BIOQUMICA DE LOS ALIMENTOS

2010
Disertante: Griselda Ballerini

Bibliografa: Caracterizacin funcional y estructural de protenas. Pilosof, A. M.; Bartholomai, G.

Qu se entiende por propiedades funcionales o funcionalidad de protenas??

Son caractersticas fsico-qumicas intrnsecas de cada protena que determinana las caractersitcas de los alimentos en los cuales se encuentran o a los cuales son agregadas

Son propiedades de importancia tecnolgica

Se las puede clasificar en tres grupos PROPIEDADES DE HIDRATACIN Dependen de la interaccin protena-agua

PROPIEDADES DEPENDIENTES DE LA INTERACCIN PROTENA-PROTENA

PROPIEDADES DE INTERFASE

Dependen de la interaccin de la protena con dos fases inmiscibles

Sorcin de agua

Absorcin de agua

Retencin de agua

PROPIEDADES DE HIDRATACIN

Solubilidad

Dispersibilidad

Viscosidad

Gelificacin

Coagulacin

PROPIEDADES DEPENDIENTES DE LA INTERACCIN PROTENA-PROTENA

Emulsificacin

Espumado

Capacidad de ligar lpidos

PROPIEDADES DE INTERFASE

Propiedades de la pelcula interfacial

Reologa de la pelcula interfacial

PROPIEDADES FUNCIONALES RELEVANTES DE ALIMENTOS

ALIMENTO

PROPIEDADES FUNCIONALES

BEBIDAS PRODUCTOS CRNICOS

Solubilidad a diferentes pH
Absorcin de agua, retencin de agua y grasa, gelificacin, emulsificacin Absorcin de agua, viscoelasticidad, emulsificacin, espumado Emulsificacin, espumado, viscosidad Emulsificacin, viscosidad

PRODUCTOS DE PANADERA

CREMAS Y HELADOS
MAYONESAS, ADEREZOS, SALSAS

FACTORES QUE INFLUYEN EN LAS PROPIEDADES FUNCIONALES DE LAS PROTENAS

INTRNSECOS

CARACTERSITCAS DEL MEDIO

PROCESAMIENTO

Calor
Cont de agua pH Fuerza inica Estructura nativa Agentes tensioactivos Azcares, lpidos Red/ox

aac

Solventes
Secado

Almacenamiento

PARMETROS ESTRUCTURALES UTILIZADOS EN RELACIN A LA FUNCIONALIDAD DE LAS PROTENAS

Tamao y forma molecular

Parmetros estricos

Flexibilidad molecular

Contenido de SH/SS
Superficial Hidrofobicidad Total Balance hidrofbico-hidroflico Parmetros elctricos Carga neta, carga superficial

Entalpa de desnaturalizacin
Parmetros termodinmicos

Temperatura de desnaturalizacin

METODOS DE EVALUACIN DE PROPIEDADES FUNCIONALES

EN SISTEMAS MODELO Utiliza pequeas cantidades Hay una evaluacin rpida Permite comparar ingredientes de distintos orgenes o distintos procesos de obtencin EN SISTEMAS REALES Se requieren mayores cantidades Permite evaluar la contribucin funcional real del ingrediente o sea su performance mediante la evaluacin de las cualidades organolpticas, textura del producto final o estabilidad Es indispensable en las etapas de optimizacin y definicin de la tecnologa industrial de produccin A NIVEL MOLECULAR Estudio de la estructura molecular y de parmetros estructurales asociados a la fiuncionalidad Permite avanzar en el diseo de protenas de caractersticas especficas

PROPIEDADES DE HIDRATACIN

Etapas de hidratacin y propiedades funcionales

Adsorcin
Vapor de agua

Hinchamiento

Polvo deshidratado

Absorcin
Agua lquida

solubilidad

Viscosidad

CAPACIDAD DE SORCIN DE AGUA Indica la aptitud de un material a adsorber agua espontneamente cuando se lo expone a una atmsfera de HR constante. En principio es un fenmeno superficial. Si la extensin de la hidratacin es muy importante, puede ocurrir absorcin en el interior, hinchamiento y eventualmente solubilizacin CAPACIDAD DE ABSORCIN DE AGUA Indica la aptitud de un material a embeber agua en forma espontnea cuando se lo pone en contacto con agua a travs de una superficie que se mantiene hmeda o por inmersin

CAPACIDAD DE RETENCIN DE AGUA Indica la aptitud de un material hidratado a retener agua frente a la accin de una fuerza externa de gravedad, centrfuga o de compresin

ABSORCIN DE AGUA Tiene significacin para los biopolmeros. La solvatacin est algo impedida por la presencia de fuerzas intermoleculares. Se llega a una situacin de equilibrio entre el polmero hinchado y el agua.

