluida, tomar las diluciones preparadas en el punto 2.1.4 transferir 1ml de cada solucin a un tubo con 19 ml de agar (dilucin 1/20) Importante: no descartar el sobrante de las soluciones de antibitico antes de finalizar el ensayo. En caso de error durante la preparacin de las placas (solidificacin total o parcial en el tubo, etc) podria llegar a utilizarlas nuevamente Homogeneizar correctamente cada tubo por inversin evitando la formacin de burbujas y vierta La mezcla agar-antibitico debe ser colocada rpidamente en las placas para evitar la
26
el contenido completo a una placa de Petri de 9 cm de dimetro. Si se formaran burbujas en la placa, pasar ligeramente la llama del mechero por la superficie de la placa para eliminarlas.
solidificacin total o parcial de la misma dentro del recipiente de mezclado La placa de Petri debe alcanzar una profundidad de 3-4 mm con la mezcla agar-antibitico Si las placas no se usan de inmediato se pueden guardar a 4 - 8C por no mas de 3 das El almacenamiento de las placas se debe hacer en bolsas de plstico para evitar su desecacin. Las placas conteniendo cido clavulanico o carbapenemes se deben preparar el dia de realizacin de la CIM debido a la rpida degradacin (hidrlisis) de la droga. Otros antimicrobianos particularmente lbiles son: lactmicos en general, y sulbactam y tazobactam No se puede asegurar que todos los antibiticos mantengan su actividad en estas condiciones, por lo tanto siempre es necesario evaluar el estado de los antibiticos mediante la prueba de cepas patrones de control de calidad. Este control (placa sin antibitico) permitir conocer la viabilidad de los microorganismos a los cuales se le evaluar la sensibilidad.
Importante: rotular cada placa con el valor de la concentracin final resultante (Tabla 5 columna 2). Se debe marcar adems cada placa de agar para conocer la ubicacin de los inculos en la misma
Preparar adems una placa con 20 ml de agar sin antibitico Esta placa sin antibitico servir como control de crecimiento. De esta manera se deben obtener, por atb, 12 placas con las concentraciones de antibitico comprendidas en el rango de la segunda columna de la Tabla 2 y una placa sin antibitico que se utilizar como control. f) Secado de las placas Antes de realizar la prueba, colocar las placas, abiertas e invertidas, en una estufa de 35 C o en un equipo de flujo laminar por al menos 30 minutos para eliminar el exceso de humedad que pudieran contener. g) Preparacin de los inculos (ver figura 9) El inculo estandarizado para el mtodo de dilucin en agar, se puede preparar permitiendo el crecimiento del microorganismo hasta la turbidez 0,5 de la escala de McFarland o bien resuspendiendo colonias directamente hasta alcanzar dicha turbidez (ver Prueba de difusin por discos Para la inoculacin de las placas para la dilucin en agar se puede utilizar un replicador tipo Stern (que deposita simultneamente mltiples inculos) o tambin puede realizarse con pipeta o ansa calibrada. La siembra de los inculos se realiza por spot en la superficie del agar (aproximadamente 2 l de suspensin). Cada spot debe contener una cantidad neta de 104 bacterias. Evite la sobre desecacin de las placas
La inoculacin de las placas se realizar utilizando un replicador de Stern Control de calidad Juntamente con las cepas incgnitas debern ensayarse las cepas de referencia que se describen mas adelante para el control de calidad del ensayo. h) Ajuste del inoculo al patrn de 0.5 Mc Farland
27
A partir del tubo con crecimiento logartmico de cada aislamiento, transferir pequeos volmenes (gotas) a un tubo con 3 ml de solucin fisiolgica hasta obtener una turbidez comparable al estndar 0.5 de Mc Farland. Utilice para esta operacin pipetas Pasteur descartables. IMPORTANTE: agitar muy bien el estndar antes de proceder a la comparacin. i) Dilucin 1/10 de la suspensin bacteriana (0.5 Mc Farland) Transferir 0.1 ml de cada inculo ajustado en el punto h a un tubo con 0.9 ml de caldo o solucin fisiolgica. De esta manera se realiza una dilucin 1/10 del inculo ajustado,
