Universidad Nacional del Santa Facultad de Ciencias E.A.P.

Biotecnologa

INTEGRANTES:
CAMPOS COBIN, Csar ESPRITU NGELES, Christopher MENDOZA RAMOS, Smit JIMNEZ AGUIRRE, Elar Alonzo NOLASCO CASTILLO, Yosselin Liliana SILVA PEREDA, Luz Marzella VSQUEZ RODRGUEZ, Jhazmn VELSQUEZ COLQUE, Bryan Oliver

EFECTO DEL TIEMPO DE ESTERILIZACIN EN LA PRODUCCIN DE PENICILINA G Y UTILIZACIN DEL PRECURSOR EN FERMENTACIN BATCH

INTRODUCCIN:
La operacin unitaria ms importante para una fermentacin satisfactoria es la esterilizacin del medio. Se emplea para mantener la pureza del cultivo durante la fermentacin. El medio puede esterilizarse por: Calor Filtracin Irradiacin Vibracin snica Exposicin a agente qumicos. En la industria de la fermentacin, el calentamiento por vapor es el mtodo ms empleado para esterilizar, ya que es confiable y fcil de controlar. Aunque se usa para erradicar microbios indeseados, puede llevar a un cambio en la composicin de nutrientes.

 Los metabolitos secundarios son compuestos orgnicos que se producen en sistemas biolgicos y, aunque no estaran involucrados directamente en el crecimiento o reproduccin del organismo, no son producidos sin razn. Entre ellos, la penicilina es el antibitico ms comercial en los ltimos 50 aos. El mercado de antibiticos -lactmicos representa ms del 65% del mercado de los antibiticos del mundo y se estima en unos 15 millones de dlares. En la produccin industrial de penicilina-G, el rendimiento se ve aumentado por la adicin de un precursor como el cido fenilactico (PAA) o cido fenoxiactico (POAA), aunque ste debe agregarse en pequeas cantidades constantemente.

El modo de fermentacin de la penicilina es el fed batch, aadiendo el precursor cido fenoxiactico (POAA) durante todo el proceso a fin de evitar la inhibicin por sustrato.

 Para una ptima produccin los otros parmetros monitoreados y controlados por programas del controlador.

fueron

Tras formular el medio, ste fue esterilizado antes de la inoculacin del cultivo deseado. Una vez que el medio de cultivo se someti a autoclave a 15 psi de presin durante 15 minutos, se extendi el vapor bajo una corriente continua durante 3 das, lo que aumento la hidrolisis de la maltosa y lactosa, para poder obtener el mximo aprovechamiento del medio por los microorganismos.

MATERIALES Y MTODO:
Cultivo y Productos Qumicos:

El cultivo empleado en este estudio fue una cepa de Penicillium Chrysogenum productora de Penicilina G de la divisin farmacutica SPIC, Kudikadu Village, Cuddalore, India, proporcionada en ampollas, a las que se les agreg 1 ml de agua estril en condiciones estriles. Se sembr 0,1 ml de la dilucin en placas LCSB (Lactose Corn Steep Broth) y se mantuvieron en incubacin durante 13 15 das. Se tom 1 mL de esta muestra y se prepararon diluciones seriadas hasta 10. La seleccin de colonias se bas en las siguientes caractersticas morfolgicas: color verde, 3-12 mm de dimetro, esporulacin uniforme, circular ligeramente alargado con centro levantados, margen blanco.

 Preparacin de la Suspensin F1:

La colonia seleccionada se diluy en 2 ml de agua estril, y se aadi la suspensin en un matraz cnico que contena 100 g de arroz. Se mantuvo durante 13 das en incubacin a 25 C con 60 a 65% de humedad relativa. Para la suspensin anterior, se aadieron 200 ml de Tween 60 0,05% (polisurbirato 60) y se mezcl.
A continuacin, la cepa fue recogida junto con Tween 60 por sedimentacin del arroz. El tensoactivo Tween 60 fue empleado para separar las esporas del arroz. Los 100 ml de esta suspensin se tomaron como la F1.

