Cromatografia Liquida - CLAE

O que Cromatografia ?
Definio:
A cromatografia uma tcnica de separao

na qual os componentes a serem separados de uma mistura migram entre duas fases sendo uma fase mvel e a outra estacionria.

A natureza qumica e fsica dos componentes

da mistura definem o grau de afinidade entre as duas fases, acontecendo o fenmeno de migrao diferencial .

O que Cromatografia a Lquido HPLC? Definio:

Na tcnica de cromatografia a lquido a

fase mvel um lquido e a fase estacionria um slido .

O processo cromatogrfico acontece na

fase lquida , sendo que os componentes da amostras devem estar dissolvidos.

Instrumentao para HPLC

CLAE -HPLC
Fase mvel
(amostra)

Fase estacionria
(Componentes retidos)

Migraes diferenciais
Analitomov

Analitoest

K = Analitoest / Analitomov= coeficiente de partio

INSTRUMENTAO
MIXER

detector injector pump column oven

Fase mvel

One pump used to control 4 reservoirs; mixing is done before pump.

data processor

Instrumentao para HPLC

FM
COLUNA

DETECTOR
INJETOR PURGA

BOMBA

Componentes de um Cromatgrafo a Lquido HPLC

Um cromatgrafo a lquido composto de 3 partes principais : Injetor : o dispositivo que tem a funo de introduzir a amostra na fase mvel ; Coluna cromatografia : o dispositivo que tem a funo de separar os componentes da amostra ; Detector : o dispositivo que tem a funo de detectar os componentes eludos da coluna cromatogrficas

Componentes auxiliares de um HPLC

Bomba :
o dispositivo que bombeia e controla o

fluxo e a presso da fase mvel ( solvente ); composta de um ou mais pisto acoplados a um sistema de vlvulas. Fornece uma alta presso.

BOMBA
- Fluxo deve ser constante (0,01-10 mL/min)
- Opes: Simples, gradiente binrio, quaternrio

- Mede a presso sobre o sistema

- Manuteno preventiva (selos, pistes, check valves, etc.)

Componentes auxiliares de um HPLC

Vlvula de purga:
o dispositivo que permite a troca rpida de

solvente desviando o fluxo de solvente para o dreno. Misturador:

o dispositivo que homogeneza a mistura de

solventes quando operando com gradiente de eluio .

Fase estacionria

Colunas Cromatogrficas
Fases estacionrias :

Slica- C8 Slica- C18 Slica- C18 ( ODS) Slica- NH2 Slica- Diol Slica Troca Inica Resinas DVB-ST Sulfonadas Ca Resinas DVB-ST porosas

Pr-Coluna:
o uma pequena coluna instalada a montante

da coluna analtica .
Tem como objetivo reter slidos e em muitos

casos reter materiais que por reaes qumicas podem precipitar sobre a fase estacionria.

COLUNAS CROMATOGRFICAS

SLICA (suporte + usado):

- Resistncia mecnica - Variedade de forma, tamanho de partculas e poros - Instabilidade frente a fases mveis cidas ou bsicas - Superfcie no homognea

SLICA GRUPOS SILANIS

OH Si HO Si OH

OH Si

OH Si

LIVRES

GEMINAL

VICINAIS

influenciam no grau de acidez da slica

Fase Estacionria
A fase estacionria mais utilizada

composta de partculas microporosas de slica.

So permeveis ao solvente e

possuem uma rea superficial de varias centenas de metros por gramas.

No

deve ser utilizada em sistemas com pH acima de 8,0.