Las suspensiones bacterianas contendrn 1 x 108 UFC/ml.
preparadas
Evitar extremos en la densidad del inculo.
Se obtendr as una suspensin de ~1 x 107 UFC/ml que ser el inculo de trabajo.
Una vez ajustado, el inculo debe utilizarse dentro de los 15 min. j) Colocacin de los inculos (ver figura 9 y 10) La colocacin de los inculos obtenidos en el punto 2.1 en el pocillo del replicador.8 se realizar con pipeta automtica, depositando con mucho cuidado 400 l de cada uno de ellos en el pocillo correspondiente. IMPORTANTE: asegurarse de no salpicar y contaminar los pocillos continuos al que se est cargando. Y de anotar la posicin del pocillo en el que se deposita cada inoculo (ver esquema en la Figura10)
Para evitar sobrecrecimiento bacteriano
Recuerde agitar muy bien el inculo de trabajo antes de proceder a colocarlo en el pocillo del replicador
Se recomienda distribuir las cepas de referencia en varias posiciones de los pocillos (preferentemente distantes uno de otro) para monitorear toda la extensin de la placa
Pocillo del Replicador
Cepa Nro.
Figura 10. Esquema de distribucin de los inculos
28
k) Siembra de las placas IMPORTANTE: Se debe rotular cada placa de agar antes de comenzar con la siembra para conocer la ubicacin de los inculos en la misma Se debe comenzar con la placa control que slo contiene agar Mueller Hinton y luego se continuar con la serie de placas con antibitico comenzando con aquella que posea la menor concentracin. Verifique que todas las placas estn secan antes de la siembra. Sembrando desde la placa con menor concentracin de antibitico se reduce la posibilidad de efecto carry over. De todas maneras se debe inocular una segunda placa control de viabilidad al finalizar la serie (corresponde a la placa sin antibitico del la droga siguiente), para confirmar que no hubo contaminacin un significativo efecto "carry over" de antibitico durante el procedimiento
IMPORTANTE: mirar peridicamente que todos los clavos estn depositando la microgota de inculo.
Cada clavo del replicador de Stern deposita aproximadamente 2 l, como el inculo utilizado tiene 1 x 107 UFC/ml (ver punto 2.1.9), por cada spot quedarn aproximadamente 2 x 104 bacterias que es el inculo recomendado.
Las placas inoculadas se deben mantener a temperatura ambiente hasta que el agar absorba el lquido que acompaa al inculo pero no ms de 15 minutos
IMPORTANTE: no invertir ni inclinar las placas hasta que la microgota de inculo se haya absorbido.
l) Incubacin Incubar las placas invertidas durante 16-18 hs a 35C en ambiente aerbico
Da 2 m) Lectura e interpretacin Para determinar el punto final, las placas se deben colocar sobre una superficie oscura y opaca. La CIM se registrar como el valor de la menor dilucin que inhibe completamente el desarrollo bacteriano
Comentarios tericos
Si persisten dos o ms colonias en concentraciones superiores al aparente punto final, o si se encuentra desarrollo a altas concentraciones y no a bajas, se debe controlar la pureza del cultivo y probablemente deba repetirse la prueba.
No se debe considerar el desarrollo de una simple colonia o una tenue pelcula causada por el depsito del inculo.
29
Algunos antagonistas del medio de cultivo pueden permitir un leve desarrollo bacteriano cuando se ensaya trimetoprima o sulfonamidas. El punto final en estos casos corresponder a la concentracin en la que haya ms del 80 % de reduccin del crecimiento comparando con el control. Los resultados de CIM obtenidos sern interpretados con la Tabla 2A, y los organismos se informarn sensibles, intermedios o resistentes frente al antimicrobiano ensayado
Este fenmeno ocurre por que pueden arrastrarse sustancias antagnicas de la sntesis del cido flico
El documento de la CLSI M100-S17no incluye puntos de corte para todos los antibiticos ensayados. En estos casos los puntos de corte son asignados de acuerdo a un anlisis de la distribucin poblacional y segn las propiedades farmacocinticas y farmacodinamia del antibitico
n) Informe de los resultados Utilizar la planilla para el registro de los resultados
30
Figuras
Dilucin en Agar - AMPICILINA

