ncercrile de aplicare a diferitelor tehnologii transgenice la psri s-au confruntat cu o serie ntreag de dificulti, care deriv din deosebirile

biologice majore i, in primul rnd, de dezvoltare embrionar, dintre acestea mamifere. De exemplu, microinjectarea de ADN, in pronucleii masculi este o tentativ dificil, din mai multe considerente: la psri, mai muli spermatozoizi, pot penetra intr-un singur ovul n timpul fecundatiei, spre deosebire de mamifere, la care un ovul este fecundat de un singur spermatozoid; in consecint, este dificil s se identifice pronucleul mascul; care va fuziona cu pronucleul femel i care urmeaz s fie injectat cu ADN-ul exogen; tinnd cont de aceast realitate, incercarea de microinjectare a ADN-ului in citoplasma ovulului nu constituie o alternativ, deoarece transgena are anse minime s se integreze corect in genomul oului fecundat; microinjectarea de ADN este cu att mai dificil cu ct oul de pasre, dup fecundaie, acumuleaz mari cantitti de albumin, invelit, la rndul ei, de stratul intern al cojii calcaroase.

Cu toate aceste dificulti, este totui posibil s se injecteze o transgen n zona glbenuului oului (discului geminativ), ce conine pronucleul femel i mascul, deoarece aceast formaiune apare inaintea formrii cojii oului. Dup microinjectarea de ADN in regiunea discului gerrninativ, fiecare ou este cultivat in vitro pn in momentul in care se formeaza embrionul, iar apoi este introdus intrun ou surogat, pana la dezvoltarea complet a puiului.

Utiliznd aceast strategie, s-a obinut intradevr o linie de pui transgenici, dar, in ansamblu, metoda are o eficienta redusa i este prea dificila pentru a deveni o aplicaie de rutin in vederea obtinerii de psri transgenice.

Un alt demers experimental pentru crearea de psri (gini) transgenice, se bazeaza pe aplicarea si adaptarea metodei vectorilor retrovirali, practicata pe oarecii de laborator. n acest caz, s-a pornit de la constatarea c, in momentul in care membrana externa a cojii oului se intareste, embrionul aflat in curs de dezvoltare (in stadiul de blastula) este format din doua straturi, ce cuprind 40.000 - 80.000 celule. Inlocuind experimental unele din celulele blastodermice embrionare cu vectori retrovirali defectivi in replicare, purtatori de gene marker bacteriene, s-au obtinut in final pui ce poart transgenele in liniile lor germinative. Desi o bun parte din aceti pui nu au produs virui, utilizarea vectorilor retrovirali in scopul ameliorrii transgenice a unor produse aviene (carne, ou) ridic problema securitii consumului de asemenea produse de ctre om. In plus, dimensiunea transgenelor ce pot fi transferate prin vectori retrivirali este redusa (cca 8 kb) i frecvent, integrarea acestora in siturile tinta nu este permanent, ci temporara.

Tinnd cont de dezavantajele acestei metode, s-au cautat cai alternative pentru realizarea unei transgeneze eficiente la psrile domestice.
Astfel, dei pn in prezent nu au fost identificate celulele ES avian - specifice, metoda manipulrii celulelor ES fiind impracticabil pe aceste organisme, o metod bazat pe utilizarea celulelor embrionare de psri ar oferi posibiliti de transgenez care nu sunt neglijabile. Astfel, celulele embrionare pot fi izolate din blastoderm, transfectate cu complexe de ADN transgenic incorporate in lipozomi (globule lipidice cu caracter cationic) i apoi pot fi reintroduse in spaiul subgerminal embrionar din oule proaspt depuse. O parte din descendentii rezultati vor reprezenta aa - numitele "himere", fiind constituiti dintr-un mozaic de celule, dintre care unele provin din celulele blastodermice ale embrionului donator, iar altele din celulele embrionilor receptori.

Deoarece, in ginile himer, celulele ce descind din celulele embrionare transfectate pot deveni parte integrant a tesutului germinativ (formnd celule germinative), prin mai multe reprize de incruciri dintre exemplarele himerice se pot stabili in final linii transgenice de psri purttoare ale transgenei in toate celulele corpului.