H2O

Protena hinchada

Alimentos en los que importa la absorcin de agua: Carnes procesadas Masas En estos alimentos las protenas embeben agua sin disolverse e impartes cuerpo, viscosidad y textura

EQUIPOS Aparato de BAUMANN (1966) Aparato modificado de BAUMANN (1977) Consiste de un filtro bacteriolgico Milipore de 4 cm de dimetro, en el que se coloca un papel de filtro (tipo Whatman o similar). El filtro est conectado mediante una manguera flexible a una pipeta graduada de 1 o 2 ml, sostenida en posicin horizontal y al mismo nivel que el papel de filtro.

ECUACIN PARA MODELAR LAS CURVAS DE ABSORCIN DE AGUA q = Q t / (B+t) q : cantidad total de agua absorbida en el tiempo t Q : mxima capacidad de absorcin de agua B : tiempo necesario para absorber la mitad de la cantidad mxima de agua (Q/2)

CINTICA DE ABSORCIN DE AGUA

La velocidad de absorcin de agua puede obtenerse diferenciando la ecuacin anterior con respecto al tiempo

APLICACIONES Sirve para determinar la absorcin espontnea de agua de cualquier material proteico en polvo

Permite determinar adems de la capacidad de absorcin de agua (Q), loa velocidad de hidratacin. Este es un parmetro muy importante desde el punto de vista tecnolgico, vinculado a la prctica de rehidratacin que normalmente se realiza antes de la utilizacin de cualquier ingrediente proteico

Permite estudiar el efecto de la temperatura, pH y la presencia de solutos en el agua de hidratacin

SOLUBILIDAD La solubilidad de un material proteico describe la capacidad de formar soluciones coloidales El concepto de solubilidad para protenas depende de las condiciones experimentales para solubilizar y recuperar la protena soluble y no puede ser definido por los productos de solubilidad usados por ejemplo para las sales. Este comportamiento complica la definicin de solubilidad enh el caso de las protenas y dado que no se puede hacer una definicin termodinmica, existen diferentes definiciones operacionales. La solubilidad de las protenas depende del estado fisicoqumico de sus molculas, el que puede ser alterado por Calentamiento, procesamiento, secado y condiciones de almacenamiento La solubilidad depende del pH, fuerza inica, T y solventes orgnicos

El conocimiento de las caractersitcas de solubilidad es til para: Seleccin de condiciones ptimas de extraccin de protenas Conocer las aplicaciones potenciales Optimizar las condiciones de procesamiento Indicar el grado de tratamiento trmico SOLUBILIDAD: Se define como la proporcin de nitrgeno de una muestra que se solubiliza luego de un determinado y especfico procedimiento

NDICES MS COMUNES: NSI: ndice de solubilidad de N2 (100 . g N2 en solucin / N2 total) PDI : ndice de dispersibilidad de protena (100 . g de protena en dispersin / prot. total)

ETAPAS PARA LA DETERMINACIN DE LA SOLUBILIDAD

Dispersin de la protena en H2O

Ajuste de pH al de estudio
Agitacin Centrifugacin Dosaje de nitrgeno en sobrenadante MTODO DE REFERENCIA PARA DETERMINACIN DE N2 KJELDAHL

OTROS MTODOS PARA DETERMINACIN DE PROTENA

Absorbancia a 280 nm

Mtodo de Biuret
Mtodo de Lowry Mtodo de Bradford Mtodo del cido 4,4-Dicarboxil-2,2-biquinona (BCA)

GELIFICACIN
Las protenas determinan las caractersticas de muchos alimentos por debido a su propiedad de gelificar.
La textura, propiedades organolpticas y calidad de productos como gelatinas, embutidos crnicos, surimi, yogur, postres lcteos, productos de panadera, etc, estn vinculados a la formacin de un gel proteico

