Cincia & Engenharia (Science & Engineering Journal) 15 (2): 7 - 12, 2005

ISSN 0103-944X

ANLISE SISTEMTICA APLICADA A PROCESSOS DE SACARIFICAO E FERMENTAO SIMULTNEA DO AMIDO EM ETANOL, UTILIZANDO MICROORGANISMOS MODIFICADOS GENETICAMENTE
APPLICATION OF SYSTEM ANALYSIS TO THE PROCESS OF SIMULTANEOUS SACCHARIFICATION AND FERMENTATION OF STARCH TO ETHANOL UTILIZING GENETICALLY MODIFIED MICROORGANISMS Maicon Charles de Araujo Tait, Aparecido Nivaldo Mdenes e Alexander Dimitrov Kroumov
Universidade Estadual do Oeste do Paran-Campus de Toledo Ncleo de Biotecnologia e Desenvolvimento de Processos Qumicos Rua da Faculdade, 645, Jardim La Salle 85903-000-Toledo PR Brasil E-mail: adkrumov@unioeste.br

ABSTRACT
The instability of the market of the petroleum raises the importance of research of alternative production processes of renewable liquid fuels. The production of etanol by fermentation, using starch as substrate, has been studied intensively in the last years, resulting in a simultaneous process of saccharification and fermentation of the starch to etanol using modified microorganisms. The objective of this work was to develop a mathematical model for the direct bioconversion of starch to etanol being used Saccharomyces cerevisiae YPB-G strain that secreted a bifunctional protein with enzymatic activity of the B. subtilis alpha-amylase and the A. awamori glucoamylase. The modeling strategy consisted of dividing the process in two hierarchic levels of knowledge that would be studied separately, and later unified through the glucose balance, and enzymes synthesis balance. The model was validated with the experimental data and was compared with cybernetic modeling results for the same system. Keywords: Ethanol, Simultaneous saccharification and fermentation, Saccharomyces cerevisiae YPB-G, System analysis.

RESUMO
A instabilidade do mercado do petrleo releva a importncia de pesquisa de processos alternativos de produo de combustveis lquidos renovveis. A produo de etanol por via fermentativa, utilizando amido como matria prima, tem sido estudado intensivamente nos ltimos anos, resultando em um processo simultneo de sacarificao e fermentao do amido em etanol utilizando microorganismos modificados. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um modelo matemtico da bioconverso direta do amido em etanol utilizando a cepa Saccharomyces cerevisiae YPB-G, que secreta uma protena bifuncional com atividade enzimtica do B., subtilis alfa-amilase e do A. awamori glucoamilase. A estratgia de modelagem consistiu em dividir o processo em dois nveis hierrquicos do conhecimento, que seriam modelados separadamente, e posteriormente unificados atravs do balano de glicose e balano e sntese de enzimas. O modelo foi validado com os dados experimentais e foi comparado com resultados do modelo ciberntico para o mesmo sistema. Palavras-chave: Etanol, Sacarificao e fermentao simultnea, Saccharomyces cerevisiae YPB-G, Anlise sistemtica

1 - INTRODUO O potencial agrcola brasileiro indiscutvel, entretanto os recursos naturais renovveis, especialmente os materiais amilceos, no so utilizados em grande escala na produo de etanol como fonte de energia (MIELENZ, 2001). A dificuldade deste processo a necessidade de se realizar a hidrlise da matria prima, incluindo o amido, para a transformao em produtos fermentescveis. Uma alternativa para a produo de etanol a partir do amido a utilizao do processo de sacarificao e fermentao simultnea (SFS) em etanol, o qual se tornou possvel, devido aos avanos da engenharia gentica, modificar os microorganismos tornando-os capazes de secretar as enzimas necessrias sacarificao e, capazes tambm, de fermentar a glicose em etanol (ALTINTAS et.al, 2002a;

BIROL et.al, 1998a). O grande desafio atual modelar e otimizar este processo para que se torne economicamente vivel e possvel industrialmente. A modelagem ciberntica, que sofisticada e eficiente quando se utiliza mltiplos substratos, foi aplicada ao processo de sacarificao e fermentao (ALTINTAS et.al, 2002b; KOMPALA et.al,1984; KOMPALA et.al, 1986), entretanto, algumas hipteses requerem avaliao. O objetivo deste trabalho desenvolver um modelo matemtico no estrutural do processo de SFS do amido em etanol, utilizando Saccharomyces cerevisiae YPB-G, o qual secreta uma protena bifuncional, que tem em sua base a atividade enzimtica do B. subtilis alfa-amilase e do A. awamori glucoamilase. Ser utilizado a anlise sistemtica que eficiente em sistemas complexos, onde

