NOVOS MTODOS EMPREGADOS EM ANLISE MICROBIOLGICA

Analise microbiolgica de alimentos:

Investigar presena / ausncia de micro-organismos Quantificar os micro-organismos de interesse Identificar diferentes espcies microbianas presentes

Os Mtodos Microbiolgicos podem ser divididos em:

Mtodos tradicionais ou convencionais

Mtodos rpidos ou alternativos ou novos mtodos

Mtodos tradicionais
Desenvolvidos h muitos anos e desde ento vem sendo empregados como mtodos oficiais na maioria dos laboratrios. Descritos em publicaes de referncia, internacionalmente aceitas:
Alguns exemplos:
- Bacteriological Analytical Manual (BAM) (FDA/AOAC)

- Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (APHA)

- International Organization for Standardization (ISO) - International Dairy Federation (IDF)

- Food and Drug Administration (FDA).

Mtodos tradicionais
So laboriosos e consomem muito tempo operacional
Dependendo do no. de anlises: - perigo de contaminao cruzada; - muitas etapas a serem validadas; - limitada rea fsica e pessoal.

A maioria dos testes so baseados na contagem de clulas viveis

Injria, alteraes - processamento

Mtodos tradicionais
1. ANLISE QUANTITATIVA MTODOS DE CONTAGEM DE MICRO-ORGANISMOS

A) Contagem de colnias de microorganismos em placas de petri -Em profundidade " pour-plate"

Tcnica de contagem por membrana filtrante

-Na superfcie do meio

Tcnica da determinao do
nmero mais provvel (NMP)

Mtodos tradicionais
2. ANLISE QUALITATIVA -Tcnica de presena/ausncia

Problemas com os mtodos tradicionais:

Sensibilidade insuficiente capacidade de detectar o que o mtodo

prope

Especificidade: nem sempre ocorre (podem haver falsos negativos); Repetitividade: nem sempre se o teste for repetido por um mesmo
operador inmeras vezes se obtm o mesmo resultado;

Reprodutibilidade: capacidade de gerar resultados estatisticamente

iguais (nem sempre ocorre).

Mtodos rpidos ou novos mtodos

Apresentam as seguintes vantagens:
Reduo do tempo de anlise;

Menor tempo de reteno do produto na indstria;

Diminuio de custos; Simplificao das tarefas envolvidos na anlise;

Facilidade de leitura dos resultados;

Especificidade; Maior sensibilidade de alguns mtodos quando comparados com os mtodos convencionais.

Mtodos rpidos ou novos mtodos

Importante: 1) Ter um microbiologista treinado para interpretao; 2) Ser aprovado pelos rgos oficiais.

Mtodos rpidos ou novos mtodos

3 grupos:

1) Automao laboratorial;
2) Mtodos para avaliar a qualidade;

3) Mtodos para avaliar inocuidade.

1) AUTOMAO LABORATORIAL
Utilizado nas etapas da analise:

a . Pesagem- Por ex, atravs de um aparelho chamado DILUTER - ajustado que ao colocar a amostra, pesa a alquota desejada, e j dilui acrescentando a gua necessria para a diluio!

1) AUTOMAO LABORATORIAL
b . Homogeneizao- Uso do stomacher homogeneizador de pisto no mais os liquidificadores que cortam as clulas microbianas injuriando-as na anlise!!!

c. Semeadura Utilizao de um aparelho chamado spiral plater amostra semeada na placa, atravs de uma cnula, que verte o inculo, e a placa fica numa superfcie que gira.

2. Mtodos para avaliao da qualidade

Mtodos de contagem: direta e indireta

MTODOS DE CONTAGEM DIRETA

Tcnica de membrana filtrante: Utilizada para lquidos onde grande quantidade necessitada para amostra: ex.: gua e refrigerantes. Aprovado pela AOAC para enumerao de bactrias totais, coliformes totais, Escherichi coli e Salmonella.

MTODOS DE CONTAGEM DIRETA

Tcnica fluorognica: A enzima -glicuronidase produzida pela maioria das cepas de Escherichia coli transforma o MUG (que adicionado ao meio de cultura) em umbeliferona (que fluorescente quando observado sob luz ultravioleta de onda longa).

MTODOS DE CONTAGEM DIRETA

Sistemas prontos para uso: Placas de Petrifilm-3M, Placas de Simplate e diversos gares adicionados de substratos cromognicos ou fluorognicos.

