Genetic Resources and Biotechnology Cenargen

Curso PCR em Tempo Real

Dr. Jlio Carlyle M. Rodrigues (Cenargen) XVIII MET Salvador, Outubro 2013

Introduo: Reao em Cadeia da Polimerase Mecanismo de replicao; Histrico; Princpios;

Aplicaes.

Replicao do DNA

Replicao do DNA
Mecanismo de reao da DNA polimerase

ataque nucleoflico OH/PO4;

cofatores: metais divalentes (Mg+2); energia: quebra de pirofosfato; pareamento posiciona dNTP corretamente

PCR: histrico
1953 Watson & Crick: estrutura (1962) 1957 Arthur Kornberg: replicao e descoberta da DNA polimerase (1959) 1959 Gobind Khorana: cdigo gentico, sntese de oligonucleotdeos (1968)

1969 Thomas D. Brock: isolamento da bactria Thermus aquaticus

1970 Isolamento do fragmento Klenow 1971 - "... one would hope to obtain two structures, each containing the full length of the template strand appropriately complexed with the primer. DNA polymerase will be added to complete the process of repair replication. Two molecules of the original duplex should result. The whole cycle could be repeated, there being added every time a fresh dose of the enzyme."

PCR: histrico
1976 Isolamento de DNA polimerase de T. aquaticus 1977 Frederick Sanger Sequenciamento (1980) Pesquisa em diagnstico Cetus Corporation, California Kary B. Mullis (1983) reao cclica para deteco da mutao de anemia falciforme (usou princpio de Sanger e teve a idia de colocar o 2nd primer); Cetus aplicou para patente em Maro, 1985, aprovada em 1987; Cetus purificao e utilizao da Taq polimerase, patente Junho 1987, aprovada em 1990; 1985 joint venture Cetus- Perkin Elmer: instrumentao; Kary B. Mullis Nobel 1993 Roche compra patente por US$ 300.000.000,00

Polymerase Chain Reaction

Polymerase Chain Reaction

Polymerase Chain Reaction

simplicidade; custo; diversidade de aplicaes; material biolgico limitante.

PCR: cuidados
Contaminao!!!!
Bancada, primers, reagentes, pipetas
preparar controles negativos/positivos;

sempre uma boa idia sequenciar produtos; desenho de primers fundamental: evitar hairpins, complementariedade (formao de dmeros). Programas: primer3 (http://fokker.wi.mit.edu/primer3/input.htm);

PCR: otimizao

MgCl2 - altas concentraes facilitam inespecificidade, tpico 1,5 mM;

dNTP alta concentrao aumenta erro, tpico 0,2 mM;

concentrao do molde: muito pode favorecer inespecifidade;

temperatura de anelamento do primer: ponto mais crtico, quanto mais alta mais especfico. Testar usando gradiente; tempo do ciclo: extenso - de acordo com tamanho do fragmento a ser amplificado (aprox. 1Kb/min)

Aplicaes: RT-PCR (Reverse Transcription)

anlise de expresso gnica;

isolamento de RNA (total ou poli-A+); sntese de cDNA (transcriptase reversa); PCR com primers especficos

Aplicaes: RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends)

obteno de cDNA full length; kits (Clontech/Invitrogen); extrao de RNA total; sintese de cDNA (oligo-dT); adio de adaptadores nas pontas;

PCR usando primers gene-especficos e primers especficos aos adaptadores;

derivao: genome walking elementos regulatrios (promotores)

Aplicaes: RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA)

detecta polimorfismos; utilizao de primers randmicos (6nt); gera marcadores moleculares; pode gerar SCAR (Sequence Characerized Amplified Region)

Aplicaes: PCR-based diagnostic assays

US$ 5,4 bilhes (2008)

Aplicaes: RT-PCR (Reverse Transcription)

Consideraes importantes
Qualidade do RNA (padronizar protocolo);
Remoo de DNA; Quantificao precisa (Nanodrop + gel); Genes de referncia: constitutivos/housekeeping; Controle negativo: sem template/reaes de cDNA sem TR; Controle positivo: gDNA

Aplicaes: RT-PCR (Reverse Transcription)

Genes de Referncia
controle de quantidade inicial de molde (evitar diferenas de

amplificao sejam devido quantidades iniciais diferentes): Normalizao mesmo nmero de cpias em todas as clulas; expresso em todas as clulas; Exemplos: gliceraldedo 3- fosfato desidrogenase; actina; tubulina; ubiquitina, genes ribossomais, etc.; Pode variar de acordo com tecido: TEM QUE TESTAR!!