Pentru ameliorarea randamentului metodei, proporia de celule transfectate (transgenice) din psrile himer poate fi mrit, prin iradierea embrionilor receptori cu doze reduse de radiatii (540 660 rad), inaintea inoculrii celulelor embrionare. Tratamentul radioactiv distruge doar parial celulele blastodermice din embrionul receptor, mrind astfel proporia relativ de celule transfectate in organismul care rezult. Interesul economic al obtinerii de psri (in special gini) transgenice, este multiplu, el viznd ameliorarea calittii raselor existente (creterea rezistentei la infectii virale i coccidiene, creterea eficienei hrnirii, scderea nivelului grsimilor i colesterolului in ou, creterea coninutului proteic al oulor, carne de calitate mai bun), dar i crearea de rase noi, cu caliti superioare. De asemenea, prin analogie cu glandele mamare ale mamiferelor, care pot exprima o serie de proteine umane in lapte, celulele tractului genital al psrilor care produc obinuit mari cantiti de ovalbumin) pot fi utilizate pentru exprimarea produselor unei transgene (proteine) in coaja olor. Ulterior, proteinele produse (ce pot avea uz farmacologic) pot fi relativ uor izolate i purificate din aceste veritabile "containere" naturale de acumulare, fiind disponibile consumului.

Exist numeroase aplicaii ale modificrilor genetice la psrile de curte, inclusiv n structurile proteinelor din ou (ovul), producnd transformri ale trsturilor psrilor de curte n urma reproducerii, i investignd genele implicate n dezvoltarea vertebratelor, aceti pui au devenit prin cretere un model folositor. Utilizarea sistemului de producere a proteinelor de gin la sinteza proteinelor pentru aplicaiile medicale/clinice este n discuie de ceva timp, dar dezvoltarea metodelor simple i eficiente ale modificrilor genetice la pui au devenit o provocare. Totui exist un numr de proteine terapeutice n dezvoltare, utilizate ca anticorpi n tratamentul cancerului i a altor boli. Scopul este de a produce gini transgenice, iar proteinele terapeutice s fie plasate n oul alb, astfel, ca ele s poat fi extrase i purificare. Diferenele majore dintre reproducerea la mamifere i cea la psri, precum i dezvoltarea embrionului de la psri sub coaja oului, face imposibil manipularea zigotului de pasre sau a embrionului proaspt format folosind metodele utilizate la mamifere, de exemplu microinjectarea ADN-ului. Prima metod de modificare genetic la pui, a fost utilizat n 1980, implicnd utilizarea de gene ale vectorilor de transfer derivai de la retrovirusurile puilor oncogenici. Aceti vectori au fost utilizai pentru a produce psri transgenice, dar frecvena foarte mic de obinere, precum i genele introduse, au fost nesemnificative. O nou clas de vectori virali au fost descoperii n ultimii ani, folosind viruii din grupul viruilor lenticulari. Aceti vectori prezint un potenial avantaj fa de vectorii oncogenici retrovirali, incluznd abilitatea de a infecta celulele care nu se divid. Avantajele aparente ale acestor noi vectori au fost testate i apoi utilizate pentru producerea de pui transgenici.

n programele fondate de Viragen Inc. n colaborare cu Oxford Biomedica PLC, s-a testat cu eficien ce psri transgenice pot fi produse utiliznd vectorii provenii de la viruii lenticulari ce produc anemia la cai (EIAV equine infectious anaemia virus). Virusul a fost injectat n embrionul puiului atunci cnd acesta se afl sub forma unui disc de aproximativ 60000 celule. Oule au fost clocite folosind metoda descoperit de Margaret Perry. n prima serie a experimentului au rezultat prin injectarea vectorilor virali coninnd gene, 12 masculi, ce prezentau la exterior trsturile provenite de la genele transmise de vectori. 10 dintre aceti cocoi au fost crescui pentru a se determina dac sunt psri transgenice. Toi cocoii transgenici au transmis vectorul viral n proporie de 4-45% la urmai. Frecvena producerii psrilor transgenice astfel, este de 10-100 de ori mai mare dect n cazul utilizrii altor vectori virali sau a altor metode de modificare genetic. S-a investigat a doua i a treia generaie de psri transgenice produse de vectorul viral EIAV. Psrile erau aparent normale i neafectate de gena transmis, dar oricare dintre ei era mpestriat cu proteina verde fluorescent (GFP).