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aplicando princpios de decomposio pode-se analisar o sistema em subnveis do conhecimento. 2 DESENVOLVIMENTO DO MODELO Neste trabalho utilizou-se os dados experimentais do processo de bioconverso direta do amido em etanol por S. cerevisiae YPB-G, apresentados na literatura (ALTINTAS et.al, 2002b), no desenvolvimento de um modelo matemtico no estrutural, avaliado atravs de dois nveis hierrquicos do conhecimento. O modelo proposto descreve as seguintes propriedades fisiolgicas da levedura modificada geneticamente: dinmica da degradao enzimtica do amido, acmulo e utilizao da glicose, caractersticas do crescimento da biomassa e produo do etanol no processo SFS. A dinmica de secreo das enzimas e a estabilidade dos plasmdios no so consideradas. A estratgia de modelagem consistiu em dividir o modelo em dois nveis hierrquicos do conhecimento, ver Figura 1. Os processos de hidrlise do amido e fermentao da glicose so conhecidos e foram modelados, inicialmente, estes dois processos em separado. Estes nveis hierrquicos do conhecimento foram unificados posteriormente, atravs do balano de glicose e balano e sntese de enzimas. A avaliao das hipteses deste modelo foram feitas atravs dos dados experimentais, alm da comparao deste novo modelo com os resultados da modelagem ciberntica para este mesmo sistema.
MODELO DA HIDRLISE DO AMIDO

cerevisiae YPB-G durante a fermentao, portanto a concentrao de enzimas funo do tempo. A maioria das representaes razoveis da estrutura do amido considera-o como duas fraes: suscetveis e resistveis sacarificao, que correspondero na reao em dois perodos com taxas diferentes de degradao, observado nos dados experimentais. Outros fenmenos incorporados ao modelo so inibio pelo produto e pelo substrato. Uma descrio matemtica do processo de hidrlise do amido como duas fraes foi desenvolvido e apresentado em detalhes em Polakovic e Bryjak (2003). Adaptamos este conhecimento para a hidrlise do amido atravs da protena bifuncional secretada por S. cerevisiae YPB-G, considerando uma enzima chave que tem sua concentrao varivel no tempo. O modelo cintico da hidrlise enzimtica descrito a seguir: Taxa de degradao da frao de amido suscetvel
R sus = K sus * Enz(t)* S sus (t) Glu(t) S sus (t) 2 + K m * 1+ + S sus (t) + S res (t) K glu K starch

(1)

Taxa de degradao da frao de amido resistvel

R res = K res * Enz(t)* S res (t) Glu(t) S res (t) 2 + K m * 1+ + S sus (t) + S res (t) K glu K starch

(2)

Balano de massa das fraes de amido suscetvel e resistvel

Primeiro Nvel Hierrquico do Conhecimento Frao de amido suscetvel Frao de amido resistvel

dS sus ( t ) = R sus dt
dS res ( t ) = R res dt

(3)

(4)

Balano da degradao do amido total Segundo Nvel Hierrquico do Conhecimento

DESCRIO DA FISIOLOGIA MICROBIANA Dinmica do: Crescimento dos microorganismos Acmulo e utilizao da glicose Produo de etanol Sntese e diluio da enzima

dS total ( t ) dS sus ( t ) dS res ( t ) = + dt dt dt

(5)

Balano da glicose produzida durante a degradao do amido

dGlu( t ) = 1.111 ( R sus + R res ) dt

Figura 1 - Representao da estratgia de modelagem em dois nveis do conhecimento

(6)

2.1. Primeiro nvel hierrquico do conhecimento O primeiro nvel hierrquico do conhecimento consiste na hidrlise enzimtica do amido, que no processo convencional acontece pela adio de enzimas, tais como alfa-amilase e glucoamilase, no incio do processo. J na SFS as enzimas so secretadas pelo Saccharomyces 8

Consideraes do modelo quanto a sacarificao do amido por uma enzima chave aditiva: 1. O modelo considera a atividade enzimtica como uma ao aditiva no processo de sacarificao do amido (soma das atividades da glucoamilase e alfa-amilase durante o processo de secreo por S. cerevisiae YPBG). Considerou-se que a ao de vrias enzimas (neste