1. Preparacin de la dilucin
3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml
Figura 2
(*) caldo, agua
3 ml
____ml de H20
3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml*
3 ml*
AMP activa ___mg
SAT 5120 g/ml
2560 g/ml
1280 g/ml
640 g/ml
320 g/ml
160 g/ml
80 g/ml
40 g/ml
20 g/ml
10 g/ml
5 g/ml
2.5 g/ml
m l
m l
m l
m l
m l
m l
m l
m l 1
19ml*
m l
2. Colocacion del ATB en el agar
19ml*
19ml*
19ml*
19ml*
19ml*
19ml*
19ml*
19ml*
19ml*
1
19ml*
19ml*
SAT 256 g/ml
128 g/ml
64 g/ml
32 g/ml
16 g/ml
8 g/ml
4 g/ml
2 g/ml
1 g/ml
0.5 g/ml
0.25 g/ml
(*) agar MH 0.125 g/ml
Volcar la totalidad del contenido del tubo (20ml) 3. Colocacin del ATB/agar ATB/ en la placa
256 g/ml
Volcar la totalidad del contenido del tubo (20ml)
Al volcar el contenido de los tubos en las placas evite la formacin de burbujas
Dilucin en Agar - CEFOTAXIMA

Figura 3
(*) caldo, agua
3 ml
____ ml de H20
Dil 1/10
3 ml*
3 ml*
3 ml*
3 ml*
3 ml*
3 ml*
3 ml*
3 ml*
3 ml*
3 ml*
3 ml*
CTX activa ___mg
Sol Interm. Interm. 1920 g/ml
SAT 320 g/ml
160 g/ml
80 g/ml
40 g/ml
20 g/ml
10 g/ml
5 g/ml
2.5 g/ml
1.25 g/ml
0.625 g/ml
0.31 g/ml
m l
m l
m l
m l
m l
m l
m l
m l
m l
19ml*
19ml*
19ml*
19ml*
19ml*
19ml*
19ml*
19ml*
19ml*
19ml*
19ml*
1
19ml*
SAT 16 g/ml
8 g/ml
4.0 g/ml
2.0 g/ml
1.0 g/ml
0.5 g/ml
0.25 g/ml
0.12 g/ml
0.06 g/ml
0.03 g/ml
0.016 g/ml
16 g/ml
m l
m l
m l
m l
3 ml*
m l
m l
0.015 g/ml
31
Dilucin en Agar - CLORANFENICOL

Figura 4
(*) caldo, agua
3 ml
____ml de Metanol
3 ml*
3 ml*
3 ml*
3 ml*
3 ml*
3 ml*
3 ml*
3 ml*
3 ml*
3 ml*
3 ml*
CHL activo ___mg
SAT 10240 g/ml
5120 g/ml
2560 g/ml
1280 g/ml
640 g/ml
320 g/ml
160 g/ml
80 g/ml
40 g/ml
20 g/ml
10 g/ml
5 g/ml
m l
m l
m l
m l
m l
m l
m l
m l
m l
m l
19ml*
m l
19ml*
19ml*
19ml*
19ml*
19ml*
19ml*
19ml*
19ml*
19ml*
1
19ml*
19ml*
SAT 512 g/ml
256 g/ml
128 g/ml
64 g/ml
32 g/ml
16 g/ml
8 g/ml
4 g/ml
2 g/ml
1 g/ml
0.5 g/ml
512 g/ml
Dilucin en Agar - CIPROFLOXACINA

Figura 5
(*) caldo, agua
3 ml
____ ml de H20
Dil 1/10
9 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml*
Sol. Intermedia
CIP activa ___mg
800 g/ml
SAT 80 g/ml
40 g/ml
20 g/ml
10 g/ml
5 g/ml
2.5 g/ml
1.25 g/ml
0.625 g/ml
0.31 g/ml
0.15 g/ml
0.08 g/ml
m l
m l
m l
m l
m l
m l
m l
m l
m l
m l
m l
19ml*
19ml*
19ml*
19ml*
19ml*
19ml*
19ml*
19ml*
19ml*
19ml*
19ml*
1
19ml*
SAT 4 g/ml
2 g/ml
1 g/ml
0.5 g/ml
0.25 g/ml
0.12 g/ml
0.06 g/ml
0.03 g/ml
0.015 g/ml
0.008 g/ml
0.004 g/ml
4 g/ml
m l
m l
0.04 g/ml
32
Dilucin en Agar TRIMETOPRIMA (TMP) / SULFAMETOXASOL (SUL) Fig. 6

____ ml de Metanol 3 ml
3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml
(*) caldo, agua

3 ml 3 ml
TMP act._____mg
Dil 1/2
3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml*
____ ml de H20
3 ml
SAT 640/12160 160/3040 40/760 1280/24320 g/ml g/ml g/ml g/ml 320/6080 80/1520 g/ml g/ml
10/190 g/ml 20/380 g/ml 5/95 g/ml
2.5/47.5 g/ml
0.625/11.875 g/ml 1.25/23.75 g/ml
SUL act._____mg
m l m l m l m l m l m l 1
19ml*
m l
m l
m l
m l
m l
19ml*
19ml*
19ml*
19ml*
19ml*
19ml*
19ml*
19ml*
19ml*
1
19ml*
19ml*
SAT 64 g/ml
32 g/ml
16 g/ml
8 g/ml
4 g/ml
2 g/ml
1 g/ml
0.5 g/ml
0.25 g/ml
____ g/ml
____ g/ml
(*) agar MH ____ g/ml
64 g/ml
Dilucin en Agar - TETRACICLINA

