Enero 2014

INHIBIDOR DE CALPANA MDL28170 INDUCE LA EXPRESIN DE MARCADORES DE APOPTOSIS EN PROMASTIGOTES DE Leishmania amazonensis
Fernanda A. Marinho, Keyla C.S. Goncalves, Simone S.C, et al

Dra. mbar Suarez

 Leishmania amazonensis se asocia con todas las formas clnicas de la enfermedad, que incluye la leishmaniasis cutnea localizada, mucocutnea y difusa Se encuentra en la regin amaznica, de pases de Amrica Latina

AMASTIGOTE: Sin flagelo, intracelular e inmvil, se encuentra parasitando clulas del Sistema Retculo Histiocitario PROMASTIGOTE: Extracelular, flagelada mvil en el tubo digestivo del vector y medios de cultivo

Segn la OMS, la leishmaniasis cutnea y visceral se incluyen en la lista de las enfermedades tropicales desatendidas ser satisfactoria:

El tratamiento de la leishmaniasis est lejos de Aumentos en resistencia a los medicamentos

y recadas (antimoniales pentavalentes, anfotericina B, pentamidina)

Toxicidad Desarrollo de nuevos frmacos leishmanicida

Las calpanas son tiolproteasas, no lisosomales, cuya actividad, es dependiente de calcio. Son enzimas responsables de la protelisis La proteolisis mediada por la calpana representa una va importante de la modificacin post-traduccional que influye en muchos aspectos de la fisiologa celular, (adhesin, la migracin, la proliferacin y apoptosis) Inhibidores de calpana (neuroprotector) En estudios anteriores, se demostr que MDL28170 (aldehdo de dipeptidil), inhibidor de calpana reduce la viabilidad de L.amazonensis

Inhibidor MDL28170 calpana en L.amazonensis y T.cruzi promovi alteraciones celulares y redujo el crecimiento de las formas proliferativas de ambos parsitos en una forma dependiente de la dosis MDL28170 actu en contra de todas las etapas morfolgicas encontradas en T. cruzi, sin mostrar ningn efecto citotxico en el husped En L.amazonensis, se identifico en la superficie del parasito una protena calpana (80kDa), utilizando un anticuerpo anti-calpana desarrollado contra D.melanogaster calpana, y sin reactividad cruzada

Investigar el mecanismo de la va de la muerte inducida por el inhibidor de calpana MDL28170 en Leishmania amazonensis formas promastigotes

El uso combinado de diferentes tcnicas

Ensayo de inhibicin de la multiplicacin

Cultivados a 28C Medio de Schneider 10% de suero inactivado por calor fetal bovino (FBS) y gentamicina (40 mg / ml).

Promastigotes de L.amazonensis (MHOM/BR/75Josefa)

Cortaron y resuspendieron en medio fresco 106 /ml (viables) IC50 Control MDL28170 [10-30 mM]
Cmara de Neubauer Incubacion 72 h

Ensayo de viabilidad de parasito Colorante resazurina / AlamarBlue (7-hidroxi-3H-fenoxazin-3-ona 10-xido) Es un indicador de potencial redox Fluorescente y colorimtrico en las clulas metablicamente activas
Resazurina 0,0125% 4 horas (control, IC50 y 2xIC50) Grupo control +: Azida de sodio

Promastigotes 5x105 cel/placa

espectrofluormetro SpectraMax

Estimacin del potencial transmembrana mitocondrial elctrico (m)

Fluorocromo JC-1
(Colorante vital lipoflico catinico mitocondrial, se concentra en respuesta a m

[bajas 530 nm] verde

Indicador de energa
mitocondrial (leishmania)

[altas 590 nm] Agregados: Rojo

Control MDL28170

2 107 parsitos con 10 mg/ml de JC-1 (40min)

Lecturas c/min SpectraMax

Control positivo de la despolarizacin de la membrana mitocondrial

Incubaron: FCCP (carbonil cianuro de 4 - (trifluorometoxi) fenilhidrazona

Anlisis ultraestructural
Control MDL28170 IC50 MDL28170 2xIC50 Promastigotes se fijaron durante la noche a 4 C
(2,5% de glutaraldehdo en 0,1 M de tampn de cacodilato, pH 7,2)

Modificaciones ultraestructurales por microscopa electrnica de transmisin

Post-fijaron (1% OSO 4 , 0,8% ferrocianuro de potasio y 5 mM CaCl 2 durante 1 h a temperatura

ambiente)

Se deshidrataron en acetona graduada Se tieron con acetato de uranilo y citrato de plomo y se observaron utilizando un FEI Morgagni F 268

Superficie de unin de Anexina-V

Anexina-V, proteina Ca-dependiente de unin a fosfolpidos con afinidad por fosfatidilserina (PS) La translocacin de (PS) desde el lado interior de la capa externa de la membrana plasmtica, ocurre en apoptosis en los sistemas eucariotas (perdida de integridad de la membrana) Permite la discriminacin entre las clulas apoptticas (anexina-V-positivo)
Anexina-V tampn de unin Anexina-V conjugada con Alexa-Fluor

Incubaron promatigotes (control y con inhibidor) 72h

Centrifugadas Lavadas PBS Ph 7,2

Incub por 20 min en la oscuridad 2025 C

Control positivo: Miltefosina, un inductor de la apoptosis establecido en L. amazonensis (40 m/24 h)

