BARTONELLOSIS: DIAGNOSTICO DE LABORATORIO

Bartonella bacilliformis

Bacteria pleomrfica pequea: 0.25 a 0.5m por 1 a 3 m Gram negativa Coloracin: Giemsa Localizacin: intracelular Posee multiples flagelos unipolares (flagelina 42kDa)

TRANSMISSION

VECTOR: Lutzomyia verrucarum? Solo en regiones endmicas INCUBACION: 2-3 semanas

CORRELACION DE LOS CASOS DE BARTONELOSIS CON LA DISTRIBUCION DE

Lutzomyia verrucarum

Casos

Lutzomyia verrucarum

CALLEJON DE HUAYLAS (CARAZ)

FASES DE LA ENFERMEDAD DE CARRION

FASE AGUDA
FASE CRONICA

FASE AGUDA

VERRUGA PHASE

PRUEBAS DE CONFIRMACION
DETECCION DE BARTONELLA EN FROTIS. GIEMSA O WRIGHT CULTIVO PCR

CULTIVO GOLD STANDARD

ESPECIES DE BARTONELLA
Bartonella alsatica Bartonella bacilliformis Bartonella clarridgeiae Bartonella doshiae Bartonella elizabethae Bartonella grahamii Bartonella henselae Bartonella peromysci Bartonella quintana Bartonella talpae Bartonella taylorii Bartonella tribocorum Bartonella vinsonii Bartonella vinsonni subsp. berkhoffi Bartonella vinsonni subsp. vinsonni

MUESTRAS QUE SE DEBEN TOMAR A PACIENTES SOSPECHOSOS

SANGRE TOTAL PARA SUERO SANGRE CITRATADA PARA CULTIVO SANGRE PARA PCR BIOPSIA O ASPIRADO EN CASO DE PACIENTES EN FASE VERRUCOSA

TRANSPORTE DE MUESTRAS
SANGRE CITRATADA A 4C A T AMBIENTE SANGRE TOTAL A 4C SUERO A -20C BIOPSIAS EN SOLUCIN SALINA ESTRIL

CARACTERISTICAS MORFOLOGICAS AL M.O.

BACILOS PLEOMORFICOS DE 0.1 - 0.2 GRAM: NEGATIVO GIEMSA: BACILOS O COCOS INTRACELULARES

La foto de la izquierda es una gota gruesa de un cultivo de Bartonella bacilliformis a los 5 das. La foto de la derecha muestra el extendido del mismo cultivo. Coloracin de Giemsa.

Diagnostic Value of the Thin Smear in Human Bartonellosis (Carrions Disease)

Paul E. Pachas1, Nelson Solorzano2, Juana Chiroque2, Yanina Rojas2, Jorge A. Chancafe1, Augusto Tarazona2, Jose Godenzi2, Mauro Quiroz2, Carlos Segovia2, Franca R. Jones3

The overall TS sensitivity found was 23.9%. However, when adjusted by clinical form, this value increased up to 26.2% for acute bartonellosis, similar to that found for Plasmodium spp. diagnosis using thick smear (24.3%)

MEDIOS DE CULTIVO
MEDIO F-1 (medio modificado en NAMRID) MEDIO AGAR PAPA MEDIO GEL

CULTIVO
CULTIVO EN F-1 INCUBAR A 28C POR 2 MESES REVISAR LOS CULTIVOS CADA SEMANA COLORACION GRAM O GIEMSA PARA UN CULTIVO SOSPECHOSO

MEDIO GEL
INCUBAR A 28 37C CRECIMIENTO A PARTIR DE 10 DIAS DEBIDO A SU MOVILIDAD PRESENTA ANILLOS DE CRECIMIENTO SE PUEDE MANTENER VIABLES EN ESTE MEDIO HASTA 6 MESES

PRUEBAS BIOQUIMICAS
NO CRECEN EN MEDIOS DIFERENCIALES

PRUEBAS SEROLOGICAS
IFI ELISA AGLUTINACION

PREPARACION DE ANTIGENO
CULTIVO EN T-J HEMOLIZAR LA SANGRE LAVAR CON SORENSEN AGREGAR SDS Y RESUSPENDER INCUBAR A 37C POR 30 MINUTOS O MAS CENTRIFUGAR GUARDAR EL SOBRENADANTE DIALIZAR DOSAR CONCENTRACION

PCR CONVENTIONAL

PCR
CITRATE SYNTHASE

379 bp

CONVENTIONAL PCR
781P, 1137N PRIMERS

379 bp

Deteccion de Bartonella bacilliformis con la tcnica de PCR en Tiempo Real en Lutzomyias Naturalmente Infectadas

Sofa Romero Mederos

RESULTADOS DE PCR CONVENCIONAL

# de Lutzomyia 1 2 3 4 5 10 0 0 VOLUMEN DE SANGRE 0.2l 0.4l 0.6l 0.8l 1.0l 2.0l 0.2l 1.0l RESULTADO DE PCR NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO NEGATIVO POSITIVO

Taqman 7700 PCR Tiempo Real

PCR en tiempo real es una de la pruebas mas sensible y especfica para el anlisis de la expresin de RNA o cuantificacin de DNA.

Deteccin de DNA con SYBR Green I Dye

El colorante libre emite muy poca fluorescencia

Alinamiento de los primers

La fluorescencia aumenta con cada enlace de DNA. Fluorescencia es observada en tiempo real.

