EXTRACCION DEL ADN

Msc. CIENCIAS BASICAS BIOMEDICAS

LABORATORIO DE BIOCIENCIAS

CONTENIDO

Generalidades sobre el ADN Muestras para extraccin del ADN

Condiciones sobre la remisin de muestras.

Mtodos de extraccin del ADN - Salting out

EL MATERIAL GENTICO

CROMOSOMAS
46 CROMOSOMAS 23 PARES DIPLOIDES
UN INDIVIDUO TIENE 23 CROMOSOMAS HEREDADOS DE LA MADRE Y 23 HEREDADOS DEL PADRE

EL MATERIAL GENTICO
Es el responsable de transmitir los caracteres heredados de una generacin a otra.

Est conformado por millones de unidades de nucletidos Cada nucletido esta a su vez formado por: Base nitrogenada, Azcar y grupo fosfato

EL MATERIAL GENETICO
BN

BASES NITROGENADAS
BN ADENINA BN GUANINA BN CITOSINA

P
A

BN

BN

P BN

TIMINA

REGIONES DEL ADN

De secuencia nica (genes)

Medianamente repetitivas

Altamente Repetitivas

CROMOSOMA

p
HETEROCROMATINA

ADN

REGIONES REPETIDAS

EUCROMATINA

GEN

Factores que afectan el rendimiento, calidad y pureza del ADN .

Cantidad de material de partida

Nmero de copias de las molculas de AN Cantidad de tejido

Condiciones en las que se encuentra el material de inicio (fresco, congelado, fijado) Contaminantes e interferentes en el material biolgico

MUESTRAS EXTRACCION DEL ADN

Sangre Semen Saliva Cabello Hueso Diente Tejido

MUESTRAS PARA EXTRACCION DEL ADN

Sangre: derivados porfirinicos de la Hemoglobina. Manchas: secado. Residuo metanolico: Chelex. Soportes: Absorbente o no.

REMISION PARA ANALISIS DE POLIMORFISMO MOLECULAR

La posibilidad de extraer el material gentico en cualquier indicio biolgico. Anlisis por medio de tcnicas como la PCR ,ha permitido obtener ADN a partir de indicios biolgicos en cantidades escasas

REMISION DE LAS MUESTRAS PARA ANALISIS DEL ADN

NORMAS DE BIOSEGURIDAD. CADENA DE CUSTODIA. FORMATOS EN CASOS ESPECIFICOS.

PROTECCION DEL PERSONAL Prevenir contacto directo Prohibir consumo de comidas y bebidas. Condiciones de asepsia y material desechable. Vacunacin.

PROTECCION DE LA MUESTRA

CONTAMINACION POR MATERIAL BIOLOGICO HUMANO.

CONTAMINACION MICROBIOLOGICA.
CONTAMINACION QUIMICA. TRANSFERENCIA DE INDICIOS BIOLOGICOS.

CONTAMINACION POR MATERIAL MATERIAL BIOLOGICO HUMANO

Depsito de material biolgico humano sobre las muestras, con posterioridad a la toma de las mismas.

CONTAMINACION MICROBIOLOGICA
Este tipo de contaminacin tiene lugar por el desarrollo de microorganismos y suele estar favorecida por la humedad y las altas temperaturas.

CONTAMINACION QUIMICA

Presencia de productos qumicos que dificultan procesos del anlisis gentico, como PCR y extraccin del ADN

TRANSFERENCIA DE INDICIOS BIOLOGICOS.

Debido al traslado de los indicios de una localizacin a otra puede dar lugar a una contaminacin o puede ocasionar la prdida de la prueba.

DEGRADACION DE LAS MUESTRAS

Humedad ambiental. Fenmenos meteorolgicos, accin de insectos, entre otros. Recogida y envi al laboratorio de estas evidencias de una manera adecuada para evitar la proliferacin bacteriana y por consiguiente la degradacin del material gentico

DEGRADACION DE LAS MUESTRAS

Exponer por mucho tiempo las muestras a los rayos ultravioleta provoca daos sobre la estructura del ADN, o aplicar ciertos conservantes que puedan provocar efectos sobre la cadena del ADN.

