Desenvolvimento de construes gnicas para a transformao de plantas

Ricardo Harakava Pesquisador Cientfico Laboratrio de Bioqumica Fitopatolgica Instituto Biolgico

Transformao via Agrobacterium

Transformao via Agrobacterium

Agrobacterium tumefaciens
Um cromossomo linear de 2 Mb e um circular de 2.8 Mb Plasmdeo Ti (tumorinducing) de 200 Kb

Transformao via Agrobacterium

Infeco de plantas por

Agrobacterium

Transformao de plantas atravs de Agrobacterium

Gene Gun - Biobalstica

Desenvolvido por John Sanford da Cornell University, em 1987 Particularmente til para aquelas espcies que se mostraram previamente difceis de transformao por Agrobacterium (monocotiledneas) nica forma de introduzir genes em cloroplastos

Como funciona?
Cobertura de partculas de ouro ou tungstnio com o DNA de interesse Complexo partcula-DNA acelerado sob vcuo, atingindo tecido alvo As clulas recebem o DNA diretamente

Trabalhando com o Gene Gun

Comparao Agrobacterium x Biobalstica

Agrobacterium: DNA integrado preferencialmente em
algumas regies do cromossomo denominadas hot spots; baixo nmero de cpias; mais eficiente em dicotiledneas

Biobalstica: integrao do DNA aleatria; elevado nmero de cpias; aplicvel a um amplo espectro de plantas

Vetores para transformao via Agrobacterium

srie pCAMBIA pBIN19, pBINPLUS pBI121 etc, etc, etc

Estrutura de um vetor

Genes de seleo
(phosphinothricin) hpt II resistncia a hygromicina man A utilizao de manose (seleo positiva) xyl A utilizao de xilose Reviso sobre marcadores: Arago e Brasileiro, Braz. J. Plant Physiol., 14(1):1-10, 2002

npt II resistncia a canamicina bar resistncia a herbicida PPT

Modelo de vetor para obteno de plantas transgnicas sem marca de resistncia

Genes reporter
uidA GUS GFP (green fluorescent protein) luciferase

GFP direcionada ao ncleo celular

Luciferase em plntula de

Arabidopsis

Estrutura de um gene eucaritico e seu promotor

Exerccio: clonagem do gene, em sentido anti-senso, da capa protica de um vrus em vetor para transformao de plantas
Regio para insero do transgene
HindIII - BamHI - EcoRI - PstI - XhoI

CaMV 35S - P

CaMV 35S-T

Amplificao do gene
Desenho de primers para amplificao do gene por RT-PCR (o vrus de RNA) Introduo de stios de restrio nos primers para clonagem no vetor Verificar se as enzimas escolhidas no clivam o gene amplificado Verificar se as enzimas podem ser utilizadas concomitantemente Equilibrar as temperaturas de anelamento dos primers

Compatibilidade das enzimas

Nvel de atividade nos diferentes tampes (%)

React 1

React 2
100

React 3
20

Hind III

55

Bam HI
Eco RI Pst I Xho I

100
100 100 55

40
100 100 100

100
100 30 40

Em negrito = tampo recomendado

Regio codificadora da capa protica do PFWV

1 61 121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901 961 1021 1081 1141 1201 agctgtacac attttgagca ataaagagga aagaaaaaga caaatggtgg gcagagtagt gaagagtgat acaacactag atgagctaga ataatggcac ttgaataccc accatttttc tgcctaggta acttttatga aggccgctgc caaacagcga ttttgggaat attgccttta accaccttcc atagaataga ccacgcgcac agacaagaac tacggaaggt ggagagcaaa gaaaagaaca tgacggctcg gcctcgactg actcaacttg agcgaccaaa tgacaatcaa ctcaccaaat actaaagcca tgatgcggct tggtactctg ggtcacatcc cctcgcgaac gaatactgaa gggtcctccg aatatctata gtcgtgctta gtcggggcag tgaccgaggt gccagtttgg tgctgtgaat gatactatcg ggaactctgg tctctaggta caaaagatta gatcatttga tcacagttcg atgagcgtca attaatggca ttagttgaaa gaggcatata cggaatttga aaaacgccaa gtttccacta aggcacactg cagtaaaggt gtagtatagc ttgtgatagt ggagaaccat ttggcaatgt atgagctaca ccgtgtctct atgccggagg caacccttga gagacaagga ccaagaaaat tcgagtacgc agtcctggta tcatgaatgg tgtgggtgat atgctcagcc tagagatgag gggacttgag acagagcaag ggttgtttgg caagggacgt taggtaaact tttcactctc gtggctttgc tgcaacgccg ttgttgtcct agaatatttg ccaatcatcc cgatggagga aaatccaaat tgttaatgct gaatctgcca tccaaaccag ttctgcagtc tttcatggtt gatggacgga cactctgaga aaattccaaa tttggctcgc agaagcggta ccttgatgga taatcaaaac gaccacagtt tttaagttta caccagtgtc gagctttcag cgtgtcctag actggaaaag agaaaagaca cccattaatc ggctcgaaag acagtgaaag gtagatttat caaaaagaat tggtgcattg gatgagcaga cagataatgc gagccgtaca tatgcttttg gctcagatga aacgtttcaa atgcacaccc agcatctcgc gtgtggttat tgtgatatct agtgggtcac