Rezultatele acestui test preliminar sunt foarte ncurajatoare: faptul c liniile transgenice pot fi stabilite cu uurin mresc eficacitatea acestui test, iar studiile ce determin activitatea acestor gene pot indica anticipat, nivelul de activitate la care se poate ajunge. Scopul acestui program curent este de a produce proteine terapeutice din oule ginilor i necesit o structur specific de esut. Dezvoltarea unui astfel de sistem eficient va permite utilizarea i altor aplicaii n biotehnologie i n cercetarea de baz. Puii ce vor crete vor deveni un sistem model pentru studiile cu privire la dezvoltarea vertebratelor, mai ales c este mult mai uor de a folosi embrionul puiului n comparaie cu studiile realizate pe oareci. Succesiunea complet a genomului de pui, precum i utilizarea vectorilor provenii de la viruii lenticulari, pentru producerea de psri transgenice, dovedesc alte modaliti de a exploata numeroasele avantaje ale acestui sistem ce include puii.

In continuare am descris o metoda simpla si eficace pentru obtinerea de pasari transgenice. Au fost folositi vectori lentiviral pentru a obtine prepelite transgenice. Expresia proteinei GFP a fost specifica pentru neuronii si consecventa dupa mai multe generatii. Expresia a fost suficient pentru a permite vizualizarea de axoni individuali i dendritele neuronilor in vivo cu fluorescenta intrinsec GFP. Transgeneza s-a dovedit a fi una din cele mai puternice unelte ale biologiei moderne. Experimentele genetice care folosesc soareci, pesti, viemi si muste transgenice au revolutionat studiul dezvoltarii biologiei, neurobiologiei si imunologiei. Din pcate, uneltele transgenice raman indisponibile pentru cercetarea multor specii comune. n special, pasarile transgenice sunt greu de obtinut, cu toate ca au fost facute numeroase incercari mai bine de 25 de ani. Un obstacol major pentru manipularea genetica la pasari a fost dobandirea expresiei transgenei. ADN-ul strain poate fi introdus intr-un mod eficient in genomul avian prin infectarea embrionului tanar cu vectori retrovirali. S-au obtinut cu success pui transgenici folosind aceasta metoda generala. Oricum, la pasarile transgenice obtinute folosind vectori oncoretrovirali, ARNm si proteinele transgenice sunt prezente la un nivel scazut sau nedetectabil.

Alta clasa de retrovirusi, lentivirusii, este activa in timpul dezvoltarii embrionare. Soarecii si sobolanii transgenici obsinuti prin folosirea vectorului lentiviral arata o expresie transgenica stabila. Vectorii lentevirali au fost de asemenea folositi pentru a obtine porci si vite transgenice, si in principiu aceste cercetari ar trebui sa ajute in obtinerea de pasari transgenice. Intr-adevar, rezultate promitatoare au fost obtinute la pui prin folosirea virusului recombinat ce produce anemia la cai (equine infectious anemia virus (EIAV)), un tip de lintivirus. Puii transgenici au fost obtinuti astfel incat sa contina proteina GFP in anumite tesuturi; oricum modelul expresiei proteinei GFP a fost incompatibil cu activitatea asteptata a promotorului viral folosit. Recent, un alt studiu a folosit vectorii lentivirali pe structura HIV-1 prin care sa se obtina pui transgenici care a facut sa apara GFP sub controlul promotorului fosfoglicerolchinazei (PGK). Frecventa de transmitere a liniei embrionare la pui raportata in acest studiu a fost mai mica de 1%, in timp ce rata de transgeneza la soareci este de aproximativ 80%. Oricum, pentru a fi folositor, ar trebui aplicate doua lucruri: un sistem pentru producerea pasarilor transgenice care sa fie eficient si expresia genica care sa fie predictibila si controlabila prin secventa regulatoare a transgenei.

