Sunteți pe pagina 1din 17

UNIVERSITATEA DE TIINE AGRONOMICE I MEDICIN VETERINAR UNIVERSITATEA DE TIINE AGRONOMICE I MEDICIN VETERINAR

Tehnica RFLP. Tehnica RFLP. Descriere Descriere general, general, aplicaii aplicaii
Toma Rodica Elena Toma Rodica Elena

Bucureti, Bucureti, 2013 2013

Tehnica RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) se bazeaz pe proprietile de hibridare care exist ntre dou fragmente de ADN, prezentnd un grad nalt de omologie (RFLP- bazat pe hibridare) i tehnica PCR denumit PCR-RFLP, n care se evideniaz polimorfismele existente la nivelul situsurilor enzimelor de restricie.

1. Tehnica RFLP bazat pe hibridare cu o sond, implic parcurgerea urmtoarelor etape:

extracia ADN din organismele ce urmeaz s fie analizate; digestia ADN cu ajutorul enzimelor de restricie;

separarea fragmentelor obinute n urma digestiei, n funcie de mrimea lor, prin electroforez n gel de agaroz; transferul ADN sub form denaturat pe o membran de nylon (Southern blotting) n care poziia relativ a diferitelor fragmente de ADN din gel se pstreaz pe parcursul transferului;

hibridarea ADN cu sonda marcat prealabil, n regiunile n care prezint omologie;

vizualizarea regiunilor hibridate cu ajutorul unui film sensibil la radiaii (autoradiografie) sau cu ajutorul unei reacii enzimatice, care d o coloraie specific.

n tehnica RFLP pot fi utilizate diferite tipuri de sonde, care permit evidenierea unor tipuri diferite de polimorfism.

Sondele mono- sau oligogenice

Sondele poligenice sau multilocus

Sondele mono- sau oligogenice pun n eviden unul sau mai muli loci; ele dau un profil simplu care include cteva benzi.

Utilizarea acestui tip de sonde permite vizualizarea polimorfismelor de secven, localizate la nivelul situsurilor de restricie,precum i a polimorfismelor de inserie/deleie, situate ntre situsurile de restricie.

Acest tip de sond a fost utilizat pentru a alctui hri genetice la om, pentru a identifica unele varieti de mr i pentru a pune la punct un test de depistare a anemiei falciforme.

Sondele poligenice sau multilocus pot fi dirijate spre zonele care prezint variabilitate foarte mare, cum sunt secvenele de tip micro i minisatelit, alctuite de 2 pn la 16 perechi de baze, repetate n tandem.

Cu ajutorul sondelor multilocus, se observ, n general un grad ridicat de polimorfism ntre genotipurile nrudite. Acest tip de sond a fost utilizat pentru prima dat de Jeffreys i colab., (1985) la hibridarea cu ADN genomic uman digerat i amprentizarea genetic a fiecrui individ.

Ulterior, au fost descoperite alte secvene satelit i la alte mamifere, la insecte i plante. Sondele multilocus permit evidenierea polimorfismului de secven la nivelul situsurilor de restricie, polimorfismului de inserie/deleie precum i polimorfismului determinat de numrul unitilor repetitive, pentru fiecare individ n parte.

2. Tehnica RFLP, bazat pe PCR, utilizeaz o enzim de restricie pentru digerarea unui produs de amplificare, obinut cu primeri specifici, iar n gelul de agaroz se vor obine benzi de dimensiuni diferite, corespunztoare celor trei genotipuri (homozigoi pe una din cele dou alele i heterozigoi).

Markerii RFLP sunt markeri cu polimorfism limitat ce identific variaiile secvenei de ADN la nivelul unui situs de restricie, prin analiza RFLP.

O surs abundent de markeri genetici, utilizai n tehnicile de cartare a genomului animal au la baz modificrile unor secvene de ADN care se produc la nivelul situsurilor de restricie. De regul aceste variaii sunt cauzate de mutaii punctiforme (substituia unei nucleotide cu o alta), inserii sau deleii, n interiorul situsului de restricie i astfel, enzima de restricie, nu mai recunoate situsul respectiv i nu mai taie.

Aceasta va determina obinerea unor fragmente de restricie de lungimi diferite (polimorfice) care pot fi uor vizualizate i identificate n gelul de agaroz datorit lungimii lor diferite.
Din aceast cauz ele se vor separa n gelul de electroforez sub forma unor benzi situate n diferite regiuni. Greutatea molecular se apreciaz cu ajutorul unui ADN standard de etalonare leadder.

n practic, mrimea unui fragment ce se detecteaz prin Southern blotting este de 300 pb 15 kb cu diferene detectabile mai mici de 50 pb.

Prin tehnica PCR se detecteaz produi ntre 60 pb-2kb, cu diferene chiar de cteva baze. Indivizii diferii genetic pentru un anumit locus, vor prezenta fragmente de restricie de lungimi diferite, ntr-un numr diferit pentru un anumit cuplu format din sonda molecular enzim de restricie. n acest context, fiecare sistem format din ADN genomic enzim de restricie, poate defini un locus polimorf care are cel mult dou alele diferite.

Cu ajutorul RFLP se pot identifica variaiile genetice dintre indivizi doar la nivelul situsurilor de recunoatere a enzimelor de restricie, respectiv dintre indivizii care posed unul din cele trei genotipuri existente n locusul de interes (AA, Aa, aa) i nu se pot detecta variaiile la nivelul ntregului genom.

V mulumesc