MODIFICAO SUPERFICIAL

- QUIMICAMENTE LIGADAS

- HBRIDAS
- RECOBERTAS COM POLMEROS ORGNICOS

Fases Quimicamente Ligadas

C8
C18 (ODS) forte amostra fraca amostra mdia

amostra
C4

RECOBRIMENTO COM POLMEROS

-RESISTNCIA MECNICA DA MATRIZ INORGNICA - SELETIVIDADE E INRCIA QUMICA DOS POLMEROS ORGNICOS

- Maior recobrimento dos stios ativos do suporte - Maior seletividade (natureza e quantidade dos grupos funcionais nas cadeias dos polmeros, espessura dos filmes, rea superficial e estrutura de poros do suporte)
Poli(etileno) Poli(butadieno) Poli(estireno) Poli(dimetilsiloxano) Poli(metiloctilsiloxano) Poli(metiloctadecilsiloxano) Politeres Polissacardeos Poliaminas Polinucleotdeos Poliamidas Protenas

Slica Zircnia Titnia Alumina

PRINCPIOS DE SEPARAO

INTERAO DO SOLUTO NAS 2 FASES (EQUILBRIO) INTERAES DE VAN DER VALLS

LIGAES DE HIDROGNIO

INTERAES DIPOLO-DIPOLO
ATRAO ELETROSTTICA

Fases estacionrias
Si

Interaes
van der Waals

C8
Si

PH

van der Waals

Si

C2

van der Waals

Fase Estacionria
Fases estacionrias
O

Interaes
Dipolo/Dipolo

CN

Si

NH2

Si

N H

H O

Ligao de hidrognio

Si

O O O H

2OH

H
H O

Ligao de hidrognio

Fase Estacionria
Fases estacionrias PRS
Si H3+N SO3

Interaes
Eletrosttica

CBA
Si

H3+N

Eletrosttica
O-

SAX

-O S 3 Si N+(CH 3)3

Eletrosttica

Processo de Eluio
Definio:
Pode ser descrita como deslocamento do soluto na

fase estacionria. Srie eluotrpica

Ordena os solventes de acordo com suas habilidades relativas de deslocar soluto de um dado adsorvente.

Fora eluente:

uma medida da energia de adsoro do solvente

Cromatografia com fase normal:

Utiliza uma fase estacionria polar e um solvente menos polar.

Cromatografia com fase reversa:

Utiliza uma fase estacionria apolar ou fracamente

polar e um solvente polar.

DETECTORES - Classificao
Dispositivos que geram um sinal eltrico proporcional quantidade eluda de um analito

UNIVERSAIS:
Geram sinal para qualquer substncia eluda.

SELETIVOS:
Detectam apenas substncias com determinada propriedade fsico-qumica.

DETECTORES
POLARMETRO

UV

MS

IR

ELETROQUMICO FLUORESCNCIA

Detectores Ultra violeta:

mais comum, usado na

CLAE.
Porque muitos solutos

absorvem a luz ultravioleta.

So bons para a eluio

por gradiente com solventes no-absorventes.

Ultra violeta (UV-visvel):

Princpio: Absoro de luz ultravioleta ou visvel pela amostra, quando nela passa radiao eletromagntica.

- Seletivo (molculas com cromforos) - Comprimento de onda () fixo - pode ser selecionado (190 600 nm) - Varredura (DAD) - Solventes tambm absorvem

nm 190 gua 210 MeOH 200 ACN 330 Acetona 200 Hexano Clorofrmio 245 215 THF
Solvente

Fluorescncia:
Princpio: Emisso de energia fluorescente de um soluto que foi excitado por radiao UV

- Seletivo (molculas que fluorescem) - Exemplo: Aromticos policclicos e duplas ligaes conjugadas - Mais sensvel que UV por ser emisso - Podem ser feitas reaes de derivao pr ou ps-coluna para que o analito se torne fluorescente.

- Reagentes de derivatizao comuns: fluorescamina e cloreto de dansila

Detectores por ndice de Refrao:

Indice de refrao:
Princpio: Mede a diferena no ndice de refrao da fase mvel e do eluente vindo da coluna

- No- seletivo - Sensvel a variaes de: - Temperatura - Presso - Fluxo - Composio fase mvel - Baixa sensibilidade e difcil de estabilizar - Muito usado em cromatografia preparativa

Espectrometria de massas:
Princpio: Determinao da massa de solutos atravs da ionizao e determinao da relao massa-carga (m/z)

- Destrutivo

- Pode ser extremamente seletivo (SIM e massas tandem MS/MS)

- Interfaces de ionizao mais comuns: ESI, ApCI

- Anlise de micro e macromolculas.

