ESCUELA POLITECNICA DEL EJERCITO

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA VIDA

INGENIERIA EN BIOTECNOLOGIA
ENZIMOLOGA
Efecto del pH sobre la actividad enzimtica
Efecto del pH sobre la actividad enzimtica
Vmax
pH
1 3 5 7 9 1 3 5 7 9
1 3 5 7 9
pH pH
Enzimas: cidas Neutras Alcalinas
pKa
o-COOH 3,0-3,2
|- -COOH 3,0-5,0
-imidazolio 5,5-7,0
o-NH3 7,5-8,0
SH 8,0-8,5
Fenol 9,8-10,5
Guanidinio 11,6-12,6
pKa de aminocidos
que pueden estar
implicados en el centro
activo
Interior de la protena
pKa cambios de hasta 2
unidades
Modelo comportamiento de una enzima con dos residuos ionizables
que interviene en el centro activo.

E EH H EH
1 2 1
S E S EH S H EH


1 2 1
P EH +

1
+ S
+ S + S
K1 K2
Ks1 Ks2
kcat
Substrato no ionizable en el rango de pH
K1 y k2 constantes de disociacin de los grupos protonizables
Ks1 y Ks2 constantes de disociacin de las diferentes especies qumicas forman
complejos la E y S
Km constante de Micaelis de formacin del nico complejo que da el producto EH
1
-

| | | |
| |
| | | |
| |
| | | |
| |
| | | |
| |
| || |
| |
| |
| |
| |
| |
(

+ + +
(

+ + =
=
=
=
=
=
+ + + =
+
+

+
+

+
=
+

+
=
+

=
+
=
+
H
Ks
Ks
H
S EH
H
K
K
H
EH Eo
S EH
EH S
Km
Ks
H
Ks
S EH S E
Ks
H
S EH S H EH
H
K
EH E
K
H
EH H EH
S E S EH S H EH E EH H EH Eo
2
1
1
1
1
2
1
1
2
1
1
1
1
1
1
2 1
2
1
1
1
2 1
1
2 1
1
2 1
Los diferentes complejos se expresan en funcin de [H+] y las contantes de disociacin
Valores de los distintos complejos
Sustituyendo y sacando factores comunes
| || |
| |
| || |
| |
| || |
| |
| || |
| | S EH
H S E
Ks
S H EH
H S EH
Ks
EH
H E
K
H EH
H EH
K

+ =
+

+ =
+
=
=
=
=
1
2 1
1
1
2
2 1
1
1
2
1
Valor de la constante de Michaelis
| || |
| |
| | | |
| |
| |
| |
| |
| |
| |
| |
| |
| |
| |
| |
| |
(

+ + +
(

+ +
=
(

+ + +
(

+ +
=
=
=
+
+
+
+
+
+
+
+

H
Ks
Ks
H
H
K
K
H
S
Km
kcatEo vo
H
Ks
Ks
H
H
K
K
H
S
Km
Eo S EH
S
Km
S EH EH
S EH
EH S
Km
2
1
1
1
1
2
1
1
1
1
2
1
2
1
1
1 1
1
1
De esta expresin tenemos que obtener el valor de
| | S EH kcat vo

=
1
| | S EH

1
| |
| |
| |
| |
(

+ + +
(

+ + =
+
+

+
+

H
Ks
Ks
H
S EH
H
K
K
H
EH Eo
2
1
1
1
1
2
1
1
A partir de la ecuacin de balance de
masas de la enzimas y el valor de Km
Multiplicando y diviendo por la expresin
| |
| |
| |
| |
| |
| |
| |
| |
| | S
H
Ks
Ks
H
H
K
K
H
Km
S
H
Ks
Ks
H
V
vo
H
Ks
Ks
H
+
(
(
(
(

+ +
+ +
(

+ +
=
(

+ +
+
+
+
+
+
+
+
+
2
1
1
1
2
1
1
max
2
1
1
2
1
Expresin general que representa el comportamiento de la velocidad de
una enzima con dos restos aminocidos protonizables y su forma activa es
pH puede modificar tanto la Vmax
como la Km
| | S EH

1
| |
| |
| |
| |
| |
| |
| |
| |
| | Eo
EH
f
H
K
K
H
f
H
K
K
H
V
VmpH
S Km
S
H
K
K
H
V
vo
Ks K
Ks K