Pentru a testa daca vectorii lentivirali ar putea fi folositi pentru a determina expresia transgenei in special in neuroni, s-a folosit o secventa a promoterului de la gena sinapsei umane (Hsyn, human synapsin I gene). Vectorii lentevirali modificati ca sa contina Hsyn au fost introdusi in embrionii de prepelita japoneza. Aceasta metoda a dus la obtinerea de prepelite mozaicate cu proteina GFP exprimata la nivelul neuronilor si au transmis transgena progeniturilor, care a exprimat un inalt nivel al selectivitatii GFP in neuroni. La animalele transgenice axonii si dendritele neuronilor in curs de dezvoltare au fost usor detectati cu microscopul cu fluorescenta. Tehnica poate fi modificata pentru a fi folosita la alte specii de pasari si poate fi folosita pentru a schimba exprimarea genelor endogene. Pasarile sunt organisme model importante pentru multe probleme ale biologiei dar nu sunt folosite frecvent deoarece metodele efective de manipulare genetica la aceste animale nu exista. Obtinerea de vectori lentivitali. A fost obtinut un vector pentru neuronul specific al expresiei transgenice bazat pe FUGW, un vector lentiviral ce se inactiveaa singur derivate din HIV-1. A fost inlocuita regiunea promotoare C a FUGW cu o secventa regulatoare care se intinde de la 570 la 93 pb de la inceputul transcriptiei Hsyn. Produsul obtinut este numit HsynGW (Fig. 1). Virusul din cultura primara a fost experimentat pe cortexul de sobolan nou nascut si s-a confirmat ca expresia GFP in vitro este specifica neuronilor.

Obtinerea de prepelite transgenice. Ouale de prepelita japoneza (Coturnix coturnix japonica) au fost lasate in repaus timp de o ora inaintea injectarii pentru a permite embrionului sa se aseze la suprafata galbenusului. Coaja oualor a fost dezinfectata cu etanol 70%. Pentru a ajunge la embrion, a fost facut un orificiu de 4 pe 4 mm in varful oului cu o unealta de gaurit, si membrane cojii a fost indepartata cu penseta. Solutia cu vector viral HsynGW (107 particule nfectioase pe microlitru) a fost incarcata intr-un capilat de sticla (o.d. = 1 mm, i.d. = 0.75 mm) cu un varf crestat. Embrionii observati la un microscop care marea de 16 X si 3 l de solutie cu vector a fost injectat in cavitatea subgerminala sub embrion cu un system de injectie hidraulic. Pentru a permite vizualizarea locului injectiei a fost adaugat in solutie fenol rosu 5%. Injectiile ar fi considerate un success daca solutia virala s-ar intinde orizontal intr-un cerc sub embrion. Peste 90%dintre injectii au fost un success conform acestui citeriu. Dupa injectare ouale au fost izolate pentru a preveni contaminarea microbiana si pierderea de fluid in timpul incubatiei.

Fig. 1. Diagrama regiunilor relevante ale vectrului HsynGW folosit pentru a obtine prepelite transgenice.

Pentru a inchide coaja oualor, o husa de sticla a fost plasata peste deschiderea cojii si a fost atasata de ou cu un silicon compatibil. Ouale au fost puse intr-un incubator, cu o temperatura de 38C si umiditate relativa de 45% pana la eclozare si au fost rasucite periodic. Ouale au eclozat dupa 18 zile de la incubare si au fost tinute dupa aceea intr-un incubator. Dupa trei saptamani, puii de prepelita au fost pusi intr-o cusca pana au ajuns la varsta maturitatii sexuale la aproximativ 7 saptamani. Ouale de la prima generatie transgenica au fost colectate, puse in incubator si examinate in diferite stadii de dezvoltare. Embrionii au fost examinati atat la microscop cu lumina fluorescenta cat si confocal.

