EQUIPO 1

1902

Uso en sntesis comercial de metabolitos secundarios de alto valor permitiendo la produccin sustentable.

Produccin de protenas sin riesgo de contaminacin del cultivo, como endotoxinas o patgenos.

Permitir el aislamiento de pantas genticamente modificadas eliminando el riesgo de migracin transgen.

El 60% de los anticancergenos y el 75% de medicamentos contra enfermedades infecciosas son productos naturales

Cultivos diferenciados producen casi las mismas cantidades de metabolitos secundario que las plantas completas
Desarrollo de un cultivo de clulas vegetales. A) Esterilizar el explante. B) El explante crece en el medio de cultivo para formar tejido calloso. C) Los callos son transplantados a medio lquido para crear un cultivo en suspensin. D) Escalar a un biorreactor.

Recuperacin (el metabolito secundario representa >1% del peso seco total de la planta.

Ejemplo: Se requiere 340 000 kg de corteza de 38 000 rboles de Taxus para obtener 25 kg por ao de paclitaxel.

Sntesis qumica total o parcial.

Expresin heterloga de ruta sinttica en otros organismos.

Produccin in situ de cultivo de clulas vegetales.

Menos del 1% de la demanda anual de la valinilla se extrae de Vanilla planifolia, se sintetiza a partir de sustratos como guaiacol, eugenol o lignina. Limitantes: tamao y centros quirales. Sntesis de morfina: tiene 5 centros de quiralidad.

Sntesis Heterologa de metabolitos secundarios de plantas: investigado en bacterias, levaduras y especies de plantas alternativas.
Ideales debido a: Duplicacin rpida Bajo costo de fuentes de carbono Facilidad de modificacin gentica

Saccharomyces cerevisiae

Sntesis de biomoleculas complejas esta limitado debido a que una protena pierde funcionalidad debido a un plegamiento incorrecto en la membrana; ejemplo: sntesis de terpenos en E. coli est limitado por la CYP450.

Escherichia coli

Solucin para la expresin una protena funcional: Disear un anclaje correcto a la membrana. Disear protenas quimeras que imiten a la protena que se encuentra en la planta. xito en produccin de flavonoides hidroxilados e isoflavonas.
Principal limitacin de la produccin heterologa es la falta de vas metablicas secundarias totalmente caracterizadas Introduccin de genes modificados con especificidad de sustrato para las vas de plantas que se pueden expresar en microbios, ejemplo: flavonoides y va de carotenoides, va de biosntesis de alcaloides.

La investigacin esta dirigida a superar los problemas asociados con los bajos rendimientos de produccin y la variabilidad del cultivo celular.
Cultivos de clulas indiferenciadas Cultivos de clulas diferenciadas

Producen niveles bajos de metabolitos secundarios.

Trabajos recientes han demostrado que la produccin de metabolitos secundarios puede ser inestable en cultivos en suspensin, esto puede estar correlacionado con las variaciones en el nivel de ploida celular, esta variacin se ha relacionado con las diferencias en la expresin gnica.
A mayor ploida aumenta el nmero de genes silenciados en la ruta metablica. Afecta significativamente la produccin del metabolito.

La tendencia de las clulas vegetales a crecer en agregados puede llevar al desarrollo de subpoblaciones heterogneas, donde las clulas difieren metablicamente y morfolgicamente. El tamao promedio del agregado de un cultivo puede afectar a la acumulacin de metabolitos secundarios.

La mayora de las investigaciones estn encaminadas a vincular el tamao del agregado y la acumulacin de metabolitos secundarios.

Mtodo tradicional utilizado para aumentar la acumulacin de metabolitos secundarios, tambin se puede utilizar para comprender la regulacin de las vas metablicas secundarias a travs de estudios de expresin gnica diferencial .
Muchos metabolitos secundarios de las plantas estn vinculados a la defensa de la planta contra patgenos y herbvoros, el metabolismo de la clula puede ser desplazado para favorecer el metabolismo secundario a travs de la introduccin de tensiones fsicas o qumicas.