 Prueba de Viabilidad:

Se tom 1 mL de la suspensin F1 y se realiz diluciones seriadas hasta 10-6 en solucin Tween 60.
Se coloc en un medio de recuento de viabilidad y despus se incub a 25 C durante 5 das. Se realiz un recuento de colonias para analizar la actividad de las esporas. La suspension F1 que mostr un recuento de viabilidad de 1,5 a 2 x 108 clulas / mL fue tomada para la etapa F2. Las placas con recuento de viabilidad menor de 1,5 x 108 clulas / mL no fueron tomadas en cuenta, ya que el nmero de colonias en las placas reflejaran la actividad de la cepa.

 Medio de Siembra y Fermentacin: Los medios de siembra usados en este trabajo contienen harina de semilla de algodn 10 (g / l); polvo de maz remojado 20 (g / l); sacarosa 40 (g / l); sulfato de amonio 2 (g / l); KH2PO4 0,5 (g / l); CaCO3 5 (g / l); (pH 6,3) y se esteriliz a 121 C durante 15 min. Tras autoclavar a 121 C durante 15 min, el medio de siembra se inocul con 10 ml de inculo que contena 9x105 esporas por ml y el cultivo se incub en un agitador rotatorio a 25 C y 230 rpm durante 54 horas. Los Medios de fermentacin contenan la composicin siguiente de nutrientes: cido fenoxi actico 10 (g / l); sulfato de potasio 5 (g / l); KH2PO4 1,5 (g / l); sulfato de amonio 12 (g / l); polvo de maz remojado 27,5 (g / l); lactosa 120 (g / l); CaCO3 10 (g / l) y 10 ml de aceite de maz. El pH del medio se ajust a 6,5.

 Esterilizacin:

Las autoclaves verticales empleadas para la esterilizacin de medios fue de acero inoxidable y que pueden soportar una presin de hasta 22 psi, equipado con visualizador de temperatura y presin (Macro Scientific Works Pvt Ltd). Los matraces de los medios fueron cubiertor con algodn y papel aluminio, y se esterilizaron como lotes a diversos intervalos de tiempo: 25, 30, 35, 40, 45, 50 y 55 min a una presin constante de 22 psi.
Inoculacin y Fermentacin: Medios esterilizados (pH 6,5) en tres matraces batch fueron inoculados con 3 ml de inculo, bajo un flujo de aire laminar y se mantuvieron en incubadora de agitacin orbital (REMI Instruments) a 220 rpm durante 164 horas.

 Mediciones Analticas: Las muestras de los 3 lotes de matraces fueron examinados a los 41, 82, 123 y 164 minutos para analizar el nivel de actividad de la produccin de penicilina G, mediante RP-HPLC (Shimadzu Corporation). La columna utilizada en el anlisis fue C18-Hypersil Octadodecyl silano (longitud 25 cm, dimetro 0,46 cm). La fase mvil polar contena ortofosfato dihidrgeno de potasio y 45% de acetonitrilo (80:20) a pH 4,6 y la velocidad de flujo utilizada fue 1,4 ml / min.

En el caso de procedimientos de fermentacin estndar se utiliz metanol como fase mvil secundaria en lugar de acetonitrilo (60:40). El detector utilizado fue detector UV. El detector era de tipo fijo y la fuente luminosa era una lmpara D2 (deuterio).

RESULTADOS Y DISCUSIN:
En la fermentacin de la Penicilina, los medios se esterilizan a 121 C durante 30 min; pero en nuestro estudio, el medio se esteriliz a 121 C durante diversos intervalos de tiempo entre 25 y 55 minutos y el anlisis se realiz a varios intervalos de tiempo de fermentacin: 41, 82, 123 y 164 minutos, respectivamente. El anlisis incluy la deteccin de la produccin de penicilina G y utilizacin de precursor cido fenoxiactico (POAA) en los medios. Los medios esterilizados a 121 C durante 45 minutos han mostrado la mxima produccin de penicilina G y la utilizacin de POAA en todo momento (41, 82, 123 y 164 minutos) de anlisis. El anlisis se llev a cabo en HPLC y el pico de elucin para POAA se obtiene alrededor del tercer minuto y el pico de elucin para la Penicilina G alrededor del decimoquinto minuto.