Anlisis de progresin del ciclo celular

La fragmentacin del ADN en clulas apoptticas se traduce en una baja intensidad de fluorescencia (fase sub-G0 / G1)
Las clulas se fijaron en metanol fro y se incubaron durante la noche a -20 C. Anlisis por citometria de flujo Control positivo: Miltefosina (40 m/24 h)

Promatigotes (control y con inhibidor) 72h

Resuspendieron en 0,5 ml de PI (100 mg / ml en PBS) con RNasa A (248 U / ml), por 20 min en la oscuridad a temperatura ambiente

\
En situ deteccin de la fragmentacin del ADN de los promastigotes
Deoxynucleotidyltranferase (TdT) mediada por dUTP (kit TUNEL) Unin BrdU-TdT mide fragmentacin

Apoptosis

Ensayo de fragmentacin de ADN mediante electroforesis en gel de agarosa

Electroforesis en gel de agarosa de ADN genmico total (Invitrogen) Grupo control, IC50, 2xIC50 y miltefosina

 Los datos fueron analizados estadsticamente mediante ANOVA de una va utilizando software informtico GraphPad Prism

Efecto del inhibidor de calpana MDL28170

MDL28170 detuvo el crecimiento dosis dependiente

Incubacin de 72 hrs
La dosis CI50 es 15 mM Todos los valores fueron estadsticamente significativos(p= 0,0001)

Figura 1A. Efectos de la MDL28170 inhibidor de la calpana en el crecimiento de promastigotes L.amazonensis, la viabilidad y la funcin mitocondrial

Efecto del inhibidor de calpana MDL28170 en la viabilidad Gran reduccin de resazurina con MDL28170 Perdida de viabilidad dependiente de la concetracion Grupo tratados con azida de sodio para obtener clulas no viables P= 0,05
Figura 1B. Efectos de la MDL28170 inhibidor de la calpana en el crecimiento de promastigotes L.amazonensis, la viabilidad y la funcin mitocondrial

La incubacin con JC-1 Grupo tratadas con el inhibidor de la calpana 2xIC50 tenan una reduccin significativa de Prdida de la viabilidad del parsito, as como la despolarizacin de la m membrana mitocondrial La comparacin de los valores a los 40 min con la adicin del desacoplador FCCP, se derrumba m
Figura 1D. Efectos de la MDL28170 inhibidor de la calpana en el crecimiento de promastigotes L.amazonensis, la viabilidad y la funcin mitocondrial

Control (A-C), el cuerpo alargado y el flagelo emergente MDL28170 durante 72 h caus acortamiento del cuerpo parsito (E-H, J) y de la flagelo, protrusiones de membrana y ruffling de la membrana plasmtica (*)

Clulas con forma extraa (D, K-M) y la agregacin de las clulas (i)
Figura 2. Microscopa electrnica de barrido de promastigotes de L.amazonensis despus del tratamiento con MDL28170

 Vacuolizacin intensa en el citoplasma (B-C) Desorganizacin de la va endoctica (distendido) Cuerpos multivesiculares Muerte y apoptosis celular Ruptura del ncleo (F) Mitocondria normal en el grupo control

Figura 3. Microscopa electrnica de transmisin de promastigotes de L.amazonensis despus del tratamiento con MDL28170

 Promastigotes positivos slo para Anexina-V fue 4,98% y 22,11% 2xIC 50 (etapa temprana) 4,61% y 31,62%, que est relacionada con eventos tardos de la apoptosis y/o necrosis

Miltefosina 81,8% apoptosis tardia

Figura 4. Superficie de unin de Anexina-V en promastigotes de L.amazonensis tratados con MDL28170

Ciclo celular
Aumento significativo en la proporcin de clulas en fase el sub-G0/G1 Inducir la detencin del ciclo celular

Apoya hiptesis de MDL28170 inhibe la viabilidad de Leishmania

Figura 5. Aumento de la sub G0/G1 contiene ADN poblacin promastigotes de L.amazonensis despus MDL28170

Figura 6. Anlisis de fragmentacin del ADN en tratados con MDL28170 promastigotes de L.amazonensis

Aumento en el nmero de clulas teidas por anticuerpos anti-BrdU. Fragmentacin de ADN 2xIC 50 de dosis y miltefosina( Figura 6B ), se observ la fragmentacin del ADN en mltiplos de 200 pares de bases

 La apoptosis se considera una caracterstica de los organismos multicelulares, una forma de muerte celular programada Los resultados presentados en el presente trabajo plante la cuestin de si calpainas deben ser el principal objetivo de MDL28170 contra el parsito MDL28170 es especifico para calpaina, sin embargo puede acta sobre otras peptidasas de cistena (catepsinas B) Sigue siendo posible que una cistena peptidasa distinta de la calpana, este implicada en la expresin de marcadores apoptticos detectados en el parsito

 Actividad leishmanicida de MDL28170, se hizo importante para estudiar el mecanismo de accin de este inhibidor de calpana

Uso de tcnicas combinadas: Ensayo de resazurina JC-1 tincin Microscopa electrnica Etiquetado Anexina-V Ensayo de TUNEL Electroforesis en gel de agarosa

 Los datos presentados en el presente estudio sugieren que MDL28170 induce la expresin de marcadores de apoptosis en promastigotes de L.amazonensis Proporcionan un fundamento para la exploracin adicional del mecanismo de accin de los inhibidores de calpana contra tripanosomtidos Pueden ampliar la investigacin de la potencial utilidad clnica de los inhibidores de la calpana en la quimioterapia de la leishmaniasis

Gracias