Aplicaes: RT-PCR (Reverse Transcription)

Aplicaes: RT-PCR (Reverse Transcription)

Semi-quantitativo

anlise na fase exponencial do PCR; usar mesma quantidade de molde; montar vrios tubos da mesma reao; variar qtde de ciclos de cada reao; softwares de anlise de imagem (Image J)

Polymerase Chain Reaction

Pq PCR em tempo real? QUANTIFICAO

Mtodo de deteco de produtos de amplificao: SYBR Green

Vantagens: custo; sensibilidade; s liga a DNA fita dupla; no interfere na reao.

Desvantagens:

liga a qualquer DNA fita dupla (detecta produtos inespecficos)

Mtodo de deteco de produtos de amplificao: TaqMan probes

Vantagens:
especificidade; sensibilidade.

Desvantagem:
custo (uma sonda por reao)

Mtodo de deteco de produtos de amplificao

PCR em Tempo Real: quantificao de expresso gnica

vantagem quando o RNA limitante; muito mais sensvel que RT-PCR comum; fazer cDNA com kits comerciais, testar diluies (depende do nvel de expresso do gene); desenho de primers: amplicon pequeno (100 a 200 bp); Tm alto; muito cuidado com formao de dmeros! fazer amostras em triplicatas.

PCR em Tempo Real

PCR em Tempo Real: genes de referncia

controle de quantidade inicial de molde (evitar diferenas de

amplificao sejam devido quantidades iniciais diferentes): Normalizao mesmo nmero de cpias em todas as clulas;

expresso em todas as clulas;

repeties para ter mdia; Exemplos: gliceraldedo 3- fosfato desidrogenase; actina; tubulina; ubiquitina, genes ribossomais, etc.; Pode variar de acordo com tecido: TEM QUE TESTAR!!

Passo-a-passo
1) Extrao de RNA total
2) Sintese de cDNA same kit, standard and optimized protocol; 3) Gene de referncia; 4) Primer design parmetros, teste com RT-PCR convencional; 5) Curva de diluio eficincia , determinar diluio para experimento, curva de dissociao (especificidade); 6) Experimento triplicata 7) Anlise Delta-delta Ct 8) Data Fold change

Extrao de RNA total

time points controle rgido, padronizao de tratamentos; DNAse treatment controle, primers spanning introns;

integridade: gel - ribossomais;

quantificao: nanodrop e gel;

Gene de referncia

testar vrios; estabilidade, pouca variao (geNorm); experimento: pode usar mais de um para normalizao;

geNorm: determina estabilidade entre vrios genes testados, Calcula fator de normalizao - auxilia na escolha

Gene de referncia

PCR em Tempo Real: genes de referncia

meristema flor

raiz

Desenho de primers
parmetros: GC 40-50%, 18-22 nt, amplicon de 100-200bp cuidados: auto-complementariedade, dimerizao; Primer 3 software http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi/ teste com RT-PCR convencional; Determinar eficincia; Curva de diluio usar cDNA ou plasmdeo; determinar diluio para experimento; curva de dissociao (especificidade);

Desenho de primers Primer3

PCR em Tempo Real: correlao e eficincia dos primers

PCR em Tempo Real: correlao e eficincia dos primers

Eficincia: E = 10(-1/slope) 1

PCR em Tempo Real: curva de dissociao

Desnaturao e Temperatura em que fluorescncia some Depende de tamanho e sequncia: utilizado para genotipagem Mais de um pico: recomenda desenho de primers novos

PCR em Tempo Real: quantificao por curva padro

fazer curva padro atribuindo valores para cada ponto de diluio;

quantificar amostras desconhecidas na curva padro; correlao (r2) tem que ser alta e valores das amostras dentro da curva; normalizao com valores do gene de referncia; Quantificao absoluta: saber nmero de cpias, molculas, partculas virais

PCR em Tempo Real: quantificao por curva padro

PCR em Tempo Real: quantificao relativa mtodo DDCt

Ct(controle)- Ct(tratamento); assume eficincia de 100% para os dois pares de primers; precisa ser validado: curva padro; bastante utilizado, mas o Pfaffl corrige para eficincias diferentes.

PCR em Tempo Real: quantificao relativa formula de Pfaffl

PCR em Tempo Real: quantificao relativa mtodo DDCt

2Ct;
211.40 = 2702 pelo mtodo Pfaffl: 1901

Statistical analysis programs

REST (Relative Expression Software Tool) - rest.gene-quantification.info/ Corrige variaes do gene de referncia, entre placas, vrios genes de referncia

Statistical analysis programs

http://www.biotechniques.com/softlib/qgene.html

Q-gene

Aplicaes PCR em tempo real

Expresso gnica; Deteco de rastreabilidade; transgenes nmero de cpias,

Diagnstico presena/ausncia, genotipagem; microRNA expression; multiplex para deteco, diagnstico e expresso