 Anlisis al Minuto 41: El set de 5 lotes de fermentacin que contienen medios esterilizados a diferentes tiempos, se tom del agitador en el minuto 41 y se analiz el nivel de actividad de penicilina G y la cantidad de POAA no utilizado presente. El medio esterilizado 45 minutos muestra 9,63% ms actividad que el de 30 min (tiempo de esterilizacin habitual). Ms all de los 45 min de esterilizacin, hasta los 55 min, hay un descenso en la actividad. La actividad mostrada por el medio esterilizado 55 min era slo 32,39% en comparacin con la actividad del medio de 45 min. El contenido residual del precursor POAA fue mayor en el medio esterilizado 25 minutos, lo que decreci sostenidamente hasta el medio esterilizado 45 min. Los frascos esterilizados por encima de 45 minutos mostraron un aumento en la acumulacin de POAA. El medio esterilizado 45 minutos mostr 98.3% menos POAA acumulado al compararse con el POAA residual presente la fermentacin en medio esterilizado 55 minutos.

Tabla 1: Actividad de Penicilina y contenido residual de POAA en varios tiempos de esterilizacin tras 41 minutos de fermentacin
Tiempo de esterilizacin del medio (minutos) 25 30 35 40 45 50 55 Actividad de Penicilina (1/mL) 1021 1329 1406 1438 1457 911 472

S. No

POAA residual (mg/mL) 8.01 4.52 2.191 2.005 0.331 10.04 16.76

1 2 3 4 5 6 7

Cuadro 1: Actividad de Penicilina y contenido residual de POAA en varios tiempos de esterilizacin tras 41 minutos de fermentacin

 Anlisis al Minuto 82: El set de 5 viales donde se llev a cabo la fermentacin conteniendo medios con diferentes tiempos de esterilizacin fue retirado del agitador tras el minuto 82 y se analiz el nivel de actividad de Penicilina y la cantidad de POAA no utilizado. El medio esterilizado 45 minutos mostr 14,16% ms actividad que el medio esterilizado 30 minutos (tiempo usual de esterilizacin). Tras 45 de esterilizacin hasta 55 minutos se produjo una cada en la actividad de Penicilina G. La actividad mostrada por el medio esterilizado 55 minutos fue solo 32,74% al compararse con la actividad del medio 45 minutos. El contenido residual del precursor POAA fue mayor en el medio esterilizado 25 minutos, el cual fue disminuyendo sostenidamente hasta los 45 minutos. Los frascos esterilizados ms de 45 minutos mostraron un incremento en la acumulacin de POAA. El medio esterilizado 45 minutos mostr 87.24% menos POAA acumulado al compararse con el POAA residual presente en el medio esterilizado 55 minutos.

Tabla 2: Actividad de Penicilina y contenido residual de POAA en varios tiempos de esterilizacin tras 82 minutos de fermentacin
Tiempo de esterilizacin del medio (minutos) 25 30 35 40 45 50 55 Actividad de Penicilina (1/mL) 10682 14019 14883 15812 16004 9912 5178

S. No

POAA residual (mg/mL) 6.32 3.62 1.65 1.38 0.221 6.71 10.81

1 2 3 4 5 6 7

Cuadro 2: Actividad de Penicilina y contenido residual de POAA en varios tiempos de esterilizacin tras 82 minutos de fermentacin

 Anlisis al Minuto 123: El set de 5 matraces que contiene medios esterilizados a diferentes tiempos fueron tomados de agitador despus de minutos 123 y se analiz el nivel de actividad de la penicilina y la cantidad de POAA no utilizado presente. El medio esterilizado 45 minutos mostr una actividad de 5,332% ms que la actividad en 30 minutos (tiempo de esterilizacin habitual). Despus de 45 minutos hasta 55 minutos se da una cada en la actividad de penicilina G. La actividad mostrada por el medio esterilizado 55 minutos fue slo 24.74% al compararse con el medio de 45 minutos. El contenido residual de POAA fue ms en el medio esterilizado 25 minutos, lo que disminuy de manera constante hasta 45 minutos. Los frascos esterilizados ms de 45 minutos mostraron aumento en la acumulacin POAA. El medio esterilizado 45 minutos mostr 97,89% menos POAA acumulado, al compararse con el POAA residual presente en el medio esterilizado 55 minutos.

