M. Sc. Ing.

JUAN FRANCISCO ROBLES RUIZ 2008

DEFINICION
Es un proceso en el que se llevan a cabo

cambios bioqumicos en un sustrato orgnico, por la accin de los catalizadores bioqumicos conocidos como enzimas, que son elaborados por tipos especficos de microorganismos

OBJETIVOS
Conservacion de alimentos: alcohol,

acido lactico.
Produccin de biomasa: levadura

para panificacin, cultivos lcticos

Produccin de productos especficos:

alcohol, cidos orgnicos, aminocidos, vitaminas, antibiticos, etc.

Produccin de enzimas:

amilasas, pectinasas, celulasas, proteinasas.

COMPONENTES DE LA FERMENTACION
FACTORES CONTROLABLES: T, O 2 , pH, ADITIVOS

M.O.
Enzimas endocelulares

ENZIMAS EXOCELULARES

Protenas

S
Permeasas

Carbohidratos Grasas

M.O

M.O

PRODUCTOS DE LA DEGRADACION Aminocidos PRODUCTOS DE DESHECHO: Acidos, Alcoholes Aldehidos,Esteres Eteres,Antibiticos Vitaminas Monosacridos Acidos Grasos

SUSTRATOS EN FERMENTACIONES
CARBOHIDRATOS: son los ms

comunes. De stos se pueden obtener por accin microbiana: alcohol, CO2, acidos, aminoacidos, vitaminas, etc.

PROTEINAS: la accin microbiana

produce: polipptidos, aminocidos.

pptidos,

 GRASAS: la accin microbiana produce

la hidrlisis de los triglicridos para producir cidos grasos.

OTROS SUSTRATOS: como el etanol

que por accin microbiana transforma en cido actico.

se

MICROORGANISMOS EN FERMENTACIONES
Requerimientos bsicos para que un microorganismo pueda usarse en fermentacin: Debe crecer rpidamente en el sustrato deseado y debe ser fcilmente cultivado en grandes cantidades Debe tener estabilidad fisiolgica bajo las condiciones de cultivo, produciendo las enzimas requeridas para efectuar la transformacin deseada en cantidades suficientes. Condiciones de cultivo sencillas y fcil de conservar.

TIPOS DE MICROORGANISMOS
Bacterias:

-Lcticas: Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus lactis, L.delbruekii -Acticas: Acetobacter pasteurianus, A. Xilynum, A. Suboxidans -Butricas: Clostridium acetobutiricum -Bacilos: Bacillus coagulans -Actinomicetos

Levaduras:

Saccharomyces cerevisciae, S. ellipsoideus, S. uvarum, Pachysolen tannophilus, Kluyveromyces lactis, Torula, Candida.
Hongos:

Aspergillus niger, A. Oryzae, Penicillium. Thichoderma viride

FACTORES DE LA FERMENTACION
Temperatura: el microorganismo no puede regular su T interna por lo que su T es idntica a la del medio de cultivo donde se desarrolla. Cada microorganismo tiene una temperatura ptima para su desarrollo y metabolismo y en funcin a ello se pueden clasificar en:

-Psicrfilos: Ts entre 1-4C -Mesfilos: Ts entre 20-40C -Termfilos: Ts entre 45 y 60C

 pH: el crecimiento de los microorganismos est

influenciado grandemente por la concentracin de iones H+ del medio exterior.

-Bacterias: pH 6-9
-Hongos y levaduras: pH 3-6

FACTORES DE LA FERMENTACION
Oxgeno: para los microorganismos implicados

en fermentaciones el oxgeno puede ser un alimento o un veneno. En funcin a esto, se pueden clasificar en: -Bacterias: Anaerobias estrictas: ausencia de O2: Clostridios Anaerobias facultativas: ausencia o presencia de O2: Cocos Aerobias estrictas: presencia de O2: Bacilos

-Levaduras: Aerobias facultativas: Saccharomyces

-Hongos: Aerobios Penicillium estrictos: Aspergillus,

Aditivos: ciertos compuestos y a determinadas

concentraciones influyen en el desarrollo de los microorganismos, como anhidrido sulfuroso, sales, vitaminas, etc.

