ARRAYS DE ADN Y ARN

Esperanza Mantilla Rivas Estefana Esguerra Len Camila Vlez Gutirrez Camila Pardo Varela Manuela Angulo Aguayo Mara Paula Moreno Knudsen Natalia Lozano Escobar Valentina Puth Reyes

Qu son?
Array, ADN microarray, ADN chip, oligonucletido, gen chip. Dispositivos compuestos de una superficie slida a la cual se le han agregado sondas de ADN. Los fragmentos de ADN representan un gen diferente y estn agrupados de una manera concreta.
SONDAS: Representan los genes de inters. Oligonucletidos , derivados de PCR y ADNc.

Para qu?
Proporcionar un fenotipo molecular Identificar un determinado ARN mensajero o una secuencia de ADN Identificacin de alteraciones genticas Puede detectar la expresin de miles de genes simultneamente Proporcionar nuevas clasificaciones de los tumores
Estudio del transcriptoma de tejidos alterados frente a los de un tejido Control. Transcriptoma: Es el conjunto de la expresin de los genes (mRNA) en un tejido y en un momento determinado. (Busquets, Agust 2001)

Material de soporte
Poroso
Geles , membranas porosas , nitrocelulosa Nylon Reutilizable y bajo costo

No poroso
Silicio , plastico u oro

Acido nucleico diana Sonda de hibridacion Es el acido nucleico procedente del tejido cuya secuencia genmica se quiere detectar Fragmento de acido nucleico marcado cuya secuencia es complementaria a la diana -ADN c -Producto de PCR -Oligonucleotidos

Micro array ADN c

Se realiza una retrotrascripcion del ARNm a ADNc para mejorar su estabilidad y poder manipularlo
Objetivos -Detectar genes que se expresan en un tejido a partir de cuantificacin de ARNm Ventajas -Se analizan simultneamente dos muestras -Mayor variabilidad Desventajas -Costos -Se requiere Software especfico para su interpretacin

Micro arrays de oligonucleotidos

Objetivos Detectar ganancias y perdidas de regiones en el genoma Ventajas -Permite conocer el contenido y secuencia -Flexibilidad en diseo -Produccin industrial sometida a grandes controles de calidad Desventajas -Al aumentar el nmero de sondas, aumenta el ruido y se tienen que extremar los controles -Se requiere anlisis en Software -Exceso de informacin complica anlisis

Micro arrays de SNP

Variante de Micro arrays de oligonucleotidos Identifica cualquier desequilibrio (aneuploidia, delecin y duplicacin ) Diseada para detectar muestra problema Permite identificar gen parental en cada copia
Objetivo -Detectar el genotipo de los marcadores polimrficos incluidos en el array -Detecta ganancia y prdida de regiones en el genoma Ventajas -Permite conocer genotipos y realizar haplotipos en estudios familiares Detecta regiones con prdidas de heterocigosidad Desventajas -Es menos sensible -Es ms dependiente del desarrollo de Software para su interpretacin

Cmo funcionan ?
Propiedad de la complementariedad del ADN
Con una hebra se puede deducir la complementaria

Determinar qu genes estn expresados o activados en una clula midiendo la cantidad de ARNm correspondiente a ese gen que hay en ella El ARNm libre es muy inestable: por retrotranscripcin (transcriptasa inversa) se sintetiza una molcula conocida como ADNc Mtodo cuantitativo: nivel de fluorescencia es proporcional al nmero de copias que se han hibridado.
Alta fluorescencia: alta hibridacin= gran transcripcin del gen en la clula

Cmo se hace?
1. 2. 3. Aislar ARNm de ambos tejidos y a partir de ellos, obtener ADNc. Marcar ADNc con complejo fluorescente (diferente color para el de cada tejido). Mezclar ADNc marcados y colocarlos en el array. Entre mayor hibridacin, mayor expresin tisular original del ARNm correspondiente.

Cada especie de ADNc hibride especficamente a su ADNc complementario inmovilizado en el array

1. 2. 3.

Incubar para permitir la hibridacin. Eliminar el exceso de ADNc mediantes lavados para evitar confusin. Sistema lector de ADN array muestra resultados. (Fluorescencia)

Cmo se hace?

http://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/chip/chip.html

Cmo interpretarlo?
Proporciona informacin de genes que han variado su expresin gnica como causa o consecuencia de enfermedades. Tecnologa generadora de hiptesis Concreta hiptesis sobre un nmero reducido de genes.

Verde Paciente Delecin

Rojo Patolgico Sobreexpresin

Amarillo Normal

Tipos
Ms comerciales Spotted microarrays Micromatrices de canal nico Genechips.

Tipos
Ms comerciales
Spotted microarrays Micromatrices de canal nico Chips de ADN para Genotipado

Las pruebas son: Oligonucletidos ADN complementario (ADNc) o Pequeos fragmentos de Reaccin en cadena de la polimerasa.