PCR em Tempo Real: Aplicaes

Transgenic detection

PCR em Tempo Real: Aplicaes

Pathogen detection

Alterao da temperatura dos picos mostra fragmentos diferentes: genotipagem

PCR em Tempo Real: Aplicaes

Pathogen detection

Painel de primers e alvos:

presena/ausncia genotipagem

PCR em Tempo Real: Aplicaes

Pathogen detection

Deteco e anlise de expresso de microRNA

codificados por genes endgenos; 21-22 nucleotdeos; afetam expresso de genes-alvo: bloqueio/degradao de mRNA;

controlam vrios processos do desenvolvimento de plantas e animais;

deteco por gel de acrilamida; validao de high throughput small RNA data

PCR em Tempo Real: Aplicaes

microRNA expression

PCR em Tempo Real: Aplicaes

Transgenic detection

Anlise por Southern blot; Caro, time-consuming, mtodo radioativo; Real-time: anlise em high throughput;

Mtodo delta-delta Ct: gene endgeno com nmero de cpias conhecido;

Planta no transformada ou previamente caracterizada

PCR em Tempo Real: Aplicaes

Transgenic detection

Gene endgeno

Transgene

- Quantificao pode determinar nmero de cpias

Deteco de transgenes: Javdi et al. Euphytica (2010) 173:185191

Taqman probe

1) Curva padro
Adicionar plasmideo equivalente de acordo com tamanho do genoma;

Usar DNA de planta no transformada;

Deteco de transgenes: Javdi et al. Euphytica (2010) 173:185191

2) Curva padro: reao multiplex gene endgeno e transgene;

TPS uma cpia por genoma;

Delta Delta Ct

Deteco de transgenes: Javdi et al. Euphytica (2010) 173:185191

Homozigose valores pequenos negativos, Hemizigose - valores positivos pequenos, No transgnico valores altos negativos

Real-Time PCR Technology for Cancer Diagnostics

Mtodo: Taqman probes

Alvo: Protena p53

PCR em Tempo Real: Aplicaes

High Resolution Melting (HRM) analysis: Genotyping

PCR em Tempo Real: Aplicaes

High Resolution Melting (HRM) analysis: Genotyping

Deteco de SNP HTR2A Fibrose Cstica

Simultaneous detection of Brazilian isolates of grapevine viruses by TaqMan real-time RT-PCR. Dubiela et al, Trop Plant Path 38(2). 2013

Taq probes and primer sets

Simultaneous detection of Brazilian isolates of grapevine viruses by TaqMan real-time RT-PCR. Dubiela et al, Trop Plant Path 38(2). 2013

Variabilidade gentica dificulta deteco e diagnstico Desenvolvimento de tcnica para detectar isolados virais brasileiros Metodologia Infeco controlada com amostras controle; Sondas: alinhamento e deteco de regies conservadas;

Extrao de RNA total;

Real time

Simultaneous detection of Brazilian isolates of grapevine viruses by TaqMan real-time RT-PCR. Dubiela et al, Trop Plant Path 38(2). 2013 96-well plates using the kit TaqMan Master Mix One-Step RT-PCR (Applied Biosystems): 6.1 L of the One-Step RT-PCR Master Mix (containing AmpliTaq Gold DNA polymerase, dNTPs, a passive reference ROX and optimized buffer); 0.6 L of the mixture of primers and probe(s) (415 nM primer and 85 nM probe); 0.3 L of MuLV reverse transcriptase and RNAse inhibitor and 3 L of total RNA (ca. 300 ng) to a final volume of 12 L.

Thermocycler StepOnePlus Real-time PCR System (Applied Biosystems) : 45C for 35 min (for reverse transcription), 95C for 10 min (activation of AmpliTaq Gold), followed by 40 cycles at 95C for 15 s (denaturation) and 60C for 1 min (annealing and extension).
Presence/absence assays by determining the CT (threshold cycle). It was established that a CT value below 35 indicates a positive result. To check the efficiency and reproducibility of reactions resulting from the use of primers and probes, virus-infected control samples and samples with unknown phytosanitary status were analyzed in simplex reactions for all ten viruses evaluated.

Simultaneous detection of Brazilian isolates of grapevine viruses by TaqMan real-time RT-PCR. Dubiela et al, Trop Plant Path 38(2). 2013

Grapevine leafroll-associated virus (GLRaV-1, -2, -3 and -5), Grapevine virus A (GVA), Grapevine virus B (GVB), Grapevine virus D (GVD), Grapevine rupestris stem pittingassociated virus (GRSPaV), Grapevine fleck virus (GFkV) Grapevine fanleaf virus (GFLV)

Simultaneous detection of Brazilian isolates of grapevine viruses by TaqMan real-time RT-PCR. Dubiela et al, Trop Plant Path 38(2). 2013

Duplex deteco de dois isolados virais

Anlise de 6 sets de primers para deteco de 4 isolados. Qual par funcionou melhor?

Thanks for Your Attention!

Julio Carlyle, PhD Assessor CHPD Biotecnologia

Embrapa Genetic Resources and Biotechnology

julio.carlyle@embrapa.br