OPERACIONES EN EL PROCESO DE FERMENTACION

I
PREPARACION DEL MEDIO

II
ESTERILIZACION DEL MEDIO

III
PREPARACION DEL INOCULO

FILTRACION DEL GAS

IV

FERMENTACION

RECUPERACION DEL PRODUCTO

VI

PREPARACION DEL MEDIO DE CULTIVO

Tiene que tenerse en cuenta: -Producto que se desea obtener -Exigencias del microorganismo -Disponibilidad y costo
El medio de cultivo debe incluir: -Fuente de energa: carbohidratos hidrolizados de almidones y

hidrocarburos -Fuente de nitrgeno: aminocidos, rea, sales nitrogenadas (fosfato de amonio, sulfato de amonio, etc.)

(azcares; celulosa),

-Sales minerales: S, P, Fe, Ca, Na, K, etc.

-Otros nutrientes: dependiendo del microorganismo, como por ejemplo: vitaminas. -Agua -Acidos o lcalis para regular el pH

PREPARACION DEL MEDIO DE CULTIVO

La

preparacin del medio de cultivo depende principalmente de la fuente de carbono a utilizar. el caso de utilizar azucares directamente aprovechables por el microorganismo, se hace una dilucin del azcar con agua hasta la concentracin ptima para la fermentacin, luego se adicionan los otros constituyentes y se regula el pH. requiere un pretratamiento para obtener azcares directamente aprovechables. El pretratamiento consiste en una hidrlisis qumica o enzimtica.

En

En el caso de los materiales amilceos y celulsicos, se

HIDROLISIS
Materiales amilceos:

-Hidrlisis quimica (cida): es llevada a cabo con cidos inorgnicos como el H2SO4 o HCl, a altas temperaturas (140-200C) y presiones (20-60 lb/pulg2). -Hidrlisis enzimtica: es llevada a cabo por enzimas, previa gelatinizacin del almidn.

 Las enzimas pueden ser provenientes de: vegetales (malta,

jora), animales (tialina) y microorganismos (Aspergillus oryzae, Bacillus coagulans)

Materiales celulsicos:

-Hidrlisis qumica (cida): al igual que en el caso de amilceos, se utilizan cidos inorgnicos y altas temperaturas y presiones. -Hidrlisis enzimtica: es llevada a cabo por enzimas, previa deslignificacin.
Las enzimas son provenientes de hongos: Thrichoderma

reesei, Thrichoderma viride

ESTERILIZACION
Se realiza con el objeto de eliminar microorganismos

patgenos o que puedan competir microorganismo fermentativo. Pueden ser:

con

el

Tratamiento trmico:

-Batch o lote: la esterilizacin se lleva a cabo en el propio fermentador, a 100C por un tiempo de 30 a 60 minutos. En este caso, la ventaja es que el fermentador y el medio se esterilizan simultneamente, pero tiene la desventaja de un mayor tiempo de operacin para el calentamiento y el enfriamiento, sobre todo si se trabaja con grandes volmenes.

-Contnuo: se realiza en esterilizadores de placa a una temperatura de 140C por un tiempo de 30 segundos. En este caso, se utiliza un menor tiempo de proceso y se pueden manejar grandes cantidades, pero el fermentador debe ser esterilizado previamente.

ESTERILIZACION
Tratamiento qumico: utilizando una sustancia qumica que inhiba el desarrollo de los microorganismos patgenos y competitivos del microorganismo fermentativo, pero que no

afecta el desarrollo de ste ltimo. Por ejemplo la utilizacin del anhidrido sulfuroso en mostos de uva, para la fermentacion alcohlica en la elaboracin de vinos.