Analiza expresiei profilelor. AND-ul genomic a fost extras din sange. AND-ul a fost amestecat cu enzima de restrictie PstI la 37C. PstI a taiat in interiorul provirusului integrat intre LTR viral 5' si promotorul Hsyn (Fig. 1). Pata de hbridizare de jos a fost citita cu o proba de etichetare de ADN 32P in comparative cu secventa GFP. Pentru a examina expresia GFP, puii si prepelitele adulte au fost perfuzate transcardiac cu paraformaldehida 3 %. Creierele au fost taiate in sectiuni de 50 m cu microtomul. Sectiunile au fost marcate cu Hoechst 33258 timp de 5 minute la temperatura camerei, montate in 5-5 glicerol si examinate la microscopul fluorescent. Pentru a examina daca expresia GFP s-a limitat la neuroni, s-a efectuat o dubla imunocitochimie prin incubarea sectiunilor pe timpul noptii la 4C cu un anticorp policlonal anti-GFP de iepure (dilutie 1:1000) si anti-NeuN monoclonal de soarece (dilutie 1:500). Ambii anticorpi au fost diluati intr-o solutie de blocare care continea 0.1% triton X-100 si 10% ser normal de capra. In ziua urmatoare sectiunile au fost spalate cu PBS de trei ori timp de o ora fiecare si incubate cu un al doilea anticorp de iepure cu fluorescenta conjugata (Fl-1000) si un anticorp de soarece (Ti-2000) la temperature camerei timp de o ora in solutie blocanta. In final, sectiunile au fost spalate cu PBS de trei ori timp de o ora fiecare, montate in glycerol 50%, si examinate la microscop epifluorescent sau confocal fluorescent.

Producerea de prepelite hibride si transmiterea liniei embrionare a transgenelor. Prepelitele hibride au fost produse prin infectarea blastocistilor oualor neincubate cu vectorul lentiviral concentrat HsynGW. In acest stadiu, blastodiscul este un strat subtire format din 40000 celule. Au fost infectati 80 de embrioni prin aceasta metoda si din acestia 8 au eclozat si s-au dezvoltat adulti. Deoarece particulele acestui vector sunt prea mari pentru a difuza in intregime prin toate straturile blastodiscului, aceasta metoda infecteaza doar un procent din celulele embrionului. De aceea este de asteptat ca primele generatii de prepelite vor fi hibride din cauza prezentei transgenei. La animalele hibride expresia GFP a fost delimitata la sistemul nervos periferic si central. In sectiune prin creier se poate observa expresia GFP in celulele corpilor neuronali, axoni si dendrite. In special, ramificatiile dendritice si celulele Purkinje ale cerebelului si axonii celulelor proieminente din hipocampus au fost luminoase fluorescente. Desi celulele individuale au fost usor de distins, marea densitate de neuroni marcati au facut dificil de identificat procesele neuronilor individuali. Conform asteptarilor, doar un procent (aprox. 10%) din neuronii indivizilor hibrizi au fost GFP pozitivi. Pentru a examina rata de transmitere a transgenei la progenituri, au fost crescuti sase adulti (F0) hibrizi salbatici de prepelita. Progeniturile hibrizilor din F0 au fost examinate prin metoda Southern blot pentru a verifica prezenta transgenei. Rata de transmitere a liniei embrionare variaza intre 8% si 33%, in functie de prima generatie (rezultatele sunt in Tabelul 1). Un hibrid initial nu produce nici un urmas transgenic. Al saisprezecelea urmas transgenic gasit poarta o singura copie a transgenei (dupa estimarile prin metoda Southern blotting).

Fig. 3. Exprimarea proteinei GFP n a 6 zi embrionar la o prepeli transgenic. (A) Vizualizarea profilului proteinei GFP ntr-un embrion intact. Sgeata indic capul. Vrful de sgeat indic mduva spinrii. Fluorescena proteinei GFP din retin poate s se vad lprin intermediul pupilei. n acest stadiu ncepe s devin vizibile membrele care se dezvolt(*). (B) Fluorescena proteinei GFP n i mduva spinrii. (C) Combinnd vizualizarea fluorescenei i cmpul strlucitor al aceluiai embrion prezentat la B. (D) Seciune transversal la nivelul membrelor din fa. Vrful sgeii indic mduva spinrii. Sgeata indic un mnunchi de axoni ai neuronilor motori ce pot excita membrul aflat n dezvoltare. Semnalul observat n zona abdominal a embrionului este cauzat de semnalul de autofluorescen provenit de la piele(*). (E) Seciunea a trei ganglioni spinali (vrful de sgeat). O seciune scurt a mduvei spinrii ce cuprinde GFP este n partea stng jos a imaginii (sgeata). Neuronii spinali sunt evideniai prin fluorescena proteinei GFP (verde), iar nucleii celorlalte celule prin Hoechst 33258 (albastru).

