VIRUSOLOGIE Lucrari practice

Prepar. Univ Dr. Aura Temereanca Asist. Univ dr. Cornel Popescu Sef Lucrari Univ. dr. Camelia Sultana

ALGORITMUL DIAGNOSTICULUI IN VIROZE

Etapele diagnosticului virusologic

Orientarea diagnosticului (suspiciunea de viroz) Recoltarea produsului patologic Transportul produselor patologice Direciile diagnosticului virusologic

Etapele diagnosticului virusologic

Orientarea

diagnosticului

Recoltarea produsului patologic Transportul produselor patologice Direciile diagnosticului virusologic

Formular de trimitere pentru diagnostic virusologic

Adresa spitalului/policlinicii/ cabinetului ce trimite produsul patologic
Nume, prenume pacient Date clinice, suspiciune diagnostic Tipul produs patologic Tipul tratamentului administrat in prealabil

Medicul caruia i se va comunica rezultatul (tel, fax, email)

Sex, Varsta Data debutului simptomatolgiei Data, ora recoltarii Date epidemiologice (contact cu boli infectioase transmisibile, vectori, calatorii in zone endemice pt o anumita boala, vaccinari)

Analiza solicitata Semnatura, parafa medicului

V. Varicela - Zoster

Etapele diagnosticului virusologic

Suspiciunea de viroz

Recoltarea

produsului

patologic
Transportul produselor patologice Direciile diagnosticului virusologic

RECOLTAREA PRODUSELOR PATOLOGICE

S T E R I L !!!

Conteinere sterile pentru recoltarea si transportul

produselor patologice

RECOLTAREA PRODUSELOR PATOLOGICE STERIL!!!

Recoltarea probelor
- locul & timpul potrivit

POLIO (enterovirusuri)

Recoltarea produselor patologice

Snge - 3-5 ml prin punctia venoasa aseptica, pe anticoagulant. Virusuri frecvent izolate: virusuri care disemineaza viremic si agentii etiologici ai febrelor hemoragice. Materiile fecale - 4-8 g in solutie de Mg SO4 (stabilizeaza infectivitatea enterovirusurilor). Virusuri frecvent izolate: enterovirusuri, rotavirusuri, calicivirusuri, mai rar adenovirusuri enterice. Secretii nazo faringiene a) spalatura nazo faringiana se obtine cu ajutorul unor tampoane cu coada (sterile) introduse in cornetul nazal inferior. b) aspiratul nazofaringian se obtine folosind un speculum nazal prin administrarea a 3 ml ser fiziologic in nari cu o seringa atasata la un tub de plastic. c) lavaj traheobronsic se obtine prin bronhoscopie in conditii speciale de catre personal calificat Virusuri frecvent izolate: virusurile gripale A si B, virusurile paragripale, adenovirusuri, rhinovirusuri, coronavirusuri, virusul respirator sincitial, v.rujeolos, v. rubeolos, v. urlian. Lichid cefalorahidian (LCR) - 5-6 ml prin punctie rahidiana, inainte de inceperea tratamentului. Virusuri frecvent izolate: virusul rabic, unele arbovirusuri.

PRODUSE PATOLOGICE

PRODUSE PATOLOGICE
Saliva. Se recolteaza saliva de langa ductul Stenon cu tampon steril. Frecvent este limitata la diagnosticul infectiei rabice. Lichid vezicular - Colectarea lichidului din vezicule, bule, pustule se face dupa dezinfectia prealabila a regiunii cutanate sau mucoase. Se perforeaza vezicula cu un ac atasat la o seringa de tuberculina sau cu ajutorul unei pipete. Virusuri frecvent izolate: HSV I, HSV II si VZV. Urina -100 ml - orice specimen urinar obtinut prin abstinenta de la mictiune timp de 2 ore este adecvat pentru diagnosticul virusologic. Virusuri frecvent izolate. V. citomegalic, v. rujeolos. Tampoane vaginale, lavaj cervico-vaginal, tampon uretral de la nivelul colului uterin si uretrei (atat la femeie cat si la barbat); cu tampoane sterile, respectiv periuta citologica (pentru uretra masculina), fara toaleta prealabila a regiunii. Virusuri frecvent izolate: virusuri herpetice si papilomavirusuri; diagnostic BTS, uretritelor, leziunilor veziculare si hiperplazice genitale. Biopsia tisulara. Fragmente de organ recoltate n ctiva ml de solutie salina + ser de vitel 10% + antibiotice n concentratiile folosite n culturile de celule.