Agregacin ordenada

Balance de fuerzas atractivas y repulsivas

Constitucin de una matriz o red proteica capaz de retener agua

Lquido viscoso

Matriz viscoelstica

Debido a que los geles pueden presentar un comportamiento soft que se rompe y fluye bajo la aplicacin de fuerzas muy pequeas, una definicin estricta es muy difcil y es por eso que se utilizan los trminos fuerte y dbil para la clasificacin de los geles

Nomenclatura relativa a la formacin de estructuras proteicas

Precipitacin: separacin de la solucin Asociacin: interaccin de molculas de protena caracterizado por uniones dbiles entre sitios especficos, formacin de monmeros, dmeros, etc. No hay modificacin estructural (cuando hay estructura cuaternaria)

Agregacin: trmino general para las interacciones no especficas protenaprotena, que incluyen floculacin, coagulacin y gelificacin
Floculacin: agregacin coloidal debido a interacciones protena-protena al azar que no involucran cambios conformacionales de importancia. Se mantiene la estructura nativa Coagulacin: agregacin desordenada que implica cambios conformacionales importantes. Desnaturalizacin

Gelificacin: agregacin ordenada que implica cambios conformacionales de importancia

Desde el punto de vista microestructural existen distintos tipos de geles proteicos:

Filamentos finos, involucran un entrecruzamiento por asociacin fsica (no covalente) entre las cadenas laterales gelatina termoreversible
Redes particuladas que involucran la agragacin mediante uniones covalentes y no covalentes de protenas globulares parcialmente dedsnaturalizadas en forma de racimos de uvas (clusters) o lineales para formar una hilera de partculas (strins of beads)

Esquema de gelificacin de la gelatina

Protenas globulares gelificantes

Protenas del msculo

Clara de huevo (ovoalbmina)

Casenas de la leche (Coagula por accin de la quimosina y Ca++)

Protenas del lactosuero (-Lactoglobulina, -lactoalbmina)

Protenas de la soja

Cmo ocurre la gelificacin?

En general mediante tratamiento trmico a T> a la de desnaturalizacin El mecanismo aceptado para la desnaturalizacin y gelificacin de protenas globulares se describe: (PN)n < -- > n PN -- > n PD n PD -- > (PD)n Se obtiene por:

Hidrlisis enzimtica moderada (micelas de casena, protenas de la soja)

Adicin de iones Ca (casena, protenas de la soja=

Tratamientos a altas presiones

Cambios de pH (embutidos, yogur)

GELIFICACIN DE PROTEINAS GLOBULARES

Interacciones que estabilizan la estructura de los geles

TIPO

GRUPOS

FUNCIN

PROTENA

Covalente

---S---S---

Puentes, orden

Soja, WPC, ovoalbmina

Puente H

--NHO=C--

Puentes, viscosidad, estabilidad

todas

Hidrofbicas

No especfico

Viscosidad

todas

Inicas

--NH3+; COO-

Interaccin con el solvente o sales

Todas, depende del pH

GELIFICACIN POR CALOR DE PROTENAS GLOBULARES

La transformacin por calentamientode una solucin proteica a gel se describe mediante varias etapas a- La protena se desnaturaliza por accin del calor

b- las molculas proteicas interaccionan entre si, llegando al punto gel donde la interaccin es suficientemente importante como para generar una matriz primaria con propiedades viscoelsticas
c- con el tiempo y el enfriamiento se forma la matriz de equilibrio es decir el gel Para describir estas situaciones existen modelos matemticos: Modelo de FLORY-STOCKMAYER (1941-1974): la gelificacin es un evento sbito que ocurre cuando es alcanzado un cierto grado de entrecruzamiento, se alcanza un valor crtico (punto gel) en el que la viscosidad diverge a infinito Teora de la percolacin: (Stauffer -1992): se asume que los monmeros forman agregados pequeos y que en cierto punto (punto gel) se inicia el entrecruzamiento

ESTUDIO DEL FENMENO DE GELIFICACIN

Se calienta en tubos de ensayo sellados, a distintas temperaturas y tiempos, dispersiones de protenas de concentraciones apropiadas y posteriormente se las enfra
Las condiciones de temperatura y tiempo son propias para cada protena La gelificacin puede ocurrir durante el calentamiento (protenas de soja, lactosuero, clara de huevo) o luego del enfriamiento (gelatina, loisozima) Factores que afectan la gelificacin: Concentracin de protena Temperatura / tiempo de gelificacin Fuerza inica / tipo de soluto Grado de desnaturalizacin de la protena

