HOSPITAL NACIONAL DOCENTE MADRE NIO SAN BARTOLOME SERVICIO DE MICROBIOLOGIA

Deteccin fenotpica de mecanismos de resistencia en gramnegativos

Lic. T:M Juan Carlos Riveros Quintana

Introduccin
El Laboratorio de microbiologa tiene la responsabilidad de proporcionar al clnico los resultados de susceptibilidad confiables y oportunos, lo cual le permitir optimizar la terapia antimicrobiana . La informacin generada a partir de las pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos es fundamental para la vigilancia de los perfiles de sensibilidad y la deteccin de nuevos patrones de resistencia por el laboratorio.

PROBLEMAS ACTUALES EN ENTEROBACTERIAS y BACILOS GRAM NEGATIVOS NO FERMENTADORES

- lactamasas de espectro extendido:

- Diseminacin mundial en el ambiente hospitalario - Diseminacin mundial de clones CTX-M - Emergencia en la comunidad

Amp-C plasmdica Resistencia a carbapenemes: EB - BNF Resistencia plasmdica a quinolonas por diferentes mecanismos Alta co-resistencia a cefalosporinas y quinolonas 1. Baumannii: aumento mundial de aislamientos multi-R

Historia
La primera evidencia de la presencia de estas enzimas fue Escherichia coli se remonta a los aos 60 cuando se describi la betalactamasa TEM-1. A partir de esa fecha y sobre todo durante los aos 70-80, se desarrollaron un gran nmero de antibiticos betalactmicos resistentes a la accin de estas enzimas.
.

Desde su descripcin inicial, se han identificado ms de 300 BLEE diferentes, y la mayora pertenecen a las familias TEM, SHV y CTX-M, Asimismo, aparecieron en el arsenal teraputico los inhibidores de betalactamasas como el cido clavulnico, el tazobactam y el sulbactam que permitan recuperar la actividad de las penicilinas.

Bacteria Gram Negativa

Bicapa Fosfolipdica con Prtenas incrustadas Permeabilidad selectiva y Transporte de Solutos Excrecin de Exoenzimas Hidrolticas y Protenas de Patogenicidad

Bacteria Gram positivo

Determina forma celular Protege de presin osmtica

Permite clasificacin bacteriana

Participa en patogenicidad Importante Antgeno de superficie Es blanco de antibiticos Contiene peptidoglicano

Mecanismos de Resistencia Bacteriana

1. Modificacin enzimtica del antibitico. 2. Bombas de expulsin. 3. Cambios de permeabilidad de la membrana externa. 4. Alteraciones del sitio de accin.

- lactamasas

MECANISMO POR LO QUE SE TRANSFIEREN GENES DE RESISTENCIA

TRANSFORMACION
Intercambio gentico producido cuando una bacteria es capaz de captar fragmentos de ADN, de otra bacteria que se encuentran dispersos en el medio donde vive.

CONJUGACIN
Una bacteria donadora F+ transmite a travs de un puente o pili, un fragmento de ADN, a otra bacteria receptora F-. La bacteria que se llama F+ posee un plsmido, adems del cromosoma bacteriano.

TRANSDUCCIN
la transferencia de ADN de una bacteria a otra , se realiza a travs de un virus bacterifago, que se comporta como un vector intermediario entre las dos bacterias.

TRANSDUCCIN
la transferencia de ADN de una bacteria a otra , se realiza a travs de un virus bacterifago, que se comporta como un vector intermediario entre las dos bacterias.

PLASMIDOS
DNA Extracromosmicos Molculas de DNA de doble cadena Circular. Autoreplicativo , No vital

En E coli, se han aislado mas de 300.

FUNCIONES Resist. a Antimicrobianos

Factores de Virulencia
Sntesis de Colisina Sntesis de Enzimas Produccin de Enterotoxinas. Degradacion de molculas complejas.

Resistencia Natural

http://www.eucast.org/expert_rules/

Betalactamasas
Enzimas que hidrolizan irreversiblemente el enlace amida del ncleo betalactmico de los antibiticos betalactmicos, transformndolos en compuestos inactivos, incapaces de ejercer su accin antibitica.

