AMINOACIDO

L-GLUTAMATO
INDUSTRIA ALIMENTARIA
ADITIVO ALIMENTARIO: SABORIZANTE O POTENCIADOR DE AROMA

NEUROQUIMICA
NEUROTRANSMISOR EXCITADOR DEL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL

Cooper and Pritchard, 1994; Zilkha et al.1995; Valero y Garcia Carmona, 1998

L-GLUTAMATO
METODOS
Kondrat et al.2002; Hanko y Rohrer,2004. Shi y Stein,1996; Liu et al, 1999; Ling, et al , 2000; Rodriguez et al. 2004

CROMATOGRAFIA
-PRE TRATAMIENTO -VOLUMEN GRANDE DE MUESTRA - TIEMPO

ENZIMATICO
GLUTAMATO DESHIDROGENASA (GDH) GLUTAMATO DESCARBOXILASA (GDC)

DESVENTAJA: -POBRE ESPECIFICIDAD DEL SUSTRATO - REQUERIMIENTO DE COENZIMA NAD+

L-GLUTAMATO OXIDASA (GLOD)

-ESPECIFICIDAD RELATIVAMENTE ALTO DEL SUSTRATO - NO REQUIERE DE UNA COENZIMA ADICIONAL EL PEROXIDO DE HIDROGENO FORMADO

ENZIMA QUE CATALIZA LA DEAMINACION OXIDATIVA DEL L-GLUTAMATO EN PRESENCIA DE AGUA Y OXIGENO CON LA FORMACION DE A-QUETOGLUTARATO, AMONIO y PEROXIDO DE HIDROGENO.

RX CROMOGENICA DE PEROXIDASA
AMPEROMETRIA

Bohmer et al, 1989; Villarta et al, 1995;Almeida y Mulchandani, 1993; Chang et al, 2003

L-GLUTAMATO OXIDASA (GLOD)

PRINCIPAL COMPONENTE EN LA DETERMINACION DE L-GLUTAMATO

DESVENTAJA: -AMPLIA ESPECIFICIDAD DE LA ENZIMA DE ALGUNOS M.O. - ALTO COSTO

1. SELECCION DE FUENTES NATURALES DE MICROORGANISMOS PARA LA PRODUCCION DEL GLUTAMATO OXIDASA 2. INVESTIGACION DE LAS CARACTERISTICAS FISICAS BIOQUIMICAS DEL GLOD DESPUES DE LA PURIFICACION. Y

3.1 MATERIALES
AMERSHAME BIOSCIENCES Ltd. (Suecia): SP-Sefarosa Fast Flow, QSefarosa Fast Flow y Superdex 200 HR 10/30

SIGMA-ALDRICH Co (USA): Marcadores de proteinas para la filtracin en gel y los aminoacidos

3.2 CONDICIONES DE LOS MICROORGANISMOS Y EL CULTIVO
Streptomyces sp.18G

AISLADO DE MUESTRA DEL SUELO

En Khlong Luang District. Thailand

MEDIO

ACIDO HUMICO-VITAMINA AGAR EN SALES INORGANICAS EN MEDIO AGAR ALMIDON

LOS MICROORGANISMOS CULTIVADOS

TENIAN MICELIA ESPIRAL CON ESPORAS

COLONIAS RESISTENTES

DESPUES DE LA FORMACION DE LAS ESPORAS

SE DESARROLLARON EN POLVO

ESTAS CARACTERSTICAS SUGIRIERON QUE EL MICROORGANISMO DE PRODUCCIN GLOD ERAN DEL GNERO STREPTOMYCES

3.3 METODOS DE SELECCION

GLOD que se produce fue seleccionado usando el METODO basado en H2O2-PEROXIDASA DEPENDIENTE CATALIZADA POR LA REACCION CROMOGENICA. ANTES DE COLOCARSE SOBRE LAS COLONIAS AISLADAS.