DOCUMENTOS NECESARIOS

Formulario de envio de muestras.

Identificacion de Muestras. Cadena de Custodia.

FORMULARIO ENVIO DE MUESTRAS

Investigacion solicitada: Investigacion restos de sangre. Antecedentes y datos sobre el caso: Causa de los hechos, lugar, fecha. Datos de la victima: Edad, sexo, Grupo poblacional, causa de la muerte, relacion con el sospechoso. Datos del sospechoso:

IDENTIFICACION DE LAS MUESTRAS

Listado de muestras de referencia: Numero, tipo de muestra, Nombre de la persona, relacin con el caso. Listado de indicios biolgicos: numero de referencia, tipo de muestra (toma vaginal), a quien pertenece y localizacin, tipo de indicio a estudiar.

CADENA DE CUSTODIA

Nombre o identificacin, firma. Fecha y hora de la recogida. Condiciones de almacenaje de las muestras hasta su envo.

METODOS DE EXTRACCION DE ADN

SALTING OUT
CHELEX FENOL - CLOROFORMO

FENOL CLOROFORMO

Tcnica Orgnica (Solventes) ADN de muy buena calidad y cantidad. Peptidos y proteinas son extraidas en la fase organica (Fenol), despus se realiza digestin con proteinasa K. El cloroformo permite que todo el fenol pueda ser lavado. DESVENTAJAS: Reactivos altamente txicos Perdidas significativas de ADN y mucho mas si esta degradado.

CHELEX

Tcnica inorgnica

Previene la degradacin del ADN por quelacin de los iones metlicos durante la ebullicin al 5%.
Tiene copolimeros de estireno dibenzeno- inones iminodiacetato. los reactivos no son txicos y no se pierde ADN. DESVENTAJAS: El ADN aislado es de cadena sencilla, utilizado en PCR pero no en RFLPS.

SALTING-OUT

Tcnica de tipo inorgnica Utiliza reactivos bajos en toxicidad Permite visualizar la malla del ADN. Desventajas: Requiere una mayor cantidad de muestra.

SALTING OUT
1. 2. 3. 4. Lisis Celular Extraccin Precipitacin Resuspensin

LISIS CELULAR
Buffer de lisis I: (lisis glbulos rojos). - Sucrosa - MgCl2 1M - Triton x 100 Buffer de lisis II: (lisis glbulos blancos) EDTA de Na NaCL.

EXTRACCION

Lauril sulfato de sodio al 10%: despolariza las proteinas Perclorato de sodio 5M NaCl 6M

PRECIPITACION

Isopropanol

Etanol al 70% lava el exceso de sales.

RESUSPENSION

Se realiza en Buffer T. E. ( Tris EDTA) o tambin se puede realizar en agua.

EXTRACCION SALTING OUT

CONCLUSIONES

El ADN es el material gentico a travs del cual se transmite la informacin contenida en los genes de generacin en generacin. El ADN esta presente en los indicios biolgicos como sangre, semen saliva, tejido, hueso, pelo etc. Es muy importante conocer las condiciones para la remision adecuada de las muestras. El Salting-out es uno de los mtodos de extraccin de ADN mas utilizados por su fcil implementacion, baja toxicidad de los reactivos y permite la visualizacion del ADN.

BIBLIOGRAFIA

MARTINEZ JARRETA, M Begoa. La prueba del ADN en medicina forense. Masson: Buenos Aires.1999. Grupo Espaol y portugus de la ISFG. Recomendaciones para la recogida y envo de la muestras con fines de identificacin gentica. Madeira, 2 de Junio 2000.

MILLER S, DYKES D, POLESKY H, A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells, Nucl. Ac. Res. 16: 1215. 1988.