CLASIFICACION DE b LACTAMASAS Bush Jacoby - Medeiros

Grupo
1 2a 2b 2be

Caractersticas

Enzimas Representativas

Cafalosporinasas no inhibidas por Acido Clavulnico AmpC Penicilinasas inhibidas por Acido Clavulnico (A.C.) Enz. de amplio espectro inhibidas por A. C. PC1 (S. aureus) TEM-1, TEM-2, SHV-1 TEM-30 - 36, TRC-1 PSE-1, CARB-3

Enz. de espectro extendido inhibidas por A.C. (BLEE) TEM-3 - 28, SHV-2 - 6

2br
2c 2d 2e

Enz. de amplio esp. con unin reducida a A.C. (IRTs)

Carbenicilinasas inhibidas por A.C. Cloxacilinasas inhibidas por A.C. Cefalosporinasas inhibidas por A. C.

OXA-1, PSE-2
P. Vulgaris IMI-1, NMC-A, Sme-1 L1 (Sten. maltophilia)

2f
3 4

Carbapenemasas no metallo b -lactamasas

Metallo b lactamasas Penicilinasas no inhibidas por A. C.

P. cepacia

- lactamasas clase C, grupo 1 de KB

AMP-C
RESISTENCIA a aminopenicilinas, cefalosporinas de 1 G, 2G incluidas cefamicinas SENSIBILIDAD a cefalosporinas de 3 y 4 generacin y carbapenemes Expresin: - constitutiva/ inducible hiperproduccin - desrepresin NO INHIBIBLE POR C. CLAVULNICO SULBACTAM NI TAZOBACTAM Inhibidas por cido bornico Cromosmica

VERIANTES PLASMDICAS

-lactamasas tipo Ampc

Estas enzimas se han encontrado codifidas por cromosomas en una amplia variedad de bacterias Gram negativas.
Aeromonas spp. Morganella morganii. Providencia spp., Pseudomona aeruginosa, Proteus spp. (indol +) Citrobacter freundii Enterobacter spp. Serratia spp.

La induccin es un mecanismo reversible

-lactamasas tipo Ampc

Como ya se mencion no existen mtodos fenotpicos estandarizados por el CLSI, para la deteccin de enzimas AmpC, no obstante, se han diseado diversos procedimientos con elevada sensibilidad y especificidad.

No induccin AmpC
AmpD AmpR

ampD

ampR

ampC

Fragmentos de la pared reciclados por AmpD Conformacin de represor AmpR No expresin de ampC (gen b-lactamasa).

Induccin de AmpC
b-lactamasa

AmpD

ampD

ampR

ampC

Mayor reciclaje: incremento de AmpD Los fragmentos de la pared activan el AmpR . Expresion ampC (gen b-lactamasa )

E. cloacae expresion AmpC cromosmica inducible

La derrepresin mutacional es el problema no la induccin

Derrepresin AmpC
b-lactamasa++

ampD

ampR

ampC

ampD inactivado por mutacin. AmpR convertido constantemente en activador. hiper-expresin de ampC

E. cloacae derrepresion mutacional de AmpC

29

E. coli con plasmido AmpC

Deteccin de AmpC por el Laboratorio

De transmisin plasmidica

Klebsiella pneumoniae AmpC

Deteccin de AmpC por el Laboratorio

Klebsiella pneumoniae AmpC

Deteccin de AmpC por el Laboratorio

Klebsiella pneumoniae AmpC

Deteccin de AmpC por el Laboratorio

E. Coli Hiperpoductora de AmpC

Deteccin de AmpC por el Laboratorio

Cmo se seleccionan las mutantes?

La derrepresion ocurre en 1 cell / 107 Estas clulas son resistentes a cef. de 3gen

La seleccin durante la terapia puede causar falla de tratamiento....

Celulas S muertas por el antibitico

Crecimiento de mutantes R

-lactamasas tipo Ampc

Las bacterias que ya no regulan la produccin de AmpC pueden ser seleccionados durante la terapia con cefalosporinas de tercera generacion y pueden acumularse en la microflora hospitalaria.

-lactamasas tipo Ampc

Los genes se codifican tpicamente en grandes plsmidos y llevan genes de resistencia adicionales. No existe consenso respecto al informe de las C3G en aislamientos productores de AmpC plasmdico

-lactamasas de espectro extendido (BLEE).

Estas enzimas confieren resistencia a las oximinocefalosporinas (como las cefalosporinas de tercera generacion), aztreonam, las penicilinas y las cefalosporinas de espectro reducido Son incapaces de hidrolizar cefamicinas (cefoxitina y cefotetan) y carbapenems.

-lactamasas de espectro extendido (BLEE).