 Filtracin

bateriolgica: utilizando filtros de celulosa o de cermica que tienen porosidades que no dejan pasar microorganismos. Este tipo de esterilizacin se utiliza para sustancias termolbiles que tienen que ser adicionadas en el medio de cultivo como las vitaminas.

PREPARACION DEL INOCULO

FILTRACION DEL GAS

El aire (oxgeno), CO2 o cualquier otro gas que debe

ser suministrado al fermentador debe ser previamente esterilizado para eliminar los microorganismos contaminantes. Se utilizan filtros de profundidad o filtros de exclusin. Los filtros de profundidad fueron los primeros en ser utilizados usando distintas fibras naturales como el algodn. Este ha sido reemplazado por la fibra de vidrio en filtros grandes, pero an se utiliza en matraces. Estos filtros no son absolutos ya que los espacios entre las fibras son mucho ms grandes que el microorganismo, pero la profundidad de la cama filtrante asegura que todos los microorganismos sean removidos.

 Los filtros de exclusin son membranas de celulosa

que tienen poros de 0.2-0.45 m que son adecuadas para eliminar bacterias.

FERMENTACIONES
Es la operacin en la que se van a llevar los

cambios bioqumicos del sustrato por medio de las enzimas de los microorganismos para obtener productos como: biomasa y metabolitos secundarios (alcoholes, acidos, etc.) Controles: -Temperatura -pH -Aireacin -Concentracin de sustrato -Concentracin de producto

ESQUEMA DE UN FERMENTADOR

METODOS DE FERMENTACION
Fermentacin discontnua: batch Se considera como un sistema cerrado. Al tiempo=0, la solucin esterilizada de nutrientes se inocula con microorganismos y se permite que se lleve a cabo la fermentacin en

condiciones ptimas de temperatura. A lo largo de la fermentacin, no se aade nada, excepto oxgeno (en forma de aire), si es requerido, un agente antiespumante y cidos o bases para regular el pH.

La composicin del medio, la concentracin de biomasa y la concentracin de metabolitos cambia en forma contnua como consecuencia del metabolismo de las clulas y se observa la curva tpica de crecimiento. El cese del crecimiento microbiano es consecuencia del agotamiento del nutriente esencial o la acumulacin de productos txicos para la clula.

METODOS DE FERMENTACION
Fermentacin contnua:

Se considera un sistema abierto. La solucin nutritiva estril se aade continuamente al biorreactor y una cantidad equivalente de solucin utilizada de los nutrientes con el producto y los microorganismos se saca simultneamente del sistema. La poblacin microbiana se mantiene en estado contnuo de crecimiento balanceado, al eliminar, de manera contnua algo del cultivo y reemplazarlo con medio nuevo a la misma velocidad.

METODOS DE FERMENTACION
Inmovilizacin celular:

La inmovilizacin celular es una tcnica que encierra una enzima o clula, catalticamente activa, dentro de un sistema o reactor y evita su salida hacia la fase mvil que lleva el sustrato y el producto.

METODOS DE INMOVILIZACION CELULAR

a)Entrecruzamiento Algunos microorganismos tienden a formar agregados o flculos en cultivos en suspensin, por ejm. ciertas cepas de levadura. Las condiciones del medio, como la adicin de polielectrolitos pueden producir agregacin.

b)Atrapamiento Consisten en la oclusin de las clulas dentro de una estructura que las retiene, sin dejar que se escapen, pero que deja penetrar los sustratos y salir los productos. Los microorganismos pueden ser atrapados en las siguientes estructuras: -Geles: poliacrilamida, alginato de calcio -Fibras: triacetato de celulosa -Precipitados de hidrxidos metlicos: sales de cloruro de titanio o zirconio -Membranas semipermeables de ultrafiltracin o de pelculas con poros calibrados.