Efectul modelului n generaiile transgenice F1 i F2. Proteina GFP a fost vizibil pentru prima dat la embrionii transgenici dup 60 de ore de incubaie. n acelai timp, GFP a fost vizibil n celulele somatice din mduva spinrii i diencefal. GFP a sporit constant datorit dezvoltrii ei de timpuriu. Dup 72 de ore de incubaie, GFP a fost prezent n axonii i drenditele celulelor din creier i mduva spinrii. Dup 4 zile de incubare, neuronii individuali din diencefal pot fi identificai (vedei Fig. 3 A i B). Utiliznd microscopul homofocal pentru embrionul intact aflat n acest stadiu, s-au evideniat axonii i corpii celulari ai neuronilor din diencefal (Fig. 3 B). n a 6 zi embrionar, creierul, mduva spinrii i sistemul nervos periferic prezint un puternic efect puternic al GFP (Fig. 2). Inervaia membrului aflat n dezvoltare a fost vizibil la embrionul viu (Fig. 2A) i n seciunea transversal (Fig. 2D). Ochii embrionilor transgenici au fost etichetai cu GFP (Fig. 3 C i D). GFP din retin a fost vizibil prin intermediul pupilei. n plus, axonii excitnd irisul i corneea determin formarea imaginii cu mai mult uurin la embrionul viu (Fig.3 C i D). Observaiile fcute pe modelul GFP de la prepeliele transgenice sunt asemntoare cu cele fcute n cazul genei I la embrionii puilor de gin. Un embrion purttor al unei copii de gen a fost evaluat prin tehnica Southern blot i nu s-a detectat nici urm de GFP. Un efect poziional poate fi responsabil de absena genei la acest animal, deoarece locul de integrare al genei pe cromozom poate avea efecte puternice asupra transcrierii genei.

Dou prepelie transgenice (F1) purttoare de inserii diferite au fost crescute pna la maturitate sexual. Aceste prepelie au fost mperecheate cu prepelie slbatice pentru a determina dac nivelele de expresie GFP i esuturile specifice s-au transmis la generaiile urmtoare. Urmaii au supui analizei Southern blot pentru a testa prezena genei, iar cu ajutorul microscopiei fluorescente verificat expresia GFP. Gena s-a perpetuat la urmaii F2 ntr-o proporie foarte apropiat de cea obinut n cazul succesiunii mendeleene la genele alele: 59%(n=17) i 62%(n=8) pentru fiecare printe n parte. Examinarea embrionului, juvenilului i adultului de prepeli, a evideniat expresia spaial i temporal a modelului GFP comparabil n generaiile transgenice F1 i F2. esuturile specifice de la ambele generaii F1 i F2 au fost examinate: pri de la embrionii din a 6 zi i pri de esut din creierele de juvenili i aduli de prepeli. Neuronii GFP-pozitivi au fost vizibili n creier, mduva spinrii i sistemul nervos periferic al animalelor transgenice, dar nu au putut fi controlai. Seciunile de la emisferele cerebrale, cerebel i tectumul optic au fost prelucrate prin imunohistochimie cu anticorpi impotriva GFP i NeuN, o protein nuclear specific pentru multe tipuri de neuroni maturi. Nicio protein GFP-pozitiv nu a fost observat n afara sistemului nervos central i sistemului nervos periferic. NeuN a fost observat n nucleul celulelor i citoplasma nuclear a celulelor din diencefal, cerebel i tectumul optic. Toate celulele NeuN-pozitive manifest GFP, i majoritatea celulelor GFP-pozitive sunt etichetate de NeuN (Fig. 4 A-C). Unele celule, cum ar fi neuronii Purkinje din cerebel, sunt GFP-pozitive, dar nu sunt NeuN-pozitive (Fig. 4D). Acest rezultat era de ateptat deoarece unele tipuri de celule, inclusiv neuronii Purkinje, nu prezint anticorpi NeuN. Oricum, celulele GFP-pozitive nu au fost etichetate cu NeuN, iar morfologia celulei indic faptul c celulele GFP sunt neuronii. Observaiile cum c celulele GFP au avut ntotdeauna o morfologie neuronal, au fost etichetate cu anticorpi NeuN, i s-au limitat la sistemul nervos demonstrnd c expresia de gen este caracteristic neuronilor.