Figura 7
(*) caldo, agua
3 ml
____ml de Metanol
3 ml*
3 ml*
3 ml*
3 ml*
3 ml*
3 ml*
3 ml*
3 ml*
3 ml*
3 ml*
TET activa ___mg
SAT 10240 g/ml
5120 g/ml
2560 g/ml
1280 g/ml
640 g/ml
320 g/ml
160 g/ml
80 g/ml
40 g/ml
20 g/ml
10 g/ml
m l
m l
m l
m l
m l
m l
m l
m l
m l
m l
19ml*
19ml*
19ml*
19ml*
19ml*
19ml*
19ml*
19ml*
19ml*
19ml*
19ml*
1
19ml*
SAT 512 g/ml
256 g/ml
128 g/ml
64 g/ml
32 g/ml
16 g/ml
8 g/ml
4 g/ml
2 g/ml
1 g/ml
0.5 g/ml
512 g/ml
m l
m l
m l
3 ml*
5 g/ml
33
Dilucin en Agar - GENTAMICINA

Figura 8
(*) caldo, agua
3 ml
____ml de H20
3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml*
3 ml*
GEN activa ___mg
SAT 2560 g/ml
1280 g/ml
640 g/ml
320 g/ml
160 g/ml
80 g/ml
40 g/ml
20 g/ml
10 g/ml
5 g/ml
2.5 g/ml
1.25 g/ml
m l
m l
m l
m l
m l
m l
m l
m l
m l
m l
m l
19ml*
19ml*
19ml*
19ml*
19ml*
19ml*
19ml*
19ml*
19ml*
19ml*
1
19ml*
19ml*
SAT 128 g/ml
64 g/ml
32 g/ml
16 g/ml
8 g/ml
4 g/ml
2 g/ml
1 g/ml
0.5 g/ml
0.25 g/ml
0.12 g/ml
128 g/ml
Figura 9
Dilucin en Agar
Preparacin y colocacin del inculo
Gotas
0.1 ml
Dilucion 1/10
Bacteria en fase logartmica
0.5 de McFarland
Cc:1x108 UFC/ml
0.9 ml de SF o caldo
Cc:1x107 UFC/ml
400 l
Policubetas de inculos del Replicador de Stenr

Servicio ANTIMICROBIANOS INEI - Dr. Carlos G. Malbrn
m l
34
Planilla - Registro de Resultados: Mtodo de dilucin en agar y microdilucin (CIM)
AISLAMIENTOS Antibitico Mtodo

Cepa Cepa Cepa Cepa
CIM g/ml
S,I,R
CIM g/ml
S,I,R
CIM g/ml
S,I,R
CIM g/ml
S,I,R
E. coli ATCC 25922 Rango CIM g/ml g/ml
AMP
CIM g/ml Concentracin inhibitoria
2-8 0.030.12 2-8 0.0040.016 <0.5 /9.5 0.5-2 0.25-1
CTX CHL mnima CIP TMS TET GEN
35
2.2 Microdilucin en caldo

