Repblica de Venezuela La Universidad del Zulia Facultad Experimental de Ciencias X Jornadas Nacionales de Investigacin Cientfica

Optimizacin del proceso de extraccin de la -D-Galactosidasa a partir de Kluyveromyces marxianus ATCC 8554

Realizado por: Lic. Marcel Mavrez M. Sc. Xiomara Montiel M. Sc. Ingrid Carruyo

26/ X /2004

Problemtica
Intolerancia a la lactosa, Baja solubilidad (Cristalizacin), Poco poder edulcorante,

Contaminacin ambiental.

Hidrlisis de la Lactosa
Resinas ionizadas,
ENZIMAS, Minerales cidos fuertes

-D-Galactosidasa

-D-Galactosidasa

S-glicosil O-glicosil

Enlace -1,4

Lactosa

-D-Galactosa + Glucosa

METODOLOGA

Mtodos Microbiolgicos previos al ensayo de extraccin

Ensayo de combinacin de parmetros fisicoqumicos

Curva de calibracin de biomasa de K. marxianus

R cuadrado 0,991

Curva de Calibracin de Orto-nitrofenol (ONP)

Solucin ONP 0,015 M

Diluciones graduales en buffer fosfato 0,05 M y pH 7,5

Desde 0,05 moles/ml hasta 0,5 moles/ml

R cuadrado 0,996

Recuperacin de la biomasa
9 horas, 29,6 C y 200 r.p.m.

1 ml muestra (Para determinacin de biomasa) Se lavaron las clulas y se procedi a montar el ensayo de toluenizacin

Los pelets lavados se resuspendieron en 9,8 ml de sol. Buffer fosfato 0,1 M a pH 6,5, pH 8,5 y pH10 debidamente rotulados.

Se les agreg 0,2 ml de tolueno (2% v/v)

Ensayo a 30 C
pH 6,5 pH 8,5 pH 10 5 horas 5 horas 5 horas 10 horas 10 horas 10 horas 20 horas 20 horas 20 horas

Ensayo a 37 C
pH 6,5 pH 8,5 pH 10 5 horas 5 horas 5 horas 10 horas 10 horas 10 horas 20 horas 20 horas 20 horas

Ensayo a 42 C
pH 6,5 pH 8,5 pH 10 5 horas 5 horas 5 horas 10 horas 10 horas 10 horas 20 horas 20 horas 20 horas

RESULTADOS Y DISCUSIN

Biomasa= 50,3709 1,83937 mg/ml

A=pH B=Temp C=Tiempo

Fuente A (A) B (B) C (C) A*B A*C B*C A*B*C

Anlisis de Varianza
F P 1458.36 2795.32 14.67 385.43 27.75 159.14 74.46 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000

Nomenclatura c/u Interacciones

pH 6.5 inter pH 8.5
5h

inter pH 10
4 5h

inter
7

5 horas 1

30 C

10 h
20 h 5h

2
3 10 11

10 h
20 h 5h 10 h

5
6 13 14

10 h
20 h 5h 10 h

8
9 16 17

37 C

10 h

20 h
5h

12
19 20 21

20 h
5h 10 h 20 h

15
22 23 24

20 h
5h 10 h 20 h

18
25 26 27

42 C

10 h 20 h

LSD comparacin de medias

Interaccin 10 (pH 6,5; 37 C por 5 horas)

Interaccin Media GRUPOS --------- ---------- ----------10 0.4937 I 14 0.4181 .I 12 0.4113 .II 11 0.3991 .II 15 0.3963 ..I 13 0.3916 ..I 20 0.3639 ...I 19 0.3568 ...I 17 0.3166 ....I 18 0.3135 ....I 21 0.3016 ....II 22 0.2835 .....I 3 0.2548 ......I 16 0.2348 .......I 5 0.2195 .......II 2 0.2132 ........I 6 0.1841 .........I 9 0.1588 ..........I 23 0.1491 ..........II 8 0.1323 ...........I 7 0.1316 ...........I 4 0.1033 ............I 24 0.0672 .............I 1 0.0622 .............I 25 8.350E-03 ..............I 26 0.0000 ..............I 27 0.0000 ..............I

moles/ml/10min de ONP liberado.

0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0

Absorbancia

10 14

12 11

15 13

20 19

17 18

21 22

3 16

5 2

6 9

23 8

7 4

24 1

25 26

27

Interacciones Tratamiento

moles/ml/10min de ONP liberado versus los nmeros asignados a las interacciones

moles/ml/10min de ONP liberado.

0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0

Absorbancia

Ensayo a 37 C

Ensayo a 30 C
Ensayo a 42 C

1 2

3 4

5 6

7 8

9 10

11 12

13 14

15 16

17 18

19 20

21 22

23 24

25 26

27

Interacciones Tratamiento

moles/ml/10min de ONP liberado versus los nmeros asignados a las interacciones, mostrando a la vez el comportamiento en bloque de los ensayos por temperatura

Mahoney y col.1975, Investigacin basada en seleccin de cepas y procedimientos de extraccin de lactasa en K. fragilis
Mejor mtodo de extraccin: Autlisis por tolueno 2% v/v, 37 C en buffer fosfato potasio 0,1 M y pH 7,0

Extraccin ptima 20 horas

Montiel y col. 2000

Ensayo de produccin de -Dgalactosidasa por K. fragilis en cultivo por carga con lactosuero como sustrato.

Electroextraccin de proteinas sobre levaduras K. lactis Ganeva y col. 2002 ,

10 horas y se pudo acelerar con ad. ditioeritriol

obtenidas por desintegracin mecnica o por lisis enzimtica

Ph
pH 6,5 K. marxianus

Punto ptimo de pH

Actividad Enzimtica

Holsinger 1978, S. lactis pH ptimo 6,8 y 7, y pH estable de 6,5 a 8,5 a 35 C. Lactasa de A. niger= pH ptimo de 4 a 4,5 a temp. ptima a 55 C en suero cido.

Rech y col. (1999) Se seala esta temperatura como punto de mx. actividad y una mnima a 30C. Figueroa y col. Enfoc el efecto del pH en la produccin de sta enzima. Dedujo pH ptimo en 5,5 y 37C.
Actividad especfica U- Gal/mg protenas versus el pH, temperatura y tiempo de extraccin de la -D-Galactosidasa

CONCLUSIONES

-La extraccin de la -galactosidasa fue ptima a 37 C y pH 6,5, resultando de stos la disminucin del tiempo de extraccin a 5 horas.

-La actividad de la -Galactosidasa result negativamente influenciada por la combinacin de un Buffer a pH 10 y una temperatura igual o por encima de 42 C por ms de 5 horas de exposicin.

- La actividad especfica reflej el mismo punto ptimo de extraccin que el obtenido del ONP liberado.

Gracias