n acest studiu s-a demonstrat c vectorii lentivirali pot fi utilizai cu eficien pentru a produce prepelie transgenice cu ajutorul genei GFP, la nivele nalte. Important, gena s-a manifestat selectiv n neuroni, un model ce st la baza activitii de transcriere a promotorilor sinaptici, utilizat n ingineria cu vectori. Realizarea de ncredere a unui model de expresie spaial i temporal al genei reprezint un pas critic n dezvoltarea tehnologiilor genetice la psri. Vectorul nostru conine dou elemente, noi spernd ca acestea s contribuie la expresia GFP n neuroni: la buna conservare a promotorului i la recombinarea viral a irei spinrii prin inginerie fr s interacioneze cu expresia genei.

Pentru promotorul nostru s-a ales o regiune de transcriere a elementului de la Hsyn, element ce se tie c produce un neuron cu o expresie specific in vitro. Dei omologul sinapsei aviare nu prezint o succesiune, regiunea promotorului pentru sinapsa genei I este foarte bine conservat la cteva specii de mamifere. n alt studiu, regiunea promotorului pentru fosfoglicerol kinaza a fost utilizat pn a condus la expresia omniprezent a puilor transgenici. n contrast, studiile anterioare cu psrile transgenice s-au bazat adesea pe promotorii virali, ca de exemplu promotorul SV40 i promotorul CMV. Este dificil s se exprime modelul expresiei acestor promotori deoarece nu exist nici o asemnare cu niciun promotor endogen tiut de la psri. Cnd vectorul lentiviral purttor al promotorului CMV a fost utilizat pentru a produce pui de gin transgenici, expresia genei a fost localizat n primul rnd n pancreas i mai puin n ficat, piele i mucoasa abdominal. n plus, nivelul expresiei genei n aceste esuturi a fost variabil ntre liniile diferitelor gene.

n plus, la promotor a utilizat coloana vertebral viral ce poate avea alte efecte asupra expresiei genei. Succesiunile virale ale retrovirusurilor provenite de la vectori pot influena expresia genei n dou moduri. Elementele oncoretrovirale i succesiunile asociate nu se manifest n timpul dezvoltrii de novo cu metilarea citozinelor reziduale. Metilarea stimuleaz formarea de heterocromatin, care blocheaz activitatea de transcriere din regiunea integrrii retrovirusurilor, determinnd rezultate slabe sau nivele nedetectabile ale expresiei genelor. LTRs retroviral conine promotori interni i amplificai, care pot interfera cu expresia genei n ambii vectori lentivirali i oncoretrovirali. Vectorul utilizat n studiu nostru a determinat minimalizarea activitii de transcriere a LTRs, i a artat c expresia genei esutului-specific este permis fr o dezvoltare calm. Astfel, vectorii lentivirali HIV-derivai sunt vectorii ce permit utilizarea expresiei genei n ambele cazuri: mamifere i psri transgenice. S-a ales folosirea prepelielor ca model de psri transgenice deoarece ele sunt foarte folosite n diferite studii dar i pentru o serie de motive practice. Prepeliele se cresc uor, necesit mai puin spaiu dect puii de gin, i se dezvolt mult mai rapid. Incubarea dureaz 18 zile, iar puii devin maturi din punct de vedere sexual dup 7 sptmni. Oule se obin uor de la fermele de prepelie prin intermediul potei fr a fi nevoie de a deine o cresctorie de prepelie pentru a obine oule necesare experimentelor. Utilizarea altor specii aviare necesit mai mult timp i spaiu pentru cretere. Deoarece asociaiile de embrioni aviari sunt bine conservai, nu se anticipeaz obstacole majore n obinerea de generaii transgenice la alte specii aviare, innd cont de experimentele anterioare fcute pe puii de gin.