Este mtodo se denomina microdilucin porque se utilizan pequeos volmenes de caldo. La prueba se realiza en policubetas de plstico estriles de fondo cnico o redondo. MATERIALES Equipos Mechero tipo Bunsen Pipetas Pasteur plsticas descartables 1 Reservorio con 12 compartimientos 5 Reservorios sin compartimientos Micropipeta multicanal para 12 y 8 puntas Microplacas de 96 pocillos fondo redondo esteriles
Soluciones, reactivos y medios de cultivo Solucin fisiolgica estril, 3 ml en tubos 13X100 Placas de agar Mueller Hinton (9 cm de dimetro, profundidad del agar de 4 mm ) Placas de agar nutritivo (9 cm de dimetro) 12 Tubos 13x100mm con 4,5 ml de caldo Mueller Hinton ajustado en cationes Tubo con 9,9 ml de caldo Mueller Hinton ajustado en cationes Estndar de turbidez equivalente al 0.5 de la escala de Mc Farland
Preparacin del caldo Mueller Hinton
Comentarios tericos
(1) Preparar el caldo M. Hinton a partir de la base deshidratada de acuerdo a las recomendaciones del fabricante. Esterilizar en autoclave.
De los medios disponibles se considera al caldo MHinton el mejor para las pruebas de sensibilidad de rutina dado que: Muestra buena reproducibilidad lote a lote en las pruebas de sensibilidad. Contiene bajo nivel de inhibidores de sulfonamidas, trimetoprima y tetraciclina. Es adecuado para el desarrollo de la mayora de las bacterias patgenas. Existen suficientes datos recopilados que avalan la experiencia de las pruebas de sensibilidad realizadas en este medio.
(2) El caldo que no se usa en el da puede mantenerse en refrigerador (2-8 C.). (3) Controlar la esterilidad de una muestra representativa de cada lote incubando 24 horas o mas a 30-35 C. Luego descar esas muestras. No deber observarse crecimiento bacterianas o mictico. Para verificar la esterilidad del medio, tome una muestra equivalente al 5-10% del total del lote producido. Ignorar cualquier contaminacin espordica; ej. una fraccin de medio. Descartar el lote completo, si el nivel de contaminacin es significativo (>10% del medio controlado). El pH para cada lote debe ser controlado cuando se prepara cada lote de medio. Si el pH es demasiado bajo, ciertas drogas (p ej. Aminoglucsidos, quinolonas y macrlidos) parecern menos activas; mientras otras (p ej. tetraciclinas) parecern tener mayor actividad. Si el pH es demasiado alto se podran esperar los efectos opuestos. Ver Tabla 1
pH: El caldo debe tener un pH 7,2 - 7,4 a temperatura ambiente. Determinar el pH despus de su preparacin.
36
Si el pH est muy alejado del rango aceptable debe controlarse el procedimiento de la preparacin del medio. El mtodo a utilizar depender del tipo de equipo disponible en cada laboratorio
Las correcciones necesarias sern realizadas por el agregado de NaOH 1M o HCl 1M
El agregado de largos volumenes de estas soluciones para correccion del pH puede alterar el contenido de sales del medio.
Efecto de la Timina o Timidina: Para evaluar cada lote de Mueller Hinton en su contenido de Timidina se debe realizar la CIM de trimetoprima / sulfametoxazol frente a Enterococcus faecalis ATCC 29212 o ATCC 33186. El punto final en estos casos corresponder a la concentracin en la que haya ms del 80 % de reduccin del crecimiento comparando con el control.
Los medios que contienen excesiva cantidad de timina o timidina pueden revertir los efectos inhibitorios de las sulfonamidas y trimetoprima, produciendo as CIMes mas altas, lo cual puede dar como resultado un informe de falsa resistencia.
El medio se considera adecuado si el valor de la CIM es < 0.5/9.5 g/ml. En caso que se observe una CIM > 0.5/9.5 g/ml podr procederse al agregado de timidina fosforilasa o sangre lisada de caballo.
La timidina fosforilasa ya sea en su forma pura (aislada) o contenida en la sangre lisada de caballo inactivar los excesos de timidita presentes en el medio y la confiabilidad de las pruebas para sulfonamidas y trimetoprima frente a patgenos comunes, excepto para enterococos
Efectos por variacin en la composicin de cationes divalentes. Las pruebas realizadas con cada lote de caldo M. Hinton deben estar de acuerdo con los lmites de control para las correspondientes cepas ATCC (ver Control de Calidad). Los resultados de las pruebas con las cepas patrones deben ser cuidadosamente observados para detectar cualquier valor aberrante debido a la composicin de cationes del medio de cultivo.
La variacin en cationes divalentes principalmente Ca++ y Mg++ afectarn los resultados con tetraciclina, colistn y aminoglucsidos frente a P. aeruginosa. Un excesivo contenido de cationes aumentar las CIMes, mientras que bajas concentraciones de cationes resultarn en CIMes menores a las esperadas. Un exceso de zinc podra aumentar las CIMes de los carbapenems
Los rangos aceptados son los siguientes (Mtodo de absorcin atmica o equivalente): Ca++ = 20 -25 mg/L; Mg++ = 10 -12.5 mg/L.
37
PROCEDIMIENTO