Desenho dos primers

1 agctgtacac agacaagaac gccagtttgg atgagctaca agaatatttg cgtgtcctag 61 121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901 961 attttgagca ataaagagga aagaaaaaga caaatggtgg gcagagtagt gaagagtgat acaacactag atgagctaga ataatggcac ttgaataccc accatttttc tgcctaggta acttttatga aggccgctgc caaacagcga ttttgggaat tacggaaggt ggagagcaaa gaaaagaaca tgacggctcg gcctcgactg actcaacttg agcgaccaaa tgacaatcaa ctcaccaaat actaaagcca tgatgcggct tggtactctg ggtcacatcc cctcgcgaac gaatactgaa gggtcctccg cccaggaggc aatatctata gtcgtgctta gtcggggcag tgaccgaggt tgctgtgaat gatactatcg ggaactctgg tctctaggta caaaagatta gatcatttga tcacagttcg atgagcgtca attaatggca ttagttgaaa gaggcatata cggaatttga aaaacgccaa gtttccacta aggcacactg cagtaaaggt gtcatt gtagtatagc ttgtgatagt ggagaaccat ttggcaatgt ccgtgtctct atgccggagg caacccttga gagacaagga ccaagaaaat tcgagtacgc agtcctggta tcatgaatgg tgtgggtgat atgctcagcc tagagatgag gggacttgag acagagcaag ggttgtttgg caagggacgt taggtaaact

tcatcc ccaatcatcc cgatggagga aaatccaaat tgttaatgct gaatctgcca tccaaaccag ttctgcagtc tttcatggtt gatggacgga cactctgaga aaattccaaa tttggctcgc agaagcggta ccttgatgga taatcaaaac gaccacagtt

actggaaaag actggaaaag agaaaagaca cccattaatc ggctcgaaag acagtgaaag gtagatttat caaaaagaat tggtgcattg gatgagcaga cagataatgc gagccgtaca tatgcttttg gctcagatga aacgtttcaa atgcacaccc agcatctcgc

1021 1081 1141 1201

attgccttta accaccttcc atagaataga ccacgcgcac

tttcactctc tttaagttta gtgtggttat gtggctttgc caccagtgtc tgtgatatct tgcaacgccg gagctttcag agtgggtcac ttgttgtcct

Desenho dos primers

F: 5 GAATTCTCATCCACTGGAAAAG 3 (stio para Eco RI) Tm = 43.89 oC R: 5 AAGCTTTTACTGCGGAGGACCC 3 (stio para Hind III) Tm = 51.70 oC
Eco RI Hind III

Acrescentar alguns nucleotdeos para digesto direta (sem pr-clonagem)

F: 5 AAAGAATTCTCATCCACTGGAAAAG 3 (stio para Eco RI) R: 5 AAAAAGCTTTTACTGCGGAGGACCC 3 (stio para Hind III)

Pr-clonagem em vetor pGEM-T

A A

Produto amplificado por RT-PCR

Transferncia do gene do vetor de clonagem para o vetor de tranformao

Eco RI
CP

35S-P

Hind III Eco RI

35S-T

CP/pGEM-T

Hind III

Sntese de um gene
Genes podem ser sintetizados artificialmente acoplando-se diversos oligonucleotdeos Protena pode ser modificada para maior atividade ou estabilidade (resistncia a proteases da planta) Adio de peptdeos sinalizadores permitem direcionamento da protena para diferentes compartimentos celulares Cdons podem ser escolhidos para otimizao da expresso na planta alvo

