COLORACIONES PARA PIGMENTOS Y MICROORGANISMOS

Araujo Romn Lessly Delgado Coila Pierina Tejada Castillo Katherine

 Los pigmentos son sustancias de color propio. Casi todos los de importancia, se presentan forma de grnulos intracitoplasmticos. Sin embargo, algunos son solubles e imbiben difusamente los tejidos, como por ejemplo, los pigmentos lipocromos, liposolubles, que le dan el color amarillo al tejido adiposo

 La bilis puede verse como grumos intracitoplasmticos, como cilindros extracelulares o puede impregnar de verde difusamente los tejidos. Por otra parte, los pigmentos de mayor importancia son endgenos, es decir, se forman dentro del organismo. Entre los exgenos hay que considerar el pigmento antractico y los de las pigmentaciones txicas.

Fontana Masson pigmento intracitoplasmtico

 La acumulacin de sustancias intra o extracelulares en los tejidos puede hacer parte de la patogenia de una enfermedad subyacente que debe ser diagnosticada, adems esas sustancias pueden alterar las funciones fisiolgicas del tejido u rgano afectado y conllevar a una sintomatologa especfica.

 PIGMENTOS: Se producen en el propio organismo y se acumulan en casos de desequilibrio entre su produccin y secrecin o metabolismo. Se acumulan en los tejidos bsicamente en cuatro pigmentos : lipofucsina, hemosiderina, bilirrubina y melanina.

PIGMENTOS
Pigmentos endgenos: Melanina Lipopigmentos Lipofucsina Pigmento ceride Pigmento malarico Pigmento biliar Pigmento de formalina Hemosiderina Pigmentos exgenos: - Antracosis - Pigmentaciones toxicas

Pigmentos Endgenos
Los ms importantes de este grupo en patologa morfolgica son: la melanina, dos lipopigmentos: la lipofucsina y el pigmento ceroide, dos derivados de la hemoglobina: la bilirrubina y el pigmento de la malaria, y los pigmentos frricos correspondientes genricamente a la hemosiderina.

Melanina
La melanina (de mlas, negro) es un pigmento pardo negruzco, intracelular. Al microscopio de luz se presenta en forma de grnulos pequeos. El color vara del amarillo pardusco al caf o negro. Las funciones : proteccin frente a radiaciones, particularmente la ultravioleta y el poder de captacin de radicales citotxicos.

 Adems, los melanoblastos participan en la

induccin de la diferenciacin de ciertas clulas (neuronas sensoriales y simpticas, clulas cromafines de la mdula adrenal, gla y clulas de Schwann). Los melanocitos se originan en la cresta neural, de la cual, en forma de melanoblastos migran a tres sitios: la piel (epidermis y bulbos pilosos), el ojo (coroides, iris y retina) y, unas pocas, a la aracnoides.

 Los melanocitos secretan los granlos de melanina, que son fagocitados por queratinocitos, que los degradan y redistribuyen. La melanina tambin es transferida a la dermis, donde es captada por macrfagos (melanofgos).

Fig. 3: Biopsia corneal con depsito de melanocitos en las capas basales del epitelio corneal.

Melanoma maligno (tipo extensin superficial). Nidos de melanocitos de forma y tamao variables, pigmentacin heterognea, invasin de estratos suprabasales de la epidermis

 La melanina puede demostrarse mediante reacciones histoqumicas. Las ms usadas estn basadas en el poder reductor de la melanina, as en el mtodo de Fontana-Masson la melanina reduce el nitrato de plata que se precipita sobre los grnulos del pigmento dando una coloracin negra. Otro mtodo se basa en la capacidad del melanocito de sintetizar melanina a partir de tirosina o de dopa. En la reaccin positiva de dopa se aporta esta substancia y el tejido se pigmenta ostensiblemente. Puede ser importante verificar la presencia de melanina, por ejemplo, en casos de tumores para establecer si trata de un melanoma, un tumor, en general, de alto grado de malignidad.

 Pigmento melanico

 melanoma

Lipopigmentos
Los lipopigmentos se presentan en forma de grnulos o grumos con autofluorescencia amarillo o amarillo pardusca; estn formados por lpidos poco solubles y por protenas. Los ms frecuentes son la lipofucsina o pigmento fusco y el pigmento ceroide o hemofuscina.

 Lipofuscina El pigmento fusco, conocido tambin como pigmento de desgaste, se observa frecuentemente en clulas parenquimatosas de rganos o tejidos con atrofia normal o patolgica, as por ejemplo, en la atrofia fusca del hgado y en la atrofia fusca del corazn. Tambin es frecuente en neuronas nerviosas del sistema nervioso central y de ganglios simpticos, adems, en la zona fascicular de la corteza suprarrenal y en el epitelio de las vesculas seminales.