Da 1 a) Preparacin de las soluciones de antibitico (figura 11) Se debe tener en cuenta que para la microdilucion, cada solucin de antibitico debe ser preparada 2 veces ms concentrada que la deseada en el pocillo Para pesar las drogas podrn utilizarse los conceptos y formulas descriptos para la dilucin en agar con la salvedad que la solucin de antibitico a preparar deber ser de una concentracin 2 veces superior a la del rango superior deseado (2X). (Tabla 5) Una vez preparada las diluciones del antibitico, homegeinicelas perfectamente y con la misma pipeta llene el correspondiente compartimiento del reservorio de la pipeta multicanal comenzando por la solucin mas diluida (Se debern utilizar reservorios con 12 divisiones). Proceda de la misma manera para las otras 11 diluciones. (ver figura 11) IMPORTANTE: Rotular los reservorios con el nombre del antibitico que esta colocando y al menos la ubicacin de la menor y mayor concentracin del rango preparado. Al finalizar todos los compartimientos (12) del reservorio de la pipeta multicanal quedarn llenos. Se utilizar un reservorio de 12 compartimientos por cada antibitico a ensayar b) Llenado de las policubetas con las diluciones del antibitico (Figuras 11 y 12) Este procedimiento se llevar a cabo mediante la utilizacin de la pipeta multicanal de doce puntas y el correspondiente reservorio. De una vez se cargan las 12 diluciones del antibitico en la lnea de la policubeta correspondiente (ver figura 12). Rotular cada lnea de las policubetas con el nombre del antibitico que le coloc y las ubicaciones de la dilucin menor y mayor del rango.
Comentarios tericos
La solucin de antibitico se debe preparar de una concentracin tal que duplique la deseada (2X). De esta forma, los pocillos sern cargados con 50 l de la solucin del antibitico y 50 l del inoculo.
Se deber preparar una policubeta por cada cepa a ensayar. Cada una ser idntica con respecto a los antibiticos que contengan.
c) Preparacin del inculo (ver figura 13)
38
El inculo estandarizado para el mtodo de microdilucin, se puede preparar permitiendo el crecimiento del microorganismo hasta la turbidez 0,5 de la escala de McFarland o bien resuspendiendo colonias directamente hasta alcanzar dicha turbidez (ver Prueba de difusin por discos Importante: agitar muy bien el estndar de turbidez antes de proceder a la comparacin Con pipeta de 0.1 o 0.2 ml, colocar 0.1 ml del inculo ajustado al 0.5 de Mc Farland (1 x 108 UFC/ml) en un tubo con 9.9 ml de caldo Mueller Hinton ajustado en cationes. Con esto se logra una dilucin 1/100 del inculo 6 ajustado (1 x 10 UFC/ml). Cuando se colocan 50 l de esta suspensin a cada pocillo se obtendr una concentracin final de bacterias de aproximadamente 5 x 105 UFC/ml (inculo recomendado) al ser diluida al medio por el agregado de igual volumen de la dilucin del antibitico
Control de calidad Juntamente con las cepas incgnitas debern ensayarse las cepas de referencia para el control de calidad del ensayo.
d) Siembra de las policubetas de la microdilucin (ver figura 13) Tomar reservorios para pipetas multicanal sin compartimientos (o placas de petri) y volcar en cada uno la dilucin 1/100 de cada una de las cepas preparadas en el punto 3.3 Una vez cargados los reservorios, tomar de a uno por vez y, con pipeta multicanal de 8 puntas, colocar 50 l del inculo en todos los pocillos de una de las policubetas preparadas Importante: recordar que hay un pocillo control de caldo que slo lleva 100 l del caldo utilizado para preparar las diluciones del antibitico Cada policubeta debe incluir un pocillo de control de crecimiento (sin antibitico), y un control negativo (caldo sin inocular): Control de caldo: contendr 100 l de caldo Mueller Hinton ajustado con cationes. Control de inculo: contendr 50 l del inculo de trabajo preparado en el punto 2.2.3. y 50 l de caldo Mueller Hinton ajustado en cationes. La aplicacin del inculo se debe realizar dentro de los 15 minutos posteriores a su ajuste
Repetir esta operacin con todas las ensayar en sus respectivas policubetas
cepas a
Importante: rotular cada policubeta con el nombre de la cepa que le coloc.
39
e) Incubacin Apilar las policubetas terminadas y colocar en la de arriba un film plstico. Incubar 16-20 hs a 35 C en ambiente aerbico. Al finalizar la prueba, se debe sellar cada policubeta con tapa plstica, pelcula plstica autoadhesiva o bolsa plstica para evitar la desecacin. Esta cubierta plstica debe permitir el intercambio de temperatura Para mantener una temperatura de incubacin uniforme, se recomienda no apilar ms de cuatro policubetas.
f) Lectura e interpretacin La CIM es la menor concentracin de antibitico capaz de inhibir completamente el desarrollo bacteriano en el pocillo, el punto final queda definido a simple vista por la falta de turbidez del caldo. Para determinar el punto final de desarrollo, debe compararse cada pocillo de la CIM con el pocillo control de crecimiento. El ensayo se considera vlido si en el pocillo control de crecimiento se observa un botn de crecimiento o turbidez neta. Si apareciera ms de un pocillo salteado con alguna droga, esta no se debera informar.
Cuando en una prueba de microdilucin se obtiene un pocillo salteado, se debe leer la CIM ms alta. Algunos antagonistas del medio de cultivo pueden permitir un leve desarrollo bacteriano cuando se ensaya trimetoprima o sulfonamidas. El punto final en estos casos corresponder a la concentracin en la que haya ms del 80 % de reduccin del crecimiento comparando con el control.
Este fenmeno ocurre por que pueden arrastrarse sustancias antagnicas de la sntesis del cido flico
Los resultados de CIM obtenidos sern interpretados con la Tabla 2A y los organismos se informarn sensibles, intermedios o resistentes frente al antimicrobiano ensayado g) Informe de los resultados Utilizar la planilla para el registro de los resultados
40
Figuras
Figura 11
Microdilucin: Microdilucin:
diluciones del ATB
3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml
____ml
3 ml*
3 ml*
3 ml*
3 ml*
3 ml*
3 ml*
3 ml*
3 ml*
3 ml*
3 ml*
3 ml*
Antibitico:_________
SAT ____ g/ml
____ g/ml
____ g/ml
____ g/ml
____ g/ml
____ g/ml
____ g/ml
____ g/ml
____ g/ml
____ g/ml
____ g/ml
____ g/ml
2 ml
Reservorio para pipeta multicanal (12 divisiones)
(*) Caldo Mueller Hinton ajustado en cationes
Microdilucin: Colocacin del ATB

