Mikhail Tswet (principios del siglo XX), utilizo una columna rellena de carbonato clcico para separar varios

pigmentos vegetales (Clorofilas y Xantofilas). A.J.P.Martyn y R.L.M.Singe recibieron el Premio Nobel en 1952, por sus descubrimientos en este campo

Cromatografa
Tcnica que permite la separacin de los componentes de una mezcla debido a la influencia de dos efectos que se contraponen: Retencin Desplazamiento

Definiciones
Se

basa en el principio general de distribucin de un compuesto entre dos fases, una fija (FE) y otra mvil (FM). Remocin selectiva de los componentes de una mezcla por la accin de la fase mvil que fluye a travs de la fase estacionaria donde se encuentran.

Clasificacin

La naturaleza de la fase estacionaria Slido (adsorcin)

slido-lquido (LSC) slido-gas (GSC)

Lquido (particin)

lquido-lquido (LLC) lquido-gas (GLC)

Otras variantes

Intercambio inico (IEC) Exclusin por tamaos (SEC) Afinidad (AFC)

Clasificacin
El

dispositivo experimental
Plana Columna

Aplicacin

Analtica Preparativa

TIPOS DE CROMATOGRAFIA EN CAPA DELGADA

ADSORCION

PARTICION

Formacin de enlaces por puentes de hidrgeno Interacciones cido-base Fase normal Fase reversa

CAMBIO IONICO

EXCLUSION

DEAE-Celulosa ECTEOLA-Celulosa CM-Celulosa Sephadex R Slica quiral

SEPARACIN DE ENANTIOMEROS

Proceso de Adsorcin
La muestra aplicada en la capa es adsorbida en la superficie del material por la accin de fuerzas electrostticas (fuerzas de Van der Waals, puentes de Hidrgeno, efectos inductivos, etc). Luego, cuando la capa es expuesta a un flujo por accin capilar, se inicia una competencia de enlaces entre los sitios activos del adsorbente y la sustancia con el solvente.

Proceso de Adsorcin
El fenmeno de adsorcin ocurre en la superficie del grnulo de la FE, y se fundamenta en la atraccin entre el soluto y el adsorbente por formacin de uniones dipolo y formacin de puentes hidrgeno.

Esta cromatografa depende de:

El equilibrio establecido en la interfase entre el slido adsorbido y la la solucin aplicada como FM. La solubilidad relativa del soluto en la FM.

Depender entonces, de la polaridad del compuesto (los solutos ms polares sern ms retenidos, mientras que los no polares corrern o se desplazarn menos), naturaleza del adsorbente y naturaleza del solvente.

Cromatografa Plana
Cromatografa

en papel Cromatografa en capa delgada

TLC (Thin Layer Chromatography)

Cromatografa

en capa delgada de alto rendimiento

HPTLC (High performance Thin Layer Chromatography)

Adsorbentes
Silica

gel (se utiliza en el 80% de las separaciones) xido de Aluminio Almina (cida, neutra bsica) Tierra Silcea Kieselguhr Celulosa (Nativa o micro-cristalina) Poliamidas

Caractersticas
Tamao

de Partcula

Volmen de Poro Dimetro de Poro rea Superficial

Homogeneidad Pureza

Se usan como soporte del adsorbente lminas de: Vidrio, Plstico Metlicos (ej: Aluminio) Los tamaos de la placa para TLC convencional son : 20 x 20; 10 x 20 y 5 x 2 Hay placas que contienen un indicadorr de Fluorescencia : F254 F366. El nmero que aparece como subndice nos indica la longitud de onda de excitacin del indicador utilizado.

Proceso
1.

2. 3.
4.

Eleccin de la Fase estacionaria. Eleccin de la fase mvil. Acondicionamiento de la placa Requiere activacin? Siembra de la muestra: la muestra se aplica en la placa segn el objetivo: Analtico Preparativa en: Banda Punto Mancha

Aplicacin de las muestras en TLC y HPTLC

5.

Acondicionamiento de la cmara de desarrollo: existen varios tipos de cmaras: Normal Doble Compartimiento Sandwich Horizontal Desarrollo del cromatograma Secado de la Placa Revelado implica la localizacin de las zonas en que se encuentran los compuestos ya separados, cuando stos no poseen color intrnseco. Elucin se utiliza cuando se intenta remover los solutos de la fase estacionaria. Interpretacin de los resultados Rf Cuantificacin

6. 7. 8.

9. 10.