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caso, a ao de duas enzimas) pode ser representada como a ao aditiva de apenas uma enzima. A estrutura do amido pode ser considerada com uma composio de duas fraes (resistvel e suscetvel) com diferentes taxas de degradao. A taxa de hidrlise da frao do amido suscetvel depende da concentrao das duas fraes do amido e esta taxa inibida pela ao da glicose e concentrao da frao do amido suscetvel. A taxa de hidrlise da frao do amido resistvel depende da concentrao das duas fraes do amido e esta taxa inibida pela ao da glicose e a concentrao da frao do amido resistvel. Limitaes de transferncia de massa e mudanas conformacionais da estrutura da enzima no so consideradas.

dX ( t ) = ( Glu , S total , S0 ).X ( t ) dt

Balano do etanol
dEt( t ) = q p ( Glu , Et , S0 ).X ( t ) + Et .X ( t ) dt

(9)

(10)

2.2. Segundo nvel hierrquico do conhecimento O segundo nvel hierrquico do conhecimento consiste na cintica da populao microbiana. Ser descrito alguns fenmenos fisiolgicos da levedura S. cerevisiae YPB-G com formas matemticas no estruturais simples, apresentadas na literatura (BIROL et.al, 1998b; MONOD, 1949; ANDREWS, 1968). Assumi-se que a taxa de crescimento especfico da levedura modificada influenciada pela glicose e concentrao do amido, que pode ser interpretado como um fator de inibio por produtos do amido. Muitos modelos cinticos foram testados e a anlise de sensibilidade mostrou que estes modelos usados ajustam-se melhor aos dados experimentais. A taxa de produo de etanol foi descrita como uma funo das concentraes da glicose e etanol. Por outro lado, esta taxa pode ser interpretada como uma funo no linear da taxa de crescimento da biomassa, onde dois tipos de inibio por produto esto envolvidos. O modelo da cintica utilizando os balanos de biomassa e etanol descrito pelas equaes (7) a (10). Taxa de crescimento da biomassa

O modelo da cintica microbiana flexvel e as equaes (11) a (13), balano da glicose, balano e sntese de enzima, unificam o primeiro e o segundo nvel do conhecimento, mostrando a dinmica de formao e utilizao da glicose e o processo de formao das enzimas para a hidrlise do amido. Estas equaes so escritas a seguir: Balano da glicose
dGlu( t ) = 1.111 ( R sus + R res ) dt 1 dX ( t ) 1 dEt( t ) . . Yx / s dt Yp / s dt

(11)

Taxa de sntese de enzima

R enz = ( max + ).Enz max .S total ( t ) K enz + S total ( t )

(12)

Balano de enzima
dX ( t ) .Enz( t ) dEnz( t ) dt = R enz .Enz( t ) dt X(t )

(13)

( Glu , S total , S 0 ) =

max .Glu( t ).

S total ( t ) S0 K s + Glu( t )

(7)

O sistema de equaes diferenciais no lineares foi resolvido utilizando o software Maple e diferentes mtodos numricos foram aplicados, como RKF45, Rosenbrock e lsode. O sistema no manifesta um perfil stiffness e o mtodo numrico Rosenbrock foi mais utilizado nas simulaes computacionais. 2.3. Procedimento de identificao dos parmetros A estimativa dos valores dos parmetros cinticos e estequiomtricos foram obtidos usando os dados experimentais do trabalho dos autores ALTINTAS et.al, (2002b). Todas as concentraes iniciais e os parmetros estimados esto apresentados abaixo, ver Tabela 1. Inicialmente utilizaram-se valores apresentados na literatura como aproximao inicial para as constantes do modelo, onde determinou-se o intervalo de possibilidades dos valores destes parmetros. Foi utilizado o mtodo dos mnimos quadrados, com ponderao, como critrio estatstico. Diferentes rotinas de estimao foram testadas, incluindo o dialogo grfico usando o software Maple. Este 9

Taxa de produo de etanol

q p ( Glu , Et , S 0 ) = Et( t ) q p max .Glu( t ).Et( t ).1 Et max = 2 (K s1 + Glu( t )). K ps + Et( t ) + Et( t ) K pi

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Balano da biomassa

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procedimento muito usado de forma educacional para anlise de sensibilidade dos parmetros e avaliao da resposta do sistema. Os dados experimentais (ALTINTAS et.al, 2002b) foram plotados juntamente com as simulaes do modelo para as mesmas condies iniciais. As estimativas dos valores dos parmetros foram realizadas com 10% ou menos de variao, dependendo da sensibilidade do sistema atravs de cada parmetro.
Tabela 1- Condies iniciais e estimativas das constantes cinticas

Condies iniciais Glu0 S0 X0 Et0 Enz0 Constantes cinticas Ksus Kres Kstarch Kglu Km per max Yx/s Ks Etmax qp,max Yp/s Ks1 Kps Kpi Kenz enzmax

