UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLN

MICROBIOLOGA INDUSTRIAL

Equipo: Melgoza Ortiz Claudia Villena Lozano Rubn

TRANSFORMACIN MEDIADA POR AGROBACTERIUM DE CRTAMO Y LA

RECUPERACIN EFICAZ DE PLANTAS TRANSGNICAS A TRAVS DE INJERTOS

ANTECEDENTES:

El crtamo (Carthamus tinctorius L.) es un cultivo difcil de transformar genticamente por ser susceptibles a la sobre hidratacin y pobres en la formacin de races in vitro. Adems de los usos tradicionales de crtamo ha surgido recientemente como una plataforma para la produccin de productos transgnicos, incluyendo aceites modificados y protenas farmacuticamente activos.

A pesar de las actividades comerciales basadas en la modificacin gentica de crtamo, no hay un mtodo disponible en el dominio pblico que describe la transformacin de crtamo

La falta de una fiable regeneracin de la progenie transgnica T1 en crtamo no slo limita su potencial como plataforma de produccin de cultivos industriales, sino tambin la aplicacin de modernas tcnicas moleculares para investigar y mejorar esta planta gran importancia econmica.

Sin lugar a dudas crtamo es una planta difcil de modificar genticamente y una gran cantidad de literatura describe una serie de limitaciones en los mtodos de cultivo de tejidos

En primer lugar, bajo condiciones in vitro brotes de crtamo son susceptibles a la Hiperhidratacin.

La Hiperhidratacin es un trastorno fisiolgico con morfologa aberrante, que se caracteriza por hinchazn de hojas translcidas y tallos quebradizos. Y es probablemente causada por dos factores importantes:

El agente de gelificacin de los medios de comunicacin y alta humedad en recipientes de cultivo pueden contribuir a la ocurrencia de la sobrehidratacin.

La mala formacin de las races de las plantas transformadas, un paso fundamental en el desarrollo hacia la generacin de mayores plantas y semillas. Ya que a menudo son muy dbiles y frecuentemente no sobreviven a la transferencia de los medios de cultivo de tejidos para el suelo.

Mostraremos el desarrollo de un protocolo para la produccin confiable de crtamo genticamente transformada. Se utilizaron antioxidantes (L-cistena, cido ascrbico) durante el co-cultivo y seleccin para reducir la necrosis, iota carragenina con fuerza gelificante modificados para controlar la hiperhidratacin y no citotxico GFP sistema de marcador visual para identificar GM-brotes. GMshoots fueron injertados, utilizando una novedosa tcnica in vitro, para recuperar y establecer las plantas maduras de crtamo transgnico.

RESULTADOS Y DISCUSIN:

1. Construccin y pruebas de un vector binario adecuado para la transformacin de crtamo El vector binario, fue modificado de modo que el gen de resistencia a kanamicina fue reemplazado con el gen de resistencia a higromicina, hph. Esta versin contiene una representacin catalasa-1 intrn del gen inactivo en Agrobacterium

Representacin esquemtica de la regin de ADNT del vector binario T-ADN desarrollado para la transformacin de crtamo.

2. Optimizado Agrobacterium pre-tratamientos y densidad de las clulas para la transferencia de TADN en experimentos de transformacin de crtamo se determin que la densidad ptima de la clula de Agrobacterium para la infeccin fu 0,4 para ambos genotipos de crtamo (Figura 2A) y esta densidad se utiliz en todos los experimentos posteriores.

Optimizacin de pre tratamientos infeccin por Agrobacterium para la transferencia de T-DNA en explantes de cotiledones de crtamo. (A) Efecto de la densidad bacteriana en la expresin transitoria de GFP en los cotiledones . (B) Acetosiringona y espermidina concentracin en la inoculacin de los medios de comunicacin.

3. La necrosis se redujo significativamente por los antioxidantes cido ascrbico y Lcysteine Se ha demostrado previamente que el cultivo de explantes con crtamo con Agrobacterium se reduce la frecuencia de regeneracin en comparacin con los controles no transformados y la adicin de regeneracin crtamo, ms reducida debido a la mayor infectividad bacteriana y resultante hipersensible respuesta.

La Necrosis de los cotiledones despus de cocultivo con Agrobacterium se observ en el presente estudio. Como la regeneracin pobre de transformarse clulas finalmente limita la produccin de plantas transgnicas, nos hemos centrado en la mejora de la regeneracin mediante la reduccin de la necrosis del cotiledn a travs de la adicin de cido antioxidantes L-cistena y cido ascrbico.
La mejor concentracin de antioxidantes fue de 15 mg l-1 de cido ascrbico y 50 mg l-1 L cistena que redujo la necrosis de los cotiledones por medio de los dos genotipos probado.

Los antioxidantes puede ayudar a la supervivencia despus de la infeccin de clulas competentes en y alrededor del cotiledn, lo que aumenta el nmero de clulas transformadas sobreviven hasta formar callos y brotes. La combinacin de Lcistena y cido ascrbico en medio de co-cultivo se puede tambin minimizar la muerte celular causada por la respuesta de hipersensibilidad de las clulas de cotiledn debido a la infeccin por Agrobacterium.

El efecto de la L-cistena y cido ascrbico en necrosis cotiledn. Cada valor es la media de tres experimentos independientes, cada uno con 30 cotiledones. Las diferencias significativas entre los tratamientos son indicados por letras diferentes en cada grupo de barras.

