MEDIOS DE CULTIVO Y SUPLEMENTOS

Mara Isabel Monsalve Restrepo

Microbiloga y Bioanalista Estudiante Maestra en Biotecnologa Universidad de Antioquia

CULTIVO DE TEJIDOS
Se refiere al cultivo asptico de clulas, tejidos, rganos u organismos en condiciones nutricionales y ambientales controladas.

OBJETIVO
Mantenimiento de clulas, tejidos (animales y vegetales) u rganos in vitro. Preservar y mantener sus propiedades fisiolgicas, metablicas y genticas.

APLICACIONES
Aprovechar la maquinaria celular para estudios sobre metabolismo, regulacin gnica y fisiologa. Transplante de rganos y tejidos. Clonacin. Produccin de protenas recombinantes.
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CONDICIONES DE CULTIVO
Medios artificiales preparados mediante la mezcla de componentes purificados o de soluciones orgnicas complejas Sobre soportes o recipientes que los contienen y aslan del medio exterior Instrumentos que mantienen las condiciones fsico-qumicas

Naturaleza del sustrato Condiciones fsico-qumicas y fisiolgicas del medio. Naturaleza y composicin de la fase gaseosa. Condiciones de incubacin (humedad y temperatura)
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EL SUSTRATO
Brinda a las clulas, tejidos u rganos en cultivo el soporte fsico necesario para realizar sus reacciones metablicas, desarrollar su metabolismo y desarrollar sus procesos morfognicos.

Recipiente o soporte

Vidrio Plstico (poliestireno) Microsoportes Sustratos metlicos Superficies tratadas Feeder layers Matrices tridimensionales Interfases Haces microcapilares permeables

FASE GASEOSA

Oxgeno Los cultivos varan sus requerimientos de O2 dependiendo del tejido del cual derivan. Las clulas creciendo en monocapa, son relativamente anaerobias y no requieren una alta tensin de O2. La disponibilidad del O2 esta limitada por: La capacidad de difusin del gas en el medio lquido. La composicin del medio de cultivo. La profundidad de la columna de medio (2 a 5 mm)

Un exceso de O2 es txico, reduce tasa de crecimiento.

FASE GASEOSA

Dixido de carbono El CO2 atmosfrico determina los niveles de CO2 disuelto en el medio de cultivo, el pH y la cantidad de iones HCO3

PROPIEDADES FISICAS
ph Osmolaridad Temperatura Viscosidad Tensin superficial.

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CONDICIONES FISIOLGICAS
Hacen referencia a la composicin del medio. La principal dificultad para el establecimiento de las lneas celulares es el de obtener medios nutritivos adecuados que sean capaces de reemplazar al medio "natural.
o Medio Basal de Eagle (BME). oMedio Mnimo Esencial de Eagle (MEM). oR.P.M.I. 1640 oMedio MEM modificado por Dulbeco (DMEM). oModificacin de Iscove del medio DMEM (IMDM). oMcCoy 5A. oMedio L-15 de Leibovitz. oMedio F-10 de Ham. oMedio F-12 de Ham. oMedio 199.

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Sales Inorgnicas

balance osmtico ayuda a regular el potencial de membrana iones requeridos para la adhesin y cofactores enzimticos. Control pH Buffer natural: CO2 Bicarbonato Buffer qumicos: HEPES Principal fuente de energa (glucosa, galactosa, fructosa) Complejo B, vitaminas A y E Precursores de numerosos cofactores El suero es la principal fuente

Buffer

Carbohidratos Vitaminas

Protenas y Pptidos Albmina, transferrina, fibronectina. El suero es la principal fuente

cidos grasos y Lpidos

El suero es la principal fuente Colesterol y esteroides (Lneas celulares especificas)

Zinc, cobre, selenio
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Otros nutrientes Agua Antibiticos

SUERO

El suero aporta al medio : Hormonas, protenas de adhesin y de matriz, factores de crecimiento, inhibidores enzimticos. Composicin compleja pero desconocida. Disponibilidad.

Adems

Problemas en la obtencin : esterilidad, tica, Problemas en la homogeneizacin entre lotes Problemas de seguridad biolgica (BSE, virus,)
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MEDIOS DE CULTIVOS CELULARES

Cualidades: Especifico para la lnea celular a cultivar Nutritivo pH adecuado Capacidad buffer Isotnico Estril

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Previamente a la realizacin de experimentos los medios deben ser probados a diferentes niveles. 1. Posible Contaminacin 2. Niveles de Proliferacin Celular (eficiencia)

TEST DEL MEDIO

ELECCIN DEL MEDIO

Se deben realizar diferentes pruebas con varios medios de cultivo en la eleccin del medio ms adecuado a las caractersticas de nuestra lnea Las pruebas consisten en la realizacin de diferentes curvas de crecimiento 16

CULTIVOS MICROBIOLOGICOS

CONDICIONES PARA EL CRECIMIENTO MICROBIANO

agua

Medios de cultivo
Nutrientes

fuente de energa
fuentes de C, N, otros elementos micronutrientes, factores de crecimiento

Crecimiento

temperatura

Condiciones de cultivo

pH
luz aireacin actividad de agua potencial redox
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El medio de cultivo qumicamente definido se prepara aadiendo cantidades precisas de compuestos orgnicos e inorgnicos puros a un volumen conocido de agua destilada. Se conoce su composicin exacta.

Medio definido para Escherichia coli

K2HPO4 KH2PO4 (NH4)2SO4 MgSO4 CaCl2 Glucosa Elementos traza (Fe, Co, Mn, Zn, Cu, Ni, Mo) Agua destilada pH7

7g 2g 1g 0,1 g 0,02 g 4-10 g 2-10 g

1000 ml

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Para elaborar el medio complejo se utilizan hidrolizados de protenas y otras sustancias muy nutritivas pero no definidas qumicamente que se pesan y se aaden a un volumen conocido de agua. No se conoce la composicin exacta del medio complejo.

Medio complejo para Escherichia coli y Leuconostoc mesenteroides Glucosa Extracto de levadura Peptona KH2PO4 Agua destilada pH7 15 g 5g 5g 2g 1000 ml

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TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO

Medios slidos y lquidos
Los medios slidos se preparan como los medios lquidos y se les aade agar (1.5%) como agente gelificante. Los medios slidos inmovilizan a las clulas, permitindolas crecer y formar masas aisladas visibles llamadas colonias.

Medios generales
Los medios generales mantienen el crecimiento de muchos microorganismos. Ej., el caldo y agar nutritivo

Medios enriquecidos
Medios generales a los que se aaden nutrientes especiales para mantener el crecimiento de microorganismos hetertrofos exigentes. Ej., el agar sangre
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Medios selectivos
Favorecen el crecimiento de microorganismos particulares. Ej.,agar Levine y Agar MacConkey. Contienen colorantes y sales biliares que inhiben el crecimiento de las bacterias Gram positivas. Otros medios selectivos contienen nutrientes que pueden utilizar algunas bacterias de forma especfica. Ej., el agar celulosa

Medios diferenciales
Medios que diferencian entre grupos distintos de bacterias e incluso permiten una identificacin tentativa de los microorganismos segn sus caractersticas biolgicas. El agar MacConkey es tanto selectivo como diferencial. Como contiene lactosa y colorante rojo neutro, las colonias fermentadoras de lactosa (Escherichia coli) aparecen de color rosa o rojo y se distinguen fcilmente de las colonias no fermentadoras.

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 El que no posee el don de maravillarse ni de entusiasmarse ms le valdra estar muerto, porque sus ojos estn cerrados A. Einstein