Cintica enzimtica

Estudio cuantitativo de la catlisis enzimtica que proporciona informacin sobre las velocidades de reaccin, afinidad de las enzimas por su sustrato, mecanismos de reaccin y los inhibidores Aplicacin: - Mejor comprensin de las rutas metablicas - Diseo de tratamientos ms adecuados Velocidad de una reaccin bioqumica: Cambio de la concentracin de un reactante o un producto por unidad de tiempo

Variables que influyen en la velocidad de una reaccin enzimtica

1. Concentracin de sustrato 2. Concentracin de enzima 3. pH 4. Temperatura 5. Efectores (Activadores e Inhibidores)

La velocidad inicial Vo de la reaccin A P , donde A= Sustrato y P= Producto, es: - [A] t = [P] t Donde [A]= concentracin de sustrato [P]= concentracin del producto T= tiempo Es proporcional a la frecuencia con que las molculas reactantes forman el producto, la velocidad de reaccin es

Vo=

Vo=

K [A]x

Donde Vo= velocidad K= constante de velocidad (temp, pH, fuerza inica) X= orden de reaccin

Orden de una reaccin enzimtica

Orden de Reaccin: Suma de los componentes de los trminos de concentracin en la expresin de velocidad
Reaccin de Primer Orden: La velocidad es proporcional a la concentracin de sustrato Reaccin de Orden Cero: Independientemente de la concentracin de sustrato, la velocidad es constante

Cintica Michaelis-Menten
Modelo propuesto por Leonor Michaelis y Maud Menten en 1913 Donde:
K1= constante de velocidad de la formacin de ES

E+S

k1 K-1

ES

k2

E+P

K-1= constante de velocidad de la disociacin de ES K2= constante de velocidad de la formacin y liberacin del producto del lugar cataltico

Hiptesis del Estado Estacionario: establece que [ES] se mantiene casi constante durante gran parte de la reaccin

K1 [E][S]=K-1 [ES] + K2 [ES]

Cintica Michaelis-Menten
Inducen una nueva constante: Km (Constante de Michaelis) Km= K-1 + K2 K1 Ecuacin de Michaelis-Menten: Donde

Vmax s v Km s

Vmax= velocidad mxima Km= constante de Michaelis [S]= concentracin del sustrato

Efecto de la [S]
Representa la Ecuacin de Michaelis-Menten
Km (Constante de Michaelis): mide la concentracin del sustrato a la que la enzima tiene la mitad de la velocidad mxima (Vmx/2)

Vmx: Se alcanza cuando todos los centros catalticos de la enzima se encuentran ocupados por sustrato
Km y Vmax se determina midiendo las velocidades iniciales de reaccin a varias [S]

Cintica Michaelis-Menten. Limitantes

No todas las enzimas cumplen las condiciones (Enzimas alostricas) Difcilmente aplicable a reacciones con dos sustratos No se puede determinar con exactitud Vmax ni Km (Hiprbola rectangular, nunca llega a Vmax)

Unidades de actividad enzimtica

Unidades Internacionales (UI): Cantidad de enzima necesaria para producir 1 mol de producto/minuto Nueva Unidad: Katal Cantidad de enzima que transforma 1 mol de sustrato/segundo (6 x 107 UI)

Grado de Pureza: Actividad Especfica. Nmero de UI en 1 mg de protena

Ecuacin de Lineweaver-Burk
Consiste en representar la recproca de la ecuacin de MichaelisMenten

1 v0

KM V max

1 S

1 V max
Donde:
y = 1/Vo x = 1/[S]

Resultado: lnea recta Pendiente: Km/Vmax Corte en ordenada: 1/Vmax Corte en Abscisa (extrapolado): -1/Km

m = Km/Vmx b = 1/Vmx

Representacin de Lineweaver-Burk

Inhibicin enzimtica
Inhibidores: molculas que reducen la actividad de una enzima (frmacos, antibiticos, conservantes alimentarios, venenos) - Importante para regular las rutas metablicas - Tratamiento clnico Tipos de Inhibicin Enzimatica: Isostrica: Reversible (competitiva, acompetitiva y no competitiva) e Irreversible Alostrica

Inhibicin Competitiva

Representacin de dobles recprocos de una actividad enzimtica sin inhibir frente a un inhibidor competitivo

Representacin de MM de una actividad enzimtica sin inhibir frente a un inhibidor competitivo

Inhibicin Acompetitiva

Representacin de dobles recprocos de una actividad enzimtica sin inhibir frente a un inhibidor acompetitivo

Inhibicin no competitiva

Representacin de MM de una actividad enzimtica sin inhibir frente a un inhibidor no competitivo

Representacin de dobles recprocos de una actividad enzimtica sin inhibir frente a un inhibidor no competitivo

Inhibidores
Los inhibidores irreversibles reaccionan con un grupo qumico de la enzima, modificndola covalentemente, su accin no se describe por una constante de equilibrio Ki, sino por una constante de velocidad ki:

E+I

A diferencia de la inhibicin reversible, el efecto de los inhibidores irreversibles depende del tiempo de actuacin del inhibidor. Los inhibidores irreversibles son, por lo general, altamente txicos.
Algunos tipos de inhibidores irreversibles 1. Reactivos de grupos -SH 2. Organofosfricos 3. Ligandos de metales 4. Metales pesados

Sustratos suicidas: (Inhibidores activados enzimticamente)

E+I 1 EI 2 EI* 3 E + I*

1. El inhibidor se unen al centro activo de la enzima, de manera especfica, igual que el substrato o un inhibidor competitivo convencional

2. La accin cataltica de la enzima convierte al inhibidor I en una especie altamente reactiva I*

3. I* modifica covalentemente a la enzima, inactivndola de forma definitiva al igual que un inhibidor irreversible.

Tienen por tanto:

(a) la especificidad del inhibidor competitivo y (b) la potencia de los inhibidores irreversibles

Ejemplo: Sistema de la b-lactamasa bacteriana

La utilizacin masiva de antibiticos b-lactmicos (penicilinas, sus derivados semisintticos y cefalosporinas) ha conducido a la aparicin de resistencias a los mismos. Los microorganismos resistentes a estos antibiticos lo son por producir una enzima, la blactamasa, que inactiva a los antibiticos blactmicos.

Penicilina (activa)
R CO NH N O S CH3 CH3 COO-

b-Lactamasa
R CO NH O C HN OS CH3 CH3 COO-

c.peniciloico (inactivo)

Factores que afectan la actividad enzimtica

[E]

Temperatura

pH

Enzimas Alostricas
Caractersticas:
Tambin llamadas regulables, la actividad de la enzima se afecta por molculas efectores que se unen en otros lugares; sitios alostricos o regulables Catalizan pasos reguladores claves de las rutas bioqumicas La regulacin puede ser: - Activacin alostrica: enzima aumenta afinidad por el sustrato (disminuye su Km), as como su velocidad de catalisis - Inhibicin alosterica: efectores negativos.

Enzimas Alostricas
Caractersticas:
Cinticamente no sigue el comportamiento cataltico de MM Vo

- Grfica: curva sigmoidea o hiperblica

La presencia de una sigmoide implica la existencia de cooperatividad en la fijacin del substrato

[S]

Enzimas Alostricas
La cooperatividad (positiva) consiste en que la fijacin de una molcula de substrato favorece la fijacin del siguiente, y as hasta ocuparse toda la molcula

+
1

s s
2

s s s

+
3

s s s s

En trminos de Km veramos que Km1 > Km2 > Km3 Existe tambin cooperatividad negativa, cuando la fijacin de una molcula de substrato dificulta la fijacin del siguiente.

Modelos que tratan de explicar la cintica de las enzimas alostricas

1. Monad, Wyman y Chanqeux (MWC)
Forma R

s s

s s s i

s s s s i i i i

Forma T

i
2. Kosland, Nemethy y Filmes (KNF) 3. Eigen (Eig)

i i

i i

Los efectores alostricos operan sobre el grado de cooperatividad del sistema:

Inhibidores y activadores alostricos

Los inhibidores alostricos aumentan el grado de cooperatividad Los activadores alostricos disminuyen el grado de cooperatividad; a concentraciones elevadas de activador, la cintica pasa a ser michaeliana, y deja de ser sigmoide.

1.0

Y
Activador

0.8

0.6

Sin Inhibicin

0.4

Inhibidor
0.2

s
0.0 0 2 4 6 8 10 12

- Control Homoalostrico

- Control Heteroalostrico

Inhibicin Alostrica

Centro alostrico

Centro activo

Centro alostrico

Centro activo

s
En ausencia de inhibidor, el sustrato se fija normalmente al centro activo

Cuando el inhibidor ocupa el centro alostrico, tiene lugar un cambio conformacional en el centro activo que impide la fijacin del sustrato

Cintica de reacciones multiustrato

La mayora de las enzimas catalizan reacciones con dos o ms sustratos Varios mecanismos posibles - Orden de unin de los sustratos - Orden de liberacin de los productos Determinacin ms compleja que en las enzimas monosustrato - Para cada sustrato hay Km, Kcat y Vmax

Mecanismos principales de reacciones multiustrato

Mecanismo secuencial o de desplazamiento simple:

adicin de todos los sustratos para poder obtener los productos

Secuencial Ordenado

Secuencial Aleatorio

Mecanismos principales de reacciones multiustrato

Mecanismo de doble desplazamiento o ping pong:

no se han unidos todos los sustratos cuando ya hay salida de productos

Catlisis: Proceso en el que aumenta la velocidad a la que una reaccin se aproxima al equilibrio
Catlisis Covalente - Grupo reactivo que se une transitoriamente mediante enlace covalente Catlisis cido-Base - Molcula diferente de H2O acepta o cede protn

Catlisis por Iones Metlicos - Varias funciones, dependiendo de la reaccin

Catlisis por Aproximacin Catlisis por unin del Estado de Transicin

Quimotripsina: Dos Mecanismos Catalticos

Quimotripsina: proteasa que rompe enlaces peptdicos adyacentes a los aminocidos aromticos
Catlisis Covalente - Unin irreversible con el diisopropilfluorofosfato (DFP) - Actividad de residuo clave, Ser 195

