Reactii antigen-anticorp

Dr. Cristiana Cerasella Dragomirescu

Reactiile antigen anticorp in vitro

I.Seroidentificare: Detectarea i dozarea Ag (element necunoscut-tulpini microbiene izolate din diferite prelevate)cu ajutorul Ac specifici cunoscui. II.Serodiagnostic: Detectarea i titrarea Ac din serul bolnavilor (component necunoscut) fa de un Ag specific cunoscut .

REACIILE ANTIGEN-ANTICORP in vitro (REACIILE SEROLOGICE)

Reacia Ag-Ac este determinat de interaciunea specific dintre epitopii Antigenului i paratopii Anticorpilor. n acest proces intervin patru tipuri de legturi: - legturi de hidrogen, - legturi electrostatice, - forele Van der Waals i - legturi hidrofobe. Legtura Ag-Ac are trei caracteristici: este exotermic, specific i reversibil.

 Afinitatea unui Ac pentru un Ag specific caracterizeaz intensitatea forelor de legtur a complexului Ag-Ac. Ea depinde de complementaritatea steric dintre paratop i epitop. Aviditatea unui Ac pentru un Ag specific reprezint rapiditatea apariiei manifestrii reaciei Ag-Ac (precipitare, aglutinare, etc.). Ea depinde de constanta de asociere, de valena Ac, de numrul de epitopi, de temperatur, de pH, de fora ionic a mediului.

INTERACIUNEA ANTIGEN-ANTICORP I. Faza specific: are loc interaciunea dintre Ag i Ac specific corespunztor. Este un fenomen rapid, invizibil, comun pentru toate reaciile Ag-Ac. Decurge la temperatura de 37 C, n prezena unui electrolit (sol. fiziologic). II. Faza nespecific, vizibil a uniunii Ag-Ac, se manifest prin precipitare, aglutinare, liz, etc - fenomene determinate de anumite condiii (valena Ac, dimensiunile Ag, etc).

Teoria lui Marrack

Tipuri de reactii Ag- Ac 1. 2. 3. 4. 5. Reactii de precipitare Reactii de aglutinare Reactii de seroneutralizare Reactia de fixare a complementului Reactii in care componentele sunt marcate - izotopic-RIA - enzimatic- ELISA - fluorescent- FIA - chemiluminiscent- CLA

REACTIILE DE PRECIPITARE
Imunoprecipitarea se manifesta doar atunci cand Ag solubil este amestecat cu Ac corespunzator. Ea poate fi observata sau in mediu lichid, sau solid, fiind sau calitativa, sau cantitativa. Acestea sunt reactii specifice dar putin sensibile, ce necesita cantitati importante de anticorpi. Precipitarea complexelor moleculare rezultate din uniunea Ag-Ac este determinata de formarea unei retele tridimensionale de Ag reunite prin Ac. Condiiile de formare a reelei de precipitare: - Ac sa fie cel putin bivalent (Ac completi) - Ag sa fie multivalent (haptenele nu pot fi precipitate) Precipitarea maxima corespunde cu zona de echivalen, unde Ac si Ag sunt in raport optimal de concentraie, ce permite precipitarea tuturor moleculelor de Ac cu Ag corespunzator.n exces de Ag sau de Ac precipitatul nu se formeaz.

PRECIPITAREA IN MEDIU LICHID

Reactia de precipitare inelara

Utilizarea practica: identificarea petelor de sange, depistarea falsificarilor produselor alimentare, depistarea antigenului polizaharidic al agentului antraxului in omogenat de organe (reactia Ascoli).