Exemplo: sntese de uma cecropina modificada

Cecropina: peptdeo bactericida produzido por insetos Eficaz em baixas concentraes No h relatos de desenvolvimento de resistncia por parte da bactria

Sintese de gene por PCR

Sintese do gene de cecropina modificada

Promotores especficos
Controle da expresso do transgene para uma otimizao de seu efeito ou reduo de efeitos no desejveis Exemplos: tecido-especfico, rgoespecfico, induzvel por estresse hdrico, infeco por patgeno, injria mecnica, estgio de desenvolvimento

Promotor especfico ao xilema

Cortes transversais de pecolo de folha de tabaco transgnico contendo gene GUS sob controle do promotor do gene da PAL de Arabidopsis Objetivo: expresso de transgene para controle da bactria Xylella fastidiosa

Passos para obter um promotor algo-especfico

Identificar um gene que seja expresso especificamente na situao desejada (literatura: estudos de genes diferencialmente expressos, microarrays, ESTs) Verificar se seqncias do gene e seu promotor j esto disponveis no GenBank (genomas completos de Arabidopsis e arroz esto disponveis, cuidado com famlias multignicas) Se o promotor no estiver disponvel, utilizar uma das metodologias a seguir...

Clonagem de promotores
Screening de biblioteca genmica Busca no GenBank Gene-walking (PCR inverso ou com uso de adaptadores)

PCR inverso

Ochman et al., 1988

PCR inverso
Hind III Hind III Bam HI Eco RI

ATG

Regio do promotor

Gene com seqncia conhecida

PCR inverso
Hind III Hind III
ATG

Digesto com Hind III

PCR inverso

Hind III

Circularizao

PCR inverso
Hind III

ATG

Regio do promotor

Amplificao por PCR

Genome walker kit

Digesto com diferentes enzimas de restrio, em tubos separados Ligao de adaptadores 1 PCR com primer especfico ao gene (GSP1) e primer especfico ao adaptador (AP1) - externos 2 PCR com primer especfico ao gene (GSP2) e primer especfico ao adaptador (AP2) - internos

Interferncia de RNA
Presena de RNA dupla fita (dsRNA) na clula dispara mecanismo de degradao especfica Descrito em Caenorhabditis elegans (1998) Ocorre tambm em plantas, mamferos, insetos e fungos Forma de proteo do genoma do organismo contra transposons e vrus

short interfering RNA

RNA-induced silencing complex

Novina & Sharp, Nature 430:161, 2004

siRNA

21-23 nt 3 overhang de 2 nt Produto da ao de RNase tipo III (Dicer)

RNAi tambm atua em processos normais da clula

Foram encontradas molculas pequenas de RNA em diferentes organismos Denominadas microRNAs (miRNAs) 19-25 nt Codificados pelo prprio genoma do organismo, derivados de RNAs em forma de grampo (hairpin) Funo: regulao da expresso de mRNA (particularmente em processos de diferenciao e desenvolvimento)

miRNAs em animais
Em animais, miRNAs so parcialmente complementares ao mRNA alvo Um tipo de miRNA pode ter diferentes mRNAs alvos Regra geral, miRNAs ligam-se em vrios trechos prximos a extremidade 3 no traduzida do mRNA Essa ligao no leva degradao do mRNA, mas inibide a sua traduo

miRNAs em plantas
Em plantas, miRNAs so 100% (ou quase) complementares ao mRNA alvo Um tipo de miRNA tem somente um ou poucos mRNAs alvos A ligao do miRNA ao mRNA alvo leva degradao do mRNA, da mesma forma que o siRNA

Exemplos de miRNA em

Arabidopsis

Llave et al., Plant Cell 14:1605, 2002

Deteco do miRNA-5 em

Arabidopsis

Llave et al., Plant Cell 14:1605, 2002

Comparao de construes para desencadeamento de silenciamento gnico

Vetor para expresso de mRNA em hairpin

Varsha Wesley et al., 2001

harakava@biologico.sp.gov.br
11-5549-0114