Los jasmonatos son compuestos derivados de lpidos que participan en el crecimiento de plantas y en su desarrollo, capaces de inducir un cambio metablico en el crecimiento y en la defensa en muchas especies de plantas.

cido jasmnico jasmonato de metilo

aumentar la acumulacin de metabolitos secundarios en cultivos en suspensin aumentar la acumulacin de metabolitos secundarios en cultivos en suspensin aumenta la produccin de paclitaxel hasta 46 veces ms por clula.

Acumulacin de metabolitos secundarios limitada por: Inhibicin de retroalimentacin en la sntesis del producto. Degradacin del producto.

Medios de cultivo que utilizan sistemas slido-lquido o liquido-lquido miscibles de dos fases puede superar las limitaciones y aumentar la productividad del cultivo, al tiempo que simplifica la recuperacin del producto y permitiendo una operacin semi continua.

Aumento seis veces la produccin de paclitaxel en cultivos en suspensin de Taxus chinensis en sistemas bifsicos.

Usando una resina no aromtica se aumento significativamente la produccin de trans-resveratrol, despus de elicitacin con cido saliclico o jasmnico. En una operacin semicontinua usando una resina macroporosa hidrfoba en un cultivo de races peludas de Salvia miltiorrhiza la produccin de tanshinone aumento 7.4 en comparacin con una operacin discontinua.

Utilizado para superar problemas asociados con cultivos en suspensin.

Rendimientos del producto bajos y variables. Alta susceptibilidad en las tasas de crecimiento. Eliminacin continua de productos.

Clulas encapsuladas con xito en: Alginato de calcio Agar Agarosa Gelatina Carragenina Poliacrilamida Espuma de poliuretano Membranas de fibra hueca

Inmovilizacin de clulas de Taxus baccata en perlas de alginato de calcio en biorreactor.

Rendimiento de paclitaxel Tasa de Produccin (16 dias)

de 43.43 mg / L 2.71 mg / L/ da

Estos son los niveles mas altos de paclitaxel reportados hasta la fecha, realizados en un biorreactor de laboratorio a escala. En los sistemas que secretan el metabolito secundario de inters, encapsulacin o inmovilizacin se puede simplificar el procesamiento posterior y permitir la extraccin continua del producto.

Transformacin gentica

Transitoria

Bombardeo de partculas Electroporacin Inyeccin ADN Sistema de expresin viral

Estable Induccin por

Agrobacterium

Efecto de la regulacin gentica en la ruta metablica Factores de transcripcin de expresin gentica

Marcador de seleccin

INGENIERA METABLICA

Ingeniera Metablica Precursor alimentacin Sobreexpresin e inhibicin gentica Estudios de mutacin Expresin gentica diferencial

Limitaciones Acumulacin de metabolitos secundarios Poco conocimiento sobre rutas metablicas

Factores de transcripcin

Regulacin expresin de mltiples genes No requiere completo conocimiento de la ruta metablica

Protalix Biotherapeutics
Enfermedad de Gaucher Tratamiento enzimtico Costoso entre 100 000 y 200 000 dlares anuales

Enfermedad lisosomal causado por la disminucin de la actividad de la enzima lisosima cido--glucosidasa, acumulndose glucosilceramida.

Ampliacin del hgado y el bazo Anemia Disminucin de plaquetas Deterioro esqueltico

Protalix Biotherapeutics

Desarroll una protena recombinante taliglucerasa alfa (homloga a la GDC humana), producida por cultivos en suspensin de zanahorias modificados geneticamente

An no est autorizado, pero se puede pedir por uso compasivo para los pacientes mayores de 18 aos. Las investigaciones se encuentran en Fase III a nivel mundial con resultados exitosos.

PERSPECTIVA COMERCIALIZACIN DE CULTIVOS CELULARES DE PLANTAS

Metabolitos secundarios Protenas heterlogas Contador Coluter

Anlisis individual celular

Metabolismo celular Desarrollo y optimizacin cultivos CMC Ingeniera metablica y factor de transcripcin

Optimizacin

Seguridad Condiciones controladas cultivo Secrecin de protenas