c)Enlace covalente Consiste En el enlace directo de las clulas a un soporte activado. El enlace suele ser con algn componente reactivo de la superficie celular, por ejemplo grupos amino, carboxilo, tilo, hidroxilo, imidazol o fenol de las protenas. Se utilizan dos tipos de soporte: Orgnico (celulosa) e Inorgnico (vidrio)

d)Adsorcin Los microorganismos llegan a la superficie del soporte, bien por fuerzas dinmicas del fluido, por sedimentacin o por difusin browniana. Una vez en la superficie, se adhieren, primero de una forma reversible por fuerza de Van der Waals, electrostticas o covalentes y luego irreversiblemente por secrecin de polisacridos extracelulares que unen a los microorganismos entre s y al soporte inerte, formndose el denominado biofilm. Se utilizan como soportes: arena, almina, arcillas, plstico, resinas de intercambio inico.

RECUPERACION DEL PRODUCTO

OBJETIVOS DE LAS OPERACIONES DE RECUPERACION: -Concentrar -Purificar
Las operaciones dependen:

-Naturaleza del producto final -Tipo de microorganismo utilizado -Concentracin del producto -Productos colaterales presentes en el medio de cultivo -Grado de purificacin deseado

RECUPERACION DEL PRODUCTO

ETAPAS: A)Separacin de la biomasa y/o compuestos insolubles. Operaciones: -Sedimentacin -Floculacin -Flotacin -Filtracin -Centrifugacin

RECUPERACION DEL PRODUCTO

B)Concentracin y purificacin del producto Operaciones: -Evaporacin -Destilacin -Precipitacin qumica -Extraccin por solventes -Cristalizacin -Secado -Intercambio inico -Cromatografa -Osmosis inversa -Ultrafiltracin

PRODUCCION DE BIOMASA

A)CON FINES INDUSTRIALES : Produccin de levadura para panificacin a)Sustrato: melaza (sacarosa, glucosa) -Concentracin de azcar: 0.5-1.5% -pH: 4.0-4.5 (se regula con H2SO4) -Nutrientes: fosfato de amonio urea sulfato de amonio biotina

b)Microorganismo: Saccharomyces cerevisciae

c)Condiciones del proceso: -T : 26-30C -Aireacin d)Control del proceso: determinacin de la biomasa
e)Recuperacin del producto (levadura): -Centrifugacin -Filtracin: filtro prensa: se obtiene la levadura prensada (80-90% humedad) -Peletizacin -Secado por aire caliente: se obtiene la levadura seca activa (8% de humedad)

FLUJO DE OPERACIONES PARA LA PRODUCCION DE LEVADURA DE PAN

-Melaza -Acido sulfrico -Agua -Fosfato de Amonio -Urea -Biotina

PREPARACION DEL MEDIO DE CULTIVO

-Concentracin de azcar: 0.5-1.5% - pH 4.0-4.5

ESTERILIZACION
Saccharomyces cerevisciae >106 ufc/ml

-T = 121C -Tiempo = 20 min

INOCULACION
-T= 26-30C

FERMENTACION

-Aireacin

CENTRIFUGACION

LAVADO FILTRACION-PRENSADO MEZCLADO ENVASADO

OBTENCION DE LEVADURA DE PAN

PRODUCCION DE BIOMASA

B)CON FINES ALIMENTARIOS: Produccin de levadura alimento (CPU) a)Sustrato: azcares: melaza de caa (sacarosa) suero de leche (lactosa) hidrocarburos (petrleo) -Concentracin de azcar: 0.5-1.5% -pH: 4.0-4.5 -Nutrientes: fosfato de amonio, urea

b)Microorganismos: Candida utilis, Torulopsis utilis, Candida arborea, Torula cremoris, Candida tropicalis, Kluyveromyces Lactis. c)Condiciones del proceso: -T : 26-30C -Aireacin

d)Control del proceso: determinacin de la biomasa

e)Recuperacin del producto (levadura): -Centrifugacin -Tratamiento para degradar la pared celular y para eliminar cidos nucleicos: choque trmico, eliminacin de los cidos nucleicos mediante enzimas intracelulares, enzimas externas, con sales, etc. -Secado por rodillo o por atomizacin (concentrado protico con 5-8% de humedad).