+
+

+
+
+
+
=
(

+ +
=
(

+ +
=
+
(

+ +
=
=
=
1
2
1
1
2
1
1
1 1
2
1
1
max
2
1
1
max
2
1
Presencia de Substrato no modifica los pKa
de los grupos ionizables de la enzima
No se modifica la Km
slo la Vmax
f
-
Funcin de Michaelis
A [S] saturantes
Fraccin de la enzima en la forma EH
1
-
Da los productos de la reaccin
Valor entre 0 y 1

f
1
pH
1
0,5
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
pK
1
pK
2
[H
+
]<<<K
1
y [H
+
]>>>K
2
Vmax no se modifica
[H
+
] muy altas muy bajas
Vmax tiende a 0

f
1
pH
1
0,5
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
pK
1

f
1
pH
1
0,5
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
pK
2
Otras Formas activas
EH
1
H
2
E
=
| |
| |
2
2 1 1
1
+
+
+ + =
H
K K
H
K
f
| | | |
2 2 1
2
1
K
H
K K
H
f
+ +
+ + =
3. Deduccin de los pKa de los aminocidos del centro activo
A pH bajo

f
1
1
0,5
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
pK
1
pK
2
| |
| |
| |
2
1
1
1
1
5 , 0
1
2
1
1
1 1
pK pH
pK pH
K
H
f
H
K
K
H
f
=
=
(

+
= =
(

+ +
=
+

+
+

A pH alto
Para el modelo enzima diprtica y en su forma EH
1
-

Slo pueden hacerse cuando la diferencia entre los dos pK sea al menos
3,5 unidades de pH de diferencia

pH
Linearizacin de la ecuacin de la velocidad mxima en funcin de la variacin de pH
| |
| |
| |
2
max
log
1
max
log
1
max
2
1
1
max
pK pH
V
VmpH
pK pH
V
VmpH
H
K
V
VmpH
H
K
K
H
V
VmpH
=
=
=
(

+ +
=
+
+
+
Se desprecia 1 como sumando y K2/[H
+
]
A pH bajos
A pH altos
Se desprecia 1 como sumando y [H
+
]/K1
max
log
V
VmpH
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
pK
1
pK
2
pH
} {
-log2
Confirmados por otras tcnicas:
Modificacin qumica especfica de aa, mutagenesis dirigida, etc
+
+ H E EH
EHS
P EH+
+ S
K1
kcat
Km
| |
| |
| | max
1
max max
1
max
1 1 1
1
1
max
V S V
Km
V
K
S V
Km K
H v
S Km
S
K
H
V
v
pH
pH
+ +
(

+ =
+
(

+
=
+
+
Clculo del pKa para una Enzima monoprotica
1/[H
+
]
1/v
pH
-1/K1
4. Efecto del pH sobre la ionizacin del substrato
+
+ H S SH
EHS
P E+
+ S
Km
K
H
kcat
Slo se ioniza el substrato
So= S
-
+ SH
| |
| |
| |
| |
H
H
H
H
H
pK pH
Km
KmpH
H
K
So
Km
H
K
So
V v
H
K
SH So
H
K
SH S
=
+
+
+
=
(

+ =
=
+
+
+
+

log
1
1
max
1
Slo varia la Km
Obtener el pK
H
| |
(

+ =
+
H
K
Km KmpH
H
1
| |
So
H
K
Km
So
V
H
+
(

+
+
1
max
Generalmente fenmenos
poco frecuentes
Y si se ionizan tanto la enzima como el subtrato? Tarea
RESUMEN
pH
Las enzimas ensayadas in vitro a diferentes pH
se comportan como: enzimas cidas, neutras y
bsicas.
Las curvas de actividad enzimtica frente a
variaciones de pH puede darnos informacin sobre
los pKa de los residuos de aminocidos
implicados en la catlisis.
La funcin de Michaelis de las enzimas con
residuos ionizables se ajustan muy bien a los
comportamientos experimentales
Cuando el substrato no influye en la ionizacin
de la enzima, solamente la Vmax se ver afectada.
En el caso de que sea solamente el substrato el
que se ionice en el rango de pH estudiado,
solamente se ver modificada la constante de
Michaelis.