50 l
AMP CTX CHL CIP TMS* TET GEN Controles
256 16 512 4 64 512 128
Caldo
Fig 12
128 8 256 2 32 256 64

Inoc.
64 4 128 1 16 128 32
32 2 64 0,5 8 64 16
16 1 32
8 0,5 16
0,5
0,25 0,12
0,25 0,12 0,06 0,03 ,015 ,008 8 4 2 1 0,5 0,25
0,25 0,12 0,06 0,03 ,015 ,008 ,004 ,002 4 32 8 2 16 4 1 8 2 0,5 4 1 0,25 0,12 0,06 0,03 2 0,5 1 0,5 0,25
0,25 0,12 0,06
(-)
(+)
(*) Se indica rango de TMP Se deber preparar una placa de microdilucin por cada cepa a estudiar
41
Figura 13
Microdilucin
Preparacin y Colocacin del inculo
Pipeta multicanal
5 ml
0,1 ml
1/100
Reservorio 0.5 de McFarland

Cc:1x108 UFC/ml
9.9 ml de Caldo Mueller Hinton ajustado en cationes

Cc:1x106 UFC/ml
Cc final del Inoculo 5x105 UFC/ml
50 l
Policubetas
Control de caldo No agregar inculo
42
Planilla - Registro de Resultados: Mtodo de dilucin en agar y microdilucin (CIM)
AISLAMIENTOS Antibitico Mtodo

Cepa Cepa Cepa Cepa
CIM g/ml
S,I,R
CIM g/ml
S,I,R
CIM g/ml
S,I,R
CIM g/ml
S,I,R
E. coli ATCC 25922 Rango CIM g/ml g/ml
AMP
CIM g/ml Concentracin inhibitoria
2-8 0.030.12 2-8 0.0040.016 <0.5 /9.5 0.5-2 0.25-1
CTX CHL mnima CIP TMS TET GEN
43
Referencias 1. Bauer A.W., Kirby W.M.M., Sherris J.C., Turck M. Antibiotic susceptibility testing by standardized single disk method. Am. J. Clin. Pathol. 1966, 45:493-496 2. NCCLS. Evaluating production lots of dehydrated Mueller Hinton agar; Approved standard NCCLS document M6-A. Wayne, Pennsylvania;1996. 3. Ericsson H.M., Sherris J,C,. Antibiotic susceptibility testing. Report of an international collaborative study. Acta Pathol. Microbiol. Scand., 1971, 217(suppl B):1-90 4. Woods G.L., Washington J.A., Antibacterial Susceptibility test: dilution and disk diffusion methods. In: Murray P.R., Baron E.J., Pfaller M.A. y cols. Manual of Clinical Microbiol., 6ta ed. Washington DC: American Society for Microbiology, 1995:1327-1341. 5. Steers E., Foltz E.L., Graves B.S., An inocula replicating apparatus for routine testing of bacterial susceptibility to antibiotics. Antibiotic Chemother., 1959, 9:307-311 6. Clinical and Laboratory Standards Institute. 2006. Methods for dilution antimicrobial susceptibility test for bacteria that grow aerobically; approved standard. 7th ed. M7-A7. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA. 7. Clinical and Laboratory Standards Institute. 2006. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; approved standard 9th ed. M2-A9. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA. 8. Clinical and Laboratory Standards Institute. 2007. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; 17th informational supplement. M100-S17. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA.
44