SUMERGE EN LA MEZCLA DE REACCIN

Papeles de Filtro

MEZCLA DE REACCIN: - 2 U/mL Peroxidasa de rabano (HRP) - 10 moles glutamato monosodico (MSG) - 10 moles 4-aminoantipirina (AAP) - 17.5 moles fenol en 0.1 M de buffer pH 7.4 fosfato potasico LAS COLONIAS PRODUCTORAS DE GLOD CAMBIARON LOS PAPELES FILTROS A COLOR ROJO Y FUERON RECOLECTADOS. REACCION SE LLEVO A CABO X 15-30 MIN A T C AMBIENTE SIN LUZ.

 Streptomyces sp. 18G crecieron en medio precultivado de salvado de trigo descrito por Bohmer et al 1989 con algunas modificaciones.

MEDIO: 2.0% SALVADO DE TRIGO 0.5% NaCl 0.5% Glutamato monosodico

CULTIVO CRECIO A 37 C CON AGITACION A 200 rpm.

ENSAYO DE GLOD
ACTIVIDAD DEL GLOD
Metodo descrito por Li et al, 1996

MEZCLA DE REACCIN: - 1.0 moles 4-aminoantipirina (AAP) -17.5 moles fenol - 2.5 U Peroxidasa de rabano (HRP) - 10 moles glutamato monosodico (MSG) - Suficiente cantidad de GLOD en 0.1 M de buffer pH 7.4 fosfato potasico en un volumen total de 1.30 mL. LA REACCION FUE INICIADA POR LA ADICION DE 10 moles MSG a la MEZCLA DE REACCION

DESPUES PRE INCUBACION X 2 min a 37 C.

INCUBACION X 30 min a 37 C CON LIGERA AGITACION

MEDICION DE LA ABSORBANCIA A 500 nm

UNA UNIDAD DE ACTIVIDAD DE LA ENZIMA

CANTIDAD DE ENZIMA REQUERIDA PARA PRODUCIR 1 mol de H2O2 x min bajo las condiciones de ensayo.

Determinacin de la concentracin de la protena

La protena se determin mediante el mtodo de Bradford, utilizando como estndar la seroalbmina bovina (BSA).

Purificacin de GLOD
Concentracin de la enzima. Se utiliz la tcnica de precipitacin con Sulfato de amonio (salting out).
Sulfato de amonio pulverizado

Se dializ durante la noche con el mismo buffer Resuspendi en 20 M buffer fosfato de potasio pH6.0

Enzima refrigerada

Enzima con 80% saturacin

Agit a 0C / 1Hr

10 000 rpm 4C/45min

precipitado

Cromatografa de intercambio catinico

Columna SP sepharose FF 30ml (in sulfopropyl, matriz agarosa 6%) La columna se pre equilibr con 20M de buffer fosfato de potasio pH6.0 La enzima se eluy con un gradiente salino de 0 0.3Mde NaCl 1ml/min

Cada fraccin de la solucin de enzima se analiz la actividad GLOD.

Las fracciones fueron concentradas por ultracentrifugacin y se mantuvieron en bao de hielo para las medidas adicinales de purificacin.

Cromatografa de intercambio aninico

Las fracciones concentradas fueron primero desaladas. Columna Q sepharose Fast flow 30ml (in: grupo amino cuaternario, ternarios o secundario, matriz agarosa reticulada 6%) La columna fue lavada con 20M de buffer Tris HCl pH 8.0 a 1ml/min.

Las protenas que se unian a la columna fueron eluidas mediante gradiente salido de NaCl 0 0.1M con el mismo caudal de flujo.

Las fracciones fueron concentradas por ultracentrifugacin y se mantuvieron en bao de hielo para las medidas adicinales de purificacin.

Las partculas cargadas negativamente se unen a la matriz slida cargada positivamente y son retenidas. Mientras tanto, las partculas con carga positiva son rechazadas de la matriz eluyndose. Para regenerar la matriz, se eluyen las particulas retenidas haciendo circular una solucion salina .

Cromatografa de filtracin en gel

Columna Superdex 200 RH 10/30 de 24ml de volumen. Fue pre equilibrada con 50M de buffer fosfato de sodio pH 7.0 con NaCl 0.15M. Se utiliz la enzima concentrada de la etapa anterior. La enzima fue eluida con el mismo buffer a un caudal de 0.5 ml/mim

Se determinaron la actividad GLOD de las fracciones por el mtodo colorimtrico y se concentraron an ms para las pruebas adicionales.