Etapele diagnosticului virusologic

Suspiciunea de viroz Recoltarea produsului patologic

Transportul

produselor

patologice

Direciile diagnosticului virusologic

Transportul probelor recoltate

Rapid
La

rece Sigur
ambalare riguros corecta etichetarea cu semn biorisc documentatie in legatura cu agentul biologic transportat

Etapele diagnosticului virusologic

Suspiciunea de viroz Recoltarea produsului patologic Transportul produselor patologice

Direciile

diagnosticului virusologic

DIRECIILE DIAGNOSTICULUI VIRUSOLOGIC

1.

Izolarea viral

2.

Demonstrarea prezenei virusului / componentelor sale

3. Diagnosticul serologic

Izolarea virusurilor

Izolarea virusurilor
3 sisteme de izolare folosite n virusologie
Culturi de celule Ou de gin embrionat Animalul de laborator

Izolarea virusurilor

in culturi de celule

Izolarea pe culturi de celule

Neinfectate

= EFECTE CITOPATICE

Infectate cu v. variolic

HEK 293

HeLa

BSC-40

RABIE Sus- neuron fara incluzii Negri Jos neuron cu incluzii Negri (col HE)

Izolarea virala prin inoculare la animalul de laborator

RABIE modificari patognomonice in SNC

Infiltrat mononuclear perivascularsus

Focare de infiltratie limfocitare in celulele gliale -jos

Izolarea virala prin inoculare

pe OGE

Pocks-uri pe Membrana Chorio-alantoindiana OGE - v. variolic

DIRECIILE DIAGNOSTICULUI VIRUSOLOGIC

1.

Izolarea viral

2.

Demonstrarea prezenei virusului / componentelor sale

3. Diagnosticul serologic

Detectia directa a particulei virale

Microscopia electronica

Coloratia negativa acetat de uranil acid fosfotungstic Metode care cresc sensibilitatea (106-108 particule/ml) Metode de concentrare:

ultracentrifugare difuzia in agar

centrifugare directa pe grila de ME

Microscopie electronica
Coloratie negativa

vaccinia

Microscopie electronica Coloratie negativa

variola

Electron micrographs of hepatitis C virus purified from cell culture. Scale bar is 50 nanometers.

Detectia directa a componentelor virale

Acid nucleic Antigene virale

Detectia directa a acidului nucleic viral - PCR

Thermocycler

Detectia directa a antigenelor virale ELISA (test imuno-enzimatic)

sandwich ELISA. (1) Plate is coated with a capture antibody; (2) sample is added, and any antigen present binds to capture antibody; (3) detecting antibody is added, and binds to antigen; (4) enzyme-linked secondary antibody is added, and binds to detecting antibody; (5) substrate is added, and is converted by enzyme to detectable form.

Detectia directa a antigenelor virale reactia de imunofluorescenta (IF)

(test rapid de detectie a Ag)

Identificarea virusurilor prin neutralizarea efectului citopatogen

RSN

Reactia de Seroneutralizare - Identificarea Enterovirusurilor

Identificarea virusurilor prin inhibarea efectului viral

HA - hemaglutinina

RHAI

NA - neuraminidaza
Nucleocapsida helicoidala ARNss

anvelopa
transcriptaza

Matrice

Reactia de Hemaglutinoinhibare -Identificarea virusurilor gripale

DIRECIILE DIAGNOSTICULUI VIRUSOLOGIC

1.

Izolarea viral

2.

Demonstrarea prezenei virusului / componentelor sale

3.

Diagnosticul serologic

Diagnosticul serologic in infectiile virale

Raspuns imun primar

Raspuns imun secundar

Diagnosticul serologic

pe prob unic de ser - anticorpi antivirali de tip IgM (rspunsul imun primar) - ELISA de captur pe probe pereche de ser
-

proba I - la debut proba II - la 2-3 sptmni

ELISA tehnica indirect sau de competiie

seroconversia In proba I nu exist anticorpi In proba II apar anticorpi specifici virusului de detectat creterea semnificativ a titrului de anticorpi ntre

cele 2 probe (de minim 4 ori)

Etapele diagnosticului virusologic

Izolarea viral Dem. virusului/ componente Diagnosticul serologic
Direciile diagnosticului virusologic
Transportul produselor patologice

Recoltarea produsului patologic

Suspiciunea de viroz