Tabla 3: Actividad de Penicilina y contenido residual de POAA en varios tiempos de esterilizacin tras 123 minutos de fermentacin
Tiempo de esterilizacin del medio (minutos) 25 30 35 40 45 50 55 Actividad de Penicilina (1/mL) 29081 37791 38934 39195 39806 19861 9851

S. No

POAA residual (mg/mL) 5.213 2.91 1.33 1.1 0.171 5.15 8.12

1 2 3 4 5 6 7

Cuadro 3: Actividad de Penicilina y contenido residual de POAA en varios tiempos de esterilizacin tras 123 minutos de fermentacin

 Anlisis al Minuto 164: El set de 5 frascos de fermentacin con medio esterilizado a diferentes tiempos fue retirado del agitador tras 164 minutos y se analiz los niveles de actividad de penicilina y la cantidad de POAA no utilizado. El medio esterilizado por 45 minutos mostr una actividad de 8.315% ms que la actividad a 30 minutos (tiempo usual). Tras 45 minutos, la esterilizacin prolongada hasta 55 minutos llev a un declive en la actividad. La actividad mostrada por el medio esterilizado 55 minutos fue solo de 26,24% al compararse con la actividad del medio esterilizado 45 minutos. El contenido residual de POAA fue mayor en el medio esterilizado 25 minutos, el cual disminuy sostenidamente hasta los 45 minutos. Los frascos esterilizados ms de 45 minutos mostraron un incremento en la acumulacin de POAA. El medio esterilizado 45 minutos mostr 97,74% menos POAA acumulado al compararlo con el POAA residual presente en el medio de 55 minutos. La mxima fermentacin de Penicilina G se obtuvo en el medio esterilizado 45 minutos, mientras que el medio esterilizado ms de 45 minutos mostr un declive en la fermentacin de Penicilina G.

Tabla 4: Actividad de Penicilina y contenido residual de POAA en varios tiempos de esterilizacin tras 164 minutos de fermentacin
Tiempo de esterilizacin del medio (minutos) 25 30 35 40 45 50 55 Actividad de Penicilina (1/mL) 35071 45291 48195 48954 49057 30672 12876

S. No

POAA residual (mg/mL) 4.21 2.32 1.05 0.91 0.14 4.02 6.21

1 2 3 4 5 6 7

Cuadro 4: Actividad de Penicilina y contenido residual de POAA en varios tiempos de esterilizacin tras 164 minutos de fermentacin

 A fin de mantener una correcta fermentacin, el medio debe estar libre de microorganismos antes de la inoculacin de P. chrysogenum. La esterilizacin con vapor es uno de los mejores mtodos para esterilizacin de medios en escala industrial.

El nmero y tipo de reacciones qumicas que pueden tener lugar en un medio de fermentacin durante la esterilizacin por calor son demasiado complejas para definirse. El perfil de temperatura y tiempo del proceso de esterilizacin podra, tericamente, afectar las concentraciones resultantes de componentes. Un excesivo tiempo de esterilizacin tambin tiene un impacto negativo en algunos casos de produccin; tambin pueden generarse productos inhibitorios o carbonizacin del medio, lo que lleva a reducir la formacin del producto de fermentacin.

 Los estudios demostraron que incrementar el tiempo de esterilizacin ha incrementado la produccin de Penicilina G en 30% hasta 30 minutos, y por encima de 30 minutos el incremento en el tiempo de esterilizacin no aument demasiado la produccin de Penicilina G aunque s hubo un pequeo incremento. Ms all, se observ que a pesar que la productividad de Penicilina G aument como efecto del incremento en el tiempo de esterilizacin, el costo involucrado en el incremento de la duracin del tiempo de esterilizacin fue mayor que el costo del producto. Por lo tanto, actualmente se est trabajando en un enfoque alternativo ms barato para aumentar la duracin del tiempo de esterilizacin sin afectar la calidad del producto y obtener mayores beneficios del proceso productivo de Penicilina G.