FLUJO DE OPERACIONES PARA LA PRODUCCION DE LEVADURA ALIMENTO

-Melaza -Acido sulfrico -Agua -Fosfato y sulfato de Amonio -Urea -Sales

PREPARACION DEL MEDIO DE CULTIVO

-Concentracin de azcar: 0.5-1.5% - pH 4.0-4.5

ESTERILIZACION

-T = 140C -Tiempo = 30 seg

INOCULACION
Candida utiliz >106 ufc/ml -T= 26-30C -Aireacin

FERMENTACION

CENTRIFUGACION

LAVADO

ELIMINACION DE ACIDOS NUCLEICOS CONCENTRADO SECADO

 a)Hidrlisis alcalina de ARN de la clula empleando

METODOS PARA ELIMINAR O DISMINUIR EL CONTENIDO DE ACIDOS NUCLEICOS

NAOH La hidrlisis del ARN da lugar a los mononucletidos de la purina y la pirimidina, que se van a encontrar en el sobrenadante conjuntamente con la protena y otros componentes, quedando como precipitado la pared celular, la cual se separa por centrifugacin. Con este procedimiento son extrados 90 a 95% de cidos nucleicos y se obtiene 70 a 80% de protena.

 b)Extraccin de ARN con soluciones de cloruro de sodio u otros compuestos qumicos

Se basa en la solubilizacin del cido nucleico por la sal en una muestra homogenizada. Se utiliza una solucin de 4% de NaCl, con un tiempo de extraccin de 1 hora a 40C. Se separa la pared celular por centrifugacin, luego se precipita la protena llevando la solucin a pH 4.0 (punto isoelctrico), y luego se separa por centrifugacin, realizando varios lavados.

 c)Degradacin por enzimas endgenas Consiste en la extraccin de ribonucleasas (normalmente presentes en la levadura en condicin inactiva) que hidrolizan el cido nucleico en nucletidos, los cuales se difunden a travs de la pared celular debilitada y pueden ser extrados por centrifugacin, lavado o dilisis. Es as que a 70C por 1 minuto, se destruyen los inhibidores de las RNASAS y proteinasas, liberndolas y, luego al ser incubadas a 50C, se activan las enzimas que degradan los cidos nucleicos y en menor grado a las protenas.

 d)Degradacin de ARN por enzimas endgenas y

ClNa El efecto de la sal sobre la extraccin de ARN est relacionado con el ingreso de la sal en la clula, debilitando o destruyendo la estructura de ribosoma (que contiene el ARN) y al lisosoma (que contiene a la enzima RNASA en forma latente y asociada). La RNASA, adems, es activada por Cloruro de sodio al 3%.

 e)Degradacin de ARN por enzimas exgenas

Consiste en aadir la ribonucleasa extrada de fuentes ricas en enzimas (RNASA pancretica) a las suspensiones de clulas para hidrolizar el cido nucleico bajo condiciones especficas.

M.Sc. Ing. Amrico Guevara Prez

PRODUCCION DE ALCOHOL
a)Sustrato: azcares o hidrolizados de materiales amilceos y celulsicos b)Condiciones del sustrato: -Concentracin de azcar: 10-18% (S. cerevisciae) 20-26% (S. ellipsoideus) -Nutrientes: fosfato de amonio, sulfato de amonio -pH: 4.0 - 4.5 (S. cerevisciae) 3.3 - 3.5 (S. ellipsoideus)

c)Microorganismos usados: S. cerevisciae, S. ellipsoideus, S. uvarum, Kluyveromyces lactis, K. fragilis, Pachysolen tannophilus, Schizosaccharomyces pombe
d)Condiciones del proceso: -Aireacin: se requiere slo al comienzo, para promover el crecimiento de la levadura, luego la fermentacin se lleva a cabo en anaerobiosis. -T: 20-25C. e)Recuperacin del producto: alcohol -Destilacin -Rectificacin