PetrifilmTM - 3M

So filmes de papel quadriculado revestido com polietileno, recobertos de nutrientes desidratados e gis hidrossolveis a frio com corante indicador (cloreto de trifeniltetrazolio TTC) - exceo fungos. Cada placa tem um filme superior de polipropileno.

Aprovado pela AOAC!

Petrifilme
1
2

Anlise de Escherichia coli

3

Petrifilme

Anlise de Enterobacteriaceae

Petrifilme

Anlise de bolores e leveduras

Petrifilme

Anlise de Staphylococcus aureus

Placas de Simplate - BIOCONTROL

Placas de Simplate - BIOCONTROL

Placas de Simplate - BIOCONTROL

MTODOS DE CONTAGEM INDIRETA

Medio da atividade metablica dos micro-organismos nos alimentos;

construo de curvas-padro: correlao entre os parmetros medidos e o nmero de clulas viveis;

Princpio bsico: quanto maior o nmero de micro-organismos presentes mais intenso o fenmeno medido.

MTODOS DE CONTAGEM INDIRETA

Bioluminescncia
Emisso de luz por organismos vivos. Princpio: quantidade de ATP detectada a partir de clulas metabolicamente ativas (clulas microbianas; sangue, carne,...). ATP reage com a enzima luciferase, na presena de luciferina e ons Mg++, formando um complexo que, em contato com o oxignio, sofre uma descarboxilao, com emisso simultnea de luz.

http://www2.uol.com.br/sciam/reportagens/o_univ erso_luminoso_dos_fungos_bioluminescentes.html

 Bioluminescncia

Princpio do mtodo: emisso de bioluminiscncia por ATP

Mg+2
E - LH2 - AMP + O2 oxiluciferina + CO2 + AMP + luz

E + LH2 + ATP

E - LH2 - AMP + PP

A luz emitida pode ser medida em luminmetro, um fluormetro ou em um espectrofotmetro de cintilao lquida.

 Bioluminescncia
Aplicao comum: Monitoramento de Higienizao em plantas processadoras de alimentos. Quanto mais sujo, + luz!

MTODOS DE CONTAGEM INDIRETA

Impedncia/Condutncia Principio: Micro-organismos alteram a corrente eltrica de um meio de cultura devido atividades metablicas. Na multiplicao, molculas grandes (protenas, lpideos) se transformas em molculas menores (aminocidos, ac. graxos), que so quimicamente ativas. Resultado: acumulo destes compostos leva alteraes mensurveis na condutncia e impedncia eltrica do meio . Curva-padro: Determina micro-organismos presentes

3. Mtodos para avaliar a inocuidade

BIOQUIMICOS

IMUNOLOGICOS
MOLECULARES

BIOQUIMICOS
Baseados na avaliao da capacidade dos microrganismos de utilizarem determinados substratos ou de produzirem determinados metablitos

Testes normalmente executados em kits.

Ex: Galerias API_ Bio-Mrieux BBLRapid test- Salmonella- OXOID

IMUNOLOGICOS
Grande sensibilidade e elevada especificidade. Baseados em reaes especficas entre antgenos e anticorpos.

Imunoenzimticos;
Imunocaptura;

Imunoimobilizao;
Coaglutinao.

IMUNOLOGICOS Imunoenzimticos
Tipo mais empregado: sandwich O patgeno PROCURADO capturado da amostra por anticorpos adsorvidos superfcie de uma matriz slida (esferas de poliestireno, placas de microtitulao, etc)

A reao baseada na ligao do antgeno com o anticorpo especfico, no qual um desses reagentes marcado com uma enzima, normalmente cromognica
A cor formada pode ser observada a olho nu ou em espectrofotmetro.
Ex.: VIDAS (Bio Merieux- automatizado) Salmonella, Listeria, E. coli e E. aureus Unique (Tecra) Salmonella e Listeria

IMUNOLOGICOS Imunocaptura

Anticorpos ficam ligados a partculas metlicas

Aps a ligao com o antgeno, as partculas metlicas so atradas por um im. Aps a retirada do im, obtm-se um produto concentrado que pode, ento, ser submetido aos testes de escolha para pesquisa do microorganismo de interesse.

IMUNOLOGICOS Imunoimobilizao
Princpio: Bactrias mveis cultivadas em meios semi-slidos tem sua mobilidade bloqueada pela adio de anti-corpos flagelares especficos.
Forma uma banda de precipitao visvel na interface ANTI-CORPO/BACTRIA. Aplicvel a qualquer micro-organismo flagelado (mvel). Ex. Teste 1-2 da Bio-Control p/ Salmonella: Duas cmaras de plstico interligadas em L . Na cmara horizontal fica o caldo de enriquecimento seletivo p/ Salmonella e na vertical o meio semi-solido onde se coloca o antisoro flagelar polivalente.