4. Regeneracin de plantas sin hiperhidratacin Diferentes concentraciones de agar y iotacarragenano fueron probados por su capacidad para reducir los sntomas de hiperhidricidad en dos genotipos de crtamo que haban sido previamente inoculados con Agrobacterium El aumento de la concentracin de agar redujo la incidencia de la hiperhidratacin

Nuevos aumentos en la concentracin de iota carragenina y de hiperhidratacin afectar gravemente de forma negativa el crecimiento (datos no mostrados)

El efecto de iota carragenina y agar modificado concentracin en la hiperhidratacin de brotes de crtamo. (A) Media composicin y porcentaje de cotiledones hyperhydrated despus del cocultivo con Agrobacterium (B) Un ejemplo de brotes hyperhydrated cultivadas en medio MS (C) Proliferacin de brotes normales y sanas en medio MS (D) Un solo brote sano en un medio de elongacin, S5, y listo para el injerto.

5. Deteccin visual de brotes transgnicos utilizando un GFP(green fluorescent protein) secretada A fin de reducir el cultivo prolongado en medio de seleccin de antibiticos y para identificar los brotes transformados en primeras etapas de regeneracin La presencia de la GFP secretada se control a casi todo el desarrollo etapas de la regeneracin y se detect 5-7 das despus de la infeccin y alcanz la mxima expresin dentro de 2-3 semanas.

El uso de un marcador GFP visual para identificar rpidamente callos transgnicos y los brotes de crtamo. (A) expresin de GFP en extremo proximal del cotiledn dos semanas despus de la infeccin. (B) disparar la iniciacin del capullo desde el extremo proximal de cotiledn despus de cuatro semanas de co-cultivo (CD) brotes transformados de regeneracin en la seleccin medios de comunicacin. (E) Visualizacin de GFP seales en clulas de guarda de una hoja transgnica. (F) A no transformada hoja / disparar sin mostrar seal GFP fluorescencia de fondo y bajo.

6. Tcnica para recuperar los brotes transgnicos en plantas maduras pesar de la generacin de brotes transgnicos sanos alargados que habitualmente no son para regenerar races de plantas transformadas. En la mayora de los casos el medio de enraizamiento, formacin del callo se observ a partir de la base del brote pero no la formacin de races se observ incluso despus de 4-6 semanas de cultivo con diferentes regmenes hormonales.

Nuestros fracasos para generar plantas con races crtamo forzado el desarrollo de un procedimiento de injerto para rescatar a brotes transgnicos para permitir su desarrollo en las plantas maduras de crtamo modificados genticamente. La supervivencia de brotes transgnicos y plantas en todo el protocolo de transformacin entera se presentan en la Tabla 3, un conjunto de datos generados a partir de 20 diferentes infecciones que producen 110 GM plantas maduras de crtamo. Una combinacin de mejoras se requiere para generar saludables y alargada GFP positivos brotes, incluyendo optimizadas las condiciones de transferencia del TADN y hiperhidricidad reducida y necrosis

El injerto de brotes transgnicos de semilla de crtamo. (A) Rizoma plantas con sistema radicular bien establecido y el vstago transgnico. (B) vstago en forma de V transgnico para ser injertada en un rizoma de plantas preparadas. (C) Anillo de goma que sostiene el injerto y patrn. (D) la unin del injerto protegidas por parafilm. (E) Bien establecida la unin del injerto. (F) injertado planta de crtamo durante el desarrollo de la semilla con cabezas de flores mltiples.

LA SUPERVIVENCIA DE LOS BROTES Y PLANTAS

TRANSGNICOS A TRAVS DE PASOS CRTICOS DEL PROTOCOLO DE TRANSFORMACIN

7. Caracterizacin molecular de plantas transgnicas Presentamos aqu la generacin de 110 plantas injertadas, cada una marc como positivo para una seal de GFP, y la presencia de T-ADN secuencias ensayadas mediante amplificacin por PCR ( Reaccin en cadena de polimerasa) sobre el ADN genmico

El anlisis de los productos de PCR revel en todos los casos la presencia de ADN que codifica tanto la GFP secretada y genes de resistencia a higromicina en todas las lneas transgnicas y su ausencia en el control negativo no transformado, que indica el procedimiento de seleccin con higromicina y GFP fueron ptimas.

Anlisis Southern blot se utiliz para determinar para confirmar an ms la integracin de T-ADN en lneas T0 y tambin como una estimacin del nmero de inserciones de T-DNA por lnea. El ADN genmico total fue digerido con HindIII, una enzima que escinde una sola vez en la regin de T-ADN y se hibridaron con una sonda radiactiva GFP.

Nuestro mtodo ha producido hasta ahora ms de 110 plantas maduras crtamo modificados genticamente, y la progenie de cada una de estas lneas han sido seleccionadas como positivas para GFP fluorescencia, lo que confirma su carcter transgnico.
El anlisis de transferencia Southern indic tambin que este esquema de transformacin produce relativamente simples de ADN-T en los eventos de insercin de crtamo, una caracterstica que es importante en los procedimientos de regulacin de genes. En general estos resultados representan la primera evidencia de un mtodo fiable para generar semillas de crtamo transgnico.

CONCLUSIONES
Se desarroll un mtodo eficiente para la transformacin gentica tanto de alto oleico y alto variedades de crtamo linoleico. Se hicieron mejoras en el vector de transformacin, Agrobacterium pre-tratamientos y las condiciones de regeneracin que permiten la produccin eficiente de brotes transgnicos.

A pesar de estas mejoras, el desarrollo de un mtodo de injerto para superar la pobre novo de enraizamiento era crtico para la produccin de plantas transgnicas maduras crtamo que producen GM progenie de crtamo. Este protocolo puede ahora permitir crtamo para expandir como una plataforma de cultivo industrial y tambin ofrece la posibilidad de modernizar este cultivo antiguo de beneficiarse de los avances en biologa molecular de plantas.