Cmaras de desarrollo en TLC y HPTLC

Desarrollo ascendente, descendente

Revelado
Si la muestra (mancha) no es coloreada se requiere de mtodos que nos permitan visualizar el(los) componente(s) presentes. Tambin se conoce este procedimiento como Revelado. Estos mtodos son: Qumicos (por inmersin o rociado). Se obtienen derivados coloreados o fluorescentes Fsicos (pticos). Generalmente se utiliza radiacin UV

Visualizacin fotodensitomtrica

Evaluacin de un Cromatograma de TLC

Anlisis Cualitativo Medida de Rf Comparacin Visual de Color/Intensidad Propiedades UV/IR/MS/NMR Anlisis Cuantitativo Semi-cuantitativo Comparacin visual del dimetro y la intensidad del color de la mancha contra una serie de manchas patrones de concentracin conocida Cuantitativo Indirecta Directa Densitometra Medida de Transmisin. Medida de luz transmitida a travs de la sustancia. Medida de Emisin. Medida de luz reflejada desde la sustancia Espectrofotometra Fluorescencia Fluorescencia con "quenching"

Interpretacin de los resultados

Interpretacin de los resultados

FACTORES QUE AFECTAN AL Rf

FASE ESTACIONARIA

Calidad y presencia de impurezas presencia o ausencia de CaSO4 Naturaleza del cromatoplato, espesor, homogeneidad y preparacin (extemporanea) Grado de activacin en TLC de adsorcin
Composicin y naturaleza grado de saturacin de vapor en el tanque

FASE MOVIL

TEMPERATURA DISTANCIA DE DESARROLLO RELACION MASA/SUPERFICIE EN LA PLACA

Serie elutrpica

Ejemplos de algunos lquidos de desarrollo

Doble desarrollo a 90

USOS: Separa los componentes de una mezcla (en pequea o en gran escala) Criterio de pureza (nmero de componentes en una mezcla) Criterio de identificacin (por comparacin con patrones)

Aplicaciones de la cromatografa en capa delgada

Industria farmacutica Control de calidad Controles de identidad y pureza Uniformidad Estabilidad Medioambiente Anlisis de aguas, de suelos y de residuos Anlisis de alimentos Control de calidad Aditivos (vitaminas) Pesticidas Controles de estabilidad Medicina forense Deteccin de documentos falsificados Investigacin en envenenamientos Aplicaciones clnicas Estudios de metabolismo Control de dopaje

Variables generales que afectan la movilidad

ADSORBENTE distintos tipos distinta actividad, inercia qumica, el tamao del grnulo, empaquetamiento, homogeneidad (aumentan o disminuyen la velocidad de recorridos). ESTRUCTURA DEL SOLUTO Polarizabilidad (temporaria o permanente), Capacidad de formar puentes de hidrgeno. Grupos ms polares: ms adsorbidos, Alto PM: corre menos

Variables generales que afectan la movilidad

SOLVENTE DE DESARROLLO: Puede ser o no solvente de siembra. De menor polaridad a mayor polaridad. Solventes anhidros miscibles. Velocidad de elucin : lenta: difusin de bandas. rpida: no alcanza equilibrio adsorcindesorcin (implica la aparicin de un frente deformado) TEMPERATURA: Para poder reproducirla. Afecta volatilidad y solubilidades. SATURACION DE LA CUBA: El solvente en vez de ascender por capilaridad continuamente, tender a evaporarse de la capa del adsorbente para equilibrar al lquido con su P de vapor (ascenso inhomogneo del frente de solvente). Se agrava en mezcla de solventes.

APLICACIONES (en TLC)

Monitoreo de una reaccin Identificacin de un compuesto Determinacin de los componentes de una mezcla Comprobacin de la pureza de un compuesto Determinacin de un disolvente apropiado para llevar a cabo una separacin mediante cromatografa preparativa Anlisis de las fracciones recogidas en una cromatografa en columna.

CROMATOGRAFIA EN COLUMNA Usos: separacin y purificacin de compuestos orgnicos, slidos o lquidos, a escala preparativa. Proceso: por gravedad o por media presin. Variables Dimetro de la columna Cantidad de adsorbente Eleccin del solvente

CROMATOGRAFIA DE PARTICION
Se basa en la distribucin selectiva del soluto entre la fase estacionaria y la fase mvil. Se clasifica en cromatografa de particin en fase normal y cromatografa de particin en fase reversa. En la cromatografa de particin en fase normal las sustancias a separar se distribuyen entre dos lquidos inmiscibles uno de los cuales es ms polar, acta como fase estacionaria y se encuentra adsorbido sobre un soporte slido, brindando una gran superficie de contacto a la fase mvil menos polar. En la cromatografa de particin en fase reversa la fase estacionaria es menos polar que la fase mvil.

CROMATOGRAFIA DE PARTICION
En Fase Normal por lo comn la FE es AGUA, retenida sobre diferentes tipos de soporte. La FM es un lquido inmiscible con AGUA. Dado que ambas fases (mvil y estacionaria) son lquidas, se denomina a la cromatografa de particin, cromatografa lquido-lquido. El agua retenida por el papel es la fase fija. Tiene un poder de disolucin distinta que el agua pura, frente a solutos. Por esto es posible una particin entre el agua de la FE y otro solvente inmiscible o no que inclusive, puede ser agua pura.