Esferas de polmeros porosos

Las molculas pequeas penetran en los intersticios del gel quedando retenidas. mientras tanto, las partculas de mayor tamao, al no poder ingresar al interior del gel, son eludas. as, se consigue separar las molculas de acuerdo a su tamao molecular

Se aade una solucin de protenas a la columna que contiene el polmero reticulado Las molculas de protena son separadas por su tamao, las molculas grandes pasan con ms facilidad.

Electroforesis en gel de poliacrilamida SDS.

La plancha de gel SDS PAGE se llev a cabo utilizando una mini celda PROTEAN3, los pesos moleculares de los marcadores se obtuvieron de la corporacin Sigma Aldrich, USA. Los geles fueron sometidos a visualizacin de bandas de protenas con el mtodo de tincin de plata.

Determinacin del peso molecular por Cromatografa de filtracin en gel

El peso molecular relativo (Mr) de la enzima nativa fue determinado usando una columna superdex 200 HR 10/30. La elucin se realiz a un caudal de 0.24ml/min con una elucin de buffer de fosfato de sodio 50 M pH 7.0 y NaCl 0.15M. La curva de calibracin fue construida utilizando marcadores:
citocromo C anhidrasa carbnica albmina de suero bovino alcohol deshidrogenasa amilasa Dextran azul vitamina B12 12 400 29 000 66 000 150000 200 000 2 000 000 1 355.4

Estimacin del punto isoelctrico

El punto isoelctrico fue determinado usando PhastGel IEF 3 9. Los marcadores del pI estndar consisti en:
tripsingeno banda de lecitina de lenteja base banda de lecitina de lenteja media banda de lecitina de lenteja cido banda de moioglobina base banda de mioglobina - acido anhidrasa carbnica humana B anhidrasa carbnica bovina B lactoglobulina A inhibidor de tripsina de soya Amiloglucosidasa 9.30 8.65 8.45 8.15 7.35 6.85 6.55 5.85 5.20 4.55 3.5

El pI de GLOD se estim mediante la ecuacin de regresin lineal.

4. 1 Purificacin de la enzima
GLOD extracelular Medio de precultivo: Salvado de trigo 2% trigo, 0.5% NaCl, 0.5% MSG 30C, 60 horas, 200 rpm. Actividad: 13.79 mU/ ml

4.2 Purificacin de GLOD

Precipitacin con sulfato de amonio Cromatografa Filtracin en gel

MARCADORES DE PROTEINAS

BETA-GALACTOSIDASA

GLOD PURIFICADA

ALBUMINA DE SUERO BOVINO

OVOALBUMINA

LACTATO DESHIDROGENASA RESTRICCION ENDONUCLEASA Bsp981

BETA-LACTOGLOBULINA LISOZIMA

4.3 Peso molecular y estructura de la subunidad

4.4 Punto isoelctrico

4.5 pH ptimo y pH para estabilidad

4.6 Temperatura ptima y estabilidad trmica

4.7 Especificidad del sustrato

1. 2. 3.

GLOD extracelular fue aislada de Streptomyces sp. 18 G. La enzima fue eficientemente producida en un medio de salvado de trigo. La enzima fue purificada aprox. 990 veces del cultivo de crecimiento con un rendimiento de 16.65%. 4. La actividad especfica fue de 152.36 U /mg. 5. La enzima nativa tiene un peso molecular de 120000 Da con dos subunidades idnticas. 6. El pI de GLOD de Streptomyces sp. 18G fue estimado en 8.5. 7. Los perfiles de actividad en cuanto a pH y temperatura: 7 7.4, 37C. Aplicable para determinacin de glutamato. 8. La enzima muestra exclusividad en la oxidacin de L- glutamato. 9. Los resultados implican que el control de las condiciones de cultivo (pH, sales, etc., pueden facilitar la produccin de GLOD. 10. Uso: biosensor de kits para anlisis clnico, monitoreo de bioprocesos y control de calidad de alimentos.