Lipofuscina hepatocitos. Tenga en cuenta los grnulos de color rosado en el citoplasma de los hepatocitos, lo que corresponde a la acumulacin de pigmento ceroide

 Pigmento Ceroide

El pigmento ceroide fue observado primero en relacin con hemorragias, por lo que se le llam hemofucsina. Las hemorragias son la condicin ms frecuente que da origen a este pigmento, pero puede formarse en relacin con focos necrticos y destrucciones traumticas de tejido. Se parece al pigmento fusco, pero es siempre patolgico y se produce en el citoplasma de macrfagos en forma de grnulos pardos. Es un pigmento granular amarillo parduzco, no refringente, PAS positivo, diastasa resistente, positivo con reaccin alcohol cido resistente (Ziehl Neelsen o Kinyou), Sudan Negro positivo, azulado con la tincin de May Grunwald Giemsa y con metacromasia (con azul de toluidina), con autofluorenscencia verde amarilla.

 Pigmento Malrico Este pigmento se observa en macrfagos de diversos rganos junto a hemosiderina. Es negro y granular. Es producido por los plasmodios de la malaria a partir de la hemoglobina, contiene fierro difcil de evidenciar. Se observa especialmente en el hgado, bazo, ganglio linftico, que adquieren un color gris o gris negruzco.

 Pigmento Biliar El pigmento biliar en su forma figurada se observa al microscopio de luz slo en condicin patolgica, en la ictericia y particularmente, en el hgado. Se presenta en forma de grumos intracitoplasmticos y de cilindros en los canalculos biliares (figura 2.13). En casos de ictericias acentuadas se lo observa tambin en clulas del epitelio de tbulos renales.

Figura 2.13. Pigmento biliar. Dilatacin de canalculo biliar el que aparece relleno de bilis densa (en negro)

 Pigmento de Formalina Se forma por accin del formol sobre la hemoglobina. Corresponde a un artefacto en forma de grumos negros, predominantemente en zonas del tejido con acentuada hiperemia o hemorragias recientes.

. HEMOSIDERINA
Es un pigmento que derivado del catabolismo de la hemoglobina, realizado contiene hierro por clulas del sistema de macrfagos mononucleares. La fagocitosis de eritrocitos lleva a la liberacin del hierro y hemoglobina. Normalmente se observan pequeas cantidades de hemosiderina en los macrfagos de la mdula sea, bazo e hgado. Es un pigmento marrn granular y amorfo.

 Tanto la hemosiderina como la ferritina pueden demostrarse mediante la reaccin del Azul de Prusia, en la que el ferrocianuro de potasio y cido clorhdrico forman, en presencia del fierro, el ferrocianuro frrico de color azul. La hemosiderina se presentar en forma de grumos azules dispersos en el citoplasma. La ferritina, en suficiente cantidad, da al citoplasma una coloracin azulada difusa sin grumos en microscopa de luz.

 Depsitos Locales de Hemosiderina Estos depsitos son secundarios a una hemorragia. La sangre al ser fagocitada por macrfagos es degradada y se produce la hemosiderina, que se forma al 6 da de ocurrida la hemorragia. Si se trata de un hematoma, macroscpicamente el material hemtico, a medida que se acumula hemosiderina, va tomando una coloracin amarillo ocre y se va espesando hasta convertirse en una masilla. En los pulmones con extravasacin intraalveolar de eritrocitos, particularmente en la estasis sangunea crnica, la hemosiderina da al tejido un color rojo ladrillo.

 Hemosiderina

Son visibles en el microscopio de luz como grnulos pardoamarillentos o anaranjados, refringentes (significa una propiedad de dejar pasar la luz del microscopio en mayor medida que los tejidos adyacente, lo cual se ve como un brillo en la periferia de los grnulos al bajar y subir el condensador de campo), positivos con la tincin de azul de Prusia, sin autofluorescencia. A los tejidos les da una coloracin desde lo pardo hasta lo anaranjado.

Pigmentos Exgenos

Antracosis
Es la pigmentacin negra de los tejidos debida a la acumulacin de pigmento de carbn. La ms frecuente es la antracosis pulmonar. La acumulacin del pigmento alrededor de los bronquios acenta el dibujo de la ramificacin del rbol bronquial. Las partculas de carbn, de 1 a 2 micrones de dimetro, son inertes y no causan dao en el tejido donde se encuentran. Cuando la antracosis es muy acentuada y se produce adems destruccin del tejido pulmonar por otras causas, el pigmento del carbn puede irrumpir en la circulacin sangunea y acumularse en clulas de otros rganos: en clulas de Kupffer, en macrfagos del bazo, mdula sea y en riones, entre otros.