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Sensibilidad a los antimicrobianos en Salmonella, Shigella y E. coli

AUTORES Bioq. Fernando Pastern Bioq. Marcelo Galas

Sensibilidad a los antimicrobianos

1. Difusin por discos

Indicaciones para la realizacion de las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos

Preparacin del Agar Mueller Hinton

Descartar los medios que presenten alguna de estas caractersticas

DISMINUCION DE LA ACTIVIDAD pH cido Azitromicina Claritromicina

Conservacin de los discos

de turbidez (0.5 de la escala de Mc Farland).

completa y homognea distribucin del inculo.

Figura 1 Esquema sugerido para la colocacin de los discos

Examinar y verificar que el crecimiento sea confluente.

Efecto observado con las cepas de referencia

Disminucin general de las zonas de inhibicin

Trimetoprima-Sulfametoxasol, disminucin del tamao de la zona y/o aparicin de colonias internas

-Exceso del contenido de cationes divalentes: Ca++ y Mg++

- Aumento de las zonas

- Escaso contenido de cationes divalentes

Aminoglucsidos, macrlidos - Disminucin de las zonas

Penicilinas y tetraciclinas - Aumento de las zonas

Tabla 4 Resistencias naturales en el gnero enterobacterias

SXT CIP NAL NTI POL S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S R S S S S S S S S S Rc Rc R R

S R R S-R S S S-R S S S-R S S-R S

2.1 Dilucin en agar

PROCEDIMIENTO Comentarios tericos

Tabla 5 Ejemplo de rango sugeridos y clculo de las pesadas

Rango de diluciones (g/ml)

0.12-256 0.008-16 0.25-512 0.002-4

Agua Agua Metanol Agua TMP: metanol

Estos rangos se establecieron en base a la epidemiologa de la resistencia de Argentina

* Estas soluciones representan las soluciones de antibitico de trabajo (SAT).

______ g de droga activa (Tabla 5 columna 3) ---------------- 1 ml

________ g (cantidad de droga pesada) ---------------- X=_________ ml

(vol. de solvente para disolver la droga)

Agregar el volumen calculado del solvente apropiado (Tabla 5 columna 7)

El solvente a utilizar depender del tipo de droga.

En general cuando se preparan soluciones de antibitico, se busca obtener soluciones madres

Las suspensiones bacterianas contendrn 1 x 108 UFC/ml.

Evitar extremos en la densidad del inculo.

Se obtendr as una suspensin de ~1 x 107 UFC/ml que ser el inculo de trabajo.

Para evitar sobrecrecimiento bacteriano

Pocillo del Replicador

Figura 10. Esquema de distribucin de los inculos

n) Informe de los resultados Utilizar la planilla para el registro de los resultados

Dilucin en Agar - AMPICILINA

AMP activa ___mg

SAT 5120 g/ml

2. Colocacion del ATB en el agar

SAT 256 g/ml

(*) agar MH 0.125 g/ml

Volcar la totalidad del contenido del tubo (20ml)

Al volcar el contenido de los tubos en las placas evite la formacin de burbujas

Dilucin en Agar - CEFOTAXIMA

CTX activa ___mg

Sol Interm. Interm. 1920 g/ml

SAT 320 g/ml

2. Colocacion del ATB en el agar

(*) agar MH 0.008 g/ml

Volcar la totalidad del contenido del tubo (20ml)

Al volcar el contenido de los tubos en las placas evite la formacin de burbujas

Dilucin en Agar - CLORANFENICOL

CHL activo ___mg

g (cantidad de droga pesada) ---------------- X=_ ml