Confieren resistencia a: - Penicilinas - Cefalosporinas excepto cefamicinas (con distinto nivel segn tipo) - Monobactmicos
Plasmdicas Frecuentemente con otros determinantes de resistencia (AG, TMP/SXT, quinolonas) Tipos: TEM, SHV, CTX-M, otras Sobre todo en enterobacterias

-lactamasas de espectro extendido (BLEE).

Las BLEE son inhibidas por ac. Clavulanico, el sulbactam, y el tazobactam lo que los que lo diferencia de las -lactamasas tipo AmpC. En la practica, la presencia de cualquier tipo de infeccion moderada a seria por una bacteria productora de BLEE debe llevar al clnico a considerarla como resistente a las cefalosporinas de amplio espectro y a los monobactamicos.

BLEE

PRUEBA CONFIRMATORIA BLEE: ES INACTIVADA CON EL ACIDO CLAVULAMICO

CTX ATM

CAZ AMOXICILINA/Ac. CLAVULAMICO

CRO

Deteccin de BLEE por el Laboratorio

Klebsiella pneumoniae BLEE +

Deteccin de BLEE por el Laboratorio

Serratia Marcecens BLEE +

Deteccin de BLEE por el Laboratorio

Klebsiella pneumoniae BLEE ?

Deteccin de BLEE por el Laboratorio

Klebsiella pneumoniae BLEE .+

Deteccin de BLEE por el Laboratorio

Combination Disk Method

CLSI Approved Method

Todas las Enterobacterias CTXCROCAZ-CFTX- AZTFEP y CXM

Deteccin de BLEE

+
Informar resistencia a todas las penicilinas, cefalosporinas y monobactames sin importar los halos de inhibicin obtenidos en las pruebas de sensibilidad

Carbapenemasas
Este grupo de enzimas hidroliza hasta los carbapenems. Pueden estar codificadas en el cromosoma bacteriano o estar presentes en elementos genticos mviles.

 Se ha propuesto una clasificacin en dos grupos: carbapenemasas de serina (incluidas en la clasificacin molecular de Ambler, clases A y D y metalo lactamasas , MBL (Ambler , Clase B), denominadas asi por la dependencia de metales como el zinc para su funcionamiento

Clasificacin de Carbapenemasas

Klebsiella pneumoniae

Deteccin de carbapenemasas por el Laboratorio

Deteccin de carbapenemasas por el Laboratorio

Las carbapenemasas clase A son dependientes de serina, incluye las no metalocarbapenemasas. Son capaces de hidrolizar los carbapenemes, as como las cefalosporinas, penicilinas y aztreonam, adicionalmente son inhibidas por el clavulnico y tazobactam

Prueba alternativa sinergismo con doble disco y acido bornico La prueba de acido bornico es especfica para deteccin de KPC en K. pneumoniae.

Test de Hodge Modificado

Prueba tamiz y confirmatoria para sospecha de carbapenemasas Test de Hodge Modificado recomendado por CLSI

RESISTENTE A CARBAPENEM POR PRODUCCION DE CARBAPENEMASA TIPO KPC ( PLASMIDOS ).

Deteccin de Metalo -lactamasas Clase B (grupo 3)IMP-1,VIM-1,CcrA, BcII

Deteccin de Metalo -lactamasas Clase B (grupo 3)IMP-1,VIM-1,CcrA, BcII

Deteccin de Metalo -lactamasas Clase B (grupo 3)IMP-1,VIM-1,CcrA, BcII

EDTA 0.5M

Pseudomonas aeruginosa MBL +

Modificacin San Bartolom Dil 1/10 de 0.5 Mc farland

EDTA 0.1M

EDTA 0.5M
EDTA 0.1M

Informe microbiolgico en la decisin clnica

El impacto del informe del laboratorio en la decisin clnica depende de:

Situacin previa y evolucin del paciente y necesidad de cambio de actitud clnica

Calidad y contenido de la informacin.

CONCLUSIONES
Las resistencias bacterianas son un problema cada vez mayor, debido a que constantemente aparecen nuevas cepas resistentes de especies normalmente sensibles a un determinado antibitico. Los microorganismos multirresistentes se seleccionan con mayor facilidad en unidades hospitalarias, particularmente en las salas de cuidados intensivos, en las que se emplean antibiticos amplio espectro como terapia emprica inicial; por selecciones sucesivas emergen microorganismos con escasas alternativas teraputicas.

El monitoreo continuo de la resistencia antimicrobiana podr proveernos de estrategias para controlar la diseminacin de bacterias resistentes