FLUJO -Melaza DE OPERACIONES PARA LA OBTENCION DE ALCOHOL

-Acido sulfrico -Agua -Fosfato y sulfato de Amonio -Urea

PREPARACION DEL MEDIO DE CULTIVO

-Concentracin de azcar: 18-20% - pH 4.0 -T = 121C -Tiempo = 20 min

ESTERILIZACION
Saccharomyces cerevisciae >106 ufc/ml

INOCULACION
-T= 25-28C

FERMENTACION

-Aireacin al inicio, despus anaerobiosis

DESTILACION

RECTIFICACION

OBTENCION DE ALCOHOL

PRODUCCION DE ACIDO ACETICO

a)Sustrato: alcohol etlico, vino, sidra y cualquier bebida alcohlica de frutas o bebidas amilceas b)Condiciones del sustrato: -Concentracin de alcohol: 10-13% -Nutrientes: fosfato de amonio, borra de levadura -Acidez actica inicial: 3-3.5% (mtodo lento) 1-1.5% (mtodo de fermentacin sumergida)

c)Microorganismos usados: A. aceti, A. pasteurianus, A. suboxydans, A. ascendens, A. xylinum. d)Condiciones del proceso: -Aireacin: se requiere pero en cantidades medidas. -T: 27-30C.
e)Recuperacin del producto: acido actico -Destilacin -Rectificacin

FLUJO DE OPERACIONES PARA OBTENER ACIDO ACETICO (VINAGRE)

-Mosto alcohlico -Acido actico -Fosfato de Amonio

PREPARACION DEL MEDIO DE CULTIVO

-Concentracin de alcohol: 10% -Acidez actica: 1-3%

Acetobacter suboxydans Acetobacter pasteurianus >106 ufc/ml -T= 30C

INOCULACION

FERMENTACION

-Aireacin moderada

DECANTACION

CLARIFICACION

ESTABILIZACION

ENVASADO

FERMENTADORES

FERMENTADORES

PRODUCCION DE ACIDO CITRICO

a)Sustrato: azcares o hidrolizados de materiales amilceos y celulsicos b)Condiciones del sustrato: -Concentracin de azcar: 14% -Nutrientes:cantidades medidas de sales de nitrgeno, potasio, fsforo, azufre y magnesio -pH: 2.2 - 3.5

c)Microorganismos usados: Aspergillus niger, Penicillium luteum, Mucor piriformis.

d)Condiciones del proceso: -Aireacin: se requiere, pero en cantidades medidas -T: 26-28C.

PRODUCCION DE ACIDO CITRICO

e)Recuperacin del producto: acido ctrico -Filtracin -Precipitacin con Oxido de Calcio -Filtracin o centrifugacin -Tratamiento con H2SO4 -Filtracin -Decolorado -Filtracin -Concentracin -Cristalizacin -Centrifugacin -Lavado -Secado

FLUJO DE OPERACIONES PARA OBTENER ACIDO CITRICO

-Melaza -Acido sulfrico -Agua -Sales de N, K, P. S, Mg, Fe

PREPARACION DEL MEDIO DE CULTIVO

-Concentracin de azcar: 14% -pH: 2.2-3.5

ESTERILIZACION
Aspergillus niger >106 esporas/ml

-T = 121C -Tiempo = 20 min

INOCULACION
-T= 26-28C -Aireacin moderada

FERMENTACION

FILTRACION

-Hidrxido de Calcio

PRECIPITACION

FILTRACION

FLUJO DE OPERACIONES PARA OBTENER ACIDO CITRICO

-Acido sulfrico

PRECIPITACION

FILTRACION

-Carbn activado

DECOLORACION FILTRACION CONCENTRACION

CRISTALIZACION

CENTRIFUGACION
LAVADO SECADO

OBTENCION DE ACIDO CITRICO