IMUNOLOGICOS Coaglutinao

Conhecido como aglutinao de ltex(passiva reversa) Uso: toxinas microbianas Aglutinao de partculas de ltex sensibilizadas com anti-corpos anti-toxinas. Ex.: RPLA kits_ OXOID p/ pesquisa de enterotoxinas estafiloccicas.

MOLECULARES

- Segurana e rapidez nos resultados.

- Disponvel para patgenos e bioindicadores

MOLECULARES

Sondas genticas material gentico do micro-organismo liberado e separado em duas fitas simples; adicionam-se sondas, que so fragmentos de DNA ou RNA especficos

para o patgeno alvo, marcadas com enzimas cromognicas;

quando h hibridizao com a sonda, h desenvolvimento de cor e, portanto, a presena do micro-organismo.

MOLECULARES
Reao de Polimerase em Cadeia (PCR) O que PCR? Reao em Cadeia da Polimerase Desenvolvido em 1983 por Kary Mullis. Prmio Nobel em Qumica 1993; AMPLIFICAO DO MATERIAL GENTICO DE MICRORGANISMOS

Metodologia
Extrair o material gentico da clula (DNA ou RNA) sem danific-lo. Adiciona: 1. dNTPs (desoxirribonucleotdeos trifosfatos), que so as bases nitrogenadas ligadas com trs fosfato; 2. primers tambm chamados de oligonucleotdeos; 3. enzima DNA polimerase em soluo tampo; Toda esta mistura colocada no termociclador - faz ciclos de temperatura pr-estabelecidos com tempos exatos especficos para cada reao (fragmento a ser amplificado).

MOLECULARES
Reao de Polimerase em Cadeia (PCR)

PCR tradicional
- Dependente da seleo e qualidade do primer; - Necessidade de otimizao das reaes; - Muitas e delicadas etapas; - Mo de obra especializada; ambiente adequado;

- Perigo de contaminao.

MOLECULARES
Reao de Polimerase em Cadeia (PCR)

BAX PCR automatizado

- Primers j testados e validados;

- Aprovaes e validaes.
FACILITA A ROTINA E DIMINUI INTERFERNCIAS !

MOLECULARES
Ribotipagem

Feita em um equipamento sofisticado, totalmente automatizado, no qual bactrias podem ser identificadas rapidamente (menos de 8 horas) em nvel de espcie.

INDSTRIA ALIMENTOS NECESSITA MTODOS MICROBIOLGICOS QUE SEJAM: Precisos Rpidos Fceis de utilizar Flexveis Confiveis Econmicos Acompanhamento e

suporte tcnicos
contnuos

CONSIDERES FINAIS
devido necessidade de rapidez de resultados, hoje, j so encontrados no mercado varias tcnicas que possibilitam resultados muito rpidos, essas tcnicas so conhecidas por mtodos rpidos de anlise microbiolgica, os mais usados na rea da pesquisa so PCR, o ELISA, placas petrifilm e placas

simplate.
Os mtodos rpidos possuem muitas vantagens, como boa exatido, alm de minimizar os custos de uma empresa, sendo de rpida e fcil leitura, porm,

possuem algumas desvantagens, como o elevados custo de algumas tcnicas

e mesmo aqueles j aprovados pela AOAC, os resultados positivos ainda no so considerados confirmatrios.

Mtodos rpidos oficiais AOAC para anlise microbiolgica de alimentos e sistemas para monitoramento de higienizao. Mtodos Simplate - para contagem total de bactrias em 24 horas; contagem de bolores e leveduras em 48 a 72 horas e contagem de coliformes totais e E.coli em 24 horas VIP, 1-2 Test e Assurance EIA - mtodos imunoezimticos AOAC OMA para anlise de patgenos como Salmonella, Listeria, Campylobacter e E.coli O157:H7 GDS - Sistema de deteco gentica de ltima gerao - PCR - com aprovao AOAC para anlise de patgenos com Salmonella, Listeria spp, Listeria monocytogenes, E.coli 0157:H7, Enterobacter sakazakii Lightning MVP - Sistema para monitorar e avaliar a efetividade dos procedimentos de limpeza atravs da bioluminescncia por ATP em conjunto com medidas de controle de qualidade pH, temperatura, concentrao em ppm e condutividade. Possibilita a calibrao de todos os parmetros

DUVIDAS?