Fundamento del Monitoreo de PCR con el Sistema LightCycler

Comparacin con termocicladores convencionales

Ventajas
CUANTIFICACION MAS RAPIDO MAS FACIL

Agilent 2100 bioanalyzer

Esta plataforma esta basada en anlisis de micro fluidos para el estudio de DNA, RNA, protenas y clulas. Primer instrumento basado en tecnologa de lab-on-a-chip el Agilent 2100 bioanalyzer a demostrado ser una excelente alternativa para la tcnica de electroforesis; rpida, automatizada, alta calidad digital en vez de subjetiva, asociada con geles.

AGILENT (GEL EN UN CHIP)

NEGPOOL2

NEGPOOL2

HOSP800-29
HOSP800-29

BBF1-R1
NEGPOOL2 HOSP800-29

SET2

NEGPOOL2

HOSP800-29

SET1

SET4

OPTIMIZACION DE LOS PRIMERS

SET 3 BB511-BB586R

DISTINTAS CONCENTRACIONES

LOD 30/30 RUN

TUBE21 BROKE, TRASFERRED SAMPLE TO NEW TUBE

100fg!

SENSITIVIDAD : 100% SPECIFICIDAD: 91.11%

40 pooles de Lutzomyias negativas, 2 POS 15 DNA humano, 2 falsos positivos

RESULTADOS DE CARAZ
472 Muestras procesadas Porcentaje de infeccin 2.75%

SEASONAL DISTRIBUTION OF NATURAL INFECTED SAND FLIES

90 80 70 1

# OF POOLS

60 50 40 30 20 10 0 1 18 25 0 1 0 5 0 1 0 3 2 41 35 1 0 5 27 78 0 50 0 24 31 0

0 58 35

40

Distribucin estacional de todos los pooles trabajados en los cuatro pueblos del Per. El rea sombreada representa los pooles positivos al PCR.

M ay -9 Ju 9 n9 Ju 9 lA u 99 gS e 99 p9 O 9 ct -9 N 9 ov D 99 ec -9 Ja 9 n0 Fe 0 b0 M 0 ar -0 Ap 0 rM 00 ay -0 Ju 0 n0 Ju 0 lA u 00 gS e 00 p0 O 0 ct -0 N 0 ov D 00 ec -0 0

PCR RESULTS OF HOUSE A

60 50 40 30 20 0 10 0 1 0 5 30 26 17 0 0 3 52 42 0 11
8 7 6 0

1 0

# OF POOLS

0 0 53 0 26 30 23

14 14

PCR RESULTS OF HOUSE I

M ay -9 Ju 9 n9 Ju 9 l-9 Au 9 gS e 99 p9 O 9 ct -9 N 9 ov D 99 ec -9 Ja 9 n0 Fe 0 b0 M 0 ar -0 Ap 0 r-0 M 0 ay -0 Ju 0 n0 Ju 0 l-0 Au 0 gS e 00 p0 O 0 ct -0 N 0 ov D 00 ec -0 0

# OF POOLS

5 4 1 3 2 0 1 0 3 1 0 3 2 2 7

PCR RESULTS OF HOUSE G

12 10 0 8 6 4 6 2 0 1 1 0 2 0 1 1 9 1 3 0 0 1 0 1 2 0 1 0 2 10 0

0 1

0 1

# OF POOLS

Ju

99 l-99 -99 -99 t-99 -99 -99 -00 -00 -00 -00 -00 -00 l-00 -00 -00 t-00 r r v nn y Ju Aug Sep Oc No Dec Jan Feb Ma Ju Aug Sep Oc Ju Ap Ma

-9 Ju 9 n9 Ju 9 l-9 Au 9 gS e 99 p9 O 9 ct -9 N 9 ov D 99 ec -9 Ja 9 n0 Fe 0 b0 M 0 ar -0 Ap 0 r-0 M 0 ay -0 Ju 0 n0 Ju 0 l-0 Au 0 gS e 00 p0 O 0 ct -0 N 0 ov D 00 ec -0 0

M ay

Distribucin estacional de los pooles infectados de las casas positivas. Pooles positivos fueron encontrados en todas las casas en muestras de Marzo 2000.

Cuadro de Resultados
House letter Type of house/place Number of pools tested Positives House A House B House C House D House G House H House I House J Patient/Choquechaca Non-patient/Choquechaca Patient/Caraz City Non-patient/Caraz City Patient/Cullashpampa Non-patient/Cullashpampa Patient/Yuracoto Non-patient/Yuracoto 343 26 10 2 39 0 29 15 8 (2.33%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 3 (7.69%) 0 (0%) 2 (6.89%) 0 (0%)

House K

Non-patient/Cullashpampa

0 (0%)

CONCLUSIONES

El Set de Primers 2 tiene muy buena sensitividad y no ha mostrado reaccin cruzada con genes de especies de Lutzomyias , pero no es una buena alternativa para el uso con muestras humanas. Un set de primers basados en el gen de rivoflavin deber ser diseado para PCR Tiempo Real para confirmar cualquier positivo dudoso. Existe literatura que afirma que este gen no produce reaccin cruzada con DNA humano.

Real-Time PCR Bartonella bacilliformis MJ Research Chromo4

Taqman Standards 10-25-05

Well
A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9

Dye
Run 1:FAM Run 1:FAM Run 1:FAM Run 1:FAM Run 1:FAM Run 1:FAM Run 1:FAM Run 1:FAM Run 1:FAM

Type
Blank Standard Standard Standard Standard Standard Standard Standard Standard

Label C(T)
Neg 1 ng 100 pg 10pg 1pg 100fg 10fg 100pg 10pg None 16.953 19.983 24.931 27.643 32.268 35.665 None None

ng
N/A 1 0.1 0.01 0.001 0.0001 1e-005 0.01 0.001

Resultados
Neg fueron negativos. Standards fueron positivos hasta 10fg.

PREGUNTAS?