Seguimiento experimental de la gelificacin

La esencia del proceso de gelificacin es el punto gel, es decir el punto donde ocurre la transformacin de lquido a slido Esto indica que las propiedades que caracterizan esa transicin son de naturaleza mecnica

Mtodo: Rpido

No debe perturbar el sistema fuera de la regin lineal

Debe proveer magnitudes fsicas objetivas Medidas indicadoras del carcter de la red
Condiciones reunidas por

Mtodos reolgicos dinmicos (espectroscopa mecnica) en los que se aplica un esfuerzo oscilatorio, como nica alternativa del monitoreo de la gelificacin

Determinacin de la estabilidad trmica

Calorimetra diferencial de barrido (DSC) Determinar el grado de desnaturalizacin de la protena
Se logra

Midiendo la energa requerida para la desnaturalizacin, ya que la T vara linealmente

Requiere de una referencia y determinar la influencia de las condiciones del medio La desnaturalizacin se observa como un pico endotrmico y el area del pico es el cambio de entalpa del proceso

El flujo calrico se grafica en funcin de la T de la muestra o del tiempo transcurrido

Mtodos para el estudio de la agregacin

Para estudiar las primeras etapas dl proceso de gelificacin se utilizan diferentes tcnicas que brindan informacin complementaria
Medir el tamao de los agregados formados El grado de desnaturalizacin proteica Cintica de los procesos involucrados

Una vez formado el gel se realizan ensayos macroscpicos Textura, reometra, prdida de agua,etc. Caracterizacin estructural de los geles por diferentes tipos de microscopa.

Electroforesis PAGE
Es una de las tcnicas ms ampliamente utilizadas para la separacin y caracterizacin de protenas Puede hacerse en condiciones nativas, disociante y reductora

Dispersin dinmica de luz (Dynamic Light Scattering)

Las mediciones arrojan informacin acerca del dimetro de las partculas y de la intensidad, relacionada a la velocidad de crecimiento y nmero de partculas se determinan parmetros relacionados al tamao de las partculas presentes en la muestra se registra la intensidad de la luz refractada/dispersada por la muestra a partir de un haz de luz laser incidente el comportamiento de la intensidad fluctuante que se registra, se ajusta por medio de una funcin de autocorreccin

Pueden realizarse mediciones in-situ, en equipos que cuenten con control de temperatura y a velocidades de crecimiento de agregados dentro de la sencibilidad del equipo, o exsitu con calentamiento y enfriamiento externo, relizandose posteriormente la medicin

Tilting test
Evaluacin visual del tiempo de gelificacin (Relhkin et al., 1998) En un bao termostatizado a temp. Constante, se calientan tubos transparentes conteniendo una muestra de la solucin proteica a estudiar A tiempos sucesivos se retiran los tubos del bao

Puede determinarse el tiempo de gelificacin observando la deformacin directamente al extraer el tubo del bao El tiempo de gelificacin se determina como el tiempo necesario para que el menisco de la solucin contenida en los tubos no sufra deformacin o no fluya al inclinarlo

Este mtodo puede ser utilizado tambin para estimar la concentracin de protena mnima para la formacin de un gel, o las combinaciones tiempo-temperatura adecuada

Determinacin del punto gel y evolucin de parmetros viscoelsticos

Ensayos mecnicos de pequeas deformaciones Permiten el seguimiento de la gelificacin y la caracterizacin del comportamiento de los geles

La solucin proteica se coloca entre un par de platos paralelos cuya temperatura puede ser controlada
La muestra es sometida a una deformacin oscilatoria. Los parmetros viscoelsticos del mateiral son determinados por comparacin entre la deformacin aplicada y el esfuerzo resultante En los experimentos de reometra oscilatoria, la relacin entre deformacin y esfuerzo puede describirse mediante el mdulo complejo G*, definido como: G* = G+ i G G: mdulo viscoso (energa disipada por el sistema durante la deformacin) G: mdulo elstico (energa almacenada por el sistema durante la deformacin)

La transicin de una estructura viscosa (sol) a una viscoelstica (gel) durante el calentamiento puede ser monitoreada por reometra dinmica oscilatoria como el punto de cruce entre el mdulo viscoso (G) y el elstico (G) momento en el cual el ngulo de desfasaje es de 45 y la tangente del ngulo de prdida (tg =G/G= 1