 Antracosis pulmonar

 Pigmentaciones Txicas Estas pigmentaciones se deben a sales metlicas empleadas en algunos tratamientos o en ciertos trabajos industriales. Las sales de plata se reducen en presencia de la luz y producen manchas gris azuladas o parduscas, la argirosis. Al microscopio aparecen como grnulos negros. Las sales de oro inyectadas dan lugar a manchas violceas por reduccin ante la luz. El mercurio, plomo, bismuto y antimonio por la formacin de slfuros, producen una pigmentacin lineal gris azulada o negra en la mucosa bucal, especialmente en el borde dental de las encas. El arsnico aumenta la actividad de la tirosinasa y as produce una hiperpigmentacin melnica, la cual puede simular una enfermedad de Addison.

PIGMENTO

COMPOSICIN QUMICA

COLOR

REFRINGENCIA

TINCIN ESPE-CIAL Azul de Prusia

AUTOFLUORESCENCIA no

HEMOSIDERINA

ferritina+polmero pardo o de hidrxido amarillo oro frrico

si

BILIRRUBINA metabolito de la anaranjado o hematoidina protoporfirina IX caf verdoso

no

Lilli o Hall

no

LIPOFUSCINA lpidos complejos polmeros de lpidos y fosfolpido+prote nas

amarillopardo

no

PAS- Sudn

s amarilloblanca

CEROIDE

autoxidacin y polimerizacin de cidos grasos

amarillopardo

no

PAS- ZiehlNeelsen

s verdeamarilla

MELANINA

polmero de indol 5,6 quinona

pardonegrusco

no

Fontana-Masson

no

COLORACIN AZUL DE PERLS

COLORACIN DE AZUL DE PERLS

La tcnica del azul de Perls es la de mayor importancia para detectar hierro, ya que el hierro frrico es el ms frecuente en los tejidos. hgado Bazo mucosa intestinal mdula sea.

1. En el interior de los tejidos el hierro se puede depositar de 2 formas:

En forma inica, o formando sales ferrosas y frricas, por lo general en forma de cloruros o hidrxidos.

2. Como hierro ligado a protenas

 EL OBJETIVO DEL METODO DE PERLS :es la demostracin del hierro trivalente. Con este mtodo lo que se encuentra es la forma de hemosiderina coloreado con hematoxilina eosina se suele presentar como un pigmento granular intracitoplasmatico de color marrn el cual debe diferenciarse de otros pigmentos.

FUNDAMENTO DEL METODO NDE PERLS

El hierro trivalente al enfrentarse al ferrocianuro de potasio o de sodio forma un complejo coloreado de azul turquesa. El ferrocianuro frrico este complejo precipita a manera amorfa que atrado electrostticamente por ciertas estructuras citoplasmticas. El acido clorhidrico interviene en la liberacin del hierro, ya que este se encuentra almacenado en las clulas unido a protenas en cuya forma no puede interactuar con el ferrocianuro de potasio.

TCNICA DEL METODO DE PERLS

FIJACIN: El mejor fijador es la formalina neutra al 10% preserva mas el hierro con menos difusin que con otros fijadores . No se debe usar fijadores que contengan cidos porque estos disuelven los depsitos de hierro de los tejidos

REACTIVOS Solucion acuosa de Ferrocianuro de potasio al 2 % . Solucion acuosa de cido clorhdrico 2% Solucion colorante de rojo nutro 0.1% Agua destilada...... 98 ml. Solucin de ferrocianuro de potasio, cido clorhdrico: mezclando a partes iguales la solucin 1 y 2. esto se debe preparar inmediatamente antes de su uso.

PROCEDIMIENTO DEL MTODO DE PERLS

Desparafinar e hidratar las secciones hasta agua destilada. Agregar a la lamina un volumen conocido de ferrocianuro de potasio y dejar actuar durante 1 minuto. Sobre el ferrocianuro agregar un volumen igual de acido clorhdrico y hacer una mescla homognea, dejar que actu durante 15 a 20 minutos o hasta que el tejido tome una coloracin azul . Lavar con agua corriente por 2 minutos Teir los ncleos con el rojo neitro durante 30 segundos o con hematoxilina de harris por 1 minuto. Lavar con agua corriente Deshidratar, aclarar y montar.