Et

SG50 3.5 42.5 0.1 1.5 0.001 SG50 0.057 0.00618 62.7 1.22 0.406 0.617 0.15 0.14 1.08 15 0.129 0.376 0.154 4.67 3.65 0.05 1 6.05 0.022

Unidades g/L g/L g/L g/L U/L Unidades h-1 h-1 g/L g/L g/L [-] h-1 g/g [-] g/L h-1 g/g g/L g/L g/L h-1 g/L U/L h-1

Figura 2 - Comparao entre o perfil de concentrao de amido do modelo desenvolvido com dados experimentais (ALTINTAS et.al, 2002b)

Analisando os perfis de concentraes de amido total, suscetvel e resistvel, ver Figura 3, observa-se que o perfil do amido total influenciado, at o tempo de 100 horas, principalmente pela frao de amido suscetvel, enquanto aps este instante, o perfil totalmente influenciado pelo amido resistvel sacarificao. Por outro lado, a frao de amido suscetvel determinar o ponto de mudana acentuada da taxa de degradao, ou seja, o ponto de mudana de inclinao da curva do amido total.

3 - RESULTADOS E DISCUSSO O modelo matemtico desenvolvido foi aplicado a diferentes condies iniciais, entretanto ser mostrado neste trabalho apenas um caso. O interesse deste trabalho no apenas modelar o processo em particular, mas mostrar que a utilizao de anlise sistemtica para sistemas complexos eficiente e pode auxiliar em outros processos de SFS utilizando outros microorganismos (KOBAYASHI e NAKAMURA, 2004a; KOBAYASHI e NAKAMURA, 2004b; LGEN et.al, 2002). Para tanto, o segundo nvel hierrquico requer maior ateno, podendose utilizar outros modelos cinticos para representar os efeitos de inibio e limitao por substrato e produto. Pode-se observar, ver Figura 2, que o modelo ajusta com eficincia os dados experimentais da degradao do amido no primeiro nvel hierrquico, validando as consideraes quanto a estrutura do amido e concentrao da enzima chave como funo do tempo.

Figura 3 - Relao entre o amido total e as fraes de amido suscetvel e resistvel

O modelo desenvolvido tambm descreve a concentrao de enzimas com relao ao tempo, ver Figura 4, durante o processo SFS. No segundo nvel hierrquico, o modelo se mostrou eficiente e flexvel, simulando os perfis experimentais da biomassa, etanol e glicose, ver Figuras 5 a 7. Os perfis da biomassa e do etanol so sempre crescentes, no apresentando o perfil diauxic growth nos dados experimentais do microorganismo modificado, considerado na modelagem ciberntica (ALTINTAS et.al, 2002b), entretanto, o modelo desenvolvido neste trabalho no considera este fenmeno, apresentando bons resultados, ver Figura 5. Um dos pontos importantes do modelo de crescimento da biomassa a caracterizao dos efeitos de inibio dos produtos do amido sobre a biomassa, representado pela frao de amido total sobre amido inicial. Uma anlise

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mais precisa de algumas constantes no possvel devido a disperso dos dados experimentais da concentrao da biomassa.

O modelo desenvolvido tambm se mostrou eficiente, quando utilizado para descrever o perfil de concentrao de etanol, ver Figura 7.

Figura 4 - Simulao da Concentrao da enzima durante o processo SFS

Figura 7 - Comparao entre o perfil de concentrao de etanol do modelo desenvolvido com dados experimentais (ALTINTAS et.al, 2002b)

4 - CONCLUSO As simulaes do modelo provaram que as consideraes para o primeiro nvel hierrquico do conhecimento, sobre a representao da estrutura do amido em duas fraes e a atividade da enzima na forma aditiva eram corretos. A simulao do modelo para a degradao do amido mostrou-se eficiente quando comparado com os dados experimentais. O primeiro nvel hierrquico do conhecimento, a cintica de hidrlise do amido, foi unido ao segundo nvel, modelo de degradao enzimtica, atravs do modelo de liberao da glicose e simultnea metabolizao em etanol. Para o segundo nvel, a fisiologia microbiana foi modelada e ao modelo da taxa especfica de crescimento da biomassa foi incluido efeitos de limitao e inibio por substrato. O modelo desenvolvido foi comparado com um modelo ciberntico que foi aplicado para o mesmo sistema. Esta comparao mostrou que utilizando diferentes mtodos de modelagem pode se obter excelentes resultados. Entretanto, analisando os dados experimentais no foi observado grande manifestao de diauxic growth para esta cepa modificada, considerado pelo modelo ciberntico. O modelo proposto mostrou excelente flexibilidade para as diferentes condies operacionais do processo SFS e pode ser utilizado com sucesso para descrever a fisiologia microbiana dos microorganismos modificados geneticamente. 5 - LISTAS DE SMBOLOS Enz concentrao da enzima (U/L) Et concentrao de etanol (g/L) Glu concentrao da glicose (g/L) Km constante de Michaelis Menten (g/L) Ks, Ks1, Kps, Kenz constantes de saturao (g/L) Kstarch, Kglu, Kpi constantes de inibio (g/L) qp taxa de produo de etanol (h-1) R taxa de degradao (g.L-1.h-1) taxa de sntese de enzimas (U.L-1.h-1) Renz 11