Transgeneza cu vectorii virali se realizeaz pe baza unei analize moleculare a proceselor fiziologice ale psrilor la un nivel nalt pe care alte metode nu-l permit. Genele lentivirale pot fi utilizate s interfereze cu expresiile genelor normale n mai multe cazuri. Genele de interes pot fi utilizate pentru a modifica dezvoltarea sau funcionarea celulelor. Construciile dominant-negative pot fi introduse pentru a bloca funcionarea genei normale. Vectorii lentivirali purttori de scurte interferri de ARNs (si ARNs) pot regla endogenele mRNAs i la pot utiliza mpotriva genelor pentru care nu se cunosc construcii dominant-negative. Aceste mari manipulri determin ca genele lentivirale s reprezinte o unealt genetic pentru studierea proceselor biologice la psri.

Pentru experienele iniiale s-a ales un marker ce permite vizualizarea neuronilor individuali n dezvoltarea enbrionului. Utiliznd promotorul Hysn pentru a conduce gena GFP la neuronii prepeliei, este cu putin etichetarea celulelor individuale ncepnd dup 60 de ore de incubare. Dup 72 de ore GFP a difuzat i a etichetat dendritele i axonii neuronilor din cerebel i mduva spinrii. Deoarece aceti neuroni sunt bine etichetai i datorit vrstei timpurii la care expresia genei GFP se manifest, aceste psri vor fi utilizate pentru studiile in vivo de dezvoltare neuronal. Tendina de a obine oareci transgenice cu ajutorul expresiei GFP a neuronului, este valoroas pentru studiile in vivo de sinaptogenez i de dezvoltare a jonciunii neuromusculare. Cu toate acestea, descrierea dezvoltrii embrionare este dificil deoarece mama ar trebui ucis iar urmaii nu pot supravieui n afara pntecului mamei. Studiul dezvoltrii embrionare se realizeaz mult mai ur la psri dect la mamifere, deoarece embrionul aviar poate fi vizualizat i peste cteva ore , ba chiar i peste cteva zile, n coaj i n sisteme de culturi artificiale. Tehnicile curente in vivo de descriere a embrionilor de pui necesit injectarea de colorani sau de plasmide cu electropori, dar aceste tehnici agresive pot perturba dezvoltarea normal. Psrile transgenice pot oferi numeroase avantage n experimentele n care metodele celulelor etichetate nu pot fi utilizate.

Se anticipeaz c transgenele aviare pot fi folosite cu eficien pentru studiul comportrii neurobiologice. Experimentele cu genele transgenice, mutante, sunt extrem de valoroase pentru studiile moleculare de comportare instinctual pe msur ce este nvat i memorat. Oricum, pentru studiile de comportament, speciile aviare sunt organismele model preferate. Speciilor aviare le-au fost analizate amnunit, n libertate comportamentele, ca de exemplu: procurarea hranei, stabilirea locuinei, comunicarea. Transgeneza vectorilor lentivirali va necesita o analiz molecular precis a acestor comportri. n afara utilizrii n cercetarea tiinific, psrile transgenice au un rol important n aplicaiile comerciale, n special n producerea proteinelor terapeutice. Psrile transgenice obinute cu ajutorul vectorilor oncoretrovirali vor arta exprimarea la un nivel sczut al transgenelor n cazul oulor albe, abia ouate. Promotorul puilor de gin, albumiba din ou, a fost propus ca succesiune pentru a direciona expresia proteinei n ou. Utiliznd vectorii lentivirali ce conin albumina ca promotor, puii de gin transgenici pot fi utilizai n ingineria producerii la niveluri nalte a proteinilor transgenice n ou, devenind o surs important pentru obinerea de produse farmaceutice. n concluzie, s-a dezvoltat o metod de obinere a generaiilor de animale transgenice cu ajutorul expresiei de esuturi-specifice ntr-un grup de specii pentru care experimentele genetice anterioare nu au fost realizabile. Dei psrile au fost utilizate pentru studiile de dezvoltare i neurobiologie de-a lungul multor ani, n prezent aceste cercetri se realizeaz pe oareci (i alte animale la care experimentele genetice i moleculare sunt posibile). Oricum, pentru numeroase ntrebri din biologie, speciile aviare rmn organismele model alese. Se anticipeaz c transgeneza lentiviral va mbunti abilitatea noastr de a studia numeroase ntrebri i de a dezvolta genetica aviar.