Reactia de precipitare in inel

Titrarea toxinei difterice- reactia Ramon:

Se pun in contact, in amestec, in tuburi cantitati egale din componenta care trebuie titrata (Ag- toxina difterica) cu cantitati variabile de Ac la care titrul este cunoscut Cantitatea maxima de precipitat se gaseste in tubul unde exista raportul de echivalenta. Cunoscand titrul anticorpilor se poate afla titrul toxinei (1 Lf = 1 limes floculans= cantitatea de toxina care se combina cu o unitate de antitoxina = 1 UA= 1 unitate antitoxica )

Ex : testul Kahn pentru sifilis, metoda Dean, Web

PRECIPITAREA N MEDIU SOLID (N GEL)

n aceste reacii Ag i Ac difuzeaz unul spre altul prin geloz i n zona de concentraie optim a acestor doi reactivi se produce precipitarea sub form de linii alb-cenuii. Dac exist mai multe sisteme Ag-Ac, se vor forma linii de precipitare distincte. Poate fi utilizat n analiza calitativ a unui amestec de Ag ntr-o soluie.

PRECIPITAREA N MEDIU SOLID (N GEL)

Imunodifuzia simpl radial (tehnica Mancini)

Imunodifuzie dubl (tehnica Ouchterlony)

PRECIPITAREA N MEDIU SOLID (N GEL)

Imunodifuzie dubl (tehnica ELEK)

Reactii de precipitare in mediu solid (gel)

Contraimunoelectroforeza (CIEF)
- Este util la examinarea amestecurilor antigenice complexe. Lectura este posibila peste 90 minute.

- Electroforeza proteica in gel - Imunelectroforeza = imunodifuzie dubla in camp electric - Electroimunodifuzia = difuzie simpla mediata de camp electric

Reactii de aglutinare
In reactia de aglutinare atg sunt de natura corpusculara Reactia de aglutinare consta in reactia atc cu atg de pe suprafata unor particule (bacterii, hematii, latex, cristale de colesterol) Reactia este mai sensibila decat cea de precipitare Atc de tip IgM sunt mai aglutinanti decat cei de tip IgG.

Reactii de aglutinare
Aglutinare activ sau direct, n care particula figurat (Ag corpuscular) este el nsui purttor de determinante antigenice specifice (hematii, leucocite, trombocite, spermatozoizi, bacterii) -se utilizeaza in diagnosticul bacteriologic pt identificarea enterobacteriilor (E. coli, Salmonella si Shigella) Aglutinare pasiv sau indirect, n care particula servete doar de suport pentru un determinant antigenic solubil fixat artificial pe suprafaa sa. Frecvent sunt utilizate ca suport hematii formolate, particule de latex sau microcristale de colesterol. - se utilizeaza in determinarea factorului reumatoid, CRP, grupului streptococic

Reactii de aglutinare
Reactiile de aglutinare se pot efectua : - pe lama - in tuburi

Aglutinarea directa pe lama

Reactia de aglutinare pe lama

Utilizata in diagnosticul tulpinilor de E. coli, Salmonella, Shigella, Haemophylus influenzae, Vibrio cholerae Se utilizeaza seruri polivalente si apoi monovalente ce permit identificarea pana la nivel de specie. Reactia de aglutinare indirecta se utilizeaza pt det grupului streptococic, serotiparea pneumococilor, serogruparea meningococilor, detectarea unor enterotoxine stafilococice, detectarea unor fungi, etc

Reactia de aglutinare in tuburi

Se utilizeaza pt: - confirmarea aglutinarii pe lama - determinarea atg de tip O la bacteriile care prezinta atg H sau K (care ar putea inhiba aglutinarea cu atg O), cultura se mentine 1-2 ore la 100 grade C - se efectueaza dilutii din serul standard care contine atc si se pun in contact cu cantitati egale din suspensia de atg. Reactia este pozitiva in cazul in care apar aglutinate (grunjoase in cazul atg O si floconoase in cazul atg H)

Reactia de aglutinare in serodiagnostic utilizand atg standard

Pe lama: - reactia Huddleson in diagnosticul brucelozei si reactia Kudicks-Steuer in diagnosticul tifosului exantematic In tuburi: - reactia Wright utilizata in diagnosticul serologic al brucelozei si reactia Widal in diagnosticul febrei tifoide (utilizeaza seruri recoltate in dinamica) si se det atc anti O, anti H si anti Vi (prin hemaglutinare pasiva)

Reactia de fixare a complementului

Complementul = constituent important al apararii naturale cuprinde circa 30 de componente celulare sau plasmatice Se poate activa: - pe cale clasica declansata de complexele atcatg, celule apoptotice, virusuri, CRP - cale lectinica activata de microorganisme - cale alterna activata de bacterii, virusuri, celule tumorale

Reactia de fixare a complementului Reactie al carei rezultat nu poate fi vizualizat fara un sistem indicator. Sistemul indicator este format din hematii de berbec si atc anti hematii de oaie. Se utilizeaza in diag sifilisului reactia Bordet Wasserman.