RESULTADOS:
Hierro frrico: azul turquesa . Ncleos: rojo

Coloracin de Perls
Baso

 Glndulas salivales menores con depsitos de hierro (tcnica de Perls, 40x)

 abundante cantidad de pigmento de hemosiderina

 Higado

COLORACION DE ZIEHL NEELSEN

 La tuberculosis es una enfermedad infectocontagiosa producida por agentes del grupo Mycobacterium tuberculosis complex, especialmente por el Mycobacterium tuberculosis o bacilo de Koch (BK).

MORFOLOGIA
Bacilo aerobio, grampositivo dbil y fuertemente acidorresistente Pared celular rica en lpidos, lo que hace al microorganismo resistente a desinfectantes, detergentes, antibiticos antibacterianos frecuentes y tinciones tradicionales

FUNDAMENTO
La tincin de Ziehl-Neelsen (BAAR) es una tcnica de tincin diferencial rpida y econmica, que se basa en que las paredes celulares de ciertos parsitos y bacterias contienen cidos grasos (por ejemplo, el cido mi clico) de cadena larga (50 a 90 tomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloracin con alcohol-cido, despus de la tincin con colorantes bsicos.

 Por esto se denominan bacilos cido-alcohol resistente o BAAR. La pared celular rica en lpidos y cidos carboxlicos (cido miclico) que tienen la propiedad de unirse excepcionalmente fuerte al colorante primario (fuscina de Ziehl) cuando se usa el calor como mordiente.

 Una vez que se forma este complejo colorante-pared, ni siquiera la accin conjunta del cido y del alcohol puede deshacerlo, ya que las paredes retienen el colorante en forma "resistente". Las mico bacterias como M. tuberculosis y M. marinum y los parsitos coccdeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de cido-alcohol resistencia. La coloracin clsica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras.

PREPARACIN Y FIJACIN DEL EXTENDIDO:

Tomar una parte del aplicador y con los extremos irregulares seleccionar la partcula ms densa o purulenta de la muestra de esputo. Se colocaron las partculas seleccionadas sobre el portaobjetos y se extendieron con el aplicador con movimientos suaves, circulares, dispersndolas de forma homognea en el centro de la lmina. La lmina se deja secar al aire. Se Toma el extendido con una pinza manteniendo la cara que contiene la muestra hacia arriba, y se pasa rpidamente sobre la llama de un mechero tres o cuatro veces cuidando que no se caliente demasiado. colocar la lamina en el soporte destinado para la coloracin.

TINCIN DE CIDO-ALCOHOL RESISTENCIA (ZIEHL-NEELSEN)

Coloracin Cubrir totalmente la superficie del extendido con fucsina bsica fenicada. Y Dispersar el colorante con suavidad a lo largo de todo el extendido Con la llama de un hisopo embebido en alcohol calentar suavemente por debajo de los extendidos, con movimientos de vaivn, hasta que observe que se desprenden los primeros vapores blancos. No calentar con mechero.

 En el trmino de aproximadamente cinco minutos calentar tres veces hasta emisin de vapores; esto fue suficiente para que la fucsina penetre adecuadamente en el bacilo y se fijara a sus lpidos. Tener cuidado de no hervir la fucsina porque la pared de los bacilos puede destruirse y colorearse mal. Con una pinza, se levant cuidadosamente la lmina portaobjetos desde el extremo ms cercano. Se Enjuag con abundante agua. Y posteriormente lavar muy suave la superficie eliminando totalmente la solucin de fucsina. Inclinar el portaobjetos para eliminar el exceso de agua para evitar la dilucin de los reactivos que se utilizados en el resto de la tincin.

 Decoloracin Cubrir la totalidad del extendido con solucin decolorante y se dej actuar aproximadamen te 3 minutos Inmediatamente enjuagar el extendido con abundante agua

 Coloracin de fondo Cubrir todo el extendido con solucin de azul de metileno, Dejando actuar durante un minuto. Enjuagar las lminas en ambas caras Dejar secar las lminas a temperatura ambiente, apoyndolas en posicin vertical en un soporte.

Lectura de extendidos coloreados por Ziehl Neelsen Depositar una gota de aceite de inmersin en un extremo del frotis, sin tocar el preparado con el gotero. Enfocar el extendido donde ha colocado la gota de aceite, con la lente 100x de inmersin. Observar cada campo microscpico en superficie y profundidad, moviendo permanentemente el tornillo micromtrico Luego seguir un recorrido en lneas rectas, sistemtico para recorrer el extendido evitando repetir la lectura de algunos campos. de izquierda a derecha. Se Contaron el nmero de campos y el nmero de BAAR que han identificado.