Figura 5 - Comparao entre o perfil de concentrao de biomassa do modelo desenvolvido com dados experimentais (ALTINTAS et.al, 2002b)

A unificao do modelo atravs do balano de glicose validada, visto que o modelo simula com eficincia os dados experimentais da glicose, com uma reduo drstica da concentrao at o tempo de 20 horas, mantendo-se praticamente constante no decorrer da reao, ver Figura 6.

Figura 6 - Comparao entre o perfil de concentrao de glicose do modelo desenvolvido com dados experimentais (ALTINTAS et.al, 2002b)

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S t X Yx/s, Yp/s

concentrao de amido (g/L) tempo (h) concentrao da biomassa (g/L) coeficientes de converso (g/g) taxa de crescimento da biomassa (h-1) taxa de diluio da enzima (h-1)

Subscritos 0 max res sus total

concentrao inicial mximo amido resistvel amido suscetvel amido total

Nota: Uma unidade de enzima (U) representa a quantidade de enzima necessria para produzir 1 g de glicose a partir do amido em uma hora.
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
ALTINTAS M. M.; LGEN K. .; KIRDAR B.; NSAN Z. I.; OLIVER S. G. Improvement of ethanol production from starch by recombinant yeast through manipulation of environmental factors. Enzyme and Microbial Technology, v.31, p.640-647, 2002a. ALTINTAS, M. M.; KIRDAR B.; NSAN Z. I.; ULGEN K. . Cybernetic modelling of growth and ethanol production in a recombinant Saccharomyces cerevisiae strain secreting a bifunctional fusion protein. Process Biochemistry, v.37, p.14391445, 2002b. ANDREWS, J. F. A mathematical model for the continuous culture of microorganisms utilizing inhibitory substrates. Biotechnology Bioengeneering, v.10, p.707-723, 1968. BIROL G.; NSAN I.; KIRDAR B.; OLIVER S. G. Ethanol production and fermentation characteristics of recombinant Saccharomyces cerevisiae strains grown on starch. Enzyme and Microbial Technology. v.22, p.672-677, 1998a.

BIROL G.; DORUKER P.; KIRDAR B.; NSAN Z. I.; ULGEN K. . Mathematical description of ethanol fermentation by immobilized Saccharomyces cerevisiae, Process Biochemistry, v.33, p.763-771, 1998b. KOBAYASHI F.; NAKAMURA Y. Effect of repressor gene on stability of bioprocess whith continuous conversion of starch into ethanol using recombinant yeast. Biochemical Engineering Journal, v.18, p.133-141, 2004. KOBAYASHI F.; NAKAMURA Y. Mathematical model of direct ethanol production from starch in immobilized recombinant yeast culture. Biochemical Engineering Journal, v.21, p93-101, 2004. KOMPALA D. S.; RAMKRISHNA D.; JANSEN N. B.; TSAO G.T. Investigation of bacterial growth on mixed substrates: experimental evaluation of cybernetic models. Biotechnology and Bioengineering, v.28, p.1044-1055, 1986. KOMPALA D. S.; RAMKRISHNA D.; TSAO G. T. Cybernetic modeling of microbial growth on multiple substrates, Biotechnology and Bioengineering, v.26, p.1272-1281, 1984. MIELENZ, J.R., Etanol production from biomass: technology and commercialization status. Current Opinion in Microbiology, v.4, p.324-329, 2001. MONOD, J. The growth of bacterial cultures. Annual Reviews in Microbiolog, v.3, p.371-394, 1949. POLAKOVIC M.; BRYJAK J. Modelling of potato starch saccharification by an Aspergillus niger glucoamylase, Biochemical Enginnering Journal, v.18, p.57-63, 2004. LGEN K.; ., SAYGILI B.; NSAN Z. I.; KIRDAR B. Bioconversion of starch into ethanol by a recombinant Saccharomyces cerevisiae strain YPG-AB. Process Biochemistry, v.37, p.1157-1168, 2002.

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