Ulisses C.

Araujo

A espectrometria de massas constitui-se em: uma importante ferramenta de anlise orgnica; propsito central converter uma substncia em sub-produtos (fragmentos moleculares) mensurveis, que so indicativos da estrutura da molcula original. A reao iniciada com a ionizao da amostra atravs da remoo de um eltron da camada de valncia, formando uma espcie altamente energtica que se degrada. Os produtos formados so ctions, nions, radicais e pequenas molculas neutras.

1) Ionizao - O processo de ionizao converte as molculas ou tomos da amostra em espcies inicas numa fase gasosa. 2) Fragmentao - A energia acumulada durante a ionizao dissipada quebrando as molculas em fragmentos caractersticos e previsveis para cada estrutura molecular. 2) Separao e anlise das massas do on molecular e seus fragmentos inicos com base em suas razes massa carga (m/Z). 3) Deteco - A corrente inica formada devido as massas inicas separadas, medida amplificada e exibida na forma de um espetro de massas.

A possibilidade de localizar ou acompanhar mudanas ao nvel molecular em organismos, atravs da imagem de molculas distribudas por tecidos especficos, muito importante para estudar as vias Bioqumicas e desenvolver novas terapias com medicamentos. Recentemente, novas metodologias para anlise protemica foram desenvolvidas (ex.:MALDI MS), tornando-se possvel: Identificar, Caracterizar e Quantificar comparativamente a expresso de centenas de protenas que so coexpressas em um tipo celular ou tecido.

Matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) time of flight (TOF) mass spectrometry (MS)
Ioniza molculas atravs de pulsos de laser Separa molculas de acordo com a razo m/z

Principalmente usado para anlise de macromolculas

Dissoluo dos analitos e adio da matriz Aplicao de tiros de Laser de UV sobre a Matriz

A MALDI MS utiliza a cocristalizao da matriz (composto molecular orgnico de baixo peso molecular) e os analitos numa placa. Irradiao destes cristais por curto (escala de nanosegundo) pulsos de UV ou infravermelho, inicia a dessoro e ionizao, na qual, predominantemente so produzidos ons moleculares intactos monoprotonados (M-H+).
Os ons so medidos de acordo com a razo m/Z no analisador TOF (Time-of-Flight). MALDI MS extremamente sensvel, permitindo a deteco de molculas na ordem de fentomoles ou ainda menor, alcanando acuracidade de massa superior a 104 (em uma faixa de massa de at 30KDa).

A matriz um cido orgnico de baixo peso molecular (trans cinmico ou 2,5 dihidroxibenzico) possui capacidade de transmitir a radiao UV e minimizar a quebra direta das molculas pela ao direta do LASER sobre as mesmas. Portanto, a matriz deve ter concentrao da ordem 104 superior ao analito. A matriz mantem as molculas separadas umas das outras. A matriz funciona como fonte de prtons para ionizao das molculas. A matriz deve ser uniformemente aplicada amostra e devidamente seca para formao dos co-cristais (matriz-analito).

Etapas extremamente crticas a fim de preservar a distribuio espacial dos compostos, evitando o deslocamento e degradao dos analitos. Parmetros experimentais importantes: - Tratamento do tecido imediatamente aps coleta; - Seco; - Transferncia de amostra para a placa do MALDI ou slide de vidro condutor; - Aplicao da matriz; - Armazenamento do tecido aps seco.

Manipulao cuidadosa do tecido, incluindo congelamento em N2 lquido imediatamente aps coleta, essencial para preservao da condio nativa do tecido. Embebendo o tecido em gelatina ou agarose facilita manipular amostras pequenas e frgeis (ex.:bipsias), mas a maioria da crioseco realizada diretamente com amostras de tecidos congelados. Embebendo em polmero (OCT) ou Tissue-TEK , deve ser evitado porque compromete a integridade qumica. Cortes 10-20 M espessura podem ser ideais mais finos so mais frgeis e difceis de manipular e mais espessos demora a secar e so isolantes, podendo afetar negativamente a performance do analisador de massas.

A placa transparente e condutora de vidro recoberto (xido ndio-Sn) porque permite a obteno de imagem microscpica e a MS na mesma amostra.
Formalina-Parafina (FFPE)- induz a ligaes cruzadas entre ptns e reduz a eficincia na ionizao de peptdeos e ptns. Existem trabalhos recentes mostrando as principais aplicaes do MALDI-IMS em FFPE.

Para anlise de tecidos, o cido sinapnico fornece melhores resultados para ptns de alto PM, enquanto que o cido -ciano-4-hidroxicinmico mais adequado para peptdeos. Para obter anlise com maior resoluo espacial, na qual a deposio de matriz tem sido cuidadosamente controlada para minimizar a realocao espacial, o cido sinapnico tem sido recomendado.

Mtodos manuais - spraying airbrush ou Sprayer Cromat. Camada Delgada (TLC) ou mergulhando os cortes dos tecidos na matriz. Desvantagem: baixa reprodutibilidade. Mtodos automatizados aparatos de dois tipos: spotting e spraying. 1) Spotting - Perda de resoluo por pequenas inacuracidades de posicionamento. Spotting robticos podem ser usados para adio de reagentes qumicos sobre o tecido de uma forma controlada para modificaes qumicas ou digestes (ex.: CHiP-Shimadzu). - Limitao no tempo de preparo e na resoluo lateral. Resolues de 200-500M.

2) Spraying - Resolues significativamente maiores podem ser alcanadas.

Dois princpios de Spraying: vibracional e pneumtico Vibracional - ImagePrep (Bruker Daltonics) Vaporizao vibracional da matriz com um spray piezo-eltrico. Aplicao de pequenas gotas com dimetro mdio de 20M. As gotas so incubadas em atmosfera controlada. O processo de spraying e secagem so monitorados por um sensor ptico, avaliando a umidade do tecido, espessura da matriz e taxa de secagem. - Alta resoluo de at 25 M com boa qualidade do espectro significativa vantagem para anlises de rotina.

Pneumtico (Leaptec) TM-sprayer Capilar aquecido com spray pneumtico que se move em padres predefinidos sobre a amostra do tecido; taxa de secagem e umidade do tecido no so monitorados durante a preparao.

Colorao histolgica e MALDI-IMS

Softwares avanados em MALDI-IMS permitem a sobreposio de imagens de MALDI com imagens pticas macroscpicas e microscpicas obtidas antes das medidas no MALDI. Colorao histolgica de uma seo consecutiva Uma seo analisada no MALDI e outra seo para colorao histolgica(ex.: hematoxilina-eosina=HE). Limitao: cortes diferentes. Colorao histolgica antes do MALDI-MS - Colorao por HE usada para patologia clnica, mas infelizmente a qualidade do espectro de massas comprometida nestas amostras tratadas com HE. - Cresil-violeta e azul de metileno no comprometem a qualidade do espectro como um todo. Colorao histolgica depois do MALDI-MS Empregado recentemente (Schwarmborn et al., 2007), a colorao por HE permite correlao com MALDI-IMS, desde que o tecido esteja ntegro.

A grande vantagem da MALDI-MS em relao a outras tcnicas a capacidade de analisar diretamente matrizes biolgicas complexas, possibilitando a obteno de imagem da distribuio simultnea de diversos tipos de molculas pelos tecidos, sem a necessidade de marcao com anticorpos ou radioistopos, inclusive permitindo a descoberta de novas molculas, como candidatos a novos biomarcadores de doenas.