Reactia de fixare a complementului

R + = in tuburile cu serul de cercetat nu apare hemoliza (hematiile se depun in buton) R - = in serul de cercetat nu exista atc si in aceste tuburi apare hemoliza

Reactia de seroneutralizare
- In aceasta reactie atg are o anumita proprietate biologica (toxica sau enzimatica) care poate fi blocata prin cuplarea cu anticorpii specifici. Diagnosticul microbiologic direct : identificarea Clostridium perfringens metoda placilor seroneutralizante; testarea toxinogenezei tulpinilor de C. diphtheriae toxinotipia in suspiciunea unei infectii cu Clostridium botulinum Diagnosticul serologic Testul ASLO determinarea atc anti streptolizina O Reacia de imobilizare Unii anticorpi anti-bacterieni pot provoca imobilizarea bacteriilor mobile (vibrioni, spirochete)

Reactia ASLO
-Se realizeaza in tuburi in care se dilueaza serul de testat. -Titrul de anticorpi antistreptolizina O este dat de ultimul tub in care lipseste hemoliza -Pt Romania se accepta ca titru normal 200-250 unitati ASLO

Reactie pozitiva prezenta atc = absenta hemolizei

Reactie negativa absenta atc = prezenta hemolizei

Reactia de seroneutralizare
1. Vaccinarea in scopul obtinerii unei protectii prin seroneutralizare ( ex. Vaccinul DTP) 2. Evaluarea eficacitatii vaccinurilor - IDR Dick testarea susceptibilitatii fata de scarlatina - IDR Schick testarea susceptibilitatii fata de difterie - Atg se inoculeaza intradermic, in treimea medie a antebratului, iar daca in serul pacientului exista atc anti toxina acestia vor neutraliza atg inoculat si la locul injectarii nu va aparea reactie. 3. Terapia sau profilaxia specifica (imunoterapia pasiva) consta in administrarea de: - imunoglobuline specifice omologe obtinute de la persoane imunizate - imunoglobuline specifice heterologe (ser de cal)

Reactii in care componentele sunt marcate

Componentele reactiei pot fi marcate: -Fluorescent (FIA) -Enzimatic (ELISA) - Izotopic (RIA) -Chemiluminiscent (CLA)

Reactia de imunofluorescenta

Reactie pozitiva

Reactie negativa

Reacia Imuno-Enzimatic (RIE, ELISA -Enzyme Linked Immunosorbent Assays). - RIE direct (metoda sandwich). Utilizat doar n sero-identificarea Ag. n godeurile din placa de polistiren n care sunt fixai Ac cunoscui se toarn soluia de Ag necunoscut. Se incubeaz 1h. Dup o splare minuioas a godeurilor se adaug Ac marcai cu enzima, care se fixeaz pe epitopii liberi ai Ag polivalent. Dup incubare de 30 min-1h se spal iari godeurile. Prezena complexului Ac-Ag-Ac-marcat se depisteaz cu ajutorul substratului cromogen (substan iniial incolor, dar care se coloreaz sub aciunea enzimei, ex. apa oxigenata si orthofenilendiamina).

ELISA

RIA Radio Immuno Assey

- Este o reactie de competitie intre doua antigene: un atg marcat cu un izotop radioactiv si unul nemarcat (atg de testat) - R+ : atg din proba formeaza complexe imune cu atc din serul standard iar la adaugarea atg marcat acesta nu va fi folosit in reactie = nivel de radioactivitate scazuta - R- : absenta atg din proba faciliteaza legarea atg marcat de atc din serul standard = nivel de radioactivitate ridicat