Caracterizacin macroestructural de geles

El gel se puede caracterizar desde el punto de vista macroestructural o microestructural. Por lo general hace falta aplicar ms de una metodologa para caracterizarlo adecuadamente Vicoelasticidad

Reometra dinmica oscilatoria (G, G, tg

Ensayos de relajacin

Textura

test de fractura Dureza, fracturabilidad, elasticidad, adhesividad, cohesividad

Propiedades de flujo

Viscosidad aparente, tixotropa

Capacidad de retencin de agua

Viscoelasticidaad
Por remetro oscilatorio de pequea amplitud de deformacin el barrido de deformacin se usa para determinar los lmites del comportamiento viscoelstico lineal. En esta regin las propiedades reolgicas no son dependientes de la deformacin
308 306

G(Pa)

304 302 300 298 296

El espectro mecnico de un gel muestra la variacin (Gy G) en funcin de la frecuencia y permite definir un gel segn criterios reolgicos

0, 01 0, 07 0, 13 0, 19 0, 25 0, 31 0, 37 0, 43 0, 49 0, 55 0, 61 0, 67
Frecuencia (Hz)

Ensayo de grandes deformaciones

se estudian parmetros reolgicos en condiciones de procesamiento de alimentos y correlacionados a la evaluacin sensorial

la deformacin es aplicada a alta velocidad, fuera de la regin lineal de viscoelasticidad resultan de utilidad para estudios comparativos

Perfil de textura
El anlisis del perfil de textura (TPA) es un mtodo objetivo correlacionado con el anlisis sensorial de la textura. El ensayo comprende las dos compresiones sucesivas de una muestra imitando el proceso de masticacin Un pequeo cilindro de gel se coloca sobre la plataforma de un texturmetro tipo prensa. Sobre ellos acta un plato plano que lo comprime hasta una determinada altura predeterminada ( por ejemplo un porcentaje de la altura inicial).

Las compresiones se realizan a una velocidad constante durante las cuales se registra la evolucin de la fuerza en funcin del tiempo o la deformacin

Del anlisis de los perfiles de fuerza vs tiempo, se obtienen los parmetros de textura del material DUREZA: Altura del primer pico, F1. Se define como la resistencia a la compresin. Es la fuerza que debe aplicarsepara lograr una deformacin dada. COHESIVIDAD: A3/(A1+A2). Cada rea representa el trabajo hecho en cada compresin siendo una integral de fuerza sobre distancia, es funcin directa del trabajo necesario para vencer las uniones internas del material

ELASTICIDAD: t2/t1. Es la habilidad para recuperar la forma original luego de una suave deformacin
ADHESIVIDAD: A4. Es el trabajo necesario para levantar el plato de la muestra. Es la capacidad de pegarse a otros materiales. Representa el trabajo necesario para vencer las fuerzas atractivas entre la superficie de un gel y la superficie de otros materiales.

Capacidad de retencin de agua

Se aplica una fuerza externa (presin o centrifugacin y se miode la cantidad de agua liberada por el gel en el cual el agua es adsorbida por un material poroso

Caracterizacin microestructural
Microscopa ptica: Primer mtodo ptico empleado con fines de caracterizar cualitativamente la microestructura de los geles. Es comn aplicar colorantes para mejorar el contraste y diferenciar estructuras. Fuente de iluminacin la luz

Caracterizacin microestructural
Miscroscopa confocal: Captura luz laser. Se ussan fluorforos para aumentar el contraste y la nitidez .

Caracterizacin microestructural
Miscroscopa electrnica de barrido (SEM). Genera imgenes tridimensionales topogrficas, permite distinguir agregados de molculas y espacios vacos. La imagen se genera por electrones secundarios liberados desde la superficie del especimen

Miscroscopa electrnica de transmisin (TEM). Visualiza un campo de corte de poca profundidad (0,05 a 0,1 m) pero de alta resolucin de detalles

Cromatografa lquida de alta performance

La cromatografa es una tcnica que permite separar, aislar e identificar los componentes de una mezcla de compuestos qumicos. La muestra es distribuida entre dos fases, una estacionaria y otra mvil, de tal forma que cada uno de los componentes de la mezcla es selectivamente detenido por la fase estacionaria.