Se hbrida el ADNc ( en el mismo chip de ADN) de dos condiciones que son marcados, cada uno de esas condiciones con dos fluorforos diferentes.
Procede al escaneo del resultado y a la visualizacin del mismo. Se pueden observar genes que se activan o se reprimen en distintas condiciones.

La contraparte de estos experimentos es que no se pueden observar niveles absolutos en la expresin.

Tipos
Ms comerciales
Spotted microarrays Micromatrices de canal nico Chips de ADN para Genotipado
Las sondas se disean a partir de una secuencia de ARNm predeterminado. Dan estimaciones del nivel de expresin Las sondas son sintetizadas in situ (directamente sobre el chip) Un chip = Una muestra Se utiliza fotolitografa

No se pueden observar distintas condiciones en una misma matriz -> Diferente chip para cada condicin.

Tipos
Ms comerciales
Spotted microarrays Micromatrices de canal nico Chips de ADN para Genotipado
Los SNP arrays son un tipo particular de matrices que son usadas para identificar variaciones individuales y a travs de poblaciones, es decir, son capaces de identificar cualquier desequilibrio (aneuploida, delecin, duplicacin). Por tanto, estos arrays permiten conocer simultneamente la secuencia de cientos de miles (con frecuencia ms de un milln) de variantes gnicas presentes en la muestra Genotipificado Forense Mutaciones somticas en cncer.

No es tan eficaz por la poca fuerza que se presenta al analizar la fluorescencia

Beneficios y Limitaciones
Beneficios Limitaciones

Permite analizar mltiples genes de manera simultnea Translocaciones Inversiones balanceadas Identificacin de alteraciones cromosmicas en pacientes con patologa pero sin alteraciones en genotipo
Mayor sensibilidad y resolucin que un cariotipo convencional 1 alternativa en estudio de ganancias o prdidas de material gentico

Aplicaciones
Anlisis del nivel de expresin gnica Diagnostico y caracterizacin de tumores Genotipificacin Deteccin del Nmero de copias de ADN Deteccin de ganancias o prdidas allicas. Deteccin de mutaciones y polimorfismos

Identificacin de genes que modifican su expresin tras la administracin de un frmaco

Diagnstico de enfermedades infecciosas (genoma del M.O)

Deteccin de riesgo o suceptibilidad para presesntar enfermedades

Pronstico de tumores
Deteccin de nuevos oncogenes y genes supresores tumorales

Indicaciones
Nios con cariotipo normal pero con cuadro clnico de: Retraso mental Rasgos dimrficos Desordenes autistas En cariotipos alterados: Pacientes con translocaciones aparentemente balanceadas. Presencia de duplicaciones o deleciones. Identificacin de cromosomas marcadores, con el fin de determinar su origen.

Caso Clnico
Mujer embarazada (25 aos) Cariotipo convencional t(11;12) reciproca Feto: defecto cardiaco y leve dilatacin de pelvis renal Microarray Prdida info 16q, no detectable en cariotipo convencional

16q: FOXF1, FOXC2, FOXL1

FOXF1: Displasia alveolo-capilar
Desarrollo anormal vasculatura alrededor de alvolos HT pulmonar postnatal Deterioro rpido y muerte

FOXC2 y FOXL1: Malformaciones cardiovasculares

http://www.youtube.com/wat ch?v=wKcQZVeIK-k
http://www.youtube.com/watch?v=ePFE7yg7LvM

Bibliografa
http://www.seom.org/es/informacion-sobre-el-cancer/info-tipos-cancer/tumorescerebrales/159?task=blogcategory&showall=1 Busquets, X., and A.G.N. Agust. "Chip Gentico (ADN Array): El Futuro Ya Est Aqui." N.p., n.d.Obtenido de http://www.archbronconeumol.org/watermark/ctl_servlet?_f=10&pident_articulo=130200 94&pident_usuario=0&pident_revista=6&fichero=6v37n09a13020094pdf001.pdf&ty=154& accion=L&origen=abn&web=www.archbronconeumol.org&lan=es el 3 Mar. 2013.

Jing Liu, Francois Bernier, Julie Lauzon, R. Brian Lowry, and Judy Chernos Application of Microarray-Based Comparative Genomic Hybridization in Prenatal and Postnatal Settings: Three Case Reports Mayo 20 de 2011. Obtenido el 3 Mar. 2013
Alonso. Javier. Utilidad de los microarrays en pediatra. Instituto de Investigaciones Biomdicas. Madrid, Espaa. N.D. Obtenido el 3 Mar 2013

Instituto Cataln de Oncologa: Vctor Moreno y Xavier Sol. Uso de chips de ADN (microarrays) en medicina: fundamentos tcnicos y procedimientos bsicos para el anlisis estadstico de resultados Barcelona. Espaa. Obtenido el 3 Mar 2013