Catlisis cido-Base - Otros dos elementos de triada cataltica - Asp 102 e His 57

Catlisis por Iones Metlicos

Aprox. 30% de las enzimas usan iones metlicos: - Metaloenzimas unidas fuertemente a metales de transicin: Fe2+, Fe3+, Cu2+, Zn2+, Mn2+ o Co3+ - Metaloenzimas unidad dbilmente a metales en solucin: Na+, K+, Mg2+ o Ca2+ Mecanismos: - Enlace con el sustrato para permitir su adecuada orientacin - Participacin del metal en mecanismos de oxidorreduccin - Estabilizador de la reaccin al atraer cargas negativas del sustrato

Catlisis por Proximidad y Orientacin

Observada en reacciones con varios sustratos - Reactantes se encuentran en relacin espacial ptima Proximidad: acercamiento simple de las molculas - Aumentos de velocidad de hasta 5x

Orientacin: acercamiento de los grupos

Catlisis por unin del Estado de Transicin

Uno de los mecanismos ms importantes

- Enzima tiene mayor afinidad por el estado de transicin que por los sustratos o productos
Conjuntamente con los dems, es responsable de los grandes aumentos de velocidad

Regulacin de la actividad enzimtica

Las rutas bioqumicas estn organizadas en reacciones qumicas catalizadas por enzimas, donde la regulacin se hace ms compleja Razones de la regulacin: - Mantenimiento de un estado ordenado

- Conservacin de la energa
- Respuestas a las variaciones ambientales

Se realiza: - Regulacin de la concentracin enzimtica - Regulacin de la actividad intrnseca de la enzima 1. Regulacin alostrica 2. Regulacin por modificacin covalente

Regulacin alostrica Procesos a nivel celular; regulacin de ajuste fino de la actividad enzimtica, a travs de efectos de retroalimentacin (negativa o positiva)

Regulacin por modificacin covalente Procesos a nivel supracelular (orgnico); regulacin a gran escala de actividades enzimticas, a travs de modificacin covalente de enzimas, provocadas por seales (transduccin de seales)

Regulacin alostrica Retroalimentacin Negativa en Vas Metablicas Sntesis de Isoleucina Thr Treonina desaminasa a-cetobutirato Ile

El producto final de la ruta, Isoleucina, inhibe a la primera enzima de la misma, Treonina desaminasa

Regulacin por modificacin covalente

Suele haber fenmenos de modificacin covalente de enzimas en la respuesta celular a seales qumicas:

1. Neurotransmisores
2. Hormonas

3. Factores de crecimiento
4. Estmulos morfogenticos y de diferenciacin 5. Muerte celular programada (apoptosis) 6. Estmulos antignicos 7. Luz y otros agentes fsico-qumicos

Regulacin por modificacin covalente

Defosforilacin: Protein fosfatasas
R CH N O C Ser HC H N C R' C H N H O CH2O P OOO H H2O Pi R CH N O C Ser H C H N C R' CH N H CH2OH O H

Fosforilacin: Protein kinasas

R CH ATP N H O C Ser H C CH2OH H N C O R' CH N H ADP R CH N H O O C Ser HC CH2O P OH N OC O R' C H N H

Sobre residuos previamente fosforilados: SerP, Thr-P, Tyr-P

Sobre residuos de Ser, Thr y Tyr

Adenilacin. Sistema de la Glutamina sintetasa

ADP-ribosilacin. Acta NAD+ como donador del grupo ADP-ribosa

H 2N N N N
R CH N H O C HC H N C O R' CH N H H2N O OH NH N C H NH2 + OH CH2 O P O P O CH2 O
-

Tyr

R CH N O C HC H N C H R' C N

H O CH2 O H OH O P OO CH2 O

N O O O O N N

OH

OH

OH

Isoenzimas
Son variantes de una misma enzima. Formas fsicamente distintas de una enzima pero que catalizan una misma reaccin Enzimas multimricas con varios tipos de subunidades - LDH: cuatro cadenas, tipos M y H - 5 isoenzimas diferentes - Preferencia por reacciones diferentes Permite ajustes sutiles en funcin cataltica, una enzima simple puede tener isoenzimas, ej: anhidrasa carbnica

Niveles enzimticos como ndices de enfermedad Enzimas Funcionales: Actan normalmente en las reacciones del metabolismo Enzimas No Funcionales: Aumentan sus niveles cuando hay dao tisular o orgnico

Niveles enzimticos como ndices de enfermedad

Enzima no Funcional a-amilasa Fosfatasa Alcalina Fosfataa cida Creatinfosfoquinasa (CKmb), Lactato Deshidrogenasa (LDH-H4), ahidroxibutirato DH Trasaminasa Glutmica Oxaloactico (TGO) Dao ocasionado Dao pancretico Obstruccin biliar, cncer de huesos Cncer de Prstata Infarto al miocardio Evala infarto Evala la Hepatitis

Trasaminasa Glutmica Pirvica (TGP)