- Alta sensibilidade

MODOS DE SEPARAO
NORMAL

REVERSO

TROCA INICA

MODO NORMAL
MECANISMO DE INTERAO:

ADSORO
Fase estacionria: + POLAR que a fase mvel
Fase mvel: mistura de solventes orgnicos

Colunas: Slica, Ciano, fenil, amino

MODO REVERSO
INTERAO DA PARTE NO POLAR DO SOLUTO E A FASE ESTACIONRIA

HIDROFOBICIDADE

Fase estacionria: APOLAR Fase mvel: H2O, MeOH, CH3CN

REA DE C SOLUTO

RETENO

Tempo de Reteno e Hidrofobicidade

OH

C18 (ODS) forte OH

Interao fraca

Hidrofobicidade
Se

a amostra possui
: cadeia carbnica : grupo aromtico

CH3CH2CH2---

A hidrofobicidade ser forte

Se

a amostra possui
: grupo carboxlico : grupo amino A hidrofobicidade : grupo hidrxi

-COOH -NH2 -OH

ser fraca

TROCA INICA
MECANISMO DE INTERAO :

ATRAO ELETROSTTICA
Fase estacionria: Resinas trocadoras de ons (catinicas / aninicas) Fase mvel: Tampo (pH, , fora inica, temperatura)

Aninicas: amnio quaternrio, aminas Catinicas: cido sulfnico, cido carboxlico

Microsseringas para Injeo

LQUIDOS Capacidades tpicas: 1 L, 5 L e 10 L

mbolo

agulha (inox 316)

corpo (pirex)

Obs: Seringa de HPLC

Seqncia

Lavagem da coluna -MeOH por 30 minutos

Condicionamento da coluna com fase mvel

Monitoramento da linha de base Injeo das amostras

PARMETROS CROMATOGRFICOS

FATOR DE RETENO (k) FATOR DE SEPARAO () NMERO DE PRATOS (N)

Cromatograma
tR

SINAL

tM
TEMPO

tR = Tempo de Reteno (tempo decorrido entre a injeo e o pice do pico cromatogrfico)

tM (tempo morto) = Tempo de Reteno do Composto No-Retido (tempo mnimo para um composto que no interaja com a FE atravesse a coluna)

A migrao de um analito pela coluna provoca inevitavelmente o alargamento da sua banda:

TEMPO

Efeitos do alargamento excessivo de picos:

EFICINCIA Capacidade de eluio com o mnimo de disperso do analito.

BANDA CROMATOGRFICA

na linha de base

FATOR DE RETENO (k)

k=

tr to to

tr = tempo reteno analito to = tempo morto da coluna

Representa a capacidade de distribuio do soluto nas fases No leva em conta o tempo morto da coluna

tr to k = to

k1 = 1,3 k2 = 1,8

Se: t0 = 1,5 min t1 = 3,5 min t2 = 4,2 min

FATOR DE SEPARAO ()

k2
k1

AVALIA A SELETIVIDADE

k1 = 1,3

k2
k1
k2 = 1,8

Se:

k1 = 1,3 k2 = 1,8
= 1,38

= 1 no houve separao

NMERO DE PRATOS (N)

Mede a eficincia do sistema Depende da coluna, da amostra e do fluxo da fase mvel
2

N = 5,54

tr

w0,5

Resoluo
funo da Seletividade ()

Eficincia da coluna (N)

Fator de reteno (k)

Resoluo

Rs = 0.8

Rs = 1.05

Rs = 1.25

FASE MVEL
- Solvente grau HPLC (alta pureza)

- Filtrao (membrana 0.45 m)

- Degaseificao do solvente (ultrassom, borbulhamento de He ou automtico) - Purgar os solventes

MODOS DE ELUIO
ISOCRTICO:

Uma nica composio de fase mvel ao longo da corrida; a composio ds FM CONSTANTE.

GRADIENTE:

- Variao da composio da fase mvel (FM) ao longo da corrida. - Amostras com ampla faixa de k (0,5 < k < 20)

PREPARAO DA AMOSTRA
1) COLETA/OBTENO (QUANTIDADE, LUGAR, ETC..)

2) ESTOCAGEM E PREPARAO (ESTABILIDADE)

3) EXTRAO:

- LQUIDO-LQUIDO - LQUIDO-SLIDO - SOXHLET - FLUDO SUPER CRTICO - EXTRAO EM FASE SLIDA (EFS / SPE)

Filtrao
necessria, previamente injeo, usualmente com membranas de 0.45 m mesh para a remoo do material insolvel.

DESENVOLVIMENTO DE MTODO
Fixas as condies operacionais, o tempo de reteno ajustado de um analito uma constante

AMOSTRA

PADRO

Comparao de cromatogramas da amostra e de uma soluo padro do analito suspeito

ANLISE QUANTITATIVA
A rea do pico proporcional a massa que passa pelo detector
Clculo de rea:

ANLISE QUANTITATIVA
Se ambos os compostos
respondessem igualmente ao detector poderamos usar a relao: Massa A rea A Massa B rea B

No entanto, a mesma massa de compostos diferentes nos d reas diferentes, em funo da resposta ao detector.

PADRONIZAO EXTERNA

Este mtodo baseia-se na comparao de uma certa substncia presente na amostra com seu respectivo padro. Primeiramente deve-se construir um grfico de (rea x concentrao) da substncia padro:

PADRONIZAO EXTERNA

Em seguida, injeta-se a amostra, e a partir da rea obtida no cromatograma tira-se do grfico traado a concentrao dessa substncia na amostra.
importante salientar que o grfico deve ser construdo com concentraes prximas da concentrao esperada na amostra. Outro fator muito importante que o volume injetado do padro tem de ser exatamente igual ao volume injetado de amostra. Por esta razo este tipo de padronizao mais conveniente quando se utiliza vlvulas para injeo da amostra, que reproduzem fielmente o volume injetado. Neste mtodo no so usados fatores de correo para corrigir as reas, por haver comparao da mesma substncia

PADRONIZAO INTERNA

Uma quantidade de amostra pesada juntamente com um padro de massa conhecida. Esta mistura injetada e, a partir dos dados obtidos no cromatograma, compara-se a rea corrigida de cada componente que se deseja determinar com a rea corrigida do padro adicionado, do qual se conhece a concentrao.

Mx = massa do componente x Ma = massa da amostra Mp = massa do padro

Ap = rea do padro
Ax = rea corrigida do componente x

PADRONIZAO INTERNA

A escolha do padro deve ser feita, sempre que possvel, entre compostos semelhantes aos que existem na amostra, no devendo coincidir com nenhum composto da mesma, e estar prximo ou entre os picos da amostra. Deve ser tambm uma substncia pura para que apresente apenas um pico no cromatograma, e para que esse pico possa ser relacionado massa pesada
Este mtodo possibilita a determinao de apenas um dos componentes de uma mistura, sem haver necessidade de conhecer os outros componentes.

APLICAES

APLICAES cont

Exerccio (Petrobrs)

Exerccio (Petrobrs)

Referncias
TRINDADE, Magno Aparecido Gonalves; RINALDO, Daniel;

VILEGAS, Wagner and ZANONI, Maria Valnice Boldrin. Determinao de corantes marcadores do tipo azo e antraquinona em combustveis por cromatografia lquida com deteco eletroqumica. Qum. Nova [online]. 2010, vol.33, n.1, pp. 146-150. ISSN 0100-4042.

AFLATOXINAS EM ALIMENTOS DESTINADOS A BOVINOS E EM AMOSTRAS DE LEITE DA REGIO DE LAVRAS, MINAS GERAIS BRASIL - Maria Marlucia Gomes Pereira1, Eliana Pinheiro de Carvalho2, Guilherme Prado3, Carlos Alberto da Rocha Rosa4, Thas Veloso5, Leandro Augusto Ferreira de Souza5,Jssika Mara Martins Ribeiro6